LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARINĖS MEDICINOS PROGRAMA
VIENTISOSIOS STUDIJOS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKA
Motiejus Pocys
KRAUJO BETAHIDROKSIBUTIRATŲ KONCENTRACIJOS ĮTAKA SOMATINIŲ LĄSTELIŲ KONCENTRACIJAI KARVIŲ PIENE.
EFFECT OF BLOOD BETAHYDROXYBUTYRATE CONCENTRATION ON SOMATIC CELL CONCENTRATION IN COW'S MILK.
Veterinarijos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Mindaugas Televičius
DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kraujo betahidroksibutiratų koncentracijos įtaka somatinių ląstelių koncentracijai karvių piene“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 4 ĮVADAS ... 7 1.LITERATŪROS APŽVALGA... 8 1.1.Somatinės ląstelės ... 8
1.1.1.Tešmens ginybinis mechanizmas ... 8
1.1.2.Faktoriai įtakojantys somatinių ląstelių skaičių ... 8
1.2.Mastitas ... 9
1.2.1.Subklinikinio mastito aptikimas ... 10
1.2.2.Kalifornijos mastito testas ... 10
1.3.Tiesioginiai SLS matavimo metodai ... 10
1.4.SLS reikšmė ... 11
1.5.Pieno mėginių ėmimas ... 11
1.6.Ketozė ... 11
1.6.1.Kepenų lipidozė ... 12
1.7.Ketozės diagnostika ... 13
1.7.1.Enzimu katalazės metodas ... 13
1.7.2.Greitasis šlapimo testas ... 14
1.7.3.Greistasis pieno testas ... 14
1.7.4.Greitasis kraujo testas ... 14
1.7.5.Pieno riebalai ir baltymai ... 14
1.8.Hiperketonemijos poveikis tešmens sveikatingumui ... 14
2.TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 16
2.1.Kraujo BHB koncentracijos matavimas ... 16
2.2.Pieno SLS matavimas ... 17
3.REZULTATAI ... 18
3.1.Sergamumas mastitu ... 18
3.2.Somatnių ląstelių skaičiaus kitimas ... 20
4.REZULTATŲ APTARIMAS ... 23
IŠVADOS ... 24
REKOMENDACIJOS ... 25
SANTRAUKA
Darbo tikslas buvo įvertinti kraujo BHB koncentracijos įtaką somatinių ląstelių koncentracijai karvių piene. Tyrimui iš bandos buvo atrinktos antros ar vėlenės laktacijos, Lietuvos juodmargių ir holšteinų veislės mišrūnės, panašaus įmitimo (2,5-3 balų), praeitą laktaciją davusios panašų kiekį pieno, šviežiapienės karvės n=40. Iš atrinktų karvių buvo sudaryto dvi tiriamos grupės: viena, sveikų karvių grupė, kurioje BHB < 1,2 mmol/l ir kita, subklinikine ketoze sergančių karvių grupė, kurioje BHB > 1,2 mmol/l. Abiem grupėm SLS ir BHB buvo matuota 14 ir 28 d.. Kraujo BHB buvo matuotas, naudojant gliuko/ ketometrą. SLS duomenys buvo paimti iš bandos valdymo programos. Gauti rezultatai parodė, kad didejant BHB kiekiui, didėja ir SLS kiekis. Tarp šių požymių pastebėta stipri teigiama korealiacija. Taip pat, esant padidėjusiam BHB kiekiui (≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l), 3-2,5 kartus padaugėja mastito atvejų skaičius ir SLS vidurkis išauga 2,11 – 2,04 karto, nei BHB esant fiziologinėse normos ribose (<1,2mmol/l).
SUMMARY
The aim of this study was to find out how betahydroksibutyrates concentration in blood could affect somatic cell count in the milk. Cows were selected with following the criteria: second or more parity, same breed, similar body condition (2,5-3), similar milk yield, early lactation. Two groups of animals were formed: one – healthy group of cows with BHB concentration lower than 1,2 mmol/l, and second – group of cow that had BHB concentrations in blood greater than 1,2 mmol/l. SLS and BHB was measured for both groups at the 14 and 28 d.. BHB was measured using gliuko/ ketometer. Information about SCC was taken from herd management program. It was noticed that greater BHB concentrations mean greater concentrations of somatic cell count in milk. There was strong positive correlation between BHB and SCC. When BHB was larger than normal (≥ 1,2 mmol/l < 3 mmol/l), 3-2,5 times more cases of mastitis was noticed and 2,11-2,04 times higher SLS average was, compared to group of cow with normal levels of BHB in blood (<1,2 mmol/l).
SANTRUMPOS
BHB betahidroksibutiratai mmol/l milimoliai litre ml mililitrai
SLS somatinių ląstelių skaičius ląst./ml ląstelės mililitre
p.p. po apsiveršiavimo
NEB neigiamas energijos balansas NRR neestrifikuotos riebalų rūgštys LDH laktato dehidrogenazė
ĮVADAS
Pieninių galvijų ūkiuose, mastitas yra vienas iš dažniausiai pasitaikančių ir daugiausiai ekonominių nuostolių sukeliančių susirgimų. Jo metu pieno liaukoje kyla uždegiminis prcesas, bei padidėja somatinių ląstelių skaičiaus (SLS) koncentracija piene (1). Didėjant SLS, mažėja primelžiamo pieno kiekis ir yra neigiamai veikiama pieno sudėtis, todėl yra svarbu nuolat stebėti ir vertinti SLS (4,5). Didelės somatinių ląstelių koncentracijos piene gali įtakoti pieno produktų, gaminamų iš pieno, kokybę. Dėl aukštos somatinių ląstelių koncentracijos sumažėja laktozės kiekis piene, o tai nulemia pavėluotą galutinių produktų surūgštėjimą, reikalingą sudaryti nepalankias sąlygas daugintis
mikroorganizmams. Taip didelės SLS koncentracijos yra susijusios su didelėmis bakterijų
koncentracijomis, kas gali kelti pavojų vartotojams. Be to, aukšta SLS koncentracija piene neigiamai veikia baltymų ir riebalų kiekį, todėl sutrinka technologiniai pieno produktų gamybos procesai (3).
Nustatyta, kad padidėjęs SLS kiekis ir mastitas yra dažniau pastebimas pas gyvūnus, kuriems pasireiškė ketozė, nei pas tuos, kurių betahidroksibitiratų (BHB) koncentracija kraujyje yra
fiziologinės normos ribose (4). Ketoze yra laikoma gyvūno būklė, kai BHB koncentracija organizme yra padidėjusi. Ši būklė neigiamai veikia gyvūno organizmą. Jos metu padidėja ne tik mastito, bet ir šliužo dislokacijos, bei metrito rizika. Taip pat gali sumažėti pieno produkcijos kiekis (6).
