LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA VETERINARIJOS FAKULTETAS NUOLATINöS MAGISTRANTŪROS STUDIJOS UŽKREČIAMŲ LIGŲ KATEDRA

(1)

1

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS

NUOLATINöS MAGISTRANTŪROS STUDIJOS

UŽKREČIAMŲ LIGŲ KATEDRA

AUŠRA KELEVIŠIŪTö

METICILINUI ATSPARAUS STAPHYLOCOCCUS AUREUS IŠSKYRIMAS IŠ

VIŠČIUKŲ BROILERIŲ IR DEDEKLIŲ VIŠTŲ

Darbo vadovas: prof. dr. J. Šiugždait÷

(2)

2

Turinys

1. Įvadas ...3

2. Literatūros apžvalga ...5

2.1. Staphylococcus spp. taksonomija...5

2.2. Stafilokokams būdingos savyb÷s ...6

2.3. S. aureus virulentiškumo, patogeniškumo veiksniai ...7

2.4. S. aureus sukeliamos ligos ...8

2.5. S. aureus atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms...9

2.6. Literatūros apžvalgos išvados ...12

3. Mokslinio darbo schema ir metodika ...13

3.1. Medžiagos ir metodai ...14

3.2. Staphylococcus genties mikroorganizmai išskirti iš viščiukų broilerių ir dedeklių vištų...14

3.3. Staphylococcus aureus padermių identifikavimas ...16

3.4. Meticilinui atsparių Staphylococcus aureus padermių nustatymas ...17

3.4.1. Diskų difuzijos metodas ...17

3.5. Molekuliniai tyrimo metodai...19

3.5.1. Polimeraz÷s grandinin÷ reakcija...19

4. Statistinis duomenų apdorojimas ...21

5. Darbo rezultatai ...22

5.1. Staphylococcus genties mikroorganizmai iš paukštienos...22

5.2. Satphylococcus aureus išskirti iš vištinių paukščių ...23

5.3. Meticilinui atsparių S. aureus padermių nustatymas ir patvirtinimas naudojant PGR...26

5.3. Jautrumas oksacilinui ...29

6. Aptarimas ir išvados...30

6.1. Tyrimų duomenų palyginimas su literatūros duomenimis ...30

6.2. Išvados...31

Literatūros sąrašas...31 Priedas 1. M÷ginių ÷mimo ir tyrimo rezultatų lentel÷s

(3)

3

1. Įvadas

Dabar Europą kankina tokios problemos, kaip bakterijų atsparumas antimikrobiniams vaistams, kur žmon÷s sudaro tik 5 proc. bendro naudojimo antibiotikų, likę 5 proc. suvartojami gyvulių ir naminių paukščių pramon÷s šakose, visame pasaulyje pagal Sveikatos departamento ataskaitą „atsparumas bent keliatui antibiotikų“ [Derek Butler „MRSA Action UK - The Threat from Superbugs in our food“, 2008 08 11].

Mikroorganizmai gali adaptuotis prie esamų sąlygų. Mikroorganizmų atsparumas antimikrobiniams vaistams vis did÷ja, ir tai priklauso nuo vartojamų antimikrobinių vaistų ir jų kiekio bei dažnio [R. Bagdonas, 2005 m.].

Kai kurios stafilokokų rūšys randamos gyvūnų organizmuose kaip odos, nosies, virškinamojo trakto mikroflora. Staphyloccocus aureus, tai – plazmą koaguliuojantys stafilokokai. Auksinis stafilokokas yra žmogaus normali mikroflora, paprastai aptinkama nosies šnerv÷se. Apie 20 proc. žmonių ją turi pastoviai, o apie 60 proc. – nepastoviai [Maželien÷, 2012 m. [Internetin÷ prieiga: http://www.scribd.com/doc/78303741/Stafilokokai-streptokokai-1

(žiūr÷ta: 2012 05 10)]. Pasak Kauno medicinos universiteto Infekcinių ligų klinikos vadov÷s docent÷s Auks÷s Mickien÷s šiomis bakterijomis galima užsikr÷sti žmon÷ms nuo gyvūnų ir gyvūnams nuo žmonių. O “stafilokoko nešiotojas nejaučia jokių simptomų”. Atliekant laboratorinius tyrimus, auksinio stafilokoko ieškoma nosiarykl÷je ar nosies šnerv÷se, aplink išeinamąją angą ar nuo odos paviršiaus, pvz., nuo pažastų [A. Mickien÷, 2009 m. Internetin÷ prieiga: http://www.pasveik.lt/sveikatos-ir-medicinos-naujienos/nors-ir-auksine-bakterija-bet-infekcija-sukelia/44105 (žiūr÷ta 2012 03 15) ].

