“VEGF - A rs833068, rs1413711 ir rs833061 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajos su burnos dugno vėžio išsivystymu”

(1)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

NEUROMOKLSLŲ INSTITUTAS

OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA

“VEGF - A rs833068, rs1413711 ir rs833061 vieno nukleotido

polimorfizmų sąsajos su burnos dugno vėžio išsivystymu”

Medicinos vientisųjų studijų programos

Baigiamasis magistro darbas

Darbą atliko: Mindaugas Žukauskas

(2)

TURINYS

SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 PADĖKA ... 9 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 9

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 9

ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Burnos dugno navikų epidemiologija ... 12

1.2. Anatomija ... 12

1.3. Supiktybėti linkę pažeidimai ... 13

1.4. Gerybiniai navikai ... 14

1.5. Piktybiniai navikai ... 14

1.6. Naviko mikroaplinka ... 16

1.7. Kraujagyslių formavimosi ypatumai ... 16

1.8. Angiogenezė „sprouting“ ... 17

1.9. Navikų angiogenezė: ... 18

1.10. VEGF šeima ir „VEGF-A“ veiksnio funkcija joje ... 19

1.11. VEGF-A receptoriai ir jų veikimo keliai ... 19

TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 22

2.1. Tyrimo planavimas ... 22

2.2. Tyrimo objektas: ... 22

2.3. Tiriamųjų atranka: ... 22

2.3.1. Burnos dugno navikų grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai: ... 23

2.3.2. Burnos dugno navikų grupės neįtraukimo į tyrimą kriterijai: ... 23

2.3.3. Kontrolinės grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai: ... 23

2.3.4. Kontrolinės grupės neįtraukimo į tyrimą kriterijai: ... 23

2.4. Mėginių rinkimas: ... 24

2.5. Deoksiribonukleino rūgšties išskyrimas: ... 24

2.5.1. DNR išskyrimas naudojant magnetines daleles ... 24

2.5.2. DNR gryninimo etapai: ... 25

(3)

2.7.3. Metodas: ... 28

2.8. Statistinė analizė ... 29

REZULTATAI ... 31

3.1. rs1413711, rs833061, rs833068 ir genotipų dažnis pacientų, sergančių burnos dugno vėžiu ir kontrolinėje grupėje ... 31

3.2. rs1413711, rs833061, rs833068 polimorfizmų genotipų, sergantiems burnos dugno vėžiu ir kontrolinėje grupėje priklausomybė nuo amžiaus ir lyties ... 33

3.3. rs1413711, rs833061, rs833068 polimorfizmų genotipų dažnis sergantiems burnos dugno vėžiu priklausomai nuo stadijos ir diferenciacijos laipsnio ... 39

REZULTATŲ APTARIMAS ... 41

IŠVADOS ... 43

(4)

SANTRUMPOS

VEGF – Kraujagyslinis endotelio augimo faktorius. VEGF – A – Kraujagyslinis endotelio augimo faktorius A. TAMs – Su tumoru susiję magrofagai.

NMA – Naviko mikroaplinka. DLL4 – Delta tipo 4 baltymas. Ang – Angiopoetinas,

TJA – Tarpląstelinis jungiamasis audinys. MMP – 9 – Matrikos metaloproteinazė. DCs – Dendritinės ląstelės.

NK – Natūralieji kileriai.

EDTA – Etilendiamintetraacetatas.

TL – PGR – Tikro laiko polimerazės grandininė reakcija. BDV – Burnos dugno vėžys

(5)

SANTRAUKA

Baigiamojo magistro darbo autorius: Mindaugas Žukauskas

Tema: VEGF - A rs833068, rs1413711 ir rs833061 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajos su burnos dugno vėžio išsivystymu.

Mokslinis vadovas: m. dr. Doc. Rasa Liutkevičienė

Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Neuromokslų institutas, Oftalmologijos laboratorija

Tikslas: Nustatyti VEGF – A rs833068, rs1413711 ir rs833061 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajas su burnos dugno vėžio išsivystymu.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti VEGF-A rs833068, rs1413711 ir rs833061 genotipų dažnį pacientams, sergantiems burnos dugno vėžiu bei kontrolinėje grupėje.

2. Nustatyti VEGF-A rs833068, rs1413711 ir rs833061 polimorfizmų, sergantiems burnos dugno vėžiu ir kontrolinėje grupėje priklausomybę nuo amžiaus ir lyties.

3. Nustatyti VEGF-A rs833068, rs1413711 ir rs833061 polimorfizmų dažnį sergantiems burnos dugno vėžiu priklausomai nuo stadijos ir diferenciacijos laipsnio.

Tyrimo metodika: Ištirti 46 pacientai sergantys burnos dugno vėžiu ir 105 sveiki kontrolinės grupės asmenys. DNR išskirtas iš tiriamųjų veninio kraujo, naudojant druskų nusodinimo metodą. Mėginiai genotipuoti naudojant tikro laiko PGR metodiką. Statistinė analizė atlikta naudojant programinį paketą IBM SPSS Statistics 25.

(6)

≥ 60 metų amžiaus grupėje nustatėme, jog CC genotipas statistiškai reikšmingai dažnesnis sergantiems, nei kontrolinės grupės asmenims (p = 0,010). Atlikus logistinę regresinę analizę nustatėme, kad CC genotipas lyginant su TT genotipu šią galimybę didina 10 kartų (p = 0,003). Nustatėme, jog VEGF – A rs833061 polimorfizmo ≥ 60 metų amžiaus grupėje T alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis burnos dugno vėžiu sergantiesiems, lyginant su kontroline grupe (p = 0,009). TT genotipas, lyginant su CC genotipu, statistiškai reikšmingai didina tikimybę sirgti burnos dugno vėžiu apie 5,6 karto (p = 0,020).

Išvados: Nustatėme, jog VEGF – A rs1413711 polimorfizmo CC genotipas didina tikimybę susirgti burnos dugno vėžiu. VEGF – A rs1413711 polimorfizmo CC genotipas vyrams didina tikimybę susirgti burnos dugno vėžiu. VEGF – A rs1413711 polimorfizmo CC genotipas ≥ 60 metų amžiaus grupėje didina tikimybę susirgti burnos dugno vėžiu. VEGF – A rs833061 polimorfizmo TT genotipas ≥ 60 metų amžiaus grupėje didina tikimybę susirgti burnos dugno vėžiu.

(7)

SUMMARY

Author of master thesis: Mindaugas Žukauskas

Title: Association between VEGF-A rs833068, rs1413711 and rs833061 single nucleotide polymorphism and cancer of the floor of the mouth.

Scientific supervisor: MD – PhD. Rasa Liutkevičienė

Work was performed at: Lithuanian University of Health Sciences; Neuroscience Institute, Laboratory of Ophthalmology.

Purpose: To determine association between VEGF – A rs833068, rs1413711 and rs833061 single nucleotide polymorphism and cancer of the floor of the mouth.

Tasks:

1. To determine VEGF-A rs833068, rs1413711 and rs833061genotypes frequency between affected and control group.

2. To determine VEGF-A rs833068, rs1413711 and rs833061 genotypes dependence on age and gender between affected and control group.

3. To determine VEGF-A rs833068, rs1413711 and rs833061 genotypes frequency in affected group by gender and age.

Methods: The study enrolled 46 patients with mouth floor cancer and 105 people of control group. DNA was purified from peripheral venous blood by salting-out method. Genotyping was performed by using real-time polymerase chain reaction. For statistical analysis results were calculated by IBM SPSS Statistics 25.

(8)

After binary logistic regression analysis calculated that the CC genotype, compared to the TT genotype, statistically significantly increased the risk of cancer by 10-fold (p = 0.003). We found that the T allele in the VEGF - A rs833061 polymorphism age group ≥ 60 years were statistically significantly higher in cancer group compared to the control group (p = 0.009). The TT genotype, compared to the CC genotype, statistically significantly increased the risk of cancer by 5.6-fold (p = 0.020).

(9)

PADĖKA

Dėkoju m. dr. doc. Rasai Liutkevičienei už operatyvų, profesionalų ir rūpestingą̨ vadovavimą̨ rašant baigiamąjį̨ magistro darbą̨. Dėkoju Neuromokslų instituto oftalmologijos laboratorijos genetikei Alvitai Vilkevičiūtei už naudingas įžvalgas, patarimus ir visokeriopą metodinę pagalbą.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

(10)

ĮVADAS

Pasaulyje vėžys yra antra pagal mirtingumą liga po širdies ligų (1). Lietuvoje kasmet diagnozuojama per 16 tūkst. naujų piktybinių navikų atvejų, o nuo jų kasmet miršta daugiau kaip 8 tūkst. gyventojų (2). Lietuvos nacionalinio vėžio instituto 2012 m. duomenimis naujų susirgimų burnos ir ryklės navikais diagnozuota 314, daugiausia sergama 60 – 64 m. amžiaus grupėje; mirtingumas 229 atvejų, didžiausias mirtingumas taip pat 60 – 64 m. amžiaus grupėje (3). Šie navikai dažniausiai lokalizuojasi burnos dugne. Laikas nuo simptomų pradžios iki diagnozės vidutiniškai yra keturi mėnesiai. Pagrindinis simptomas, kuriuo skundžiasi 67 proc. pacientų, yra skausminga burnos gleivinės opelė (4).