Darbo tikslas: įvertinti kraujo BHB koncentracijos įtaką, somatinių ląstelių koncentracijai karvių piene.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti padidėjusios kraujo BHB koncentracijos poveikį karvių tešmens sveikatingumui.
2. Tiriamosioms karvėms ištirti BHB kiekį kraujyje, SLS kiekį piene, susisteminti gautus rezultatus.
1.LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.Somatinės ląstelės
Pieno somatinės ląstelės susideda iš 15 proc. neutrofilų (arba polimormofonuklearinių neutrofilų), 25 proc. limfocitų, 60 proc. makrofagų. Karvei susirgus mastitu, SLS piene labai smarkiai padidėja (7, 8). Baltųjų kraujo ląstelių funkcija yra kovoti su infekcija ir padėti atstatyti pažeistą audinį. Pieno liaukoje, infekcijos metu, somatinių ląstelių skaičius labiausiai išauga dėl neutrofilų antplūdžio į peną (9)
Priklausomai nuo laktacijos ciklo stadijos, sveikos karvės piene gali būti mažiau nei 100 000 ląst./ml somatonių ląstelių. Kilus uždegiminiam procesui – ląstelių skaičius gali išaugti daugiau kaip 1000 000 ląst./ml (10).
1.1.1.Tešmens ginybinis mechanizmas
Be minėtų imuninės sistemos ląstelių, taip pat yra svarbūs ir tešmens epiteliocitai. Jie ne tik atlieka patogenų stebėjimo ir atpažinimo funkcijas, bet ir esant infekcijai, gali fagocituoti svetimas ląsteles, bei į uždegimo vietą išskirti uždegimo mediatorius, tokius kaip citokinai, chemokinai, beta-defensinai – medžiagas, kurios pritraukia imuninės sistemos ląsteles į uždegimo vietą (9). Nusilpus gyvūno imuninei sistemai ar esant stipriai infekcijai, gali įvykti ir atvirkštinis procesas – patogenai ir jų toksinai iš tešmens gali patekti į kraujotaką ir sukelti septicemiją ar enterotoksemiją (11).
Nedidelis kiekis somatinių ląstelių yra nuolat randamas sveikame tešmenyje. Taip yra laiku atpažįstami naujai į tešmenį patekę patogenai, todėl imuninis atsakas sukeliamas greitai ir efektyvai (9). Uždegimo metu, daugiausiai randama neutrofilų (7).
1.1.2.Faktoriai įtakojantys somatinių ląstelių skaičių
Somatinių ląstelių skaičių piene gali įtakoti daugybė faktorių. Geriausiai žinomi faktoriai yra: gyvūno sveikatos būklė, amžius, veislė, sezoniškumas, laktacijos faze, stresas, laikas po melžimo. Svarbu nepamiršti, kad netitnkamas gyvūnų transportavimas, fiksavimas, pervedimas, netinkamas melžimo įrangos naudojimas ar kiti, stresą gyvuliui sukeliantys veiksniai, irgi neigiamai įtakos SLS piene (12).
Veršiavimosi metu, piene SLS gali siekti 1000 000 ląst./ml, bet sumažeja iki 100 000 ląst./ml praėjus 7-10 dienų po veršiavimosi. Didelis SLS skaičius krekenyse yra siejamas su epiteliocitų
deskvamatizacija ir mažu pieno kiekiu, dėl neatsistačiusio pieno liaukos pajėgumo po ilgo ramybės periodo. (9).
Amžius - Senesnių karvių piene SLS yra didesnis. Tai siejama su tuo, kad senesni gyvuliai yra imlesni infekcijoms (9).
Nepastebima patikimo ryšio tarp karvės pieno produkcijos ir SLS kiekių didėjimo. Tai būtų galima paaiškinti tuo, kad didėjantis SLS kiekis yra atskiedžiamas didėjančiu pieno kiekiu (13). Tačiau, nors ir pastebimas SLS augimas, didėjant veršiavimųsi skaičiui, ryšys tarp šių rodiklių nėra patikimas (13).
Patikimas ryšys yra tarp sezoniškumo ir SLS (13,14). SLS yra didesnis pavasarį ir vasarą, nei žiemą ir rudenį (15). SLS padidėjimas vasarą ir pavasarį yra susijęs su tuo, kad esant šiltai temperatūrai lengviau dauginasi infekciją sukeliančios bakterijos (15,16). Be to, vasarą SLS smarkiai padidėja dėl gyvūnų patiriamo karščio streso (17). Pavasarį ir rudenį SLS gali padidėti dėl didesnio drėgmės ir purvo kiekio, nes sunkiau užtikrinti spenių švarą ir daugiau mikrooganizmų pereina per spenio kanalą.Tai labiau aktualu lauke laikomomų karvių augintojams. (13).
SLS gali priklausyti nuo bandos dydžio. Dėl to, ūkyje didėjant gyvulių skaičiui, reikia daugiau dėmesio skirti gyvulių tešmens priežiūrai, bei gyvūnų sveikatingumui ir bendrai švarai užtikrinti (15).
1.2.Mastitas
Tai yra pieno liaukos parenchimos uždegimas, kuris gali sukelti pataloginius jos pasikeitimus. Mastitas atpažįstamas pagal fizinius, cheminius ir bakteriologinius pokyčius piene (18). Tai viena iš ligų kuri galvijų augintojams sukelia labai didelius ekonominius nuostolius, dėl sumažėjusios pieno produkcijos, suprastėjusios pieno kokybės ir netinkamumo vartoti, sunaikinamo pieno (18). Nuostolius padidina ir padidėjusios vaistų sąnaudos, išlaidos dėl papildomo darbo, bei gyvūnų gaišimas sunkiais mastito atvejais (19).
Mastitas klasifikuojamas į klinikinį ir subklinikinį. Klinikiniu mastitu laikoma, kai yra matomi pieno pasikeitimai: krešulių formavimasis, konsistencijos pasikeitimas, pūlių ar kraujo priemaišų atsiradimas (18). Klinikinio mastito simtomai gali būti: tešmens temperatūros pakilimas, rausvumas, tynimas, skausmingumas, audinio spalvos ir išvaizdos kitimas (20).
Subklinikiniu mastitu sergančios karvės gali nerodyti jokių ligos požymių, tačiau jos gali būti užsikrėtusios pavojingais mikroorganizmais. Tokia karvė bus pavojingų patogenų šaltinis bandoje ir platins sukelėjus kitom karvėms, kurios taip pat susirgs subklinikine ar netgi klinikine ligos forma (2).
