Limiti dello studio

Tre sono i limiti che condizionano il nostro studio.

• In primo luogo è importante sottolineare che i campioni prelevati con le tecniche transbronchiali, sono stati inviati, processati e studiati in due strutture diverse. I ve- trini citologici tradizionali sono di competenza dell’ISPO (Istituto per lo Studio e la Prevenzione Oncologica), mentre i cell block e i clot core vengono esaminati nel Di- partimento di Medicina Sperimentale e Clinica, sede di Anatomia Patologica. E questo non consente di effettuare una valutazione totalmente attendibile delle tre diverse me- todiche di campionamento.

• In secondo luogo, non sempre è stato possibile, durante la procedura broncoscopia, ottenere quantità adeguate di materiale per allestire vetrino tradizionale, cell block e clot core con lo stesso prelievo. Spesso, infatti, sono stati fatti più prelievi a livello dello stesso linfonodo, e sono sempre stati allestiti vetrini tradizionali ma non sempre cell block e clot core in quanto, a volte, il materiale non era sufficiente per poter preparare tutti e tre i tipi di campioni. Quindi vi possono essere diversi casi in cui la valutazione

dell’adeguatezza dei tre tipi di preparati presi singolarmente non si basa sullo stesso prelievo e quindi il confronto delle due metodiche sulla stessa stazione linfonodale non è rilevante ed attendibile.

• Infine, un importante limite è rappresentato dal fatto che solo in pochissimi casi si è potuto fare un riscontro con la mediastinoscopia o la chirurgia, per cui si può parlare di un incremento della resa diagnostica solo in relazione ai casi positivi individuati con l’esame cito-istologico. Per questo motivo abbiamo deciso di non effettuare un con- fronto tra le metodiche e di non verificare l’eventuale aumento della resa diagnostica, ma di valutare come l’utilizzo complementare delle varie tecniche può fornire un mag- gior numero di informazioni utili ad incrementare l’adeguatezza dei prelievi.

7. Discussione

Il cell block e il clot core sono due metodiche di campionamento che stanno entrando prepotentemente nella pratica clinica, soprattutto negli ultimi anni; per questo motivo, gli articoli presenti in letteratura non sono molto numerosi.

Il nostro è uno studio preliminare che mira ad affiancarsi a quei lavori il cui scopo è stato valutare la complementarietà diagnostica di cell block, clot core e della citologia tra- dizionale nella diagnosi del tumore del polmone.

Le metodiche di citoinclusione hanno il grande vantaggio di fornire materiale da esa- minare qualitativamente e quantitativamente migliore in quanto attraverso queste si riescono ad evidenziare le caratteristiche morfologiche e architetturali del tessuto neopla- stico come se fosse una vera e propria biopsia, inoltre essendo il campione trattato come un istologico si riesce ad ottenere un numero ‘fette’ di preparato sulle quali effettuare molteplici studi di immunoistochimica e di biologia molecolare .

Nel nostro studio abbiamo evidenziato che, tra i 40 cell blocks allestiti, 32 contengono materiale adeguato (80%), mentre tra i 36 clot core, 28 sono adeguati (77,7%), ottenendo percentuali di adeguatezza più basse rispetto a quella del vetrino tradizionale (90%).

Le due nuove metodiche, di conseguenza, mostrano una percentuale più elevata di campioni inadeguati, spesso a causa dell’esiguità del materiale esaminato. Abbiamo con- statato, che non sempre è stato possibile allestire preparati adeguati con il materiale in- viato come clot core o cell block dal nostro ambulatorio; in alcuni casi il materiale era sufficiente solo per la preparazione dello strato sottile. Questi motivi potrebbero suggerire l’uso di metodiche di pre-inclusione come per esempio quella a base di trombina. I sistemi di pre-inclusione agevolano la raccolta dell’intero sedimento, impedendo la perdita delle cellule durante i passaggi successivi.

Dai dati riportati in letteratura, si evince che la sensibilità del citoincluso varia dal 60% all’89%, e che questa variabilità, dipende dal tipo e dalle dimensioni del linfonodo in esame, dalle tecniche di agoaspirazione utilizzate, e dal tipo di campione. Kern e Haber, hanno studiato 393 casi in cui era stato allestito il cell block. In 237 casi (60,3%) i risultati sono stati confermati, mentre in 103 casi (26,2%) il citoincluso aggiungeva informazioni fondamentali per la diagnosi. Leung e Bedard hanno trovato che tutti i casi in cui il mate- riale era adeguato, potevano essere diagnosticati mediante citoincluso e la sensibilità era dell’86%.

Lo studio di Nathan e collaboratori mostra che materiale adeguato era presente in 296 (89,4%) cell blocks8_.

