LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS ONKOLOGIJOS INSTITUTAS

Alisa Maksimova – Česnavičienė VI kursas, 4 grupė

PROGNOSTINĖ MIKRORNR REIKŠMĖ, SERGANT GALVOS IR KAKLO NAVIKAIS

BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS Medicinos vientisųjų studijų programa

Mokslinis vadovas: doc. dr. Viktoras Rudţianskas

2 TURINYS 1. SANTRAUKA ... 3 2. SUMMARY ... 4 3. PADĖKA ... 5 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 5

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5

6. SANTRUMPOS ... 6

7. ĮVADAS ... 7

8. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 8

9. LITERATŪROS APŢVALGA ... 9

9.1. Galvos ir kaklo navikų paplitimas ir kilmė ... 9

9.2. MikroRNR biogenezė ir reikšmė ... 10

9.3. Karcinogenezė ir mikroRNR ... 11

9.4. Sutrikusi mikroRNR raiška ... 11

9.4.1. Genetiniai pokyčiai, sąlygojantys sutrikusią mikroRNR raišką ... 12

9.4.2. Epigenetiniai pokyčiai, sąlygojantys pakitusią mikroRNR ekspresiją ... 13

9.5. MikroRNR, sergant galvos ir kaklo navikais ... 13

9.5.1. MiR – 27a – 3p ... 14 9.5.2. MiR – 205 ... 14 10. TYRIMO METODIKA ... 16 10.1. Tyrimo objektas ... 16 10.2. Metodai ... 16 10.2.1. RNR ir mikroRNR išskyrimas ... 16

10.2.2. mikroRNR ekspresijos nustatymas realaus laiko PGR būdu ... 18

10.2.3. Statistinė duomenų analizė ... 20

11. REZULTATAI ... 21

12. REZULTATŲ APTARIMAS ... 26

13. IŠVADOS ... 28

14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 29

3

1. SANTRAUKA

Alisa Maksimova - Česnavičienė

Prognostinė mikroRNR reikšmė, sergant galvos ir kaklo navikais

Darbo tikslas: ištirti ir įvertinti mikroRNR – 27a – 3p bei mikroRNR – 205 raišką sergančiųjų galvos ir kaklo onkologiniais susirgimais sveikame ir navikiniame audinyje ir įvertinti ryšį su ligos eiga.

Darbo uţdaviniai: 1. Ištirti ir įvertinti mikroRNR – 27a – 3p ir mikroRNR – 205 raiškos pokyčius galvos ir kaklo navikiniame audinyje. 2. Nustatyti mikroRNR – 27a – 3p ryšį su ligos morfologiniais aspektais ir ligos prognoze. 3. Nustatyti mikroRNR – 205 ryšį su ligos morfologiniais aspektais ir ligos prognoze.

Tyrimo metodika: tyrimo objektais buvo pasirinkti pacientai, sergantys galvos ir kaklo navikais. Biologinė medţiaga iš LSMU MA MF Onkologijos instituto audinių banko atrinkta randomizacijos būdu. Naudojant „AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit“ (Qiagen, Vokietija) buvo išskirtos mikroRNR, kurių raiška vėliau buvo vertinama atlikus realaus laiko PGR reakciją. Gavus duomenis buvo vertinama mikroRNR raiškų pokyčių įtaka klinikiniam ligos pasireiškimui bei prognozei. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterinę programą „IBM® SPSS® Statistics 26.0“.

Tyrimo rezultatai: viso tyrimo metu buvo atlikta 71 paciento mėginių analizė. Siekiant įvertinti mikroRNR ekspresijos pokyčių ryšį su ligos eiga ir prognoze, buvo apskaičiuotos tirtų mikroRNR raiškų medianos (miR-27a-3p 0,692, miR-205 atitinkamai 0,751). Pagal nustatytą dydį tirti asmenys buvo suskirstyti į didelės ir maţos raiškos grupes. Atlikta statistinė analizė neparodė statistiškai reikšmingo ryšio tarp klinikinių ligos išraiškų bei tyrimo metu tirtų mikroRNR raiškos pokyčių. Abiejų mikroRNR ekspresijos koreliacija su morfologiniais ligos poţymiais buvo silpna arba labai silpna. Vis dėlto, pacientams, kuriems buvo nustatyta paţengusi ligos stadija (III – IV), stebėta silpna, tačiau statistiškai reikšminga koreliacija su mikroRNR-27a-3p raiška (r=0,250, p=0,035). Be to, duomenų analizė parodė ryšį tarp padidėjusios miR-205 raiškos ir gerklų vėţio (r=0,242, p=0,042). Apskaičiuota DFS mediana siekė 22 mėnesius, tačiau nei miR-27a-3p, nei miR-205 reikšmingai nekoreliavo su DFS (atitinkamai p=0,539 ir p=0,589).

Tyrimo išvados: tirtų mikroRNR medianos nesiekė 1. Tai leidţia daryti išvadą, jog navikiniame GKN audinyje vyravo sumaţėjusi minėtų mikroRNR raiška. Nustatytas statistiškai patikimas ryšys tarp padidėjusios miR-27a-3p raiškos ir paţengusios ligos stadijos bei miR-205 raiškos ir gerklų vėţio, tačiau reikšmingos koreliacijos su kitais klinikiniais duomenimis nestebėta.

4

2. SUMMARY

Alisa Maksimova – Česnavičienė

Prognostic Value of MicroRNAs in Head and Neck Cancer

Aim: to determine microRNA – 27a – 3p and microRNA – 205 expressions in normal and cancerous tissues of head and neck cancer and investigate correlation between expression levels and clinicopathological features.

Objectives: 1. To measure and evaluate expression of miR-27a-3p and miR – 205 in head and neck cancer. 2. To determine correlation between miR-27a-3p expression levels and clinicopathological features and prognosis. 3. To determine correlation between miR-205 expression levels and clinicopathological features and prognosis.

Methods: in this study we collected tissues of head and neck cancer patients from Tissue Bank of LUHS Institute of Oncology. Biological samples were collected randomly. For purification of total RNA, including miRNA, „AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit“ (Qiagen, Germany) was used. Expression of miRNAs was analysed by performing a quantitative real – time polymerase chain reaction. Collected data were compared with clinicopathological features and prognosis. Statistical analysis was performed using „IBM® SPSS® Statistics 26.0“.

Results: analysis of 71 patients’ biological samples was performed. A wide range of expression levels was observed. According to the median miR-27a-3p and miR-205 expression values used as a cut-off (0,692 and 0,751 respectively), all patients were classified into high and low expression groups. Statistical analysis did not show significant correlation between clinicopathological features and measured microRNA expressions. Both miR-27a-3p and miR-205 expressions weakly correlated with clinical findings. However, higher expression of miR-27a-3p in head and neck cancer patients significantly correlated with TNM stage (r=0,250, p=0,035). Moreover, we found significant correlation between high expression of miR-205 and laryngeal cancer (r=0,242, p=0,042). The Kaplan-Meier analysis and log-rank test showed that median DFS was 22 months. Unfortunately, neither miR-27a-3p nor miR-205 had significant correlation with disease free survival (p=0,539 and p=0,589 respectively).

Conclusions: median expression values of both microRNAs’ were lower than 1. It suggests that low expression levels were observed in head and neck cancer. Significant correlation was measured between higher expression of miR-27a-3p and TNM stage. It also became clear that higher expression of miR-205 correlated with laryngeal cancer. Unfortunately, no significant correlations between mentioned microRNAs’ and other clinicopathological features were observed.

5

3. PADĖKA

Nuoširdţiai dėkoju moksliniam vadovui doc. dr. Viktorui Rudţianskui bei prof. dr. Rasai Ugenskienei uţ kantrybę, pagalbą ir idėjas rengiant baigiamąjį magistro darbą.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Lietuvos Sveikatos mokslų universitetas, Bioetikos centras Bioetikos leidimo numeris BEC – MF – 07

6

6. SANTRUMPOS

AT – atvirkštinė transkriptazė

BCL2 – B ląstelių limfomos – 2 genas (angl. B – cell lymphoma 2 gene) CpG – citozino guanino dinukleotidai (angl. cytosine – guanine dinucleotides)

DGCR8 – DiDţordţo sindromo kritinio regiono 8 genas (angl. DiGeorge sindrome critical region gene 8)

DFS – išgyvenamumas be ligos (angl. disease free survival) DNR – deoksiribonukleino rūgštis

EMT – epitelinio tipo perėjimas į mezenchiminį (angl. epithelial – mesenchymal transition) GKN – galvos ir kaklo navikai

GLOBOCAN – Pasaulio Vėţio observatorija (angl. Global Cancer Observatory)

HNSCC – galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinoma (angl. head and neck squamous cell carcinoma)

iRNR – informacinė RNR kDNR – kopijinė DNR

LLL – lėtinė limfocitinė leukemija

miRNR/miR – mikroRNR (angl. microRNA)

NSCLC – nesmulkių ląstelių plaučių vėţys (angl. non-small cell lung cancer) oncomiR – onkogeninė mikroRNR