1.2.1.Subklinikinio mastito aptikimas
Subklinikinio mastito metu padidėja SLS, todėl tai galima pritaikyti subklinikinio mastito aptikimui bandoje. Vienas pagrindinių SLS nustatymo metodų „lauko sąlygomis“ yra kalifornijos mastito testas (2). Be šio metodo, mastitą yra patogu diagnozuoti pagal pieno elektrinį laidumą. Šis metodas yra naudojamas ūkiuose, kuriuose pieno linijose yra įtaisyti davikliai, kurie melžimo metu nuolat matuoja, piene esančių natrio, kalio, kalcio, magnio bei chloro jonų koncentracijas (21). Elektrinio laidumo testas yra pagrįstas tuo, kad mastito metu padaugėja mineralinių druskų. Daugėjant mineralinių druskų, daugėja ir piene ištirpusių mineralinių druskų jonų, todėl didėja ir pieno elektrinis laidumas. Šio testo jautrumas nėra didelis, juo teisingai diagnuzuojama tik apie 50 proc. atvejų, todėl geriau šį metodą naudoti su kitomis diagnostinėmis priemonėmis (22).
Viena tokių priemonių galėtų būti specifinio biožymens – laktato dehydrogenazės (LDH) aptikimas, melžimo linijose įtaisytais davikliais. Šios medžiagos padaugėja piene, kilus pieno liaukos uždegimui. Šį biožymenį galima matuoti ne tik piene, bet ir kraujyje. Nustatyta patikima, stipri, teigiama koreliacija tarp kraujo serumo LDH ir pieno SLS. Todėl galima teigti, kad esant aukštai LDH koncentracijai – bus aukšta ir pieno SLS koncentracija (23)
1.2.2.Kalifornijos mastito testas
Tai yra lengvas, greitas ir pigus SLS nustatymo piene metodas. Kalifornijos mastito testo veikimo principas yra pagrįstas tuo, kad reagentas – 3 proc. natrio laurilsulfatas, ir paveiktų ląstelių DNA, tarpusavio sąveikoje, formuoja klampią masę. Nors testas yra labai paprastas, tačiau dažnai pasitaiko atlikimo klaidų, dėl to šio testo patikimumas ir panaudos galimybės gali sumažėti. Šviežiapienių karvių testo rezultatus sunku interpretuoti. Nereiktų naudoti testo ankščiau kaip 4 dienos po veršiavimosi. Testas yra efektyvus nustatant infekcijos paveiktą ketvirtį, bei vertinant karves gydymo nuo mastito veiksmingumą (24).
1.3.Tiesioginiai SLS matavimo metodai
Tiesioginiai SLS matavimo metodai yra tikslesni, tačiau brangesni ir nevisada prieinami darbinėje aplinkoje. Jei reikia ištirti SLS dideliame kiekyje pieno mėginių – geriau juos siūsti į labaratoriją, kur mėginių ištyrimui naudojami aukšto pajėgumo ląstelių skaičiuotuvai, veikiantys tėkmės citometrijos principu. Šiuo metodu galima tiksliai diferencijuoti ląsteles ir išsiaiškinti, kurių tiksliai ląstelių padaigėjo, todėl mastito diagnostika yra žymiai tikslesnė, nei matuojant bendrą SLS kiekį (25)
Ūkiuose gali būti įsigyjami pakankamai tikslūs SLS matavimo prietaisai, kaip Porta SCC ar DeLaval ląstelių skaičiuotuvas (26).
1.4.SLS reikšmė
Piene, paimtame iš visiškai sveiko tešmens ketvirčio SLS tūrėtų būti apie 10 000 ląst./ ml, tačiau šis skaičius gali didėti dėl amžiaus, vėlesnėje laktacijoje, rujos metu, dėl karčio streso ar kitų priežasčių. Jei SLS padidėja virš 100 000 ląst./ml ribos, tai gali reikšti infekcijos pradžią, tačiau tiksli diagnozė nustatoma mikrobiologinių tyrimų metu (27). Optimalus jautrumas (73 proc.) ir specifiškumas (86 proc.), vertinant SLS yra laikant, kad intramaminė infekcija prasideda nuo 200 000 ląst./ml ribos (28).
1.5.Pieno mėginių ėmimas
Pieno mėginiai, SLS matavimui, tūrėtų būti imami tuojau pat prieš melžimą, prieš tai išmelžus 3 čiurkšles pieno. Dėl to, kad SLS gali kist, priklausomai nuo daugelio faktorių, mėginius reiktų imti ir vertinti keletą kartų.(28).
1.6.Ketozė
Dažniausiai pasireiškia karvėms ankstyvosios laktacijos periode. Ketozės metu kraujyje, šlapime, piene padaugėja ketoninių kūnų (29). Ketoniniais kūnais laikome betahidroksibutiratą (70 proc.), acetoacetatą (28 proc.) ir acetoną (2 proc). Ketoniniai kūnai lengvai pereina per ląstelės membrane ir suteikia energiją badavimo metu. Ketozė išsivysto, kai kepenys nebepajėgia efektyviai vykdyti metabolizmo, dėl išaugusios gliukoneogenezės poreikio, atsiradusio neigiamo energijos balanso metu. Neigiamu energijos balansu laikome gyvūno būklę, kai organizmas sunaudoja daugiau energijos, nei gauna su maistu. Oksaloacetato rezervas yra vienas iš pagrindinių faktorių, nulemenčių gliukoneogenezės pajėgumą kepenyse, nes jam išsekus, riebalų rūgštys nėra pilnai oksiduojamos ir yra verčiamos į ketoninius kūnus, kurie patenka į kraujotaką. Ketonų skaičius didėja ne tik kraujyje, bet ir piene, seilėse, šlapime ir t.t. (30).
Po veršiavimosi sparčiai kylanti pieno produkcija sukelia energijos deficitą, nes gyvulys nepajėgia suvartoti pakankamai pašaro, kad patenkintų savo metabolinius poreikius (31). Neigiamas energijos balansas stimuliuoja hormonams jautrios lipazės sekreciją – taip sukeliant lipolizę, kurios metu į kraują iš riebalinio audinio atleidžiamos neesterifikuotos riebalų rūgštys (NRR). Šis biocheminis procesas vadinamas lipidų mobilizacija (32). To pasekoje, organizmo riebalų atsargos yra sparčiai skaidomos ir neesterizuotų riebalų rūgščių forma patenka į kraujotaką ir iš ten į kepenis. Jei NRR nėra pilnai
kepenys nepajėgia pilnai oksiduoti NRR. Dėl to tik dalį jų panaudoja gliukoneogenezei ir gliukozės produkcijai, dalį pasilieka sandeliuoti savo ląstelėse triacylglicerolio pavidalu ir dalį, pavertus į ketoninius kūnus, grąžina į kraujotaką. Kartojantis šiam procesui didėja ketonų produkcija ir riebalų atsidėjimas kepenyse, ko pasekoje išsivysto sunkūs metaboliniai susirgimai, turintys neigiamą įtaką gyvūno produktyvumui ir sveikatai (30). Dažniausiai karvių organizme randamas ketoninis kūnas yra BHB, dėl to BHB ir NRR yra pagrindiniai biožymenys, vertinant lipidų mobilizaciją (34).