Anatomiškai burnos dugnas apibrėžiamas, kaip horizontalus „U“ raidės formos regionas burnos ertmėje, esantis po liežuviu ir apsuptas apatinėmis alveolėmis (5),(6).

Plokščiųjų ląstelių karcinoma sudaro daugiau nei 90% visų burnos navikų. Įvairūs iki navikiniai pakitimai, pavyzdžiui eritroplakija, yra susiję su šio naviko išsivystymu (7).

Nustatyta, jog genetinė predispozicija, alkoholis ir rūkymas yra rizikos veiksniai skatinantys burnos plokščiųjų ląstelių karcinomos pasireiškimą. Šių medžiagų kombinacija sustiprina karcinogenezės atsiradimo tikimybę (8).

Karcinogenezės procese pagrindinis vaidmuo tenka onkogeninių ir tumorosupresinių genų saveikoms. Būtent todėl genetiniai veiksniai šiuo metu yra aktyviai nagrinėjami. Molekuliniai vėžio žymenys priklausomai nuo jų funkcijų skirstomi į penkias grupes: naviko augimo, proliferacijos ir apoptozės, naviką slopinantys, imuninio atsako, naviko invazijos ir metastazavimo, angiogenezės (9).

(11)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas:

Nustatyti VEGF – A rs833068, rs1413711 ir rs833061 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajas su burnos dugno vėžio išsivystymu.

Uždaviniai:

1. Nustatyti VEGF-A rs833068, rs1413711 ir rs833061 genotipų dažnį pacientams, sergantiems burnos dugno vėžiu bei kontrolinėje grupėje.

2. Nustatyti VEGF-A rs833068, rs1413711 ir rs833061 polimorfizmų, sergantiems burnos dugno vėžiu ir kontrolinėje grupėje priklausomybę nuo amžiaus ir lyties.

(12)

LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Burnos dugno navikų epidemiologija

Pasaulyje vėžys yra antra pagal mirtingumą liga po širdies ligų (1). Lietuvoje kasmet diagnozuojama per 16 tūkst. naujų piktybinių navikų atvejų, o nuo jų kasmet miršta daugiau kaip 8 tūkst. gyventojų (2). Garravelo ir kt. atliktame tyrime nustatė, jog 2000 – 2004 m. sergamumas burnos ir ryklės navikais vyrams buvo apie 11/100 000, moterims apie 1/100 000 gyventojų, sergamumas metų eigoje augo. Mirtingumas nuo šių ligų dažnesnis: vyrams apie 25/100 000 gyventojų, moterims apie 2/100 000 gyventojų (10). Burnos ertmės navikai yra 10-toje vietoje pasaulyje lyginant visas mirčių priežastis. Šios formos navikų dažnumas priklauso ir nuo vietovės, pavyzdžiui, Azijoje ši vėžio forma yra viena dažniausių. Vyrai serga du kartus dažniau nei moterys ir beveik 95% pacientų yra 40 – 60 metų amžiaus (1). Lietuvos nacionalinio vėžio instituto 2012 m. duomenimis naujų susirgimų burnos ir ryklės navikais diagnozuota 314, daugiausia sergama 60 – 64 m. amžiaus grupėje; mirtingumas 229 atvejų, didžiausias mirtingumas taip pat 60 – 64 m. amžiaus grupėje (3). Šie navikai dažniausiai lokalizuojasi burnos dugne. Laikas nuo simptomų pradžios iki diagnozės vidutiniškai yra keturi mėnesiai. Pagrindinis simptomas, kuriuo skundžiasi 67 proc. pacientų, yra skausminga burnos gleivinės opelė (4). Dažniausiai tokie navikai metastazuoja į kaklo limfmazgius (11).

1.2. Anatomija

(13)

Chirurgiškai, burnos dugnas yra apibrėžiamas, kaip tarpas tarp gleivinės paviršiaus ir malamojo poliežuvinio raumens (m. mylohyoideus), įskaitant abi šias struktūras. Porinio malamojo poliežuvinio raumens siūlė skiria burnos dugną nuo kairiojo ir dešiniojo submandibulinio tarpo ir yra submentalinio tarpo vidurinė linija. Burnos dugne esančios kitos struktūros: 1) Seilių liaukos: poliežuvinės seilių liaukos, gilioji dalis požandikaulinės seilių liaukos ir subepitelinės mažosios seilių liaukos; 2) Seilių liaukų suformuoti latakai: Rinvus latakas, Bartholin latakas, kuris pereina į bendrąjį požandikaulinį lataką, Wharton latakas; 3) Nervai: liežuvinis nervas, tolimosios poliežuvinio nervo ir liežuvinio ryklės nervo dalys. Šiame pakankamai mažo ploto regione galimi įvairūs patologiniai pažeidimai: cistos, uždegiminės būklės dėl: infekcijų, bendrojo poliežuvinio latako obstrukcijos, gerybinių ir piktybinių navikų. Vieni dažniausių gerybiniai burnos dugno navikai - lipomos, pleomorfinės adenomos, nervinio dangalo kilmės. Piktybiniai - plokščialąstelinės karcinomos, seilių liaukų navikai (5).

1.3. Supiktybėti linkę pažeidimai

Eritroplakija – nežinomas pažeidimas, kurio rizika supiktybėti siekia 80%. Dažniausiai diagnozuojama senyvo amžiaus pacientams, kurie naudoją alkoholį ir tabaką. Tai raudonos spalvos, švelnus, besimptomis lopas. Dažniausia atsiradimo vieta yra burnos dugnas, ventralinė liežuvio dalis ir minkštasis gomurys. Histopatologinio tyrimo metu eritroplakijos mėginyje nustatoma įvairaus laipsnio ląstelių displazija ir carcinoma in situ, rečiau – invazinės plokščialąstelinės karcinomos požymiai (12).

(14)

1.4. Gerybiniai navikai

Lipomos, kilusios burnos ertmėje, dažniausiai formuojasi žande, liežuvyje ir burnos dugne. Pleomorfinės adenomos - reti navikai burnos dugne. Poliežuvinėse liaukose jų randama iki 1% lyginant su visomis adenomomis. Nervinio dangalo navikai (neurofibromos ir Švanomos) retai susiformuoja burnos ertmėje. Neurofibromos dažniausiai susiję su neurofibromatoze. Švanomos pasireiškia 4-tą gyvenimo dešimtmetį, susiformuoja iš periferinių motorinių, sensorinių ir simpatinių nervų, dažniausios moterims. Aprašoma atvejų, kai švanomos burnos dugne susiformavo iš liežuvinio ir poliežuvinio nervų (5).

1.5. Piktybiniai navikai

(15)

Buvo tirti 102 burnos plokščialąstelinės histopatologiniai mėginiai iš tiriamųjų archyvo: 74 vyrų ir 28 moterų. Amžiaus vidurkis buvo 54,77 metai, svyravo nuo 22 iki 81 metų. Imunohistocheminė analizė parodė statistiškai reikšmingą VEGF faktoriaus padidėjimą (53,92 proc.) BPK audinyje lyginant jį su nenavikiniais BPK kraštais ir normalia gleivine. Vis dėlto statistiškai reikšmingo skirtumo tarp amžiaus, lyties, diferenciacijos laipsnio ir patologijos stadijos nebuvo nustatyta (16). Mărgăritescu C. ir kt tyrė ar

VEGF imunohistocheminė raiška koreliuoja su naviko angiogeneze. Buvo tirti 54 pirminės BPK

mėginiai (39 vyrų ir 15 moterų) ir lyginti su sveikos gleivinės kraštais. VEGF – A faktoriaus raiška buvo statistiškai reikšmingai didesnė navikiniame audinyje lyginant su preneoplastiniu ir normaliu audiniu. Taip pat faktoriaus raiška buvo statistiškai reikšmingai mažesnė mažai diferencijuotose BPK formose lyginant su vidutiniškai diferenciuotomis formomis. VEGF – A raiška buvo didesnė T4 lyginant su T3 stadija ir N2 lyginant su N1 bei N0 stadija. Naviko mikrokraujagyslinė zona netiesiogiai koreliavo su pacientų amžiumi ir buvo sumažėjusi T4 stadijoje lyginant su T3 stadija. Taip pat faktoriaus raiška ir mikrokraujagyslinė zona netiesiogiai koreliavo naviko kraštuose, tačiau koreliacijos nebuvo pastebėta lyginant su amžiumi, lytimi, diferenciacijos laipsniu ir T bei N stadijomis (17). Cheng SJ ir kiti tyrė

VEGF raišką BPK, burnos epitelio displazijoje (BED) ir sveikoje gleivinėje, taip pat jo galimą

prognostinę reikšmę BPK. Buvo tiriami 100 BPK mėginių (91 vyrų ir 9 moterų, amžiaus vidurkis 53 metai, svyravo nuo 30 iki 81 metų), 20 sunkios BED mėginių (19 vyrų ir 1 moterų, amžiaus vidurkis 50 metų, svyravo 36 iki 63 metų), 22 mėginiai su vidutine BED (visi vyrai, amžiaus vidurkis 48 metai, svyravo nuo 23 iki 77 metų) ir 24 lenva BED (visi vyrai, amžiaus vidurkis 48 metai, svyravo nuo 31 iki 63 metų). Iš 100 BPK mėginių 3 mėginiai buvo paimti iš burnos dugno. VEGF raiša statistiškai reikšmingai didėjo nuo sveikos gleivinės mėginių, toliau lengvuose, vidutiniuose ir sunkiuose BED mėginiuose ir didžiausią raišką pasiekia BPK mėginiuose. Statistiškai reikšmingo ryšio nebuvo tarp

VEGF faktoriaus ir pacientų amžiaus, naviko lokalizacijos ir dydžio bei atsinaujinimo. Taip pat

statistiškai reikšmingas ryšys nebuvo nustatytas tarp VEGF ir gyvenimo būdo įpročių: rūkymas, alkoholio vartojimas (18).