MRSA (methicillin resistant Staphyloccocus aureus - meticilinui atsparus auksinis stafilokokas). Auksinio stafilokoko sukeltos infekcijos buvo gydomos antibiotiku meticilinu, tod÷l bakterijos mutavo ir tapo jam atsparios. Bakterijų atsparumą antimikrobiniams vaistams skatina neracionalus ar nepagrįstas jų vartojimas. MRSA d÷l savo atsparumo antibiotikams, virulentiškumo dar vadinamos superbakterijomis ar net 21 a. maru. Esant MASA atvejui svarbu buities daiktų ir patalpų dezinfekcija, nes bakterija gali užkr÷sti dulkes ar paviršius. Ypač atsargiai reik÷tų elgtis su maistu, maisto produktais, gyvūmais pašarais ar kitomis žaliavomis [http://www.as-galiu.lt/lt/zinoti/MRSA-superbakterija1.php 2012 01 12].

(4)

4 MASA labiau žinomas reiškinys kaip hospitalin÷ infekcija, bet JAV, Didžiojoje Britanijoje ir kitose šalyse pasitaikanti visuonen÷je (maisto pramon÷je, maisto produktuose ar jų žaliavose) ir tarp gyvūnų. [A. Mickien÷, 2009 m. Internetin÷ prieiga: http://www.pasveik.lt/sveikatos-ir-medicinos-naujienos/nors-ir-auksine-bakterija-bet-infekcija-sukelia/44105 (žiūr÷ta 2012 03 15) ].

Mūsų atlikto tyrimo metu analizuoti vištų m÷giniai (iš gerkl÷s, kloakos, nuo plunksnų) nustatomi Staphylococcus aureus, ir ieškoma meticilinui atsparių S. aureus (MASA).

Šio darbo tikslas:

Ištirti Staphylococcus aureus padermes iš viščiukų broilerių ir vištų dedeklių, nustatyti meticilinui atsparias padermes.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti Staphylococcus genties mikroorganizmus iš viščiukų broilerių ir vištų dedeklių.

2. Identifikuoti išskirtas Staphylococcus aureus padermes.

3. Nustatyti meticilinui atsparių Staphylococcus aureus padermių išplitimą tirtuose m÷giniuose.

(5)

5

2. Literatūros apžvalga

Šiame skyriuje bus nagrin÷jama stafilokokų taksonomija (2.1. lentel÷), patogeniškumo ir virulentiškumo veiksniai, sukeliamos infekcin÷s ligos, atsparumas antibiotikams ir įvairios studijos apie MASA paplitimą gyvūnų tarpe.

2.1. Staphylococcus spp. taksonomija

Staphylococcus genties suskirstymas pagal grupes ir pogrupius yra pateiktas 2.1 lentel÷je.

2.1. lentel÷. Staphylococcus genties suskirstymas pagal grupes ir pogrupius. [Internetin÷ prieiga: http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus (žiūr÷ta 2012 01 15)]

Nr.: Grup÷ Pogrupis

1. S. aureus S. aureus, S. simiae 2. S. auricularis S. auricularis

3. S. carnosus S. carnosus, S. condimenti, S. massiliensis, S. piscifermentans, S. simulans

4. S. epidermidis S. capitis, S. caprae, S. epidermidis, S. saccharolyticus 5. S. haemolyticus S. devriesei, S. haemolyticus, S. hominis

6. S. hyicus-intermedius

S. chromogenes, S. felis, S. delphini, S. hyicus, S. intermedius, S. lutrae, S. microti, S. muscae, S. pseudintermedius, S. rostri, S. schleiferi

7. S. lugdunensis S. lugdunensis

8. S. saprophyticus S. arlettae, S. cohnii, S. equorum, S. gallinarum, S. kloosii, S. leei, S. nepalensis, S. saprophyticus, S. succinus, S. xylosus 9. S. sciuri S. fleurettii, S. lentus, S. sciuri, S. stepanovicii, S. vitulinus 10. S. simulans S. simulans

(6)

6 Patogeniniai stafilokokai: S. aureus, S. aureus porūšis anaerobius, S. hyicus, S. hyicus porūšis chromogenes, S. intermedius.