OS – bendrasis išgyvenamumas (angl. overall survival) PSO – Pasaulio Sveikatos Organizacija

RAN – GTP – su RAS susijęs branduolio baltymas, prisijungęs GTP (angl. RAS related nuclear protein – guanosine 5` - triphosphate)

RISC – RNR aktyvinamas slopinimo kompleksas (angl. RNA – induced silencing complex) RL – PGR – realaus laiko polimerazės grandininė reakcija

RNazė III – ribonukleazė III RNR – ribonukleino rūgštis

YAP1 – angl. yes – associated protein 1 ŢPV – ţmogaus papilomos virusas

7

7. ĮVADAS

Kasmet pasaulyje yra nustatoma apie 20 mln. naujų vėţio atvejų, iš kurių daugiau nei 800 tūkst. sudaro galvos ir kaklo onkologiniai susirgimai. Galvos ir kaklo navikai 2020 m. uţėmė 7-ą vietą pasaulyje pagal sergamumą ir mirtingumą 100 tūkst. gyventojų. Nuolat tobulėjant diagnostinėms galimybėms daugėja naujai nustatytų galvos ir kaklo vėţio atvejų. Vis dėlto, nepaisant paţangių diagnostinių būdų, net dviem trečdaliams pacientų nustatoma išplitusi liga (III ar IV stadija). Tai skatina ieškoti naujesnių, ankstyvesniam ligos nustatymui tinkamų diagnostinių priemonių.

Nors mikroRNR buvo atrastos palyginti neseniai, praeito šimtmečio paskutiniajame dešimtmetyje, jos sulaukė didelio įvairių šalių mokslininkų susidomėjimo. Šios nedidelės, iš 18 – 25 nukleotidų sudarytos RNR sudaro tik nedidelę genomo dalį, tačiau atlieka svarbų vaidmenį organizmo vystymosi procese. Keisdamos potranskripcinę genų ekspresiją, mikroRNR reguliuoja ląstelės išsivystymo, diferenciacijos, taip pat ir navikinio audinio formavimosi bei augimo slopinimo procesus. Atlikti tyrimai parodė, jog mikroRNR gali ne tik skatinti navikinio audinio formavimąsi, bet ir slopinti kancerogenezę. Tiriant skirtingų lokalizacijų navikus mokslininkai pastebėjo, kad vienų onkologinių susirgimų atvejais specifinių mikroRNR ekspresija didėja, o kitų – maţėja. Tai leido daryti išvadą, jog mikroRNR gali tapti naujaisiais biomarkeriais, leidţiančiais ne tik anksti diagnozuoti, bet ir prognozuoti įvairių ligų eigą.

Siekiant įvertinti mikroRNR reikšmę onkologinių susirgimų atvejais, šio darbo metu buvo tiriamos mikroRNR – 27a – 3p ir mikroRNR – 205. Jų raiškos buvo nustatomos pacientų, sergančių galvos ir kaklo navikais, sveikame bei navikiniame audiniuose. Tyrimo metu tikimasi, kad bus nustatytas ryšys tarp minėtų mikroRNR ekspresijos pokyčių ir ligos eigos bei prognostinės mikroRNR savybės.

8

8. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti ir įvertinti mikroRNR – 27a – 3p bei mikroRNR – 205 raišką sergančiųjų galvos ir kaklo onkologiniais susirgimais sveikame ir navikiniame audinyje ir įvertinti ryšį su ligos eiga.

Darbo uţdaviniai:

1. Ištirti ir įvertinti mikroRNR – 27a – 3p ir mikroRNR – 205 raiškos pokyčius galvos ir kaklo navikiniame audinyje.

2. Nustatyti mikroRNR – 27a – 3p ryšį su ligos morfologiniais aspektais ir ligos prognoze.

9

9. LITERATŪROS APŢVALGA

9.1.Galvos ir kaklo navikų paplitimas ir kilmė

Galvos ir kaklo navikai – viena iš dešimties daţniausiai nustatomų vėţio formų pasaulyje, skaičiuojanti daugiau nei 800 tūkst. naujų atvejų kasmet [1]. Pasaulinės vėţio observatorijos (angl. GLOBOCAN) duomenimis, 2020 metais GKN sudarė 4,8% naujai nustatytų vėţio atvejų (11,8 atvejo 100 tūkst. gyventojų) [2]. Lyginant su 2015 m. Vėţio registro duomenimis, sergamumas GKN Lietuvoje buvo didesnis ir siekė 20,1 atvejo 100 tūkst. gyventojų [3].

Daţniausiai GKN yra nustatomi burnos ertmėje (apie 40%), gerklose (apie 20%), kitose anatominėse struktūrose (nosiaryklėje, burnaryklėje ir kt.) – rečiau [2]. Nepaisant įvairios pirminio naviko lokalizacijos, apie 90% atvejų yra nustatoma plokščialąstelinė karcinoma [4]. Nustatyta, kad iki 75% atvejų GKN išsivystymą lemia rūkymas ir nesaikingas alkoholio vartojimas. Tai iš dalies paaiškina, kodėl vyrų sergamumas GKN yra 2 – 4 kartus didesnis nei moterų [4,5]. Įrodyta, kad rūkymas riziką susirgti GKN didina 5 – 25 kartų. Atitinkamai asmenims, per dieną suvartojantiems 50 g ir daugiau gryno alkoholio, rizika susirgti GKN išauga 2 – 3 kartus, lyginant su alkoholio nevartojančiais asmenimis [6]. Per pastaruosius dešimtmečius buvo išaiškinti ir kiti, ne maţiau svarbūs rizikos veiksniai. Tai – ţmogaus papilomos (ypač 16 tipas) bei Epštein – Barro virusai. Šie virusai pagrinde yra siejami su burnaryklės ir nosiaryklės vėţiu [1,5,7]. Nors pastaraisiais dešimtmečiais maţėja tabako sukeltų GKN dėl maţėjančio rūkymo, ŢPV – teigiamų GKN skaičius didėja. Manoma, kad riziką susirgti ŢPV – teigiamu burnaryklės vėţiu didina daţni oraliniai lytiniai santykiai bei daţna lytinių partnerių kaita [8].

Nepaisant to, kad ankstyvos (I – II) stadijos GKN gali būti išgydomi chirurginiu būdu arba taikant radioterapiją (5 metų išgyvenamumas siekia 70 – 90%), tarp besikreipiančių asmenų ankstyva stadija nustatoma tik 30 – 40%. Dviem trečdaliams pacientų diagnozės metu nustatoma lokaliai išplitusi arba metastatinė liga [1,6]. Net iki 60% pacientų liga recidyvuoja, nepaisant taikomo gydymo ir po jo pasiektos remisijos [6]. Vėlyvųjų (III – IV) stadijų nustatymas siejamas su prastesne prognoze – 5 metų išgyvenamumas nesiekia 50% [1]. GLOBOCAN duomenimis, 2020 m. GKN lėmė 4,7% mirčių pasaulyje, susijusių su onkologiniais susirgimais (5,9 mirtys 100 tūkst. gyventojų) [2]. Lietuvoje, 2015 m. duomenimis, mirtingumo rodiklis buvo ţenkliai didesnis – 15,3 mirtys 100 tūkst. gyventojų [3].

10 9.2.MikroRNR biogenezė ir reikšmė

MikroRNR – tai nekoduojanti viengrandė RNR, sudaryta iš 18 – 25 nukleotidų [9]. Ţmogaus genome yra apytiksliai 2 tūkst. genų, koduojančių mikroRNR, o tai, manoma, sudaro iki 5 % visų ţinomų ţmogaus genų [10]. Pirmą kartą mikroRNR buvo aprašyta 1993 metais, kuomet Viktoras Ambros kartu su Gariu Ruvkun nustatė pirmąją mikroRNR Caenorhabditis elegans kirmelėje [10,11]. Tai paskatino tolesnius mikroRNR tyrinėjimus, dėl ko šiuo metu yra nustatyta virš 48 tūkst. brandţių mikroRNR sekų iš 271 organizmo [12].

MikroRNR brandinimas vyksta keliais etapais: biogenezė prasideda ląstelės branduolyje, o pasibaigia brandţios mikroRNR suformavimu citoplazmoje. Visų pirma, mikroRNR seka yra nuskaitoma branduolyje, kur yra transkribuojama RNR polimerazės II arba RNR polimerazės III. Taip susidaro pirminė mikroRNR (pri – miRNR), kuri yra daug ilgesnė nei brandi mikroRNR [9,10].

Susidariusi pri – miRNR susilanksto į segtuko pavidalo antrinę struktūrą. Tokiu būdu ji yra atpaţįstama baltymų komplekso, sudaryto iš endonukleazės DROSHA ir baltymo DGCR8 (angl. DiGeorge syndrome critical region gene 8). Pastarasis yra DROSHA kofaktorius ir jį stabilizuoja [13]. Susidaręs kompleksas sukarpo pri – miRNR į smulkesnes, 60 – 70 nukleotidų ilgio mikroRNR, geriau ţinomas kaip pre – miRNR. Tokio ilgio mikroRNR jau gali būti pernešama į ląstelės citoplazmą galutiniam brandinimui. Tai atlieka baltymo eksportino – 5 ir RAN – GTP (angl. RAS related nuclear protein – GTP) kompleksas [9,10,11].