(16)

Tai lėtai augantis, turintis polinkį plisti perineuriniais tarpais ir gana sunkiai skiriamas nuo plokščialąstelinės karcinomos. Navikai kilę burnos dugne gali įtraukti apatinį alveolinį nervą, to pasekoje didindami apatinio alveolinio nervo kanalą. Metastazinė kaklo limfadenopatija yra dažnesnė sergant mukoepidermoidine karcinoma (5).

1.6. Naviko mikroaplinka

Normalių ląstelių transformacija į greitai besidauginančias piktybines ląsteles gali priklausyti nuo daugelio veiksnių, įskaitant genetines translokacijas, delecijas ir padidintą raišką. Navikinės ląstelės gali naudotis aplinkiniais audiniai, kad susikurtų sau palankesnę aplinką, kuri padės jiems augti. Naviko mikroaplinka (NMA) yra sudėtinga sąsaja, kurią sudaro: neoplastinės ląstelės, stromos matriksas, sekretuojami augimą moduliuojantys veiksniai ir kiti ląsteliniai elementai. Visi šie elementai kartu palaiko naviko proliferaciją ir invaziją bei formuoja savo mikroaplinką (19). Dar vienas svarbus veiksnys naviko augimui yra gera kraujotaka, be jos navikas negalėtų augti ir metastazuoti į kitus organus. Yra plačiai priimta, kad „angiogenezinis jungiklis“ yra „išjungtas“, kai pro-angiogeninės molekulės yra pusiausvyroje su anti-angiogeninėmis, o „įjungtas“, kai dominuoja pro-angiogeninės. Įvairūs veiksniai stimuliuoją šią sistemą: metabolinis stresas (žemas parcialinis deguonies slėgis, žemas pH arba hipoglikemija), mechaninis stresas (spaudimas, atsirandantis ląstelėms besidauginant), imuninis/uždegiminis atsakas (imuninės/uždegiminės ląstelės infiltruoja audinį) ir genetinės mutacijos (onkogenų aktyvacija ar naviko supresinių genų delecija, kuri atsakinga už angiogenezės reguliaciją) (20).

1.7. Kraujagyslių formavimosi ypatumai

(17)

Naviko kraujagyslės taip pat formuojasi šiais dviem būdais. Cirkuliuojantys endotelio prekursoriai, atsiskyrę nuo kraujagyslės sienelės arba mobilizuoti iš kaulų čiulpų, prisideda prie naviko angiogenezės. Dar navikinės ląstelės gali augti aplink esamą kraujagyslę, taip suformuodamos perivaskulinę kišenę (20).

Naujos kraujagyslės yra formuojamos dviem būdais: vaskulogeneze ir angiogeneze. Vaskulogenezė apibrėžiama kaip de novo formavimasis pradinio kraujagyslių tinklo diferencijuojantis, plečiantis ir susiliejant endoteliniams prekursoriams. Angiogenezė apibrėžiama kaip naujų kraujagyslių formavimasis šakojimosi („sprouting“) arba skilimo („intussusception“) būdais iš jau esamų kraujagyslių tinklo (21).

1.8. Angiogenezė „sprouting“

Sprouting angiogenezė tai naujų kraujagyslių formavimasis, kurio metu nuo egzistuojančių kraujagyslių atsišakoja naujosios. Angiogeneniai signalai skatina pericitų atsiskyrimą ir degradaciją nuo pamatinės membranos, ko pasekoje ant subrendusių kraujagyslių formuojasi naujos šakos, dengtos pericitais ir pamatine membrana. Tuo pačių metu angiogeniniai signalai stimuliuoja epitelinių ląstelių diferenciaciją į „tip“ arba „stalk“ ląsteles (22). „Tip“ ląstelės formuoja filopodijas, kurios nukreipia būsimą kraujagyslę link angiogeninio stimulo. Šios ląstelės pasižymi didele DLL4 ligando raiška, mažu poveikio aktyvumu į „Notch“ signo perdavimo kelią, lėtu dauginimusi ir spindžio trūkumu. „Stalk“ ląstelės išskiria Notch1 ir greitai dauginasi, šios ląstelės palaiko besiformuojančios kraujagyslės ilgėjimą.

(18)

Nauja endotelio ląstelių šaka turi suformuoti spindį ir susijungti su kita kraujagysle, kad pradėtų funkcionuoti. Spindžio formavimąsi sudaro keletas skirtingų mechanizmų, įskaitant pūslelių epiteliocituose formavimąsi ir susiliejimą (ląstelės įdubimą) ir spindžio tarp epiteliocitų susidaryma (kordos įdubimą) (25).

1.9. Navikų angiogenezė:

Angiogenezė ir aprūpinimas krauju yra labai svarbus navikų augimui ir jų progresavimui (26)[16]. Hipoksija yra vienas iš pagrindinių angiogenezės veiksnių, kuris skatina proangiogeninių veiksnių, įskaitant ir VEGF-A išskyrimą. Lyginant su fiziologine angiogeneze, navikai pasižymi padidinta proangiogeninių veiksnių gamyba ir balanso praradimu tarp pro- ir anti- angiogeninių veiksnių. Taip sutrikdomas naujų kraujagyslių formavimąsi, to pasekoje tęsiasi nekontroliuojama angiogenezė, kurios metu formuojasi patologinis kraujagyslių tinklas (27). Navikinės ląstelės yra pakitusios morfologijos ir praradusios šakojimosi modelį, kuris skiria arterijas, venas ir kapiliarus. Jų forma, dilatacija ir susisukimas yra pakitę (28).

Navikų kraujagyslių endoteliocitai yra praradę savo kūbinę formą ir nėra pakankamai priartėję vienas prie kito, tai sąlygoja didesnį kraujagyslių pralaidumą. Šios ląstelės pakitę ir funkciškai, o jų metaboliniai procesai labai priklausomi nuo gliukozės metabolizmo organizme (29). Naviko kaujagyslių endoteliocitams būdingos šios savybės: pagreitėjęs dauginimasis ir citogeniniai pokyčiai (30). Naviko kraujagyslių pericitai laisvesni ir mažiau susipynę lyginant su normaliomis kraujagyslėmis. Šiuos naviko kraujagyslių patologinius pokyčius sąlygoja nevienodas aprūpinimas krauju, deguonies stygius ir rūgštinė aplinka.

(19)

1.10. VEGF šeima ir „VEGF-A“ veiksnio funkcija joje

Į skirtingus kraujagyslių augimo mechanizmus yra įtraukti įvairiausi molekuliniai veiksniai. Dominuojantys faktoriai yra kraujagyslinio endotelio augimo faktoriaus (VEGF) šeima ir angiopoetino (Ang) šeima (10). VEGF šeimą sudaro šeši veiksniai, kurie atsakingi už angiogenezę ir limfogenezę. Tai sekretuojami glikoproteinai: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E ir placentos augimo faktorius (PlFG) – 1 ir – 2. VEGF–A (dažniausiai apibrėžiamas kaip VEGF) buvo pirmasis nustatytas faktorius, išskirtas iš navikinių ląstelių sekretuojamo skysčio, kuris skatina kraujagyslių pralaidumą (33). VEGF–A yra 45-kad homodimerinis glikoproteinas, turintis skirtingo diapazono angiogeninį aktyvumą. Šis veiksnys alternatyvaus splaisingo metu suformuoja brandžias izoformas iš 121, 165, 189 ir 206 aminorūgščių, taip pat galimi retesni variantai iš 145 ir 183 aminorūščių. VEGF121 yra laisvai sekretuojamas, tačiau didesnės izoformos (VEGF189 ir VEGF206) yra izoliuotos tarpląsteliniame jungiamajame audinyje (TJA), o jų aktyvacijai reikalingos proteazės. VEGF165 egzistuoja tiek tirpioje, tiek prisijungusioje prie TJA formose. Su TJA susijusios VEGF-A, VEGF-C ir VEGF-D izoformos C-gale gali būti paverstos į tirpias per plazminų skilimą, kurių metu generuojami bioktyvūs fragmentai. Kitas būdas išlaisvinti VEGF iš TJA – veikiant matrikso metaloproteinazei (MMP-9), šis fermentas įjungia angiogeninį jungiklį. VEGF165 yra predominuojanti izoforma ir jo raiška dažniausiai padidinta įvairiuose solidiniuose navikuose (34).

VEGF – A faktorius svarbus fiziologiniuose angiogenzės procesuose, tokiuose kaip: embriono kraujagyslių formavimesi, skeleto morfogenezei ir augimui, postnatalinei angiogenezei, žaizdų gijimo ir reprodukcijos funkcijoms. Buvo nustatyja, jog pelėms, kurioms trūko bent vieno VEGF – A alelio buvo sutrikusi angiogenezė, kuri vėliau sąlygojo mirtį. Šis veiksnys taip pat atsakingas už navikų angiogenezę, o to pasekoje ir navikinių ląstelių metastazavimą (35).