Klinikine ketoze dažniausiai suserga per pirmas 6-8 savaites po veršiavimosi ir pasireiškia ryškūs simtomai, tokie kaip: anoreksia, išliesėjimas, kietos ir sausos išmatos, primilžio sumažėjimas ar net aklumas (35). Klinikinės ketozės metu, gliukozės koncentracija kraujyje, gali sumažėti iki ribos, kai energijos nebeužtenka nervų sistemos ir smegenų veiklai, todėl gyvulys eidamas gali klūpčioti, svyruoti, ar rodyti kitus centrinės nervų sistemos disfunkcijos požymius. Be to, ketoze sergančių karvių piene padaugėja riebalų, dėl padidėjusio riebalų rūgščių ir BHB kiekio. Dažnai sergančios karvės neturi apetito, dėl ko jų būklė tik dar sparčiau blogėja. Sumažaėjus primilžiui, sumažeja ir energijos poreikis, todėl gyvūno būklė gerėja (36). Dėl ryškių simtomų klinikinės ketozės diagnostika gali būti atliekama greitai ir tiksliai.
Subklinikinė ketozė priimta laikyti kai padidėja ketoninių kūnų skaičius virš normos (1,2 mmol/l), bet nepasireiškia klinikiniai simtomai. Dėl gaunamo nepakankamo energijos kiekio, rizika susirgti subklinikine ketoze labiausiai išauga per pirmus du mėnesius po veršiavimosi (37). Subklinikinė ketozė sukelia daugiau ekonominių nuostolių, nei klinikinės ketozė. Kadangi nėra jokių simtomų subklinikinė ketozė yra rečiau pastebima, gyvulys gali sirgti keliomis ligomis ir likti ilgai negydomas (37).
Pastebimas ryšys tarp klinikinės ketozės ir tokių ligų kaip metritas, šliužo dislokacija, mastitas. Subklinikinė ketozė asocijuojama su sumažėjusiu pieno primilžiu, padidėjusia rizika susirgti klinikine ketoze, metritu. Be to, subklinikinės ketozės metu padidėja rizika susidaryti kiaušidžių cistoms, bei gali suprastėti gyvulio reprodukcinė būklė. Dėl visų, minėtų, susirgimų gyvūnas netenka ekonominės vertės ir gali būti brokuojamas iš bandos (30).
1.6.1.Kepenų lipidozė
Produktyvios karvės organizme, norint užtikrinti pieno gamybą, reikalingi dideli gliukozės kiekiai. Gliukozės tiekimas labai priklauso nuo jos gamybos efektyvumo kepenyse. Padidėjęs riebalų kiekis kepenyse gali sumažinti gliukozės gamybos pajėgumą (38).
Kepenų lipidozė apibūdinama kaip riebalų, daugiausiai tryacylglicerolio, kaupimasis kepenyse. Tai yra vienas iš svarbiausių metabolinių susirgimų, aukšto produktyvumo karvėms, anstyvojoje laktacijoje (39). Nutukusioms karvėms, veršingumo pabaigoje ir po veršiavimosi, suvartojamo pašaro kiekis yra ženkliai mažesnis, nei normalaus sudėjimo karvėms, todėl ankstyvojoje laktacijoje, nutukusių karvių, neigiamas energijos balansas yra didesnis. Dėl to sukeliama lipolizė ir didėja kepenų lipidozės rizika (40).
Normaliomis sąlygomis, tryacylglicerolis yra sekretuojamas iš kepenų, mobilizavus jį kaip labai mažo tankio lipoproteiną. Tolesnis lipidų kaupimasis kepenyse neigiamo energijos balanso metu gali sutrikdyti tryacylglicerolio mobilizaciją ir dar labiau pagreitinti kepenų suriebbėjimo procesą.
Pernelyg didelės tryacylglicerolio ar kitų lipidų metabolitų sankaupos hepatuocituose gali fiziškai žaloti ląstelės organeles, sukeliant jų kompresiją (41). Gausus lipidų atsidėjimas kepenyse sutrikdo mitochondrijų funkciją, energijos apykaitą, ląstelinių signalų transdukciją (42). Tolesnė lipidu akumuliacija sukelia per daug didelius reaktyvaus deguonies gamybos kiekius. Aukšti reaktyvaus deguonies kiekiai sukelia: lipidų peroksidaciją, baltymų, nukleo rūgščių struktūros pakitimus, dėl ko pažeidžiamas ląstelių membranų vientisumas, pažeidiamos ląstelės ir jų organelės, sukeliama apoptozė. (43)
1.7.Ketozės diagnostika
Geriausia ketoze diagnozuoti iš kraujo BHB, nes kraujyje šis ketoninis kūnas stabilesnis nei acetonas ar acetoacetatas. Laikoma, kad karvei yra subklinikinė ketozė, kai kraujo BHB siekia arba viršyja 1,2 mmol/l (37). Kai kurie kiti šaltiniai subklinikine ketoze laiko kai kraujo BHB koncentracija siekia arba viršija 1,4 mmol/l koncentracijos ribą (44). Tačiau, pasirenkama koncentracijos riba neturi reikšmingos įtakos, interpretuojant rezultatus. Klinikinė ketozės forma pasireiškia kai BHB koncentracija kraujyje yra ženkliai padidėjusi – siekia arba višyja 3,0 mmol/l koncentracijos ribą (45).
1.7.1.Enzimu katalazės metodas
Testo rinkinyje yra ultravioletinių spindulių spektrofotometras ar biocheminis analizatorius, kuris gali būti naudojamas nustatyti kraujo serumo BHB vertes žmonėms ar gyvūnams (37).
1.7.2.Greitasis šlapimo testas
Šlapimas gali būti tiriamas, norint diagnozuoti ketozę. Tačiau šlapimo mėginių ėmimas yra žymiai sunkesnis nei pieno ar kitų mėginių. Šlapimo acetoacetatas gali būti kiekybiškai įvertintas su nitroprusido juostelėmis. Šis testas yra jautrus, tačiau nėra specifiškas/tikslus. (45).
1.7.3.Greistasis pieno testas
Pieno mėginiai gaunami lengviau nei šlapimo – nereikia specialiai laukti, kol gyvūnas pasituštins, todėl galime būti tikri, kad pavyks ištirti visas karves. Visgi, šie testai nėra tokie jautrūs kaip šlapimo testai. Šiuo metodu naudojame nitroprusido miltelius acetoacetato kiekiui piene ištirti (45).
1.7.4.Greitasis kraujo testas
Ūkiuose naudojamas kraujo BHB koncentracijos nustatymo prietaisas, kuris orginaliai buvo skirtas diabetu sergantiems žmonėms. Gliukometro/ ketometro sistema yra labai supaprastinta ir yra pritaikyta naudoti lauko sąlygomis. Diagnostinė juostelė įstatoma į matuoklį, kraujo lašas aplikuojamas ant juostelės galo. Rezultatas apskaičiuojamas per 15s. Juostelės yra vienkartinio naudojimo, todėl papildomai kalibruoti jų nereikia. Testui kraują imti rekomenduojama iš uodegos venos, naudojant 25 dydžio adatą ir 1 ml tūrio švirkštą. Prietaisas jautriau veikia nustatinėjant BHB nei gliukozės koncentraciją. Jautrumas nustatant BHB koncentraciją yra labai geras – virš 95 proc. (46).