Patekusi į citoplazmą, pre – miRNR yra skaidoma Dicer (RNazė III) į neilgus, 21 – 24 nukleotidų mikroRNR dupleksus, dar ţinomus kaip miRNR/miRNR* kompleksus [9,10]. Pastarieji yra prijungiami prie Argonauto (Ago) šeimos baltymų, sudarydami RISC (angl. RNA – induced silencing complex) kompleksą. Toks RISC nėra funkciškai stabilus – jis stabilizuojamas, kuomet iš dupleksų lieka tik biologiškai aktyvi grandis. Dėl šios prieţasties iš miRNR/miRNR* komplekso yra pašalinama ir sunaikinama miRNR* grandis. Likusi brandi mikroRNR sudaro stabilų kompleksą su Ago baltymais. Susidarius stabiliam RISC kompleksui, subrendusi mikroRNR jau gali nukreipti RISC į taikininę iRNR. Taip inicijuojama iRNR degradacija arba sustabdoma jos transliacija, dėl ko yra sutrikdomas koduojamo baltymo susidarymas [11,13,14].

Tokiu būdu mikroRNR, reguliuodamos potranskripcinę genų ekspresiją, įsitraukia į daugelį ląstelinių ir organizmo vystymosi etapų [9]. MikroRNR reguliuoja ląstelės išsivystymo, diferenciacijos, taip pat ir navikinio audinio formavimosi bei augimo slopinimo procesus [15]. Nepaisant to, jog yra atlikta nemaţai tyrimų, siekiant išsiaiškinti mikroRNR raiškos pokyčius įvairių ligų vystymosi metu, didţiausi jų buvo nustatyti vėţinių susirgimų atvejais [9,10]. Tai leido daryti išvadą, jog mikroRNR gali tapti naujaisiais bioţymenimis, leidţiančiais ne tik anksti nustatyti įvairias ligas, bet ir prognozuoti jų eigą [9,10].

11 9.3.Karcinogenezė ir mikroRNR

Karcinogenezė – procesas, kurio metu yra sutrikdomos normalios ląstelės savybės bei gyvenimo ciklas, dėl ko pastaroji pakinta ir įgyja naujų, navikinei ląstelei būdingų bruoţų. Jiems priskiriami nekontroliuojamas dalijimasis, dėl ko susidaro pirminis navikas; aplinkinių audinių infiltravimas, patekimas į kraujotaką ir vėliau – išsisėjimas atokiuosiuose organuose [16].

Tam, kad normali ląstelė pavirstų piktybine, turi įvykti eilė pokyčių. Tai – daugiapakopis procesas, kurio metu dėl vidinių ir išorinių veiksnių įvyksta genų mutacijos, lemiančios pasikeitimus ląstelės fiziologijoje [16]. Daţniausiai dėl mutacijų yra aktyvuojami onkogenai arba nuslopinami naviko supresoriai [17]. Normaliam ląstelės gyvenimo ciklui yra svarbūs proto-onkogenai, kurie koduoja baltymus, dalyvaujančius ląstelės augime, vystymesi ir jos diferenciacijoje. Onkogenais vadinami genai, kuriuose įvyksta navikinį procesą aktyvuojančios mutacijos (angl. driver mutations). Tai – mutavusi proto-onkogeno forma, dėl kurios atsiranda kiekybiniai (padaugėja sintetinamo baltymo) arba kokybiniai (sintetinamas naujas baltymas) pokyčiai [17,18,19].

Ne maţiau svarbų vaidmenį ląstelės gyvybiniame cikle atlieka naviką slopinantys genai (angl. tumor suppressor genes, TSGs). Šie genai yra atsakingi uţ DNR paţaidų taisymą, reguliuoja ląstelės proliferaciją, paleidţia apoptozės mechanizmus bei slopina naviko metastazavimą [19]. Įvykus driver mutacijai naviką slopinančiuose genuose, pastarieji yra inaktyvuojami [18]. Inaktyvavus šiuos genus, atsiranda palankios sąlygos naviko augimui bei progresavimui [17,19].

Pastaraisiais dešimtmečiais buvo tiriamas mikroRNR vaidmuo įvairių ligų, tarp jų – ir vėţio, vystymesi. Buvo nustatyta, kad mikroRNR gali veikti tiek kaip onkogenai, tiek kaip naviką slopinantys genai. Onkogeninės mikroRNR dar kitaip vadinamos „oncomiRs“ [16,20,21]. Priklausomai nuo susirgimo, gali būti padidėjusi oncomiR raiška arba atvirkščiai – sumaţėjusi naviką slopinančių mikroRNR ekspresija. Šiuo metu nebelieka abejonių, jog įvairių mikroRNR raiškos pokyčių yra nustatoma beveik visų vėţinių susirgimų atvejais. [22].

9.4.Sutrikusi mikroRNR raiška

Sutrikusią mikroRNR raišką vėţinių susirgimų atvejais lemia įvairūs genetiniai ir epigenetiniai mechanizmai. Genetiniams pokyčiams priskiriamos delecijos, amplifikacijos, įvairios mutacijos, dėl kurių pakinta DNR seka. Priešingai genetinėms modifikacijoms, epigenetiniai veiksniai keičia genų raišką, nekeisdami DNR sekos. Geriausiai išnagrinėtos epigenetinės modifikacijos - DNR metilinimas bei histoninių baltymų pokyčiai [23-27,31,32]. Šiame skirsnyje aptariami daţniausiai literatūroje aprašomi pokyčiai, lemiantys mikroRNR raiškos kitimus onkologinių ligų atvejais.

12 9.4.1. Genetiniai pokyčiai, sąlygojantys sutrikusią mikroRNR raišką

Yra pastebėta, jog daugiau nei pusė ţinomų mikroRNR genų lokalizuojasi lengvai paţeidţiamose chromosomų vietose arba šalia jų. Dalis jų yra aptinkamos chromosomų lokusuose, kuriuose daţnai vyksta delecijos ar genų amplifikacijos [23-27]. Minėti genetiniai pokyčiai yra stebimi ir įvairių vėţinių susirgimų atvejais. Tai leidţia daryti išvadą, jog įvykus atitinkamoms genetinėms modifikacijoms, gali būti pakeistas specifinės mikroRNR raiškos profilis, dėl kurio inicijuojamas karcinogenezės procesas [25-27].

Pokyčiai mikroRNR koduojančių genų srityse pirmą kartą buvo nustatyti tiriant sergančiuosius lėtine limfocitine leukemija. Atliktuose tyrimuose pastebėta, jog daugiau nei pusėje LLL atvejų yra randama 13-os chromosomos ilgojo peties 14-to regiono (13q14) delecija. Ištyrinėjus šio regiono sandarą, buvo nustatyta, jog šios delecijos metu yra prarandami dvi mikroRNR - miR-15a ir miR-16-1 - koduojantys genai [24-27]. Vėlesniais tyrimais nustatyta, jog šių mikroRNR pagrindinis taikinys yra BCL2 genas. Šis genas yra ţinomas kaip ląstelių apoptozę slopinantis onkogenas, kurio raiška daugelio onkologinių ligų atvejais yra padidėjusi [25,26]. Manoma, jog per didelė BCL2 raiška yra vienas svarbiausių veiksnių, inicijuojančių LLL vystymąsi [26]. Minėtos mikroRNR įprastai slopina šio onkogeno ekspresiją, tačiau praradus jas koduojančius genus, ţenkliai sumaţėja šių mikroRNR raiška. LLL atveju sumaţėjusi miR-15a ir miR-16-1 ekspresija lemia didesnę BCL2 raišką. Tai leido daryti išvadą, jog šios mikroRNR veikia kaip tumoro supresoriai [25,26]. 13q14 delecijos nustatymas parodė, kad tam tikrų mikroRNR genų praradimas nulemia padidėjusią onkogenų raišką bei vėţinio proceso inicijavimą [27].