Staphylococcus genčiai priklauso apie 32 stafilokokų rūšių. Staphylococcus aureus – dažniausias stafilokokinių ligų suk÷l÷jas.

Stafilokokai gali būti klasifikuojami remiantis plazmokoagulaze: S. aureus yra plazmą koaguliuojantys. O kiti – plazmą nekoaguliuojantys stafilokokai.

2.2. Stafilokokams būdingos savyb÷s

Stafilokokai – gramteigiami kokai (sen÷dami gali virsti gramneigiamais), apie 0,5 – 1,0 µm skersmens, sferin÷s formos. Pagal Gramo metodą dažosi m÷lynai – violetine spalva, nes sienel÷je yra apie 90 proc. peptidoglikano, kuris sulaiko susidariusį netirpų genciano violetinio ir jodo kompleksą. Stafilokokus mikroskopuojant matomi ląstelių telkiniai, primenantys vynuogių kekes. Taip yra tod÷l, kadangi stafilokokai dalijasi k÷liose plokštumose (2.1 paveikslas) Nejudrūs sporų nesudaro, bet dalis padermių gali sudaryti mikrokapsulę. Ląstel÷s struktūriniai dariniai – antigenai: peptidoglikanas, teicho rūgštys ir lipopolisacharidai (gramteigiamų bakterijų endotoksinai) baltymai (baltymas A) [A. Lasinskait÷ ir kiti, 2003 m., A. Pavilonis, ir kiti, 2007 m]. Fakultatyviniai anaerobai dauginasi daugelyje maitinamųjų terpių (optimali augimo temperatūra - 37°C), gamina vandenyje netirpstantį kremo, baltos ar geltonos spalvos pigmentą. S. aureus gali hemolizuoti eritrocitus, gamina katalazę – skiriamasis bruožas nuo streptokokų. Fermentuodami angliavandenius išskiria pieno rūgštį, dujų nesudaro. Patogeniški stafilokokai sintetina daug neląstelinių medžiagų – toksinus, fermentus [Tortora Gerard J., et al, 2002m.].

(7)

7 2.1. pav. Staphylococcus aureus nudažytas Gramo metodu (padidinta 1000 kartų)

2.3. S. aureus virulentiškumo, patogeniškumo veiksniai

S. aureus virulentiškumo, patogeniškumo veiksniai yra skirstomi į ląstel÷s struktūrinius darinius, egzotoksnius, fermentus ir Adhezijos ir kolonizacijos veiksnius.

Ląstel÷s struktūriniai dariniai

Peptidoglikanas - polisacharidų polimeras, kuris sužadina interliaukino-1 ir opsonizuojančių antikūnų sintezę monocituose.

Teicho rūgštys - glicerolio ar adonitolio fosfatų polimerai, antigenai.

A baltymas. Yra ląstel÷s sienel÷je, sukimba su IgG molekulių (išskyrus IgG3) Fc dalimi, tačiau IgG Fab dalis yra laisva ir gali jungtis su specifiniu antigenu) [A. Lasinskait÷ ir kiti, 2003 m].

Egzotoksinai

Pirogeniniai egzotoksinai, citotoksinai (sintezuoja S.aureus padermes) sąveikauja su makrofagų molekul÷mis ir su daugeliu T limfocitų specifiniais receptoriais. Šie egzotoksinai sukelia karščiavimą, alpimą ir šoką, didina kapiliarų pralaidumą. Pirogeniniai egzotoksinai sukelia ląstel÷s imuninį atsaką [A. Lasinskait÷ ir kiti, 2003m.].

Enterotoksinai. 33 proc. S.aureus padermių sintezuoja enterotoksinus - baltymai atsparūs virškinimo fermentams, yra termostabilūs. Enterotoksinų tipai: A – F (A, B, C, C2, D, E).

(8)

8 Enterotoksinas A - geriausiai ištirtas ir sukelia apsinuodijimą maistu [Samuel Baron, M. D., 1982 m].

Toksinio šoko sindromo toksinas - sukelia toksinio šoko sindromą, kuris sukelia karščiavimą, daugelio organų disfunkciją ir šoką [A. Lasinskait÷ ir kiti, 2003 m; Samuel Baron, M. D., 1982m].

Leukocitotoksinas (leukocidinas). Žaloja leukocitus ir makrofagus. Slopina fagocitozę.