Infine, nel più recente studio di Gauchotte e collaboratori la sensibilità del vetrino è del 72,8%, mentre quella del citoincluso è del 69,9%9_{(Tab. 6).}

Tabella 6 – Sensibilità del citoincluso. Numero di casi Kern e Haber, 1986 (n = 393) 237 (60%) Leung e Bedard 1993 (n = 63) 54 (86%) Nathan et al. 2000 (331) 296 (89,4%) Gauchotte et al. 2012 (493) 276 (69,9%)

Anche Kossakowski e collaboratori nel loro studio del 2014, sottolineano che la pre- parazione del citoincluso a partire dal materiale prelevato mediante agoaspirazione è es- senziale nell’incrementare la qualità dei test diagnostici e predittivi e che questa nuova metodica dovrebbe essere considerata come un approccio affidabile e sicuro, che presenta una importante complementarietà con l’analisi citologica10_.

La cosa più importante emersa dai nostri dati, è che in 7 casi (10%), il cell block e clot core hanno contribuito a fare diagnosi, quando il vetrino citologico tradizionale non è stato in grado di fornire informazioni, o perché il materiale era inadeguato o perché ade- guato negativo: il clot core ha contribuito a fare diagnosi in 4 casi, mentre il cell block in 3. Analizzando i dati a nostra disposizione, il cell block e il clot core, insieme al vetrino tradizionale, hanno permesso di aumentare l’adeguatezza del campione dal 90% al 97%. Dai nostri risultati pertanto si evince che l’utilizzo complementare delle tre metodiche di allestimento dei prelievi transbronchiali ci permette di raggiungere un’adeguatezza di quasi il 100%.

I nostri risultati, inoltre, sono in linea con quelli presenti negli studi di Sanz-Santos e collaboratori, di Gauchotte e collaboratori, e di Alici e collaboratori, che riportano un in- cremento dell’adeguatezza dei campioni esaminati, quando si utilizzava, insieme al vetri- no tradizionale, anche il citoincluso9,11,12_.

Nonostante l’esiguità della casistica si può notare una percentuale inferiore di NSCLC- NOS diagnosticata con le metodiche di citoinclusione, un risultato preliminare impor- tante per raggiungere ciò che ci prefiggiamo con l’utilizzo di queste tecniche, ovvero una maggiore capacità di tipizzare le neoplasie. Come già riportato da Travis nel 2013 infatti una corretta e soprattutto precisa diagnosi anatomopatologica della neoplasia polmonare è richiesta, per offrire al paziente una terapia mirata che possa migliorare sempre più la prognosi. Un concetto fondamentale, pertanto, è che non è più pensabile di fare una dia- gnosi di NSCLC-NOS13_.

Lo studio di Loukeris e collaboratori dimostra inoltre che il cell block è in grado di for- nire materiale aggiuntivo importante per studi morfologici che sono in grado di valutare la presenza di caratteristiche architettoniche tipiche dei vari sottotipi tumorali e quindi di tipizzare in maniera più accurata il tumore del polmone14_.

L’altro obiettivo del nostro studio era verificare quanto queste due nuove metodiche possano contribuire nel rendere disponibile materiale aggiuntivo per effettuare ulteriori studi, come l’analisi immunoistochima e l’analisi molecolare.

I test molecolari possono essere eseguiti in campioni ottenuti mediante diverse tecni- che di prelievo: resezioni chirurgiche, biopsie endoscopiche, biopsie trans toraciche, ago- aspirazione o toracentesi. Nella maggior parte dei casi di tumore al polmone in stadio avanzato, i campioni sono spesso ottenuti attraverso procedure di agoaspirazione. Diversi studi in letteratura hanno dimostrato che le mutazioni possono essere rilevate da cam- pioni citologici soprattutto quando il materiale prelevato viene allestito come citoincluso. Come riportato precedentemente, l’analisi molecolare, secondo le linee guida, dovrebbe

essere eseguita al momento della diagnosi nei pazienti affetti da adenocarcinoma polmo- nare in stadio avanzato, indipendentemente dalla loro storia clinica, e candidabili a rice- vere terapie personalizzate11.

Nel nostro studio, l’analisi molecolare è stata eseguita in 3 campioni citoinclusi. In 7 casi, l’analisi molecolare è stata eseguita sul vetrino citologico o su biopsie. Su 14 con ADK in stadio avanzato le mutazioni sono state richieste solo in 10 pazienti, quindi nel 71% dei casi. Da qui si evince che vi è un problema su chi e quando devono essere richieste le indagini molecolari. Le linee guida AIOM dicono che dovrebbe essere l’oncologo a ri- chiedere la biologia molecolare in tutti i casi di carcinoma polmonare in stadio avanzato (adenocarcinoma, carcinoma a grandi cellule e carcinoma non a piccole cellule NOS) 15. Ma la maggior parte dei pazienti che afferisce in broncologia non è inviata dall’oncologo. Quindi, le motivazioni del basso numero di analisi molecolari effettuate non sono state ben dimostrate; tuttavia un’ipotesi è quella dei protocolli organizzativi non ben stabiliti.