1.11. VEGF-A receptoriai ir jų veikimo keliai

(20)

Kraujagyslių endotelio ląstelėse VEGF – A dažniausiai aktyvuoja VEGFR-2 (38). Faktorius taip pat sąveikauja su VEGFR – 1 (39),(40). Dėl reliatyviai silpno kinazės aktyvumo šis receptorius yra laikomas inhibuojančiu receptoriumi VEGF – A, nes prisijungdamas faktorių, neleidžia jam jungtis prie VEGFR-2. Vėliau buvo nustatyta, jog VEGF-A/VEGFR – 1 signalo perdavimo kelias atsakingas už naujų kraujagyslių formavimąsi susijusį su įvairiausiomis patologijoms, įskaitant ir navikus (41),(42),(43). VEGF/VEGFR signalo kelias yra aktyvinamas daugybėje navikų, yra susijęs su nekontroliuojama angiogeneze ir metastazavimu. Didėjant naviko masei ir stingant deguonies bei maisto medžiagų tolimesniam augimui užtikrinti, pats navikas arba TJA esančios stromos ląstelės gamina proangiogeninius faktorius, kurie skatina endotelio ląsteles daugintis ir migruoti. To rezultatas – naujų kraujagyslių, kurios teikia deguonį ir maisto medžiagas navikui, formavimasis. Hipoksijos indukuojamas faktorius alfa (HIF-1α), šis transkripcijos faktorius aktyvuojamas, kai sumažėja deguonies kiekis, kontroliuoja VEGF – A geno transkripciją. Šios naujai susiformavusios kraujagyslės užtikriną puikų kelią naviko metastazių plitimui. Vis dėlto naujų kraujagyslių tinklas, suformuotas veikiant naviko atpalaiduotam VEGF – A faktoriui, yra struktūriškais ir funkciškai pakitęs (44),(45),(46). VEGF-A turi funkciją ne tik aktyvuoti VEGFR-1, bet ir sutelkti monocitus/makrofagus bei skatinti jų virtimą į su tumoru susijusiais (TAMs). Šios imuninės ląstelės sukelia uždegimą, naviko augimą, invaziją ir metastazes (47),(48),(49).

VEGF – A per didelė raiška dažniausiai susijusi su didesniu naviko invazyvumu ir didele atsinaujinimo rizika bei nepalankia prognoze (50). Tuo remiantis, VEGF-A/VEGFRs signalo inhibavimas leidžia rinktis plačiai naudojamą navikų gydymo metodą naudojant anti-VEGF-A ir anti-VEGFR-2 monokloninius antikūnus (mAbs) (51),(52). Deja, veiksniai, kurie trikdo VEGF-A/VEGFR-2 signalo perdavimą taip pat inhibuoja ir fiziologinę angiogenezę ir sukelia sunkius sisteminius nepageidaujamus efektus. Priešingai, selektyvus taikymąsis į VEGFR-1 signalo perdavimą, ar išskirtinai į šio receptoriaus ligandus (P1GF ar VEGF-B), gali būti tinkamas pasirinkimas siekiant susilpninti naviko skatinamą kraujagyslių formavimą. Svarbiausia, jog VEGFR-1 yra susijęs su navikų, bet ne fiziologine angiogeneze, todėl tikimasi, jog VEGFR-1 blokuojantis gydymas sukelia mažiau nepageidaujamų reiškinių, nei gydymas nukreiptas į VEGFR-2 (52),(53).

(21)

(22)

TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI

2.1. Tyrimo planavimas

Magistrinio baigiamojo darbo tyrimai atlikti LSMU Neuromokslų institute, Oftalmologijos laboratorijoje ir LSMUL KK Ausų, nosies ir gerklės ligų klinikoje. Prieš pradedant šį darbą buvo analizuojamas problemos aktualumas, renkama informacija apie anksčiau atliktus mokslinius tyrimus, aiškinančius burnos dugno navikų etiopatogenezę, nagrinėjami VEGF - A pakitimai ir jo ryšys su burnos dugno navikais. Vėliau analizuojamos genetinių tyrimų metodikos, jos įsisavinamos ir užsakomi reagentai bei laboratorinės priemonės, reikalingos VEGF – A rs833068, rs1413711 ir rs833061 polimorfizmui nustatyti. Gavus LSMU bioetikos centro leidimą (Nr. BE-2-37) buvo pradėtas magistro baigiamojo darbo tyrimas.

Tyrimas buvo patvirtintas Lietuvos bioetikos komiteto biomedicininiams tyrimams atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete. Tyrimas buvo atliktas Lietuvos sveikatos universitete, Neuromokslų institute, Oftalmologijos laboratorijoje.

2.2. Tyrimo objektas:

Tyrimo metu burnos dugno vėžiu sergantiems pacientams ir kontrolinės grupės asmenims buvo ištirti VEGF - A rs833068, rs1413711 ir rs833061 polimorfizmai.

2.3. Tiriamųjų atranka:

(23)

I grupė: pacientai, sergantys burnos dugno vėžiu (n = 46). Tiriamųjų amžius svyravo nuo 40 iki 84 metų. Grupę sudarė 11 moterų (23,9 proc.) ir 35 vyrai (76,1 proc.).

II grupė (kontrolinė): šią grupę sudarė sveiki pacientai 105 pacientai. Tiriamųjų amžius svyravo nuo 55 iki 79 metų. Grupę sudarė 41 moterys (39,0 proc.) ir 64 vyrai (61,0 proc.).

2.3.1. Burnos dugno navikų grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai: 1. Pacientai, kuriems diagnozuotas burnos dugno vėžys. 2. Nesergantys kitomis onkologinėmis ligomis.

3. Gera bendra būklė.

4. Pasirašyta informuota asmens sutikimo anketa. 5. Sutikimas dalyvauti tyrime.

2.3.2. Burnos dugno navikų grupės neįtraukimo į tyrimą kriterijai:

1. Sisteminės ligos (cukrinis diabetas, onkologinės ligos, sisteminės jungiamojo audinio ligos, lėtinės infekcinės ligos, būklė po audinių ar organų transplantacijos)

2. Kitos burnos dugno ligos.

2.3.3. Kontrolinės grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai: 1. Nesergantys onkologiniais susirgimais.

2. Nesergantys lėtiniais ir ūminiais infekciniais susirgimais. 3. Pasirašyta informuota asmens sutikimo forma.

(24)

1. Kiti navikiniai susirgimai. 2. Rūkantys, vartojantys alkoholį.

Kontrolinė grupė sudaryta iš sveikų žmonių, kurie kreipėsi į LSMUL KK Ausų, nosies ir gerklės skyrių profilaktiniam ištyrimui, kurie atitiko amžiaus ir lyties pasiskirstymą burnos dugno vėžiu sergančiųjų grupėje.

2.4. Mėginių rinkimas:

Tyrimui kraujas iš pacientų ir kontrolinės grupės asmenų buvo paimtas į vakuuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatas), kad nesukrešėtų. Iki DNR skyrimo mėgintuvėliai buvo laikomi -20 °C temperatūroje, LSMU Neuromokslų institute, Oftalmologijos laboratorijoje.

2.5. Deoksiribonukleino rūgšties išskyrimas:

Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) išskyrimui kraujas buvo surinktas į vakuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatu), kad nesusidarytų mikrokrešuliai ir DNR būtų apsaugota nuo degradacijos. Tyrime naudojama Genominė DNR buvo išskirta iš periferinio kraujo baltųjų kraujo ląstelių – leukocitų, naudojant ,,Thermo Scientific GenJET Genomic DNA Purtification Kit’’ rinkinį.

2.5.1. DNR išskyrimas naudojant magnetines daleles

(25)

2.5.1.1. Rinkinio sudedamosios dalys:

• Skaidymo tirpalas (Digestion solution) • Lizavimo tirpalas (Lysis solution) • Plovimo buferis I (Wash buffer I) • Plovimo buferis II (Wash buffer II) • Eliucijos buferis (Elution buffer) • Proteinazės K tirpalas • Rnazės A tirpalas • Magnetinės dalelės • Magnetinis stovelis 2.5.2. DNR gryninimo etapai: 2.5.2.1. Ląstelių lizė

Pirmiausia į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 µl veninio kraujo, 200 µl skaidymo tirpalo 20 µl proteinazės K tirpalo. Mėginys gerai išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56ºC temperatūroje. Skaidymo tirpalas suardo išorinę ląstelių membraną. Proteinazė K suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir inaktyvuoja nukleazes, ardančias DNR.

(26)

2.5.2.3. DNR surišimas su magnetinėmis dalelėmis

Į mėginį įpilama 300 µl lizės buferio, 400 µl 96 proc. etanolio ir 25 µl magnetinių dalelių. Sumaišytas mėginys įstatomas į magnetinį stovelį ir laikoma 3 min. DNR su magnetinėmis dalelėmis prikimba prie mėgintuvėlio sienelės, esančios prie magneto.

2.5.2.4. DNR išvalymas nuo baltyminių liekanų, druskų ir reagentų, panaudotų ląstelių lizavimui DNR išvalymui naudojami du buferiai. Pirmiausiai į mėginį įpilama 800 µl plovimo buferio I, mėginys sumaišomas. Vėliau mėginys du kartus plaunamas naudojant 800 µl plovimo buferio II. Po kiekvieno plovimo mėginys įstatomas 2 – 3 min. į magnetinį stovelį.

2.5.2.5. DNR išgryninimas

Naudojamas eliucijos buferis. Į mėginį įpilama 75 µl eliucijos buferio, mėginys gerai sumaišomas ir inkubuojamas 72ºC temperatūroje 5 min.