Tam tikrais atvejais įvyksta atvirkštiniai procesai, kurių metu genai nėra prarandami, o jų kaip tik padaugėja. Šie genetiniai pokyčiai įvyksta dėl genų amplifikacijos [24,26]. Vienas tokių pavyzdţių – miR – 17 ~ 92 raiškos pokyčių nustatymas B ląstelių limfomos atveju. Ši policistroninių mikroRNR grupė koduoja 6 skirtingas mikroRNR – miR–17, miR – 92a, miR – 19a, miR – 20a, miR – 18a ir miR – 19b [26, 28]. Minėtasis miR – 17 ~ 92 klasteris lokalizuojasi 13-os chromosomos ilgojo peties 31-ajame regione (13q31.3) [26]. 2004 metais Japonijos mokslininkų atliktame tyrime buvo nustatyta, jog šis regionas yra amplifikuotas difuzinės didelių B ląstelių limfomų atvejais [29]. 2009 metais bandymų su laboratorinėmis pelėmis metu Ping Mu ir kt. eksperimentiškai pašalino miR – 17 ~ 92 alelius iš limfominių ląstelių. Gauti rezultatai parodė, kad minėto regiono delecija ţenkliai sumaţino limfominių ląstelių dauginimąsi [30]. Nustatyta, jog miR – 17 ~ 92 priklausančios mikroRNR, veikdamos kaip onkogenai, skatina ląstelių proliferaciją, inhibuoja jų apoptozę, indukuoja naujų kraujagyslių susidarymą navike. Vėlesni tyrimai parodė, jog šios mikroRNR grupės raiška yra padidėjusi ir kitų onkologinių susirgimų, tokių kaip krūties, storosios ţarnos, plaučių vėţys atvejais [26,28,30].

13 9.4.2. Epigenetiniai pokyčiai, sąlygojantys pakitusią mikroRNR ekspresiją

Įvairiais tyrimais įrodyta, jog sutrikusi mikroRNR raiška yra vienas lemiamų veiksnių, sąlygojančių vėţio vystymąsi ir progresavimą [31]. Kaip minėta anksčiau, mikroRNR raiškos pokyčius nulemia ne tik genetiniai, bet ir epigenetiniai veiksniai. Vienas daţniausių epigenetinių mechanizmų - promotoriuje esančių CpG salelių hipermetilinimas [25,31].

Normaliai DNR sekos metilinimas yra vienas iš svarbiausių epigenetinių mechanizmų, reguliuojančių genų ekspresiją. DNR metiltransferazės pagalba prie citozino ţiede esančio penktojo anglies atomo yra prijungiama metilo grupė, taip susidarant 5 – metilcitozinui. Esant metilintai DNR, sumaţėja afinitetas specifiniams transkripcijos faktoriams ir tokiu būdu sutrikdomas transkripcijos pradţios komplekso formavimasis. Nesant transkripcijos iniciacijos komplekso, atitinkamas genas negali būti nurašytas. Tai vadinama geno nutildymu (angl. gene silencing). Šis DNR metilinimas vyksta išskirtinai DNR vietose, sudarytose iš CpG dinukleotidų sekų, todėl didţioji dalis CpG yra prisijungusi metilo grupę. Tam tikrose srityse šių dinukleotidų koncentracija yra keliasdešimt kartų didesnė, lyginant su pavieniais CpG dinukleotidų išsidėstymais. Tai vadinamosios CpG salos, kurių randama daugiau nei pusėje ţinomų ţmogaus genų promotorių. Nepaisant to, jog šiose srityse yra padidintas citozino ir guanino kiekis, dauguma CpG salų nėra prisijungusios metilo grupės [32,33].

Daugelio vėţinių susirgimų atvejais CpG salų metilinimas būna pakitęs. Genų promotoriuose prasideda šių dinukleotidų hipermetilinimas, dėl ko yra nuslopinama atitinkamų genų ekspresija. Tokiu būdu yra „nutildomi” naviką slopinantys genai bei inicijuojama karcinogenezė [32]. Išsami mikroRNR genų sekos analizė parodė, jog apie pusė visų mikroRNR genų yra susiję su CpG salomis. Tai leido daryti išvadą, jog onkologinių susirgimų atvejais naviką slopinančių mikroRNR genai gali būti nuslopinami metilinant CpG salas, esančias genų promotoriuose [33,34]. Vienas tokių pavyzdţių - epigenetinis miR - 145 „nutildymas” stemplės vėţio atveju. Yra ţinoma, jog normaliai ši mikroRNR atlieka naviko supresoriaus vaidmenį. Tačiau įvykus epigenetiniams pokyčiams geno promotoriaus srityje pastaroji mikroRNR šios funkcijos netenka – atsiranda sąlygos navikinio proceso vystymuisi. Tai pagrindţia Harada ir kt. tyrimas, kurio metu buvo stebėtas ţymiai didesnis miR–145 promotoriaus metilinimas navikiniame stemplės audinyje lyginant su sveiku audiniu. Promotoriaus hipermetilinimo pasekmė – sumaţėjusi miR–145 ekspresija, sąlygojanti stemplės vėţio vystymąsi [35].

9.5. MikroRNR, sergant galvos ir kaklo navikais

Įvairūs atlikti tyrimai nepalieka abejonių, jog mikroRNR ekspresijos sutrikimai turi įtakos onkologinių ligų, tarp jų ir GKN, vystymuisi ir progresavimui. Atrastos sąsajos paskatino tirti jų, kaip

14 prognostinių vėţio bioţymenų bei terapinių taikinių, vaidmenį įvairių vėţinių susirgimų atvejais [9,10]. Toliau šiame skirsnyje yra aptariamos mikroRNR, naudotos šiame tyrime.

9.5.1. MiR – 27a – 3p

Ši mikroRNR priklauso miR – 27 šeimai, kuriai yra priskiriamos dvi mikroRNR – miR – 27a ir miR – 27b [36]. Šių mikroRNR genai lokalizuojasi skirtingose chromosomose, iš kurių miR – 27a lokusas randamas 19-oje chromosomoje [37]. MiR – 27a vaidmuo pirmą kartą buvo nustatytas krūties vėţio atveju, tačiau vėliau pastebėta, jog sutrikusi miR – 27a raiška gali būti ir skrandţio adenokarcinomos, kepenų vėţio ir kitų onkologinių susirgimų atvejais [36,37].

Atliktuose tyrimuose miR – 27a – 3p raiškos pokyčiai aprašomi nosiaryklės ir burnos plokščiųjų ląstelių karcinomos atvejais [38,39]. Tyrimų metu buvo nustatyta, jog navikiniame nosiaryklės audinyje miR – 27a – 3p raiška buvo ţenkliai didesnė, lyginant su sveiku nosiaryklės audiniu. Taip pat pastebėta, jog miR – 27a – 3p raiška tiesiogiai koreliavo su klinikine ligos eiga. Gauti tyrimų rezultatai leido daryti išvadą, jog padidinta miR – 27a – 3p raiška gali būti susijusi su nosiaryklės vėţio progresavimu [38].

Priešingai nei Li ir Lou studijoje nosiaryklės vėţio atveju, tiriant miR – 27a – 3p raišką burnos plokščiųjų ląstelių karcinomos audinyje, nustatyta maţesnė jos ekspresija. Tyrimo metu buvo ieškoma tikėtinų miR – 27a – 3p taikinių. Vienas iš nustatytų – YAP1 baltymas [39]. Šis onkobaltymas yra atsakingas uţ ląstelių proliferaciją, kontroliuoja kamieninių ląstelių atsinaujinimo procesus bei gali inhibuoti ląstelių apoptozę, veikdamas kelis skirtingus mechanizmus [40]. Burnos plokščiųjų ląstelių karcinomos atveju buvo nustatyta, jog maţa miR – 27a – 3p raiška neigiamai koreliavo su onkobaltymo YAP1 raiška. Taip pat išsiaiškinta, jog ši neigiama koreliacija turi įtakos naviko metastazavimui, kadangi YAP1 skatina EMT aktyvuojančių transkripcinių faktorių gamybą [40]. Dėl aktyvuotos epitelinės – mezenchiminės tranzicijos yra prarandamos adhezinės ląstelių savybės, jungtys tarp ląstelių, taip sudarant sąlygas ląstelių invazijai ir atokiųjų metastazių formavimuisi [41].

9.5.2. MiR – 205

Kaip ir daugelis mikroRNR, miR - 205 skirtingų onkologinių ligų atvejais gali funkcionuoti kaip onkogenas arba tumoro supresorius. Tyrimais įrodyta, jog ši pirmoje chromosomoje uţkoduota mikroRNR dalyvauja tiek normalaus, tiek navikinio audinio susidaryme [42,43]. Slopindama ląstelių

15 proliferaciją bei invazines jų savybes, miR - 205 veikia naviką slopinančiai, tačiau pakitus miR - 205 raiškai, ji gali inicijuoti navikinio audinio formavimąsi bei proliferaciją [44].

Daugėja duomenų, jog specifinės mikroRNR gali būti naudojamos kaip bioţymenys onkologinių ligų diagnostikoje bei prognozės vertinime. Prognostinė miR – 205 reikšmė buvo tiriama nesmulkių ląstelių plaučių vėţio atveju [45,46]. Atliktuose tyrimuose buvo nustatyta ţenkliai padidėjusi miR – 205 raiška NSCLC audinyje, lyginant su sveiku. Taip pat buvo stebėta neigiama koreliacija tarp miR – 205 raiškos ir bendrojo išgyvenamumo. OS buvo statistiškai reikšmingai (p < 0,05) didesnis maţos miR – 205 raiškos grupėje [45]. Be to, Jing-Hua Li ir kt., atlikę 16 tyrimų metaanalizę, nustatė, kad miR – 205 diagnostinis NSCLC jautrumas gali siekti 88%, specifiškumas – 78 % [46]. Šie duomenys leidţia pagrįstai manyti, jog ši mikroRNR gali būti naudingas onkologinių ligų bioţymuo tiek diagnostine, tiek prognostine prasme.