1.7.5.Pieno riebalai ir baltymai
Pieninėms karvėms, per pirmas 2 svavaites, pasireiskia neigiamas energijos balansas (47). Šiuo laikotarpiu, iš kūno riebalų rezervo, mobilizuojama daug lipidų. Dalis, mobilizuotų laisvųjų riebalų rūgščių, patenka į pieną, dėl ko piene padaugėja riebalų. Dėl energijos trūkumo, šiek tiek sumažėja pieno baltymingumas. Subklinikinės ketozės stebėsenai bandoje gali būti naudojamas pieno riebalų ir baltymų santykis. (47).
Jei riebalų ir baltymų santykis didesnis nei 1,5, tai indikuoja subklinikine ketoze, o jei santykis mažesnis nei 1,1 – indikuoja prieskrandžių acidozę. (37) Šis metodas geras, norint stebėti visos bandos būklę, tačiau nepakankamai jautrus pavienių gyvūnų diagnostikai (37).
1.8.Hiperketonemijos poveikis tešmens sveikatingumui
Karvės, kurių neigiamas energijos balansas (NEB), rodo susilpnėjusio tešmens gynybinio mechanizo požymius. Keliamos hipotezės, kad hiperketonemija yra vienas iš svarbiausių faktorių,
Dėl NEB gali sumažėti polimorfonuklearinių ląstelių ir makrofagų fagocitozės pajėgumas. Taip, esant ketoninių kūnų koncentracijos padidėjimui, sumažėja sunaikinamų bakterijų skaičius. Reiktų nepamiršti, kad tešmenyje visada yra leukocitų, kurie intramaminės infekcijos metu skatina kitas imuninės sistemos ląsteles keliauti į infekcijos vietą. Ketoze sergančių karvių leukocitai išskiria mažiau tokių citokinų kaip interferonas, interleukinas ir vėžio nekrozės faktorius. Kitaip tariant – sumažėja biocheminių medžiagų, kurios aktyvuoja imuninę sistemą. Be viso to, sumažėja ir pačių leukocitų, kurie migruoja iš kraujo į pieno liauką, skaičius. Nustatyta, kad mastito pasireiškimo dažnumui leukocitų chemotaksio sumažėjimas yra reikšmingas (48).
2.TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tyrimas buvo atliktas 2018 – 2019 metais Lietuvoje esančioje žemės ūkio bedrovėje. Ūkyje galvijai yra laikomi palaido laikymo būdu, šeriami du kartus per parą. Užtraukinimo laikotarpiu karvės išvedamos į atskirą tvartą, kur jos šeriamos skirtingu, nei melžiamos karvės - trinčiu daugiau stambiųjų pašarų ir mažiau koncentruotųjų, bei sultingųjų pašarų, racionu. Karvių melžimas vykdomas du kartus per parą „eglutės tipo“ melžimo aikštelėje, griežtai laikantis spenių aseptikos reikalavimų.
Tyrimui iš bandos buvo atrinktos antros ar vėlenės laktacijos, Lietuvos juodmargių ir holšteinų veislės mišrūnės, panašaus imitimo (2,5-3 balų), praeita laktaciją panašų kiekį pieno davusios, šviežiapienės karvės n=40. Iš atrinktų karvių buvo sudaryto dvi tiriamos grupės:
Kontrolinė n=20, šios karvės buvo kliniškai sveikos ir jų kraujo BHB neviršijo maksimalios fiziologinės normos, būdingos šviežiapienėms karvėms (BHB < 1,2 mmol/l)
Bandomoji n=20, šiai grupei priskirtos karvės, kurioms pasireiškė subklinikine ketozė (BHB > 1,2 mmol/l).
Karvių kraujas ir pienas tirtas 14 ir 28 dieną po veršiavimosi, matuojant kraujo BHB ir pieno SLS koncentracijas. Toks ,intervalas tarp tyrimų, pasirinktas, norint įvertinti BHB poveikį somatinių ląstelių skaičiui pirmą mėnesį po atvedimo. Tyrimas atliktas prisilaikant gyvūnų globos, laikymo, naudojimo bei veterinarinių reikalavimų.
Gautų tyrimų rezultatų statistinė analizė buvo atlikta naudojant Microsoft Excel programą, kuri papildomai turėjo duomenų analizės (data analysis tools) priedą. Atrinkti atvejai, atitinkantys specifinius kriterijus, apskaičiuota: duomenų vidurkiai, duomenų patikimumas, koreliacijos koeficientai, procentai, kartai.
Duomenys laikyti patikimais, kai buvo mažiau nei 5 proc. tikimybė, kad duomenys yra atsitiktiniai (p<0,05).
2.1.Kraujo BHB koncentracijos matavimas
Kraujo BHB matavimui buvo naudojamas „FreeStyle precision neo“ gliuko/ ketometras (1 pav.). Su juo kartu buvo naudojamos „FreeStyle Precision Blood β-ketone“ diagnostinės juostelės. Kraujas buvo imtas iš uodegos venos, naudojant 25 dydžio adatą ir 1 ml talpos švirkštą, prieš tai injekcijos vietą nuvalius 70 proc. spiritu. Į ketometrą idėta diagnostinė juostelė ir aplikuotas lašelis paimto kraujo.
Tyrimo metu laikyta, kad karvei pasireiškė subklinikinė ketozė, jei BHB koncentracija buvo ≥ 1,2 mmol/l ir < 3 mmol/l. Sveikomis karvės laikytos kai BHB koncentracija buvo < 1,2 mmol/l.
1 pav. Gliuko/ketometras. https://www.freestyle.abbott/ca/en/products/precision_neo.html
2.2.Pieno SLS matavimas
Duomenys apie SLS imti iš „DeLaval“ firmos sukurtos bandos valdymo programos - „Alpro“. Karvės, kurių SLS piene buvo ≤ 300 000 ląst/ml – tyrimo metu laikytos sveikomis. SLS koncentracija, kuri > 200 000 ląst/ml, laikyta padidėjusia. Karvės, kurių SLS > 300 000 ląst./ml laikytos sergančios mastitu. Atrinktos karvės N=40 Kontrolinė grupė BHB < 1,2 mmol/l (n=20) Tiriamoji grupė BHB ≥ 1,2 mmol/l (n=20) SLS ir BHB įvertinimas 14 ir 28 d. p.p.