2.6. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru

(27)

2.7. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu

Geno polimorfizmų tyrimai (VEGF - A rs833068, rs1413711 ir rs833061) buvo atlikti tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu.

2.7.1. PGR etapai

TL – PGR sudaro trys cikliškai pasikartojantys etapai:

1. Pirmas etapas – DNR denatūracija. Šis etapas vyksta 94 – 95ºC temperatūroje. Jo metu, nutrūksta vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių ir DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.

2. Antras etapas – pradmenų hibridizacija, vykdoma 40 - 60ºC temperatūroje. Pradmenys šio etapo metu vandenilinėmis jungtimis jungiasi prie jiems komplementarių dauginamos DNR sričių.

3. Trečias etapas – elongacija, vyksta 72ºC temperatūroje, reakciją katalizuoja fermentas Taq polimerazė. Šio etapo metu polimerazė sintetina komplementarią matricinei DNR grandinę.

Grandinė sintetinama iš mononukleotidų, kurie pridedami į terpę. DNR kiekis, kartojant denatūraciją, hibridizaciją ir elongaciją didėja eksponentiškai.

2.7.2. PGR principas

(28)

,,Applied Biosystems‘‘ genotipavimo rinkinys (VEGF - A rs833068) Arba (VEGF – A rs1413711) Arba (VEGF – A rs833061) 0,5 µl 23 µl Viso (PGR mišinio) 9 µl 414 µl DNR 1 µl Viso 10 µl

2 lentelė. Optimalios genotipavimo reakcijos sąlygos nustatant VEGF - A rs833068 genotipą tikro laiko PGR gausintuvu ,,StepOnePlus real-time PCR system‘‘

Genotipavimo rinkinys PGR sąlygų protokolas Produkto

dydis ,,Applied Biosystems‘‘ genotipavimo rinkinys

(VEGF - A rs833068) 95ºC 10 min

50 ciklų: 92ºC 15s

60ºC 90s Nenurodyta ,,Applied Biosystems‘‘ genotipavimo rinkinys

(VEGF - A rs1413711) 95ºC 10 min

50 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 90s

Nenurodyta

,,Applied Biosystems‘‘ genotipavimo rinkinys (VEGF - A rs833061) 95ºC 10 min 50 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 90s Nenurodyta 2.7.3. Metodas:

1. Paruošiamas PGR mišinys visiems mėginiams. 2. Mišinys išpilstomas po 9 µl į 96 šulinėlių plokšteles.

3. Į šulinėlius su PGR mišiniu įpilama po 1 µl DNR, o paskutiniame šulinėlyje, kaip neigiama kontrolė, įpilamas sterilus vanduo.

(29)

6. Po 2 val. programa baigia darbą. Gauti genotipavimo rezultatai, kaip pavyzdys pateikiamas 2 paveikslas. Pagal skirtingų detektorių fluorescensijos intensyvumo santykį, programa nustato individų genotipus. X ašyje VIC fluorescensiniais dažais žymėtas molekulinis zondas, o Y ašyje FAM fluorescensiniais dažais žymėtas molekulinis zondas. Gauti rezultatai toliau naudojami statistiniams skaičiavimams.

1 pav. ,,Alelių nustatymo’’ programos rezultatų diagrama

Žalios spalvos taškai – heterozigotai, mėlyni ir raudoni – homozigotai pagal skirtingus alelius.

2.8. Statistinė analizė

(30)

(31)

REZULTATAI

Tyrime buvo suformuotos pacientų ir kontrolinė grupės. Amžius pacientų grupėje atitiko normalumo skirstinį (Shapiro-Wilk p = 0,492), o kontrolinėje grupėje neatitiko normalumo skirstinio (Shapiro-Wilk p = 0,000). Statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo nustatyta lyginant grupes pagal amžių (Mann-Whitney U p = 0,064). Lyginant lyčių pasiskirstymą pacientų ir kontrolinėje grupėse statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatėme. (Pearson Chi-Square p = 0,046). Tiriamųjų charakteristikos pateikiamos 3 lentelėje.

3 lentelė. Tiriamųjų charakteristikos

Grupė

Pacientai Kontrolinė

Vyrai Moterys Vyrai Moterys

Lytis Skaičius 35 11 64 41 Iš viso: 46 105 Dažnis 76,1% 23,9% 61,0 % 39,0 % Iš viso: 100% 100% Amžius (metai) Mediana 59,5 60 IQR 13,25 16,00 p reikšmė 0,064 G n (proc.) 1 1 (2%) - 2 34 (76%) - 3 10 (22%) - 4 - - Stadija 1 2 (4%) - 2 7 (16%) - 3 12 (27%) - 4 24 (53%) -

G – morfologinis diferenciacijos laipsnis. IQR – tarpkvartilinis plotis.

(32)

ir rs833068 genotipų ir alelių pasiskirstymus tiriamosiose grupėse statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (4 lentelė).

4 lentelė. VEGF – A rs1413711, rs833061, rs833068 genotipų dažnis pacientų, sergantiems burnos dugno vėžiu ir kontrolinėje grupėje

Genotipas Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė (n = 108) (proc.) P HWE BDV grupė (n = 46) (proc.) Grupių palyginimas P reikmė Genas VEGF - A rs1413711 T/T 49 (45,4)1 0,122 9 (19,6)1 χ2 = 9,512 p = 0,009 C/T 40 (37,0) 23 (50,0) C/C 19 (17,6) 14 (30,4) Alelis T 138 (64) 41 (45) p = 0,002 C 78 (36) 51 (55) VEGF - A rs833061 T/T 31 (28,7) 0,158 15 (32,8) χ2 = 1,971 p = 0,373 C/T 44 (40,7) 22 (47,8) C/C 33 (30,6) 9 (19,6) Alelis T 106 (49) 52 (57) p = 0,231 C 110 (51) 40 (43) VEGF - A rs833068 G/G 60 (55,6) 0,957 24 (52,2) χ2 = 0,160 p = 0,923 A/G 41 (38,0) 19 (41,3) A/A 7 (6,5) 3 (6,5) Alelis G 161 (75) 67 (73) p = 0,754 A 55 (25) 25 (27)

BDV – burnos dugno vėžys, p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio – Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05, χ2 – Chi kvadrato reikšmė, p1_{= 0,003 (Chi kvadrato testas).}

(33)

C/C vs. T/T 3,766 (1,395 - 10,170) 0,009 Dominantinis C/T + C/C vs. T/T 3,205 (1,406 - 7,308) 0,006 Recesyvinis C/C vs. C/T + T/T 1,980 (0,889 - 4,411) 0,094 Viršdominantinis C/T vs. T/T + C/C 1,625 (0,807 - 3,270) 0,174 Adityvinis C 1,983 (1,200 - 3,128) 0,007 rs833061

Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p reikšmė

Kodominantinis C/T vs. C/C 1,819 (0,739 - 4,476) 0,193 T/T vs. C/C 1,778 (0,677 - 4,666) 0,243 Dominantinis C/T + T/T vs. C/C 1,802 (0,779 - 4,169) 0,169 Recesyvinis T/T vs. C/T + C/C 1,210 (0,573 - 2,555) 0,618 Viršdominantinis C/T vs. C/C + T/T 1,322 (0,658 - 2,654) 0,433 Adityvinis T 1,303 (0,819 - 2,074) 0,264 rs833068

Kodominantinis A/G vs. G/G 1,198 (0,580 - 2,473) 0,626

A/A vs. G/G 1,054 (0,251 - 4,417) 0,943

Dominantinis A/G + A/A vs. G/G 1,176 (0,587 - 2,356) 0,648

Recesyvinis A/A vs. A/G + G/G 0,977 (0,241 - 3,958) 0,974

Viršdominantinis A/G vs. A/A + G/G 1,191 (0,587 - 2,417) 0,629

Adityvinis A 1,106 (0,634 - 1,928) 0,723

GS – galimybių santykis, p – reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

3.2. rs1413711, rs833061, rs833068 polimorfizmų sąsajos su burnos dugno vėžio pasireiškimu, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių ir lytį.

Antras baigiamojo magistro darbo uždavinys buvo įvertinti VGFA - A polimorfizmų (rs1413711, rs833061, rs833068) įtaką burnos dugno vėžio išsivystymui priklausomai nuo lyties ir amžiaus. Polimorfizmai buvo įvertinti kontrolinėje ir sergančiųjų grupėse lyginant vyrų ir moterų grupes (6 lentelė). Taip pat, šie polimorfizmai įvertinti suskirsčius tiriamuosius į dvi amžiaus grupes: < 60 metų ir ≥ 60 metų (6 lentelė).

(34)

Tiriant rs833061 genotipų (TT, CC ir CC) pasiskirstymus moterų sergančių burnos dugno vėžiu ir kontrolinėje grupėse, nustatėme jog šie skiriasi statistiškai reikšmingai (36,4 proc., 63,6 proc. ir 0 proc. vs. 39 proc., 39 proc. ir 22 proc. , atitinkamai, p = 0,040), (6 lentelė). Taip pat nustatyta, jog rs833068 AG genotipas statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančiųjų moterų grupėje, lyginant su kontroline grupe (72,7 proc. vs. 39,0 proc., p = 0,046, atitinkamai). VEGF - A rs833061 genotipų ir alelių analizė statistiškai reikšmingų rezultatų neparodė (6 lentelė).