MiR – 205 raiškos pokyčiai buvo tyrinėjami ir sergant GKN [47-49]. Vis dėlto, atliktų tyrimų rezultatai buvo kontraversiški. Howard ir kt., tirdami sergančiuosius HNSCC, nustatė padidėjusią miR – 205 raišką, kuri sąlygojo ţenklesnę navikinių ląstelių proliferaciją [47]. Kitų tyrėjų – Childs ir kt. – gauti duomenys buvo prieštaringi. Jie nustatė, jog miR – 205 raiška navikiniame GKN audinyje buvo apie 3 kartus maţesnė, lyginant su sveiku audiniu. Be to, Childs ir kt. duomenimis, maţa miR – 205 raiška buvo siejama su ankstesniu lokaliu HNSCC recidyvavimu [48]. Fletcher ir kt. nustatė, jog miR – 205 yra pakankamai audiniui specifiška mikroRNR. Ištyrus miR – 205 raišką skirtinguose eksperimentinės pelės audiniuose, buvo stebėta didesnė šios mikroRNR ekspresija audiniuose, kurie yra sudaryti iš ar iškloti plokščiuoju epiteliu. Vis dėlto, Fletcher ir kt. nenustatė ţenklaus miR – 205 raiškos skirtumo navikiniame bei sveikame audiniuose [49].

Nuo to laiko, kuomet buvo atrasta mikroRNR, atlikta nemaţai tyrimų, ieškant sąsajų tarp onkologinių susirgimų ir mikroRNR. Šie tyrimai ne tik padėjo geriau suprasti įvairių navikinių ligų patogenezę, bet ir paskatino tolimesnius mikroRNR, kaip potencialių bioţymenų, tyrinėjimus. Vis dėlto, šiai dienai yra atlikta per maţai tyrimų, kad būtų išskirta viena ar kelios mikroRNR, tinkamos taikyti klinikinėje praktikoje diagnozuojant galvos ir kaklo navikus bei prognozuojant ligos eigą.

16

10. TYRIMO METODIKA

Remiantis naujausios literatūros duomenimis, tyrimui buvo atrinktos dvi mikroRNR – miR – 27a – 3p ir miR – 205. Minėtosios mikroRNR buvo tirtos sergant galvos ir kaklo navikais publikuotose uţsienio studijose.

Iš LSMU MA MF Onkologijos instituto audinių banko buvo atrinkti biopsinės medţiagos mėginiai. Specialių reakcijų metu buvo išskirtos mikroRNR, kurių raiška vėliau buvo vertinama atlikus realaus laiko PGR reakciją. Gavus duomenis buvo vertinama mikroRNR raiškų pokyčių įtaka klinikiniam ligos pasireiškimui bei prognozei.

10.1. Tyrimo objektas

Siekiant ištirti minėtų mikroRNR raiškas, tyrimo objektais buvo pasirinkti pacientai, sergantys galvos ir kaklo navikais. Biologinė medţiaga iš LSMU MA MF Onkologijos instituto Audinių banko atrinkta randomizacijos būdu.

10.2. Metodai

10.2.1. RNR ir mikroRNR išskyrimas

Šiame darbe tiriamos mikroRNR buvo išskiriamos iš audinių, naudojant „AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit“ (Qiagen, Vokietija) rinkinį pagal gamintojo rekomendacijas. Šio rinkinio pagalba vienmomentiškai yra išskiriamos genominė DNR ir visuminė RNR kartu su mikroRNR. Pirmiausiai iš paruoštos biologinės medţiagos yra selektyviai išskiriama DNR, vėliau atliekamas RNR bei mikroRNR išskyrimas.

Prieš atliekant RNR bei mikroRNR išskyrimą, paruošiamas darbinis tirpalas. Ţemiau išvardinti jį sudarantys reagentai:

● Buffer FRN – 42 ml izopropanolio; ● Buffer AW1 – 25 ml 96 – 100% etanolio; ● Buffer AW2 – 30 ml 96 – 100% etanolio;

● Buffer RLF Plus – 10 µl β – merkaptoetanolio 1 ml buferio. Įvertinama dėl precipitatų. Jiems susidarius, pašildoma vandens vonelėje;

17 ● DNase I – 550 µl RNase – free vandenyje ištirpinamas liofilizatas;

● Buffer RPE – 44 ml 96 – 100% etanolio.

Pasvėrus ir stabilizavus audinius, atliekamas jų lizavimas ir homogenizacija. Biologinė medţiaga perkeliama į audinių homogenizatorių, į kurį įpilama 600 µl Buffer RLT Plus. Šio buferio pagalba yra inaktyvuojamos DNazės ir RNazės, taip uţtikrinamas nepaţeistų DNR ir RNR išskyrimas. Po hemogenizacijos lizatas yra perkeliamas į AllPrep DNA Mini mėgintuvėlį, esantį 2 ml talpos surinkimo mėgintuvėlyje. Mėgintuvėlis nucentrifuguojamas 30 s maksimaliu apsisukimų kiekiu (maksimaliai 20 000 x g). AllPrep DNA Mini kartu su paruoštu lizatu perkeliamas į naują 2 ml mėgintuvėlį tolimesniam RNR bei mikroRNR skyrimui. Toliau pateikiami RNR ir mikroRNR išskyrimo etapai:

1. Į mėgintuvėlį įpilama 150 µl chloroformo, gauta suspensija gerai išmaišoma ir supipetuojama. Centrifuguojama 4°C temperatūroje 3 min. maksimaliu greičiu (max 20 000 x g). Susidariusi vandeninė fazė perkeliama į naują 2 ml mėgintuvėlį.

2. Į vandeninę fazę įpilama 80 µl Proteinazės K, gerai supipetuojama.

3. Papildomai įpilama 350 µl 96 – 100% etanolio ir gerai supipetuojama. Susidaręs mišinys 10 min. inkubuojamas kambario temperatūroje.

4. Įpilama 750 µl 96 – 100% etanolio ir gerai sumaišoma.

5. Iki 700 µl susidariusio mėginio perkeliama į RNeasy Mini mėgintuvėlį, esantį 2 ml talpos surinkimo mėgintuvėlyje. Mėginys centrifuguojamas 15 s didţiausiu apsisukimų greičiu (max 20 000 x g). Surinkimo mėgintuvėlyje susidaręs skystis išpilamas.

6. Mėginys, likęs RNeasy Mini mėgintuvėlyje, perkeliamas ir pakartotinai centrifuguojamas. Skystis, susidaręs surinkimo mėgintuvėlyje, išpilamas.

7. Į susidariusį mėginį įpilama 500 µl Buffer RPE, 15 s centrifuguojama maksimaliu apsisukimų greičiu (max 20 000 x g). Surinkimo mėgintuvėlyje susidaręs skystis išpilamas.

8. Papildomai įpilama 10 µl DNase I + 70 µl Buffer RDD. Švelniai apverčiant mėgintuvėlį mišinys sumaišomas ir trumpai nucentrifuguojamas.

9. 80 µl DNase I inkubacinio mišinio įpilama ant RNease Mini mėgintuvėlio membranos ir paliekamas 15 min. kambario temperatūroje.

10. Po inkubavimo į mėginį įpilama 500 µl Buffer FRN ir centrifuguojama maksimaliu apsisukimų greičiu (max 20 000 x g) 15 s. RNease Mini mėgintuvėlis perkeliamas į 2 ml talpos surinkimo mėgintuvėlį.

18 11. Praeito ţingsnio metu surinkimo mėgintuvėlyje susidaręs skystis įpilamas į RNease Mini mėgintuvėlį ir mišinys centrifuguojamas 15 s maksimaliu apsisukimų greičiu (max 20 000 x g).

12. Įpilama 500 µl Buffer RPE ir centrifuguojama 15 s anksčiau minėtomis sąlygomis. 13. Mėginys papildomas 500 µl 96 – 100% etanoliu ir centrifuguojamas 2 min. anksčiau

minėtomis sąlygomis. Šio ţingsnio metu praplaunama RNease Mini mėgintuvėlio membrana.

14. RNease Mini mėgintuvėlis perkeliamas į naują 1,5 ml talpos surinkimo mėgintuvėlį. Ant RNease Mini mėgintuvėlio membranos įpilama 50 µl RNase – free vandens. Mėgintuvėlis uţdaromas ir centrifuguojamas 1 min. ≥ 8 000 x g greičiu. Išgryninta RNR gali būti laikoma nuo –15 iki –30°C arba –70°C temperatūroje.