Epidermolitinis toksinas - eksfoletinas. Išskiriamos dvi rūšys: ETA; ETB – gamina S. aureus paderm÷s. Sukelia paviršinių epidermio sluoksnių atsiskyrimą.

Hemolizinai (α, β, γ, δ) - citotoksinai. α-hemolizinas – baltymas gaminamas S. aureus padermių. Lizuoja avių, kiaulių, šunų eritrocitus, pažeidžia trombocitus, veikia kraujagyslių lygiuosius raumenis [A. Lasinskait÷ ir kiti, 2003 m].

Fermentai

Stafilokokai sintetina β - laktamazę, fibrinoliziną – stafilokinazę, DRN -azę, lecitinazę – trynio veiksnys, koaguliazę, fosfolipazę, hialuronidazę, penicilazę. Koaguliaz÷ (surišanti koaguliaz÷, neląstelin÷ koaguliaz÷) skatina fibrino kaupimąsi stafilokoko paviršiuje ir d÷l to silpnina fagocitozę. Kapsul÷ taip pat slopina fagocitozę [Edwards-Jones V, Dawson MM, Childs C. A 2000].

Adhezijos ir kolonizacijos veiksniai

S.aureus kolonizuoja audinių ląsteles, jungdamiesi suriša laisvą koaguliazę prie fibrinogeno.

2.4. S. aureus sukeliamos ligos

S.aureus yra dažniausias stafilokokinių ligų suk÷l÷jas, kurios skirstomos į:

1. Paviršin÷s odos ligos. Pasireiškia vietine audinių nekroze, pūliavimu, pūliais pripildytų abscesų susidarymu, piodermija, folikulitais, šunvot÷mis, miežiais, abscesais ir pikvot÷mis.

(9)

9 2. Giliosios ligos: osteomielitas, plaučių uždegimas, ūminis endokarditas, artritas, bakteremija, sepsis, giliųjų audinių pūliniai.

3. Stagfilokokų toksinų sukeliamos ligos: „nudegusios odos‘‘ sindromas, stafilokokin÷ maisto intoksikacija, toksinio šoko sindromas (TŠS) [Samuel Baron, M. D., 1982m.; A. Lasinskait÷ ir kiti, 2003m.].

MASA - Meticilinui atsparūs S. aureus:

1. Hospitalin÷s paderm÷s (HA-MASA) - Kauno m. ligonin÷se: 1999 - 4,3%, 2000 – 5,6% [R. Bagdonas, 2005 m].

2. Visuomen÷je įgytos paderm÷s (CO-MASA) – Lietuvoje n÷ra duomenų.

3. Gyvulių tarpe paplitusios paderm÷s (LA-MASA).

Stafilokokin÷s infekcijos yra svarbios tiek žmonių, tiek veterinarin÷je medicinoje. S. aureus kolonizuoja žmonių, primatų ir kartais gyvūmų odą ar/ir gleivinę. Visai neseniai buvo pasteb÷tas MASA reiškinys tarp gyvūnų, manoma, kad d÷l išaugusio antimikrobinių vaistų naudojimo veterinarin÷je medicinoje. Tarp žem÷s ūkio gyvūlių egzistuojanti nauja MASA paderm÷ (angl. Livedstock-accosiated (LA) - MRSA) vadinama zoonoze, nes kelia pavojų žmonių sveikatai. Pagal Pantosti A. (2012) studijas ST398 nustatoma daugelyje maistui auginamų gyvūnų taip pat ir žmon÷ms. O ST1 paderm÷ jau randama ir gyvūmų tarpe, nors buvo manyta, kad tai išskirtinai žmonių infekcijas sukeliantis štamas. Taip pat tarp žmonių paplitusi kita paderm÷ – ST5, kuri randama ir tarp paukščių. Tačiau paukščių ST5 yra praradęs kelis reikšmingus baltymus (kas nesumažina pačio štamo patogeniškumo), kuo ši paukščių paderm÷ skiriasi nuo žmonių. [Pantosi A., 2012]

2.5. S. aureus atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms

„Atsparumas antibiotikams yra problema ne tik mūsų ligonin÷se, bet ir bendruomen÷je. Medicinos ekspertai nurodo nenuosaikų antibiotikų naudojimą gyvūnų pašaruose, kas įtakoja MASA plitimą visuomen÷je“, - sak÷ Rebecca Goldburg Aplinkos Gynybos vyresnysis mokslinis

(10)

10 patar÷jas. Veterinarin÷je medicinoje ir pramoniniuose ūkiuose naudojami antibiotikai skatina atsparių bakterijų (ir MASA) vystymąsi ir plitimą. Suinteresuotų Mokslininkų Sąjunga apskaičiavo, kad 70 proc. visų antibiotikų ir antimikrobinių vaistų, naudojamų Jungtin÷se Amerikos Valstijose, naudojami kaip pašarų priedai vištininkyst÷je, kiaulininkyst÷je ir m÷sin÷je galvijininkyst÷je. Manoma, kad antibiotikai naudojami žem÷s ūkyje palengvina MASA plitimą [Inge van Loo et al, „Emergence of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus of Animal Origin in Humans“ 2007 m].