3.REZULTATAI
3.1.Sergamumas mastitu
Bandomojoje grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l) 14 d. p.p., iš tirtų 20-ies karvių, 6-ios (30 proc.) buvo sergančios mastitu (3 pav.)
3 pav. Bandomosios grupės sergamumas mastitu 14 d. p.p.
Kontrolinėje grupėje (BHB < 1,2) 14 d. p.p., iš tirtų 20-ies karvių, tik 2-i (10 proc.) susirgo mastitu (4 pav.). Lyginant kontrolinę grupę su tiriamaja, mastito atvejų buvo 3 kartus mažiau p<0,05.
4 pav. Kontrolinės grupės sergamumas mastitu 14 d. p.p. 30%
70%
Bandomoji grupė
Sergančios mastitu sveikos
10%
90%
Kontrolinė grupė
Bandomojoje grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l) 28 d. p.p., iš tirtų 20-ies karvių, 5-ios (25 proc.) buvo sergančios mastitu (5 pav.). Lyginant su rezultatais 14 dieną – 1-u (5 proc.) mastito atveju mažiau p>0,5.
5 pav. Bandomosios grupės sergamumas mastitu 28 d. p.p.
Kontrolinėje grupėje (BHB < 1,2) 28 d. p.p., iš tirtų 20-ies karvių, 2-i (10 proc.) susirgo mastitu (6 pav.). Rezultatas nepasikeitė nuo 14-tos dienos. Lygnant kontrolinę grupę su bandomaja 28 d. p.p., kontrolinėje grupėje matome 2,5 kartų mažiau mastito atvejų p<0,05. Lyginant su 14 d. p.p., mastitu sergančių karvių skaičius nesikeičia p>0,5.
6 pav. Kontrolinės grupės sergamumas mastitu 28 d. p.p. 25%
75%
Bandomoji grupė
Sergančios mastitu Sveikos
10%
90%
Kontrolinė grupė
3.2.Somatnių ląstelių skaičiaus kitimas
Pieno SLS koncentracijos vidurkis kontrolinėje grupėje (BHB < 1,2) 14 d. p.p. buvo 180050 ląst./ml, o bandomojoje grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l) SLS vidurkis buvo 380600 ląst/ml. Matome, kad badomojoje grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l) SLS koncentracijos piene vidurkis yra 2.11 kartų didesnis nei kontrolinėje grupėje (BHB < 1,2) p<0,01 (7 pav.).
7 pav. Kontrolinės ir bandomosios grupės SLS koncentracijų vidurkio skirtumas 14 d p.p. (p<0,01)
Pieno SLS koncentracijos vidurkis kontrolinėje grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l) 28 d. p.p. buvo 176300 ląst/ml, o bandomojoje grupėje (BHB < 1,2) SLS vidurkis buvo 359600 ląst/ml.
Badomojoje grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l < 3 mmol/l) SLS koncentracijos piene vidurkis yra 2.04kartų
didesnis nei kontrolinėje grupėje (BHB < 1,2) p<0,01 (8 pav.).
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000
Kontrolinė grupė Bandomoji grupė
SL S, lą st. /m l SLS vidurkiai 14 d. p.p. 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000
Kontrolinė grupė Bandomoji grupė
SL
S,
lą
st/ml
Vertinan SLS koncentracijos piene padidėjimą, jei laikysime, kad SLS koncentracija padidėjo, kai SLS > 200 000 ląst/ml, tada 14 d. p.p., bandomojoje grupėje buvo 11-a karvių iš 20-ies (55 proc.), o kontrolinėje grupėje 2,2 kartus mažiau – 5-ios karvės iš 20-ies (25 proc.), kurių SLS > 200 000 ląst/ml p<0,05 (9 pav.).
9 pav. Karvės kurių SLS didesnis nei 200 000 ląst./ml 14 d. pp (p<0,05)
Vertinant karves, kurių SLS > 200 000 ląst/ml, 28 d. p.p., bandomojoje grupėje buvo 9-ios karvės iš 20-ies (45 proc.), o kontrolinėje grupėje 2,25 kartus mažiau – 4-ios karvės iš 20-ies (20 proc.), kurių SLS > 200 000 ląst./ml p<0,05 (10 pav.).
10 pav. Karvės kurių SLS didesnis nei 200 000 ląst./ml 28 d. p.p. (p<0,05)
Kontrolinėje grupėje (BHB<1,2 mmol/l) tarp SLS ir BHB 14 - 28 d. vidurkių yra stipri teigiama koreliacija r=0,86, p<0,001 (11 pav.). 0 2 4 6 8 10 12
Kontrolinė grupė Bandomoji grupė
Ka
rvė
s,
vnt.
SLS koncentracijos piene padidėjimas 14 d. pp
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Kontrolinė grupė Bandomoji grupė
K
arvė
s,
vnt
11 pav.Kontrolinės grupės BHB ir SLS korealecija 14 – 28 d. p.p. (r=0,86, p<0,001)
Bandomojoje grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l) tarp SLS ir BHB 14 - 28 d. vidurkių yra stipri teigiama koreliacija r=0,85, p<0,001 (12 pav.).
12 pav. Bandomosios grupės BHB ir SLS koreliacija 14 - 28 d. p.p. (r=0,85, p<0,001)
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 SLS, ląs t/ml BHB, mmol/l
Kontrolinės grupės SLS ir BHB vidurkų koreliacija
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 SLS, ląs t. /m l BHB, mmol/l
4.REZULTATŲ APTARIMAS
Viena iš svarbiausių SLS koncentracijos piene paidėjimo priežaščių yra intramaminė infekcija, todėl tyrime buvo atlikti mastito atvejų statistiniai skaičiavimai. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad mastito pasireiškimo dažnumas yra susijęs BHB koncentracija kraujyje, nes mastito atvejų 14 ir 28 dienomis po veršiavimosi buvo 2,5 ir 3 kartus daugiau bandomojoje grupėje (p < 0,05), kur BHB koncentracija kraujyje buvo ≥ 1,2 mmol/l < 3 mmol/l, nei kontrolinėje grupėje, kur BHB koncentracija kraujyje buvo < 1,2 mmol/l. Mastito atvejų skaičius 14 ir 28 d. skyrėsi nereikšmingai (p>0,05). Uyarlar C ir kt. (2018) atliktame tyrime (30) taip pat pastebi stiprų ryšys tarp BHB ir mastito. Tyrėjai pastebėjo, kad mastito atvejų daugėja esant subklinikinei ir klinikinei ketozei. Mastito atvejų padaugėja, nes ketozės metu vyksta tešmens audinio imunosupresija.