L’ultimo obiettivo dello studio era quello di confrontare la resa diagnostica del cell block e del clot clore, valutando quale delle due avesse fornito maggiori informazioni aggiuntive.

Dai grafici esaminati si evince che la percentuale dei preparati diagnostici è superiore nel clot core rispetto al cell block, anche se più spesso il clot core fornisce materiale non adeguato. Pertanto il clot core è la metodica che è in grado di aumentare maggiormente la resa diagnostica.

Per questo motivo, è necessaria una sempre maggiore accuratezza diagnostica, la qua- le si può ottenere più facilmente con preparati istologici o simil-istologici. Il citoincluso rappresenta una metodica che può incrementare la resa diagnostica e soprattutto la speci- ficità dell’esame, consentendo di tipizzare la neoplasia nel modo più dettagliato possibile. 8. Conclusioni

Con lo sviluppo di nuovi trattamenti personalizzati per NSCLC, i quali hanno tuttavia diversi gradi di efficacia e tossicità nei diversi sottotipi di tumorali, una classificazione patologica è diventata essenziale.

Le difficoltà di una corretta diagnosi patologica, sono diminuite con l’emergere di tec- niche di stadiazione mini-invasive, come l’EBUS-TBNA. Con questa tecnica, si possono ottenere vetrini citologici tradizionali, con i quali si raggiunge un’ottima sensibilità. An- che i cell blocks possono essere ottenuti mediante EBUS-TBNA, e, rispetto al vetrino tra- dizionale, questi presentano il vantaggio di consentire l’allestimento di sezioni cellulari maggiori e più appropriate per effettuare le diverse colorazioni immunoistochimiche e l’analisi molecolare.

È importante precisare che questo studio non ha l’intento di confrontare le diverse me- todiche di allestimento dei campioni citologici, bensì mira a dimostrare che l’utilizzo com- plementare delle varie tecniche può fornire un maggior numero di informazioni utili ad incrementare l’adeguatezza dei prelievi. Inoltre, permette di migliorare la qualità del mate- riale analizzabile e ciò risulta di fondamentale importanza vista le necessità sempre maggiori di una specifica tipizzazione delle neoplasie polmonari oltre che di analisi molecolari mirate.

Il nostro lavoro dimostra che l’analisi del preparato mediante cell block e clot core è stato utile in 7 pazienti, nei quali la citologia aveva dato una risposta inadeguata o non corretta.

Quando le informazioni ottenute dal materiale adeguato costituente il citoincluso sono state integrate con quelle ottenute dai vetrini citologici convenzionali, si è osservato un

aumento dell’adeguatezza tecniche di prelievo (TBNA ed EBUS-TBNA). Infatti, quando le tre metodiche di campionamento sono state valutate nel loro insieme, abbiamo riscontra- to un’alta percentuale di preparati adeguati, pari al 97%. Da ciò si constata che l’utilizzo complementare delle varie tecniche può fornire un maggior numero di informazioni utili ad incrementare l’adeguatezza dei prelievi.

Come già accennato nell’introduzione, le caratteristiche morfologiche apprezzabili nel vetrino tradizionale offrono, in alcune circostanze, la possibilità di differenziare i diversi sottogruppi di carcinoma non a piccole cellule. Quando queste caratteristiche architettoniche sono visibili, possono rendere non necessaria l’analisi immunoistochimi- ca. Il nostro studio riporta che attraverso le tecniche di citoinclusione abbiamo ottenuto una bassa percentuale di diagnosi di NSCLC-NOS a fronte però di una percentuale non trascurabile di materiale con note di atipia (quindi non tipizzato). Questo risultato può derivare dal fatto che non sempre il materiale inviato e processato è risultato ottimale e sufficiente per analisi accurate, quindi potrebbe essere interessante valutare se me- todiche di pre-inclusione siano in grado di aumentare la resa cellulare consentendo di tipizzare meglio la malattia. L’esser comunque riusciti a diminuire il numero di NSCLC- NOS è un risultato incoraggiante anche se ancora non rilevante visto il numero di pa- zienti esiguo.

In letteratura è stato più volte constatato che le due metodiche in esame possono au- mentare la quantità e la qualità di materiale disponibile per l’analisi molecolare, dando così la possibilità di tipizzare meglio la malattia neoplastica. Per gli stessi motivi sopra elencati non siamo riusciti nel nostro studio ad ottenere importanti risultati dall’analisi molecolare, ma soprattutto solo nel 71% dei pazienti candidati è stata effettuato questo tipo di indagine. Questo risultato fa riflettere sul fatto se vi siano o meno dei protocolli organizzativi ben delineati che stabiliscano chi e quando deve richiedere le indagini di biologia molecolare.