Amerikos medicinos asociacijos duomenimis Jungtin÷se Amerikos Valstijose 2005 metais buvo užfiksuota 100000 MASA infekcijų atvejų, iš kurių 19000 baig÷si mirtimi (19 proc.). Palyginimui, JAV statistikos duomenimis 2005 metais nuo ŽIV/AIDS mir÷ 17000 žmonių [Inge van Loo et al, „Emergence of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus of Animal Origin in Humans“ 2007 m].

Vis dažniau visuomen÷je aptinkamas Meticilinui atsparus S. aureus (CA-MASA) paskatino Nyderlanduose atlikti tyrimą, kurio tikslas buvo nustatyti, ar MASA izoliatai yra susiję su gyvulių auginimu ir palyginti fenotipinius, genotipinius ir epidemiologinius požymius tarp žmonių ir gyvūnų MASA štamų. Duomenys buvo renkami vadovaujantis klausimynais, kuriuose buvo įrašomi duomenys apie pacientą: gimimo data, lytis, pašto kodas, infekcijos buvimas ar nebuvimas, ligonio pri÷mimo data, profesija, partnerio profesija, t÷vų profesija, ir sąlytis su gyvūnais (kiaul÷mis, karv÷mis, arkliais, viščiukais, kat÷mis, šunimis). Iš 26 skirtingų gydymo istaigų buvo atrinkta 41 m÷ginys iš pacientų ir 82 m÷giniai iš pacientus aptarnaujančio personalo. Atlikus klinikinius tyrimus, 5 iš 41 ir 5 iš 82 buvo atmesti. Galiausiai, 35 pacientų, turinčių sąlytį su gyvūnais, ir 76 aptarnaujančio personalo m÷giniai iš 24 skirtingų gydymo istaigų buvo įtraukti į tyrimą [Inge van Loo, et al, 2007 m]. 32 pacientų ir 74 aptarnaujančio personalo izoliatams jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms buvo nustatytas naudojant Mueller-Hinton agarą pagal Kirby-Bauer metodą (diskų difuzijos metodas) [National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Wayne (PA): The Committee; 2006 m]. 32 pacientų ir 74 aptarnaujančio personalo m÷giniams buvo nustatytas SCCmec genas [Zhang K, et al, 2005 m].

Nyderlanduose pirmas ST398 MASA izoliatas buvo nustatytas 2003 metais, ir nuo tada jis buvo aptinkamas vis dažniau. MASA koreliuoja su naminių gyvūnų populiacijos tankiu. De Neeling AJ, 2007m. tyrimas patvirtino, kad naujo tipo MASA yra reikšmingai susijęs kontakte su gyvūnais. Buvo rastas reikšmingas ryšys su galvijais, kiaul÷mis. Nyderlandų kiaulių ūkiuose

(11)

11 atliktas tyrimas parod÷, kad beveik 40 proc. kiaulių ir ≈ 80% kiaulių ūkių buvo kolonizuotos MRSA padermių [De Neeling AJ, et al, 2007 m]. Galime daryti išvadą, kad šis naujas MASA štamas yra gyvūnin÷s kilm÷s. MASA perdavimas tarp gyvūnų ir žmonių anksčiau buvo aprašytas. Susijęs su užkr÷stais naminiais gyvūnais ir asmenimis, kurie rūpinasi jais [Duquette RA, Nuttall TJ., 2004 m.; Cefai C, et a, 1994 m.; Loeffler A, et al, 2005 m.; Weese JS, et al, 2005 m]. Izoliatai iš gyvūnų buvo lyginami su izoliatais iš žmonių ir buvo nustatytas ryšys. MASA gali būti perduodamas žmogaus gyvūnams ir gyvūnų žmon÷ms [Baptiste KE, et al, 2005m]. Iki šiol, šių klonų perdavimas žmon÷ms nebuvo patvirtintas.