Apskaičiavus pieno SLS vidurkius, nustačiau, kad 14 ir 28 d. SLS koncentracija piene buvo 2,04 ir 2,11 karto didesnė bandomojoje karvių grupėje (BHB ≥ 1,2 mmol/l < 3 mmol/l), nei kontrolinėje (BHB < 1,2 mmol/l) (p<0,01), kas rodo jog BHB koncentracija kraujyje įtakoja SLS koncentraciją piene. SLS vidurkių skirtumas tarp 14 ir 28 d. buvo nereikšmingas (p>0,05). Guanshi Zhang ir kt. (2016) savo tyrime (49), taip pat gavo panašius rezultatus. Jų tirtos karvės, kurioms pasireiškė ketozė, piene turėjo didesnę SLS koncentraciją (p<0,01), nei karvės, kurios nesirgo ketoze. Subklinikine ketoze sergančioje karvių grupėje SLS padidėjo net 5,4 kartus, lyginant su kontroline, sveikų karvių grupe.
Vertinant karvių, kurių SLS > 200 000 ląst/ml skaičių, 14 ir 28 d. bandomojoje (BHB ≥ 1,2 mmol/l < 3 mmol/l) karvių grupėje buvo 2,2 ir 2,25 karto daugiau karvių, kurioms pieno SLS padidėjęs (p<0,05), kas rodo priklausomybę nuo BHB koncentracijos kraujyje. Karvių, kurioms SLS padidėjo virš 200 000 ląst./ml, skaičius 14 ir 28 d. skyrėsi nereikšmingai (p>0,05). E. Leslie ir kt. tyrime (2000) (4) pastebėta, kad ketoze sergančių karvių grupėje SLS buvo 1,4 kartus didesnis, nei fiziologiškai sveikų karvių grupėje.
Taip pat pastebima stipri teigiama koreliacija kontrolinėje (r=0,86) ir bandomojoje grupėse (r=0,85) tarp pieno SLS koncentracijos ir kraujo BHB koncentracijos. Kadangi koreliacija yra teigiama ir artima vienetui, galime laikyti, kad SLS yra stipriai priklausomas nuo BHB koncentracijos kraujyje. Guanshi Zhang ir kt. (2016) savo tyrime (49) taip pat pastebėjo stiprią teigiama koreliacija tarp pieno SLS koncentracijos ir kraujo serumo BHB (r>0,84).
IŠVADOS
1. Nustatyta, kad karvės, kurių BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l, 14 ir 28 d. atitinkamai 3 ir 2,5 kartus dažniau sirgo mastitu.
2. Nustatyta, kad karvėms, kurių BHB ≥ 1,2 mmol/l iki < 3 mmol/l, pastebimas padidėjęs SLS kiekis, lyginant su karvėmis, kurių BHB < 1,2 mmol/l
3. Nustatyta stipri teigiama koreliacija tarp BHB ir SLS augimo. Kuo didesnis buvo BHB – tuo labiau didėjo SLS.
REKOMENDACIJOS
Norint sumažinti somatinių ląstelių kiekį piene, tokiu būdu pagerinant pieno kokybę, rekomenduojame taikyti ketozės profilaktikos priemones.
LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Kirsanova E, Heringstad B, Lewandowska-Sabat A, Olsaker I. Alternative subclinical mastitis traits for genetic evaluation in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 2019;102(6):5323-5329.
2. Kumar Sethi A, Jayswal K, Singh Sandhu J. Detection of subclinical mastitis in herd of cattle. International Journal of Veterinary Sciences and Animal Husbandry. 2019;4(2):31-33.
3. Malik T, Mohini M, Mir S, Ganaie B, Singh D, Varun T et al. Somatic Cells in Relation to Udder Health and Milk Quality-A Review. Journal of Animal Health and Production. 2018;6(1).
4. E. Leslie K, F. Duffield T, H. Schukken Y, J. LeBlanc S. The influence of negative energy balance on udder health. University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada Cornell University, Ithaca, New York. 2000;.
5. El-Awadyl H.G, Ashour A.F, Shamia S.M. Genetic and economic evaluation for the relationship between somatic cell counts, milk yield and milk constituents in egyptian buffaloes. Buffalo Bulletin October-December. 2016. Vol.35 No.4
6. Mann S, Yepes F, Behling-Kelly E, McArt J. The effect of different treatments for early-lactation hyperketonemia on blood β-hydroxybutyrate, plasma nonesterified fatty acids, glucose, insulin, and glucagon in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 2017;100(8):6470-6482.
7. Chen L, Gao X, Xue H. Recognition of milk somatic cells based on dichotomy model. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2019;569:022034.
8. Petzer I, Karzis J, Donkin E, Webb E, Etter E. Somatic cell count thresholds in composite and quarter milk samples as indicator of bovine intramammary infection status. Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 2017;84(1).
9. Sharma N, Singh N, Bhadwal M. Relationship of Somatic Cell Count and Mastitis: An Overview. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 2011;24(3):429-438.
10. Bytyqi H, Zaugg U, Sherif K, Hamidi A, Gjonbalaj M, Muji S et al. Infl uence of management and physiological factors on somatic cell uence of management and physiological factors on somatic cell count in raw cow milk in Kosova. Vet arhiv. 2010;80(2):173-183.
11. Katsafadou A, Politis A, Mavrogianni V, Barbagianni M, Vasileiou N, Fthenakis G et al. Mammary Defences and Immunity against Mastitis in Sheep. Animals. 2019;9(10):726.
12. Alhussien M, Dang A. Milk somatic cells, factors influencing their release, future prospects, and practical utility in dairy animals: An overview. Veterinary World. 2018;11(5):562-577.
13. Saravanan R, Das D, De S, Panneerselvam S. Effect of season and parity on somatic cell count across zebu and crossbred cattle population. Indian Journal of Animal Research. 2015;49(3):383.
14. Gomes V, Melville Paiva Della Libera A, Paiva M, Madureira K, Araújo W. Effect of the stage of lactation on somatic cell counts in healthy goats (Caprae hircus) breed in Brazil. Small Ruminant Research. 2006;64(1-2):30-34.
15. Archer S, Mc Coy F, Wapenaar W, Green M. Association of season and herd size with somatic cell count for cows in Irish, English, and Welsh dairy herds. The Veterinary Journal. 2013;196(3):515-521.
16. Sandrucci A, Bava L, Zucali M, Tamburini A. Management factors and cow traits influencing milk somatic cell counts and teat hyperkeratosis during different seasons. Revista Brasileira de Zootecnia. 2014;43(9):505-511.
17. Gantner V, Bobic T, Gantner R, Gregic M, Kuterovac K, Novakovic J et al. Differences in response to heat stress due to production level and breed of dairy cows. International Journal of Biometeorology. 2017;61(9):1675-1685.
18. Guerra S, Paula C, Bolaños C, Hernandes R, Ribeiro M. Virulence factors of Escherichia coli: an overview of animal and human infections with emphasis in bovine mastitis. Semina: Ciências Agrárias. 2019;40(5):2087.
19. Jamali H, Barkema H, Jacques M, Lavallée-Bourget E, Malouin F, Saini V et al. Invited review: Incidence, risk factors, and effects of clinical mastitis recurrence in dairy cows. Journal of Dairy Science. 2018;101(6):4729-4746.