10.2.2. mikroRNR ekspresijos nustatymas realaus laiko PGR būdu

Siekiant ištirti mikroRNR raišką, išskirtos mikroRNR buvo gausinamos ir jų ekspresija vertinta atliekant realaus laiko polimerazės grandininę reakciją. Tuo tikslu buvo naudojamas „TaqMan® Advanced miRNA Assays“ bei „TaqMan® Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit“ (Life Technologies Corporation, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas. Šio rinkinio pagalba išskirtos mikroRNR atvirkštinės transkripcijos būdu yra verčiamos į kopijines DNR (angl. cDNA), kurios PGR pagalba vėliau amplifikuojamos ir analizuojamos.

Pirmiausia, prie išskirtų brandţių mikroRNR 3` galo poli(A) polimerazės pagalba prijungiama poli(A) uodega, sudaryta iš adenozino nukleotidų. Antro etapo metu ligazė prijungia adapterį prie mikroRNR 5` galo. Prie šio adapterio miR-Amp reakcijos metu bus prijungiamas tiesioginis pradmuo. Trečio etapo metu atliekama atvirkštinės transkripcijos reakcija. Prie poli(A) uodegos 3` galo prisijungęs universalus AT pradmuo lemia mikroRNR atvirkštinę transkripciją. Šio etapo galutinis produktas – kopijinė DNR. Ketvirtas etapas yra skirtas padidinti transkribuotos kDNR molekulių kiekį. Pastaba: reakcijoms atlikti reagentai ir jų kiekiai buvo naudojami remiantis gaminio naudojimo instrukcija pagal gamintojo nurodymus [50]. 1 pav. schematiškai pateikta kDNR paruošimo iš išskirtų mikroRNR eiga.

Galiausiai, paruošta kopijinė DNR yra išpilstoma į PGR plokštelę, kuri patalpinama į realaus laiko PGR aparatą. Reakcija vykdoma automatizuotame termocikleryje pagal ţemiau nurodytą programą (1 lentelė).

19 1 pav. Kopijinės DNR paruošimas, naudojant „TaqMan® Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit“.

PAP – poli(A) polimerazė; Lig – ligazė; AT – atvirkštinė transkriptazė; P – DNR polimerazė.

1 lentelė. Termociklerio programos nustatymai, atliekant RL – PGR

Ţingsnis Temperatūra Laikas Ciklų skaičius

Fermento aktyvacija 95°C 20 s 1

Denatūracija 95°C 1 s

40

Ilginimas 60°C 20 s

Kiekvienos mikroRNR raiškos pokyčiai buvo matuojami 3 kartus. Gauti duomenys standartizuoti ir išreikšti santykiniu kiekybiniu įvertinimu (angl. relative quantification).

20 10.2.3. Statistinė duomenų analizė

Statistiniam rezultatų įvertinimui buvo naudota kompiuterinė programa „IBM® SPSS® Statistics 26.0“. Atitinkamiems dydţiams apskaičiuoti buvo pritaikyti χ2

kriterijus bei Pearsano koreliacijos testas. Prognozės įvertinimui buvo naudota Kaplan – Meier formulė. Duomenys laikyti statistiškai reikšmingi, jeigu apskaičiuota p reikšmė buvo maţesnė nei 0,05 (p<0,05)

21

11. REZULTATAI

Iš kiekvieno paciento biologinės medţiagos (navikinio ir sveiko audinio) buvo išskirtos mikroRNR ir nustatytos jų raiškos. MikroRNR ekspresija sveikajame audinyje buvo prilyginta vienetui. Navikinio audinio mikroRNR raiškos buvo lyginamos ir išreikštos santykiniais dydţiais.

Siekiant suskirstyti navikus pagal mikroRNR ekspresijos lygius į didelės ir maţos raiškos, išvestos tirtų mikroRNR medianos. Pacientai, kurių mikroRNR raiškos buvo didesnės negu mediana, buvo priskirti didelės ekspresijos grupei. Priešingai, tiriamieji, kurių mikroRNR raiškos nesiekė medianos, buvo priskirti maţos ekspresijos grupei. 2 lentelėje pateiktos apskaičiuotos mikroRNR raiškų medianos.

2 lentelė. miR-27a-3p ir miR – 205 raiškų medianos tarp tirtų pacientų Mediana

miR-27a-3p 0,692 (intervalas 0,105 iki 8,814)

miR-205 0,751 (intervalas 0,001 iki 72,215)

Iš viso tyrimo metu buvo išanalizuoti 71 paciento klinikiniai duomenys ir ištirtos mikroRNR raiškos. Didţiąją tiriamųjų dalį sudarė vyrai (n=65, atitinkamai 91,5%) ir maţesne dalimi moterys (n=6, atitinkamai 8,5%). Vidutinis tiriamųjų amţius diagnozės nustatymo metu buvo 63,92 ± 10,87 metai. Pacientų pasiskirstymas pagal amţiaus grupes pateiktas 2 pav.

2 pav. Tirtų pacientų pasiskirstymas pagal amžių 0 5 10 15 20 25 30 35 iki 40 40 - 49 50 - 59 60 - 69 70 - 79 80+ P ac ientų sk aičiu s Amţius (metais)

Amţiaus grupės

22 Daugumai tirtų asmenų (71,8%) buvo nustatyta gerklų vėţio diagnozė. 15,5% sudarė pacientai, sergantys gerklaryklės vėţiu. Likę 12,7% atitinka kitų lokalizacijų galvos ir kaklo navikus. 3 ir 4 lentelėse pateikti apibendrinti klinikiniai tirtų galvos ir kaklo navikų duomenys bei statistinis skirtumas ir koreliacija tarp skirtingų raiškų grupių.

3 lentelė. Pacientų klinikinių charakteristikų apibendrinimas, vertinant skirtumus tarp žemos ir aukštos mikroRNR – 27a – 3p ir mikroRNR – 205 raiškų

Kriterijus Tiriamieji (n) miR-27a-3p raiška pa miR-205 raiška pa

Ţema Aukšta Ţema Aukšta

Pirminis navikas T1 – T2 T3 – T4 31 40 18 18 13 22 0,275 16 20 15 20 0,893 Sritiniai limfmazgiai N0 N1 N2 N3 43 9 16 3 25 2 8 1 18 7 8 2 0,220 22 2 11 1 21 7 5 2 0,133 Atokiosios metastazės M0 M1 68 3 35 1 33 2 0,535 35 1 33 2 0,535 Stadija I – II III – IV 27 44 18 18 9 26 0,035* 16 20 11 24 0,259 Diferenciacijos laipsnis G1 G2 G3 G4 9 57 4 1 6 28 1 1 3 29 3 0 0,327 4 30 1 1 5 27 3 0 0,442 Recidyvas Nebuvo Lokalus Sritiniai limfmazgiai Lokalus + sritiniai l/mb 56 11 1 3 29 6 0 1 27 5 1 2 0,599 30 4 0 2 26 7 1 1 0,419

23 3 lentelės tęsinys Kriterijus Tiriamieji (n) miR-27a-3p raiška pa miR-205 raiška pa

Ţema Aukšta Ţema Aukšta

Progresavimas Nestebėtas Atokiosios metastazės 68 3 35 1 33 2 0,535 35 1 3 2 0,535 Mirties faktas Ne Taip 48 23 26 10 22 13 0,399 23 13 25 10 0,497

a – skirtumas tarp ţemos ir aukštos raiškos grupių bei jo patikimumas vertintas taikant χ2 kriterijų

b – sritiniai limfmazgiai * – p < 0,05

Atlikta statistinė analizė neparodė statistiškai reikšmingo ryšio tarp klinikinių ligos išraiškų bei tyrimo metu tirtų mikroRNR raiškos pokyčių. Tiek miR-27a-3p, tiek miR-205 ekspresijos koreliacija su morfologiniais ligos poţymiais buvo silpna arba labai silpna. Vis dėlto, statistiškai reikšminga sąsaja stebėta tarp ligos stadijos ir miR-27a-3p raiškos. Pacientams, kuriems buvo nustatyta paţengusi ligos stadija (III – IV), stebėta silpna, tačiau statistiškai reikšminga koreliacija su mikroRNR-27a-3p raiška (r=0,250, p=0,035).

Įdomu tai, kad tarp tirtų mikroRNR buvo nustatyta stipri teigiama koreliacija (r=0,711, p<0,001). Be to, duomenų analizė parodė ryšį tarp padidėjusios miR-205 raiškos ir gerklų vėţio (r=0,242, p=0,042).