6 lentelė. VEGF – A rs1413711, rs833061, rs833068 genotipų analizė pagal lytį tiriamųjų grupėse

Genotipas Dažnis (proc.) Vyrai P Moterys P Kontrolinė grupė n = 64 (proc.) BDV grupė n = 35 (proc.) Kontrolinė grupė n = 41 (proc.) BDV grupė n = 11 (proc.) Genas VEGF - A rs1413711 TT 31 (48,4)1 _{9 (25,7)}1 χ2 = 6,434 p = 0,040 15 (36,6)3 ₀3 χ2 = 6,188 p = 0,045 TC 24 (37,5) 15 (42,9) 16 (39)4 8 (72,7)4 CC 9 (14,1)2 _{11 (31,4)}2 _{10 (24,4)} _{3 (27,3)} Alelis T 86 (67) 33 (47) p = 0,006 46 (56) 8 (36) p = 0,100 C 42 (33) 37 (53) 36 (33) 14 (64) VEGF - A rs833061 TT 14 (21,9%) _(31,4%)11 χ2 = 1,552 p = 0,460 16 (39,0) 4 (36,4) χ2 = 6,434 p = 0,040 CT 27 (42,2%) _(42,9%)15 16 (39,0) 7 (63,6) CC 23 (35,9%) 9 (25,7%) 9 (22,0) 0 Alelis T 55 (43) 37 (53) p = 0,182 48 (59) 15 (68) p = 0,411 C 73 (57) 33 (47) 34 (41) 7 (32) VEGF - A rs833068 GG 38 (59,4) 21 (60,0) χ2 = 0,699 p = 0,705 21 (51,2) 3 (27,3) χ2 = 4,285 p = 0,117 AG 23 (35,9) 11 (31,4) 16 (39,0)5 8 (72,7)5 AA 3 (4,7) 3 (8,6) 4 (9,8) 0 Alelis G 99 (77) 53 (76) p = 0,795 58 (70) 14 (64) p = 0,522 A 29 (23) 17 (24) 24 (30) 8 (36)

BDV – burnos dugno vėžys, p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio – Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05, χ2 – Chi kvadrato reikšmė, p1_{= 0,028; p}2_{= 0,040 ; p}3_{= 0,017 ; p}4_{= 0,046; p}5_{= 0,046.}

Atlikus dvinarę logistinę analizę pagal tiriamųjų lytis gauti šie rezultatai:

(35)

galimybę 2 kartus (GS = 2,059; 95 proc. PI: 1,163 - 3,646; p = 0,013). VEGF - A rs833061 ir rs833068 genotipų ir alelių analizė statistiškai reikšmingų rezultatų neparodė (7 lentelė).

7 lentelė. VEGF – A rs1413711, rs833061, rs833068 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė pagal lytį

VYRAI rs1413711

Kodominantinis C/T vs. T/T 2,153 (0,805 - 5,755) 0,126 C/C vs. T/T 4,210 (1,331 - 13,320) 0,014 Dominantinis C/T + C/C vs. T/T 2,714 (1,100 - 6,693) 0,030 Recesyvinis C/C vs. C/T + T/T 2,801 (1,027 - 7,636) 0,044 Viršdominantinis C/T vs. T/T + C/C 1,250 (0,540 - 2,893) 0,602 Adityvinis C 2,059 (1,163 - 3,646) 0,013 rs833061

A/A vs. G/G 1,810 (0,335 - 9,774) 0,491

Adityvinis A 1,091 (0,557 - 2,140) 0,799

MOTERYS rs1413711

Kodominantinis C/T vs. T/T - -

C/C vs. T/T - -

Dominantinis C/T + C/C vs. T/T - -

(36)

Adityvinis T 1,479 (0,559 - 3,915) 0,431

rs833068

A/A vs. G/G - -

Dominantinis A/G + A/A vs.

G/G 2,800 (0,649 - 12,073) 0,167

Recesyvinis A/A vs. A/G +

G/G - -

Adityvinis A 1,426 (0,501 - 4,060) 0,506

Atlikta rs1413711, rs833061 ir rs833068 genotipų ir alelių analizė skirtingo amžiaus grupėse parodė, jog rs1413711 polimorfizmo TT genotipas ≥ 60 metų amžiaus grupėje buvo statistiškai reikšmingai retesnis sergantiems, nei kontrolinės grupės asmenims (13,0 proc. vs. 45,8 proc., p = 0,006, atitinkamai), o CC genotipas statistiškai reikšmingai dažnesnis sergantiems, nei kontrolinės grupės asmenims (39,1 proc. vs. 13,6 proc., p = 0,010, atitinkamai). Nustatyta, jog šioje amžiaus grupėje rs1413711 C alelis yra statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančiųjų grupėje, lyginant su sveikųjų grupe (63 proc. vs. 34 proc., p = 0,001, atitinkamai) (8 lentelė). Rs833061 polimorfizmo genotipų ir alelių skirtumai lyginant sergančiųjų burnos dugno vėžiu ir kontrolinę grupes nustatyti taip pat tik ≥ 60 metų amžiaus grupėje. Rs833061 CC genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis sergantiems burnos dugno vėžiu, nei kontrolinės grupės asmenims (13,0 proc. vs. 37,3 proc., p = 0,030, atitinkamai). Taip pat nustatyta, jog T alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis burnos dugno vėžiu sergančiųjų grupėje, lyginant su kontroline grupe (65 proc. vs. 42 proc., p = 0,009, atitinkamai) (8 lentelė). VEGF - A rs833068 genotipų ir alelių analizė statistiškai reikšmingų rezultatų neparodė.

(37)

VEGF - A rs833061 TT 17 (37,0) 5 (21,7) χ2 = 1,642 p = 0,440 13 (22,0%) 10 (43,5) χ2 = 5,935 p = 0,051 CT 19 (41,3) 12 (52,2) _(40,7%)24 10 (43,5) CC 10 (21,7) 6 (26,1) 22 (37,3%)3 3 (13,0)3 Alelis T 53 (58) 22 (48) 0,227 50 (42) 30 (65) p = 0,009 C 39 (42) 24 (52) 68 (58) 16 (35) VEGF - A rs833068 GG 23 (50,0) 13 (56,5) _χ2₌ 0,292 p = 0,864 36 (61) 11 (47,8) χ2 = 1,370 p = 0,504 AG 19 (41,3) 8 (34,8) 20 (33,9) 11 (47,8) AA 4 (8,7) 2 (8,7) 3 (5,1) 1 (4,3) Alelis G 65 (70) 34 (74) 0,688 92 (78) 33 (72) p = 0,400 A 27 (30) 12 (26) 26 (22) 13 (28)

BDV – burnos dugno vėžys, p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio – Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05, χ2 – Chi kvadrato reikšmė, p1_{= 0,006; p}2_{= 0,010; p}3_{= 0,030.}

Atlikus dvinarę logistinę regresiją skirtingose amžiaus grupėse gauti šie rezultatai:

Tiriamųjų ≥ 60 metų amžiaus grupėje nustatyta, jog rs1413711 CT genotipas, lyginant su TT genotipu, didina galimybę sirgti burnos dugno vėžiu 4 karus (GS = 4,125; 95 proc. PI: 1,027 – 16,561; p = 0,046), CC genotipas lyginant su TT genotipu šią galimybę didina 10 kartų (GS = 10,125; 95 proc. PI: 2,200 - 46,589; p = 0,003). CT ir CC genotipai kartu, lyginant su TT genotipu, didina galimybę sirgti burnos dugno vėžiu 5,6 karto (GS = 5,625; 95 proc. PI: 1,507 - 20,997; p = 0,010). Taip pat CC genotipas, lyginant su CT ir TT genotipais kartu, statistiškai reikšmingai didina galimybę susirgti burnos dugno vėžiu 4 kartus (GS = 4,098; 95 proc. PI: 1,027 - 7,636; p = 0,044). Kiekvienas C alelis didina susirgimo galimybę 3 kartus (GS = 3,102; 95 proc. PI: 1,492 - 6,451; p = 0,002) (5 lentelė).

(38)

C/C vs. T/T 1,439 (0,355 - 5,837) 0,610 Dominantinis C/T + C/C vs. T/T 1,994 (0,663 - 5,992) 0,219 Recesyvinis C/C vs. C/T + T/T 0,884 (0,266 - 2,935) 0,840 Viršdominantinis C/T vs. T/T + C/C 2,045 (0,739 - 5,664) 0,169 Adityvinis C 1,253 (0,648 - 2,422) 0,502 rs833061

A/A vs. G/G 0,885 (0,142 - 5,507) 0,895

Adityvinis A 0,854 (0,390 - 1,872) 0,694

≥ 60 metų rs1413711

Kodominantinis C/T vs. T/T 4,125 (1,027 - 16,561) 0,046 C/C vs. T/T 10,125 (2,200 - 46,589) 0,003 Dominantinis C/T + C/C vs. T/T 5,625 (1,507 - 20,997) 0,010 Recesyvinis C/C vs. C/T + T/T 4,098 (1,336 - 12,573) 0,014 Viršdominantinis C/T vs. T/T + C/C 1,337 (0,507 - 3,523) 0,557 Adityvinis C 3,102 (1,492 - 6,451) 0,002 rs833061

Kodominantinis C/T vs. C/C 3,056 (0,743 - 12,565) 0,122 T/T vs. C/C 5,641 (1,309 - 24,316) 0,020 Dominantinis C/T + T/T vs. C/C 3,964 (1,055 - 14,887) 0,041 Recesyvinis T/T vs. C/T + C/C 2,722 (0,973 - 7,616) 0,056 Viršdominantinis C/T vs. C/C + T/T 1,122 (0,423 - 2,972) 0,817 Adityvinis T 2,280 (1,150 - 4,522) 0,018 rs833068

(39)

3.3. rs1413711, rs833061, rs833068 genotipų dažnis sergantiems burnos dugno vėžiu priklausomai nuo stadijos ir diferenciacijos laipsnio

Trečias baigiamojo darbo uždavinys buvo įvertinti VEGF – A polimorfizmų (rs1413711, rs833061, rs833068) sąsajas su burnos dugno vėžio stadija ir diferenciacijos laipsniu. Atlikta rs1413711, rs833061, rs833068 genotipų ir alelių analizė sergančiųjų burnos dugno vėžiu atsižvelgiant į ligos stadiją (10 lentelė) ir morfologinį diferenciacijos laipsnį G (11 lentelė) statistiškai reikšmingų skirtumų neparodė.