20. Johnzon C, Dahlberg J, Gustafson A, Waern I, Moazzami A, Östensson K et al. The Effect of Lipopolysaccharide-Induced Experimental Bovine Mastitis on Clinical Parameters, Inflammatory Markers, and the Metabolome: A Kinetic Approach. Frontiers in Immunology. 2018;9.
21. Khatun M, Bruckmaier R, Thomson P, House J, García S. Suitability of somatic cell count, electrical conductivity, and lactate dehydrogenase activity in foremilk before versus after alveolar milk ejection for mastitis detection. Journal of Dairy Science. 2019;102(10):9200-9212.
22. Lima R, Danielski G, Pires A. Mastitis Detection and Prediction of Milk Composition Using Gas Sensor and Electrical Conductivity. Food and Bioprocess Technology. 2017;11(3):551-560.
23. Ahmed LI, Fahim KM. Incidence of Subclinical Mastitis with Special Reference to Lactate Dehydrogenase (LDH) Enzyme as a Biomarker. International Journal of Dairy Science. 2018;13(1):30-39.
24. Lam T, Olde Riekerink R, Sampimon O, Smith H. Mastitis diagnostics and performance monitoring: a practical approach. Irish Veterinary Journal. 2009;62(S4).
25. Zecconi A, Vairani D, Cipolla M, Rizzi N, Zanini L. Assessment of subclinical mastitis diagnostic accuracy by differential cell count in individual cow milk. Italian Journal of Animal Science. 2018;18(1):460-465.
26. Sahar K, Mohamed E, Faysal A, Elsayed G, Ameer M, Peter C. Clinical utility of two leukocyte esterase reagent strips for the cow-side diagnosis of subclinical mastitis in lactating dairy cattle. Assiut Vet. Med. J. Vol. 2017;63(155).
27. Astuti A, Obitsu T, Taniguchi K, Sugino T. Effect of Milking Frequency on Body Condition Score, Somatic Cell Count, and Reproductive Performance of Dairy Cows Milked by An Automatic Milking System. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2019;251:012055.
28. Schukken Y, Wilson D, Welcome F, Garrison-Tikofsky L, Gonzalez R. Monitoring udder health and milk quality using somatic cell counts. Veterinary Research. 2003;34(5):579-596.
29. Tehrani-Sharif M, Hadadi M, Noughabi H, Mohammadi A, Rostami F, Sharifi H. Bovine subclinical ketosis in dairy herds in Nishaboor, Iran. Comparative Clinical Pathology. 2011;21(6):1637-1641.
30. Uyarlar C, Çetingül S, Gültepe E, Sial R, Bayram İ. Effects of Subclinical and Clinical Ketosis on The Incidence of Mastitis, Metritis, Culling Rate and Some Hematological Parameters in Dairy Cows. Kocatepe Vet J. 2018;11(2): 186-193
31. Overton T, Waldron M. Nutritional Management of Transition Dairy Cows: Strategies to Optimize Metabolic Health. Journal of Dairy Science. 2004;87:E105-E119.
32. Melendez P, Marin M, Robles J, Rios C, Duchens M, Archbald L. Relationship between serum nonesterified fatty acids at calving and the incidence of periparturient diseases in Holstein dairy cows.
33. Drackley J, Dann H, Douglas N, Guretzky N, Litherland N, Underwood J et al. Physiological and pathological adaptations in dairy cows that may increase susceptibility to periparturient diseases and disorders. Italian Journal of Animal Science. 2005;4(4):323-344.
34. González F, Muiño R, Pereira V, Campos R, Benedito J. Relationship among blood indicators of lipomobilization and hepatic function during early lactation in high-yielding dairy cows. Journal of Veterinary Science. 2011;12(3):251.
35. Youssef M, El-Khodery S, El-deeb W, El-Amaiem W. Ketosis in buffalo (Bubalus bubalis): clinical findings and the associated oxidative stress level. Tropical Animal Health and Production. 2010;42(8):1771-1777.
36. Goff J. Major Advances in Our Understanding of Nutritional Influences on Bovine Health. Journal of Dairy Science. 2006;89(4):1292-1301.
37. Zhang L, Wang Z. Detection of subclinical ketosis in dairy cows. Pak Vet J. 2012;32(2): 156-160.
38. Hammon H, Stürmer G, Schneider F, Tuchscherer A, Blum H, Engelhard T et al. Performance and metabolic and endocrine changes with emphasis on glucose metabolism in high-yielding dairy cows with high and low fat content in liver after calving. Journal of Dairy Science. 2009;92(4):1554-1566.
39. Mulligan F, Doherty M. Production diseases of the transition cow. The Veterinary Journal. 2008;176(1):3-9.
40.Allen S, Piantroni P. Metabolic control of feed intake: implications for metabolic disease of fresh cows. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2013;29: 279-297.
41. Graugnard D, Moyes K, Trevisi E, Khan M, Keisler D, Drackley J et al. Liver lipid content and inflammometabolic indices in peripartal dairy cows are altered in response to prepartal energy intake and postpartal intramammary inflammatory challenge. Journal of Dairy Science. 2013;96(2):918-935.
42.Naito Y, Suematsu M, Yoshikawa T. Free Radical Biology in Digestive Diseases (eds). Front Gastrointest Res. Basel, Karger. 2011;29:144–1555.
43. Schieber M, Chandel N. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 2014;24(10):R453-R462.
44. Iwersen M, Falkenberg U, Voigtsberger R, Forderung D, Heuwieser W. Evaluation of an electronic cowside test to detect subclinical ketosis in dairy cows. Journal of Dairy Science. 2009;92(6):2618-2624.
45. Oetzel R. Herd level ketosis - Diagnosis and risk factors. Preconference Seminar 7C: Dairy Herd Problem Investigation Strategies: Transition Cow Troubleshooting, American association of bovine practitioners 40th Annual Conference. 2007: 67-91.
46. Voyvoda H, Erdogan H. Use of a hand-held meter for detecting subclinical ketosis in dairy cows. Research in Veterinary Science. 2010;89(3):344-351.
47. Jenkins N, Pena G, Risco C, Barbosa C, Vierira A, Klibs G. Utility of inline milk fat and protein ratio to diagnose subclinical ketosis and to assign propylene glycol treatment in lactating dairy cows. Canadian Veterinary Journal. 2015;56:850–854.
48. Witaya S, Cord H, Elsbeth N S, Ynte S. Hyperketonemia and the impairment of udder defense: a review. Vet. Res. 2000;31:397–412.
49. Guanshi Z, Dagnachew H, Elda D, Seyed G, Qilan D, Suzanna D, Burim A. Dairy cows affected by ketosis show alterations in innate immunity and lipid and carbohydrate metabolism during the dry off period and postpartum. Research in Veterinary Science. 2016;107:246–256.