4 lentelė. miR-27a-3p ir miR-205 raiškų koreliacija su klinikiniais duomenimis.a

Kriterijus Tiriamieji (n) miR-27a-3p raiška miR-205 raiška

Ţema Aukšta Ţema Aukšta

Diagnozė C32 C00 – C14 51 20 r = 0,179 p = 0,135 r = 0,242 p = 0,042* Pirminis navikas T1 – T2 T3 – T4 31 40 r = 0,130 p = 0,281 r = 0,016 p = 0,895

24 4 lentelės tęsinys

Kriterijus Tiriamieji (n) miR-27a-3p raiška miR-205 raiška

Ţema Aukšta Ţema Aukšta

Sritiniai limfmazgiai N0 – N1 N2 – N3 52 19 r = 0,040 p = 0,738 r = -0,151 p = 0,210 Atokiosios metastazės M0 M1 68 3 r = 0,073 p = 0,545 r = 0,073 p = 0,545 Stadija I – II III – IV 27 44 r = 0,250 p = 0,035* r = 0,134 p = 0,265 Diferenciacijos laipsnis G1 – G2 G3 – G4 66 5 r = 0,059 p = 0,625 r = 0,059 p = 0,625 Recidyvas Ne Taip 56 15 r = 0,042 p = 0,729 r = 0,111 p = 0,358 a – koreliacijos stiprumas ir statistinis patikimumas apskaičiuotas taikant Pearsano koreliacijos testą

* – p < 0,05

Iki 2021 m. kovo 19 d. 15 pacientų (21,1%) nustatytas ligos recidyvas: 11-ai pacientų liga atsinaujino vietiškai, trims recidyvavo sritiniuose limfmazgiuose, 1-am pacientui ligos recidyvas nustatytas tiek vietiškai, tiek sritiniuose limfmazgiuose. Dar trims pacientams nustatytos atokiosios metastazės. 8 iš minėtų pacientų mirė. Iš viso tyrimo metu patvirtintos 23 mirtys (32,4%).

Apskaičiuota DFS (angl. disease free survival) mediana siekė 22 mėnesius. Siekiant įvertinti tirtų mikroRNR ekspresijos pokyčių įtaką DFS, sudaryti Kaplan – Meier grafikai (3 pav). Vis dėlto, nei miR-27a-3p, nei miR-205 reikšmingai nekoreliavo su DFS (atitinkamai p=0,539 ir p=0,589).

25 3 pav. MiR-27a-3p ir miR-205 raiškos koreliacija su DFS. Rausva spalva – ţemos raiškos grupė,

26

12. REZULTATŲ APTARIMAS

Per kelis dešimtmečius, kuomet buvo atrasta mikroRNR, atlikta šimtai tyrimų ieškant sąsajų tarp mikroRNR raiškos pokyčių bei įvairių ligų eigos ypatumų. Tam tikrų mikroRNR ekspresijos pokyčiai jau yra susieti su atitinkamų ligų eiga bei prognoze, o kai kurioms dar trūksta pakankamai įrodymų. Šio darbo metu buvo atrinktos dvi mikroRNR – miR – 27a – 3p ir miR – 205, siekiant įvertinti jų raišką bei sąsajas su ligos eiga bei prognoze galvos ir kaklo navikų atvejais. Minėtų mikroRNR raiškos pokyčiai apţvelgtoje literatūroje buvo siejami su labiau paţengusia liga bei prastesne jos prognoze.

Tyrimo metu pasirinktos mikroRNR buvo tiriamos tų pačių asmenų sveikame ir navikiniame audiniuose. Viso tyrimo metu buvo ištirti 71 paciento mėginiai. Kiekvienos mikroRNR raiška buvo tiriama tris kartus, gautos reikšmės išreikštos santykiniais dydţiais. MikroRNR ekspresija varijavo nuo 0,001 iki 72,215, tačiau nei mikroRNR-27a-3p, nei mikroRNR-205 medianos neviršijo 1. Tai leidţia daryt išvadą, jog navikiniame audinyje labiau vyravo sumaţėjusi mikroRNR raiška. Vis dėlto, išmatuotos mikroRNR raiškos varijavo plačiame diapozone. Tam įtakos galėjo turėti skirtingų lokalizacijų biologiniai mėginiai. Įdomu tai, kad didesnė miR-205 raiška stebėta navikiniame gerklų vėţio audinyje (r=0,242, p=0,042). Statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp miR-27a-3p ir skirtingų lokalizacijų vėţio nestebėta. Tai leidţia daryti prielaidą, kad miR-205 galėtų būti audiniui specifiška mikroRNR.

Vertinant miR-27a-3p ir miR-205 sąsajas su klinika ir patologija, ryškių skirtumų nebuvo stebėta. Tirtų mikroRNR ekspresija silpnai arba labai silpnai koreliavo su pirminio naviko dydţiu, sritinių limfmazgių įtraukimu, diferenciacijos laipsniu ir recidyvavimo daţniu. Vis dėlto, šie duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi. Stipresnė koreliacija stebėta tik tarp ligos stadijos ir miR-27a-3p raiškos. Tyrimo metu nustatyta, kad statistiškai reikšmingai (r=0,250, p=0,035) didesnė mikroRNR ekspresija stebėta paţengusios ligos (III – IV stadija) atvejais.

Norint įvertinti DFS priklausomumą nuo mikroRNR raiškos, buvo sudarytos Kaplan-Meier kreivės. Kadangi tyrimo metu buvo nustatyta 15 ligos recidyvų, iš kurių 8 pacientai mirė, bei dar 15 mirčių (viso – 23 mirtys), DFS buvo skaičiuojamas nuo gydymo pradţios iki įvykio (recidyvo arba mirties). Apskaičiuota laiko be ligos mediana siekė 22 mėnesius, tačiau statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp miR-27a-3p bei miR-205 raiškų nebuvo stebėta.

Apibendrinant, šio tyrimo metu nebuvo nustatyta reikšmingo ryšio tarp tirtų mikroRNR ir galvos ir kaklo onkologinių susirgimų klinikopatologinių duomenų bei prognozės. Vis dėlto, nustatytos koreliacijos tarp ligos stadijos bei naviko lokalizacijos leidţia daryti išvadą, kad miRNR-27a-3p ir miRNR-205 raiškų pokyčiai gali turėti prognostinės reikšmės. Tiek ir uţsienio mokslininkų

27 atlikti tyrimai, tiek ir šis tyrimas nepagrindţia, kokia mikroRNR raiška – sumaţėjusi ar padidėjusi – vyrauja galvos ir kaklo navikuose. Tai leidţia daryti prielaidą, kad duotuoju momentu šioje srityje yra atlikta per maţai tyrimų ir ištirtos nepakankamos imtys.

28

13. IŠVADOS

1. Ištyrus 71 paciento biologinius mėginius, nustatytas platus miR-27a-3p ir miR-205 ekspresijos lygių diapozonas (nuo 0,001 iki 72,215). Išvestos tirtų mikroRNR medianos nesiekė 1 (atitinkamai 0,692 ir 0,751). Tai leidţia daryti išvadą, jog galvos ir kaklo navikų audinyje vyravo sumaţėjusi minėtų mikroRNR raiška.

2. MikroRNR-27a-3p raiška silpnai arba labai silpnai koreliavo su pirminio naviko dydţiu, sritinių limfmazgių įtraukimu ir kitais klinikiniais duomenimis, tačiau duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi. Vis dėlto, stebėtas statistiškai patikimas ryšys tarp padidėjusios miR-27a-3p raiškos ir paţengusios ligos stadijos.

3. MikroRNR-205 raiška labai silpnai, tačiau statistiškai nereikšmingai koreliavo su klinikopatologiniais duomenimis. Vienintelis statistiškai reikšmingas ryšys, nustatytas tarp miR-205 ir gerklų vėţio.

29

14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Nepaisant tobulėjančios onkologinių ligų diagnostikos, galvos ir kaklo navikai didesnei daliai pacientų yra nustatomi paţengusios ligos stadijose. Siekiant paankstinti šių ligų diagnozavimą bei pagerinti išgyvenamumo prognozę, išlieka naujų diagnostinių priemonių poreikis. Kadangi vis daugėja atliktų tyrimų, kurie įrodo mikroRNR vaidmenį kancerogenezėje, šioms molekulėms turėtų būti skiriamas didelis dėmesys, ieškant ryšio su galvos ir kaklo navikais. 2. Šio tyrimo metu nebuvo pasiekta statistiškai reikšmingų rezultatų, siekiant įrodyti tirtų

mikroRNR raiškos pokyčių ryšį su ligos eiga bei prognoze. Pagrindiniai veiksniai, kurie galėjo turėti įtakos rezultatams – per maţa imtis bei didelė pirminių navikų lokalizacijų įvairovė (iš viso buvo tirti mėginiai iš 13 skirtingų lokalizacijų). Tyrimo metu įrodţius, kad miR-27a-3p raiška koreliavo su ligos stadija, o miR-205 – su gerklų vėţiu, išlieka poreikis tyrimą tęsti, išplėtus tiriamųjų imtį. Tik ištyrus didesnę sergančiųjų galvos ir kaklo navikais populiacijos dalį galima būtų patvirtinti arba paneigti šio tiriamojo darbo metu nustatytas koreliacijas.

30

15. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Chow L. Head and Neck Cancer. New England Journal of Medicine. 2020;382(1):60-72. 2. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global cancer

statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2020.

3. Statistiniai duomenys - Nacionalinis vėţio institutas [Internet]. Nvi.lt. 2020 [cited 1 December 2020]. Available from: https://www.nvi.lt/naujausi-duomenys/

4. Gupta B, Johnson N, Kumar N. Global Epidemiology of Head and Neck Cancers: A Continuing Challenge. Oncology. 2016;91(1):13-23.