10 lentelė. VEGF – A rs1413711 rs833061, rs833068 genotipų analizė pagal klinikinę ligos stadiją rs1413711

Genas Genotipas _{1 n(proc.) 2 n(proc.) 3 n(proc.) 4 n(proc.)}Ligos stadija χ2 _reikšmėP

VEFG - A rs1413711 CC 0 3 (7%) 3 (7%) 8 (18%) 3,288 0,772 TC 1 (2%) 2 (4%) 7 (16%) 12 (27%) TT 1 (2%) 2 (4%) 2 (4%) 4 (9%) rs833061

VEFG - A rs833061 CC 1 (2%) 2 (4%) 2 (4%) 4 (9%) 2,796 0,834 TC 1 (2%) 2 (4%) 6 (13%) 12 (27%) TT 0 3 (7%) 4 (9%) 8 (18%) rs833068

VEFG - A rs 833068

AA 0 0 1 (2%) 2 (4%)

5,166 0,523

AG 0 4 (9%) 7 (16%) 8 (18%)

GG 2 (4%) 3 (7%) 4 (9%) 14 (31%)

p – reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05, χ2 – Chi kvadrato reikšmė.

(40)

VEFG - A rs833061 CC 0 7 (16%) 2 (4%) 2,074 0,722 TC 0 16 (36%) 5 (11%) TT 1 (2%) 11 (24%) 3 (7%) rs833068

Genas Genotipas G diferenciacijos laipsnis χ2 P reikšmė

1 n(proc.) 2 n(proc.) 3 n(proc.) VEFG - A rs 833068

AA 0 3 (7%) 0

2,165 0,705

AG 0 15 (33%) 4 (9%)

GG 1 (2%) 16 (36%) 6 (13%)

(41)

REZULTATŲ APTARIMAS

Mūsų atliktame tyrime, nustatėme, jog VEGF – A rs1413711 polimorfizmo CC genotipas didina tikimybę susirgti burnos dugno vėžiu.

Daugelis atliktų tyrimų analizuoja VEGF-A koncentraciją kraujo serume, o ne VEGF-A genų polimorfizmus, sergantiems galvos ir kaklo vėžiu.

Moksliniuose tyrimuose koncentracija būna statistiškai reikšmingai padidėjusi galvos ir kaklo plokščialąstelinėmis karcinomomis sergantiems pacientams. Šis padidėjimas nepriklauso nuo naviko dydžio ir vietos (57). Šio faktoriaus raiška navikiniuose audiniuose apie 20 kartų didesnė lyginant su sveikais audiniai (58). VEGF – A raiška stimuliuojama ciklooksigenazės – 2 keliu, o padidėjimas siejamas su tankesniu naviko kraujagyslių tinklu (59). Išsiaiškinta, jog pagrindinis raišką provokuojantis veiksnys yra naviko patiriama hipoksija, kuri atsiranda didėjant navikui. Todėl VEGF – A faktorius gali būti naudojamas kaip naviko patiriamo deguonies trūkumo rodiklis (60). Didžiausias faktoriaus padidėjimas nustatomas pacientams, kurių ligos prognozė yra bloga. Pastebėta, jog galvos ir kaklo navikuose dažniausiai didėja VEGF145 ir VEGF165 izoformų raiška (61). Nustatyta, jog VEGF – A raiškos padidėjimas nėra susijęs su amžiumi, lytimi, diferenciacijos laipsniu, limfmazgių būkle ir rūkymo įpročiais. Tačiau susijusi su sunkesne klinikine stadija (62). Tiriant VEGF faktoriaus raišką tiek burnos plokščialąstelinės karcinomos audiniuose, tiek sveikoje gleivinėje. Imunohistocheminė analizė parodė statistiškai reikšmingą VEGF faktoriaus padidėjimą (53,92 proc.) BPK audinyje lyginant jį su nenavikiniais BPK kraštais ir normalia gleivine. Vis dėlto statistiškai reikšmingo skirtumo tarp amžiaus, lyties, diferenciacijos laipsnio ir patologijos stadijos nebuvo nustatyta (16). Tiriant ar VEGF imunohistocheminė raiška koreliuoja su naviko angiogeneze, nustatyta, kad VEGF – A faktoriaus raiška buvo statistiškai reikšmingai didesnė navikiniame audinyje, lyginant su preneoplastiniu ir normaliu audiniu. Taip pat faktoriaus raiška buvo statistiškai reikšmingai mažesnė mažai diferencijuotose BPK formose lyginant su vidutiniškai diferenciuotomis formomis. VEGF – A raiška buvo didesnė T4 lyginant su T3 stadija ir N2 lyginant su N1 bei N0 stadija (17).

(42)

Mes VEGF – A rs1413711 polimorfizmo grupėje nustatėme, jog TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis, lyginant su kontroline grupe (p = 0,003). C alelis yra statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančiųjų grupėje, lyginant su kontroline grupe (p = 0,002). CC genotipas, lyginant su TT genotipu, didina galimybę susirgti burnos dugno vėžiu 3,8 karto (p = 0,009). Kiekvienas C alelis didina susirgimo burnos dugno vėžiu galimybę 2 kartus (p = 0,007). CC genotipas yra nustatomas statistiškai reikšmingai dažniau vyrams, sergantiems burnos dugno vėžiu, nei sveikiems (p = 0,028). Nustatėme, jog CC genotipas vyrams, lyginant su TT genotipu, statistiškai reikšmingai didina galimybę sirgti burnos dugno vėžiu 4,2 karto (p = 0,006), o kiekvienas C alelis didina susirgimo galimybę 2 kartus (p = 0,013). ≥ 60 metų amžiaus grupėje nustatėme, jog CC genotipas statistiškai reikšmingai dažnesnis sergantiems, nei kontrolinės grupės asmenims (p = 0,010). Atlikus logistinę regresinę analizę nustatėme, kad CC genotipas lyginant su TT genotipu šią galimybę didina 10 kartų (p = 0,003). Nustatėme, jog VEGF – A rs833061 polimorfizmo ≥ 60 metų amžiaus grupėje T alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis burnos dugno vėžiu sergantiesiems, lyginant su kontroline grupe (p = 0,009). TT genotipas, lyginant su CC genotipu, statistiškai reikšmingai didina tikimybę sirgti burnos dugno vėžiu apie 5,6 karto (p = 0,020). Priešingai nei mūsų atliktame tyrime, Zhao SF ir bendraautorių atliktoje meta-analizėje nustatyta, jog šis polimorfizmas statistiškai reikšmingos įtakos burnos dugno vėžio išsivystymui neturi (64). Kitų šio polimorfizmo tyrimų, susijusių su burnos dugno navikais, nebuvo rasta. Tačiau nustatyta, jog šis VEGF – A polimorfizmas taip pat susijęs su gliomos išsivystymo rizika (65). Kitame atliktame tyrime siūloma naudoti VEGF – A kaip diagnostinį biožymenį kiaušidžių vėžio prognozei ir piktybiškumui įvertinti (66).

VEGF – A rs833068 polimorfizmo grupėje AG genotipas statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančiųjų moterų grupėje, lyginant su kontroline grupe (p = 0,046). Lyginome šį tyrimą, su tyrimu atliktu prieš metus, kuriame buvo aiškinamasi VEGF – A rs833068 polimorfizmo genotipų įtaka burnos dugno vėžio išsivystymui. Jame nustatyta, jog AG ir AA genotipai, nepriklausomai nuo lyties, lyginant su GG genotipu kodominantiniame modelyje, galimybę sirgti burnos dugno vėžiu mažina 0,3 karto (p=0,001; p=0,052).). Statistiškai reikšmingi skirtumai atsižvelgiant į vyrišką lytį parodė, jog kiekvienas A alelis mažina galimybę vystytis burnos dugno vėžiui 0,4 karto (p=0,005) (67).

(43)

IŠVADOS

1. Nustatėme, jog VEGF – A rs1413711 polimorfizmo CC genotipas didina tikimybę susirgti burnos dugno vėžiu.

2. VEGF – A rs1413711 polimorfizmo CC genotipas vyrams didina tikimybę susirgti burnos dugno vėžiu.

(44)

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Gelažius R, Gervickas A, Kubilius R. Epidemiology of primary oral cancer diagnostics in Kaunas. Stomatologija. 2018 Jan 1;20(2):49–53.