5. Beynon R, Lang S, Schimansky S, Penfold C, Waylen A, Thomas S et al. Tobacco smoking and alcohol drinking at diagnosis of head and neck cancer and all-cause mortality: Results from head and neck 5000, a prospective observational cohort of people with head and neck cancer. International Journal of Cancer. 2018;143(5):1114-1127.

6. Hashim D, Genden E, Posner M, Hashibe M, Boffetta P. Head and neck cancer prevention: from primary prevention to impact of clinicians on reducing burden. Annals of Oncology. 2019;30(5):744-756.

7. Cohen E, Bell R, Bifulco C, Burtness B, Gillison M, Harrington K et al. The Society for Immunotherapy of Cancer consensus statement on immunotherapy for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC). Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 2019;7(1).

8. Kobayashi K, Hisamatsu K, Suzui N, Hara A, Tomita H, Miyazaki T. A Review of HPV-Related Head and Neck Cancer. Journal of Clinical Medicine. 2018;7(9):241.

9. Morales, S., Monzo, M. and Navarro, A., Epigenetic regulation mechanisms of microRNA expression. Biomolecular Concepts, 2017;8(5-6):203-212.

10. Vishnoi A, Rani S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 2016;:1-10.

11. Matsuyama H, Suzuki H. Systems and Synthetic microRNA Biology: From Biogenesis to Disease Pathogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 2019;21(1):132.

12. Kozomara A, Birgaoanu M, Griffiths-Jones S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 2018;47(D1):D155-D162.

13. Pong S, Gullerova M. Noncanonical functions of micro RNA pathway enzymes – Drosha, DGCR 8, Dicer and Ago proteins. FEBS Letters. 2018;592(17):2973-2986.

31 14. Wang Z, Liu Y. Predicting Functional MicroRNA-mRNA Interactions. Methods in Molecular

Biology. 2017;:117-126.

15. Bhattacharyya M, Nath J, Bandyopadhyay S. Identifying significant microRNA–mRNA pairs associated with breast cancer subtypes. Molecular Biology Reports. 2016;43(7):591-599. 16. Markopoulos G, Roupakia E, Tokamani M, Chavdoula E, Hatziapostolou M, Polytarchou C et

al. A step-by-step microRNA guide to cancer development and metastasis. Cellular Oncology. 2017;40(4):303-339.

17. Haschek W, Haschek W. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier/AP; 2013.

18. Pon J, Marra M. Driver and Passenger Mutations in Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 2015;10(1):25-50.

19. Wang L, Wu C, Rajasekaran N, Shin Y. Loss of Tumor Suppressor Gene Function in Human Cancer: An Overview. Cellular Physiology and Biochemistry. 2018;51(6):2647-2693.

20. Kavitha N, Vijayarathna S, Jothy S, Oon C, Chen Y, Kanwar J et al. MicroRNAs: Biogenesis, Roles for Carcinogenesis and as Potential Biomarkers for Cancer Diagnosis and Prognosis. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 2014;15(18):7489-7497.

21. Lin S, Gregory R. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 2015;15(6):321-333.

22. Svoronos A, Engelman D, Slack F. OncomiR or Tumor Suppressor? The Duplicity of MicroRNAs in Cancer. Cancer Research. 2016;76(13):3666-3670.

23. Sandhu R, Rivenbark A, Mackler R, Livasy C, Coleman W. Dysregulation of microRNA expression drives aberrant DNA hypermethylation in basal-like breast cancer. International Journal of Oncology. 2013;44(2):563-572.

24. Peng Y, Croce C. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2016;1(1).

25. Palmero E, Campos S, Campos M, Souza N, Guerreiro I, Carvalho A et al. Mechanisms and role of microRNA deregulation in cancer onset and progression. Genetics and Molecular Biology. 2011;34(3):363-370.

26. Croce C. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 2009;10(10):704-714.

27. Iorio M, Croce C. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Molecular Medicine. 2012;4(3):143-159.

28. Concepcion C, Bonetti C, Ventura A. The MicroRNA-17-92 Family of MicroRNA Clusters in Development and Disease. The Cancer Journal. 2012;18(3):262-267.

32 29. Ota A, Tagawa H, Karnan S, Tsuzuki S, Karpas A, Kira S et al. Identification and Characterization of a Novel Gene, C13orf25, as a Target for 13q31-q32 Amplification in Malignant Lymphoma. Cancer Research. 2004;64(9):3087-3095.

30. Mu P, Han Y, Betel D, Yao E, Squatrito M, Ogrodowski P et al. Genetic dissection of the miR-17 92 cluster of microRNAs in Myc-induced B-cell lymphomas. Genes & Development. 2009;23(24):2806-2811.

31. Suzuki H, Maruyama R, Yamamoto E, Kai M. DNA methylation and microRNA dysregulation in cancer. Molecular Oncology. 2012;6(6):567-578.

32. Serman A, Vlahović M, Serman L, Bulić-Jakus F. DNA methylation as a regulatory mechanism for gene expression in mammals. Coll Antropol. 2006 Sep;30(3):665-71.

33. Wang F, Ma Y, Wang H, Qin H. Reciprocal regulation between microRNAs and epigenetic machinery in colorectal cancer. Oncology Letters. 2017;13(3):1048-1057.

34. Ali Syeda Z, Langden S, Munkhzul C, Lee M, Song S. Regulatory Mechanism of MicroRNA Expression in Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2020;21(5):1723.

35. Harada K, Baba Y, Ishimoto T, Kosumi K, Tokunaga R, Izumi D et al. Suppressor microRNA-145 Is Epigenetically Regulated by Promoter Hypermethylation in Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Anticancer Res. 2015 Sep;35(9):4617-24.

36. Li X, Xu M, Ding L, Tang J. MiR-27a: A Novel Biomarker and Potential Therapeutic Target in Tumors. Journal of Cancer. 2019;10(12):2836-2848.

37. Zhang J, Cao Z, Yang G, You L, Zhang T, Zhao Y. MicroRNA-27a (miR-27a) in Solid Tumors: A Review Based on Mechanisms and Clinical Observations. Frontiers in Oncology. 2019;9:893.

38. Li L, Luo Z. Dysregulated miR-27a-3p promotes nasopharyngeal carcinoma cell proliferation and migration by targeting Mapk10. Oncology Reports. 2017;37(5):2679-2687.

39. Zeng G, Xun W, Wei K, Yang Y, Shen H. MicroRNA-27a-3p regulates epithelial to mesenchymal transition via targeting YAP1 in oral squamous cell carcinoma cells. Oncology Reports. 2016;36(3):1475-1482.

40. Abylkassov R, Xie Y. Role of Yes-associated protein in cancer: An update. Oncology Letters. 2016;12(4):2277-2282.

41. Guttilla Reed I. Mechanism and regulation of epithelial-mesenchymal transition in cancer. Cell Health and Cytoskeleton. 2015;7:155-166.

42. Nordby Y, Richardsen E, Ness N, Donnem T, Patel H, Busund L et al. High miR-205 expression in normal epithelium is associated with biochemical failure - an argument for epithelial crosstalk in prostate cancer?. Scientific Reports. 2017;7(1).

33 43. Xiao Y, Humphries B, Yang C, Wang Z. MiR-205 Dysregulations in Breast Cancer: The

Complexity and Opportunities. Non-Coding RNA. 2019;5(4):53.

44. Qin A, Zhang X, Liu L, Yu J, Li H, Emily Wang S et al. MiR-205 in cancer: An angel or a devil?. European Journal of Cell Biology. 2013;92(2):54-60.

45. Duan B, Guo T, Sun H, Cai R, Rui Q, Xi Z. miR-205 as a biological marker in non-small cell lung cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2017;91:823-830.

46. Li J, Sun S, Li N, Lv P, Xie S, Wang P. MiR-205 as a promising biomarker in the diagnosis and prognosis of lung cancer. Oncotarget. 2017;8(54):91938-91949.

47. Howard JD, Cheng H, Perez J, Ratner E, Fertig EJ, Considine M et al. miRNA array analysis determines miR-205 is overexpressed in head and neck squamous cell carcinoma and enhances cellular proliferation. Journal of Cancer Research & Therapy. 2013;1(6):153-162.

48. Childs G, Fazzari M, Kung G, Kawachi N, Brandwein-Gensler M, McLemore M et al. Low-Level Expression of MicroRNAs let-7d and miR-205 Are Prognostic Markers of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. The American Journal of Pathology. 2009;174(3):736-745. 49. Fletcher A, Heaford A, Trask D. Detection of Metastatic Head and Neck Squamous Cell

Carcinoma Using the Relative Expression of Tissue-Specific Mir-205. Translational Oncology. 2008;1(4):202-208.

50. TaqMan Advanced miRNA Assays Quick Reference [Internet]. 2016 [cited 14 March 2021].

Available from:

https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/LSG/manuals/100027898_TaqManAdv_miRNA_Assays_QR.pdf?_ga=2.140959803.80 8236951.1618395194-982640616.1618395194