2. Pagrindiniai onkologinės pagalbos rezultatai Lietuvoje. 2005 metai. (The main results of cancer control in Lithuania. Transitional report 2005.) Vilnius: VU Onkologijos institutas; 2006. No Title.

3. Nacionalinis vėžio institutas. Vėžio registras. Vėžys Lietuvoje 2012 metais. Interneto prieiga : https://www.nvi.lt/uploads/pdf/Vezio%20registras/Vezys_lietuvoje_2012.pdf. No Title.

4. Aygun C, Salazar OM, Sewchand W, Amornmarn R, Prempree T. Carcinoma of the floor of the mouth: A 20-year experience. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1984 Apr 1;10(5):619–26.

5. La’Porte SJ, Juttla JK, Lingam RK. Imaging the floor of the mouth and the sublingual space. Radiographics. 2011 Sep 6;31(5):1215–30.

6. K. Watanabe, M. M. Shoja, M. Loukas, R. S. Tubbs. Anatomy for plastic surgery of the face head and neck. NY: T; 2016. No Title.

7. Montero PH, Patel SG. Cancer of the Oral Cavity. Vol. 24, Surgical Oncology Clinics of North America. W.B. Saunders; 2015. p. 491–508.

8. Kruse AL, Bredell M, Grätz KW. Oral squamous cell carcinoma in smoking and non-drinking patients. Head Neck Oncol. 2010;2(1):24.

9. Liutkevičius, V. Matrikso metaloproteinazių raiškos ir jų genų polimorfizmo charakteristika nepiktybinių gerklų darinių, ikivėžinių būklių bei gerklų vėžio atvejais. Daktaro disertacija, Lietuvos sveikato mokslų universitetas 2011. Repository.lsmuni.lt. Prieiga internetu: https://repository.lsmuni.lt/handle/1/60204. No Title.

10. Garavello W, Bertuccio P, Levi F, Lucchini F, Bosetti C, Malvezzi M, et al. The oral cancer epidemic in central and eastern Europe. Int J Cancer [Internet]. 2010 Jul 1 [cited 2020 May 12];127(1):160–71. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/ijc.25019

11. Kaya I, Ozturk K, Turhal G. Sublingual Lymph Node Metastasis in Early-Stage Floor of the Mouth Carcinoma. Turk Otolarengoloji Arsivi/Turkish Arch Otolaryngol. 2017 Dec

18;55(4):177–9.

(45)

May 12];111(4):486–93. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21420637 14. Domingueti CB, Janini JBM, Paranaíba LMR, Lozano-Burgos C, Olivero P,

González-Arriagada WA. Prognostic value of immunoexpression of ccr4, ccr5, ccr7 and cxcr4 in squamous cell carcinoma of tongue and floor of the mouth. Med Oral Patol Oral y Cir Bucal. 2019 May 1;24(3):e354–63.

15. Feng Z, Wang C, Li B, Kim K, Li J, Mao M, et al. A pilot study of modified resection for anterior floor of the mouth squamous cell carcinoma without infiltration of the mandible. J Cranio-Maxillofacial Surg. 2019 Mar 1;47(3):516–22.

16. Li C, Sun CJ, Fan JC, Geng N, Li CH, Liao J, et al. Angiopoietin-2 expression is correlated with angiogenesis and overall survival in oral squamous cell carcinoma. Med Oncol. 2013 Jun;30(2). 17. Mǎrgǎritescu C, Pirici D, Stîngǎ A, Simionescu C, Raica M, Mogoantǎ L, et al. VEGF

expression and angiogenesis in oral squamous cell carcinoma: An immunohistochemical and morphometric study. Clin Exp Med [Internet]. 2010 Dec [cited 2020 May 12];10(4):209–14. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20376688

18. Cheng SJ, Lee JJ, Kok SH, Chou CH, Chang HH, Yang H, et al. Expression of vascular endothelial growth factor is significantly associated with progression and prognosis of oral squamous cell carcinomas in Taiwan. J Formos Med Assoc. 2011;110(1):50–7.

19. Mittal K, Ebos J, Rini B. Angiogenesis and the tumor microenvironment: Vascular endothelial growth factor and beyond. Semin Oncol. 2014;41(2):235–51.

20. Carmeliet P, Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseases. Vol. 407, Nature. 2000. p. 249–57.

21. Naito H, Iba T, Takakura N. Mechanisms of new blood-vessel formation and proliferative heterogeneity of endothelial cells. Int Immunol [Internet]. 2020 Jan 30;32(5):295–305. Available from: https://doi.org/10.1093/intimm/dxaa008

22. Blanco R, Gerhardt H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 2013 Jan;3(1).

(46)

research on angiogenesis. N Engl J Med [Internet]. 1995 Dec 28 [cited 2020 May 13];333(26):1757–63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7491141

27. Bergers G, Benjamin LE. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer [Internet]. 2003 Jun [cited 2020 May 13];3(6):401–10. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12778130

28. Jain RK. Molecular regulation of vessel maturation. Vol. 9, Nature Medicine. 2003. p. 685–93. 29. Cantelmo AR, Conradi LC, Brajic A, Goveia J, Kalucka J, Pircher A, et al. Inhibition of the

Glycolytic Activator PFKFB3 in Endothelium Induces Tumor Vessel Normalization, Impairs Metastasis, and Improves Chemotherapy. Cancer Cell. 2016 Dec 12;30(6):968–85.

30. Hida K, Hida Y, Amin DN, Flint AF, Panigrahy D, Morton CC, et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 2004 Nov 15;64(22):8249–55. 31. Kuczynski EA, Vermeulen PB, Pezzella F, Kerbel RS, Reynolds AR. Vessel co-option in

cancer. Vol. 16, Nature Reviews Clinical Oncology. Nature Publishing Group; 2019. p. 469–93. 32. Hendrix MJC, Seftor EA, Hess AR, Seftor REB. Vasculogenic mimicry and tumour-cell

plasticity: Lessons from melanoma. Vol. 3, Nature Reviews Cancer. 2003. p. 411–21. 33. Ceci C, Atzori MG, Lacal PM, Graziani G. Role of VEGFs/VEGFR-1 signaling and its

inhibition in modulating tumor invasion: Experimental evidence in different metastatic cancer models. Vol. 21, International Journal of Molecular Sciences. MDPI AG; 2020.

34. Hicklin DJ, Ellis LM. Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis. Vol. 23, Journal of Clinical Oncology. 2005. p. 1011–27.

35. Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor as a Target for Anticancer Therapy. Oncologist. 2004 Jun;9(S1):2–10.

36. Matthews W, Jordan CT, Wiegand GW, Pardoll D, Lemischka IR. A receptor tyrosine kinase specific to hematopoietic stem and progenitor cell-enriched populations. Cell. 1991 Jun 28;65(7):1143–52.

37. Terman BI, Carrion ME, Kovacs E, Rasmussen BA, Eddy RL, Shows TB. Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene. 1991;6(9):1677–83. 38. Simons M, Gordon E, Claesson-Welsh L. Mechanisms and regulation of endothelial VEGF

receptor signalling. Vol. 17, Nature Reviews Molecular Cell Biology. Nature Publishing Group; 2016. p. 611–25.

(47)

activator activity in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Sep 29;95(20):11709–14. 41. Luttun A, Tjwa M, Moons L, Wu Y, Angelillo-Scherrer A, Liao F, et al. Revascularization of

ischemic tissues by PLGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1. Nat Med. 2002;8(8):831–40.

42. Hiratsuka S, Nakao K, Nakamura K, Katsuki M, Maru Y, Shibuya M. Membrane Fixation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Ligand-Binding Domain Is Important for Vasculogenesis and Angiogenesis in Mice. Mol Cell Biol. 2005 Jan 1;25(1):346–54.

43. Bae DG, Kim TD, Li G, Yoon WH, Chae CB. Anti-Flt1 peptide, a vascular endothelial growth factor receptor 1 - specific hexapeptide, inhibits tumor growth and metastasis. Clin Cancer Res. 2005 Apr 1;11(7):2651–61.

44. Ferrara N. VEGF-A: A critical regulator of blood vessel growth. Vol. 20, European Cytokine Network. 2009. p. 158–63.

45. Nagy JA, Chang SH, Dvorak AM, Dvorak HF. Why are tumour blood vessels abnormal and why is it important to know? Vol. 100, British Journal of Cancer. 2009. p. 865–9.

46. Ferrara N. Binding to the extracellular matrix and proteolytic processing: Two key mechanisms regulating vascular endothelial growth factor action. Mol Biol Cell. 2010 Mar 1;21(5):687–90. 47. Linde N, Lederle W, Depner S, Van Rooijen N, Gutschalk CM, Mueller MM. Vascular

endothelial growth factor-induced skin carcinogenesis depends on recruitment and alternative activation of macrophages. J Pathol. 2012 May;227(1):17–28.

48. Incio J, Tam J, Rahbari NN, Suboj P, McManus DT, Chin SM, et al. PlGF/VEGFR-1 signaling promotes macrophage polarization and accelerated tumor progression in obesity. Clin Cancer Res. 2016 Jun 15;22(12):2993–3004.

49. He C, Zhu K, Bai X, Li Y, Sun D, Lang Y, et al. Placental growth factor mediates crosstalk between lung cancer cells and tumor-associated macrophages in controlling cancer

vascularization and growth. Cell Physiol Biochem [Internet]. 2018 Jul 1 [cited 2020 May 13];47(6):2534–43. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29991059