Manoma, kad ši problema yra ne tik Nyderlanduose. Be to, ST398 neseniai buvo rasti gyvūnams ir žmon÷ms Vokietijoje [Cuney C. Et al., 2006 m.]. Honkongo specialiojo administracinio regiono, Kinijos Liaudies Respublika, MASA ST398 buvo rasta 2 pacientams su bakteriemija [Ip M, et al., 2005 m.].

Meticilinui atsparių Staphylococcus aureus bakterijų ST398 paderm÷ nustatoma skerdyklose ir šviežioje m÷soje. Šių bakterijų rizika skerdyklų ir m÷sos perdirbimo įmonių darbuotojų sveikatai yra maža. Meticilinui atsparių Staphylococcus aureus bakterijų ST398 paderm÷ labiausiai paplitusi kiaulių, m÷sinių galvijų ir broilerių laikymo vietose. Gyvūnų augintojai taip pat gali platinti meticilinui atsparias Staphylococcus aureus bakterijas. Meticilinui atsparios Staphylococcus aureus bakterijos nustatytos arkliams, šunims, kat÷ms ir kitiems augintiniams. MASA ST398 paderm÷ labiausiai plinta d÷l gyvūnų jud÷jimo ir tiesioginio kontakto. [Europos maisto saugos tarnyba, 2009 m. Internetin÷ prieiga:

http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1211902408758.htm žiūr÷ta: 2011 11 02].

Buvo įrodyta, kad pagrindinis MASA (ST398) rezervuaras yra kiaul÷s. Kadangi šis tipas taip pat buvo išskirtas iš kitų gyvūnų rūšių, tod÷l galima teigti, kad šis štamas sukelia gyvulių MASA. ST398 izoliatai buvo rasti ant vištienos žaliavos ar skerdenų Kor÷joje ir Japonija [Davy Persoons, et al., 2009 m].

2007 metais iš atsitiktinai atrinktų ūkių Belgijoje, buvo paimti 5 vištų dedeklių m÷giniai iš 10 ūkių ir 5 broilerių viščiukų iš 14 ūkių. Iš broilerių auginimo ūkių m÷giniai buvo imami du kartus (po 4 m÷nesių pertraukos, iš skirtingų pulkų tose pačiose patalpose). M÷giniai buvo paimti iš 50 dedeklių vištų ir 75 viščiukų broilerių kloakų ir nosies ertmių. Fenotipiškai nustatyti MASA štamai buvo patvirtinti PGR tyrimu. Jautrumas buvo patikrintas naudojant Kirby - Bauer diskų

(12)

12 difuzijos metodą. MASA nebuvo aptikta dedeklių vištų m÷giniuose. Galima daryti prielaidą, kad MASA pas dedekles vištas n÷ra arba apima tik nedidelį skaičių vištų dedeklių, galbūt d÷l riboto antimikrobinių vaistų naudojimo. MASA buvo aptikta 8-niuose viščiukų broilerių m÷giniuose (2-juose iš 14 atrinktų ūkių). MASA pulkų teigiamų tyrimų rezultatų ir teigiamų m÷ginių skaičius svyravo tarp 1/5 (20%) ir 5/5 (100%). M÷giniai iš ūkių buvo imami du kartus ir abu kartus buvo aptikta MASA. Tai rodo, kad MASA gali išlikti ūkyje ir kolonizuoti ateities pulkus. Iš 8-MRSA teigiamų viščiukų broilerių (16 m÷ginių), MASA buvo rasta visuose m÷giniuose, išskyrus 1 kloakos tepin÷lį. Viso 15 teigiamų MASA m÷ginių, kurie buvo atsparūs eritromicinui, kanamicinui, tobramicinui, linkomicinas, tilozinas, tetraciklino, ir trimetoprimui [Davy Persoons, et al., 2009 m].

Dr. Persoons iš Gento universiteto, (Merelbeke, Belgijoje) patvirtino MASA buvimą tarp viščiukų broilerių, tačiau tarp vištų dedeklių - ne. Visi izoliatai priklaus÷ vienam tipui, t1456, ir taip skyr÷si nuo kitų atmainų, priklausančių ST398 [Davy Persoons, et al., 2009 m].

2.6. Literatūros apžvalgos išvados

1) Nesaikingas antimikrobinių vaistų vartojimas medicinoje ir žem÷s ūkyje prived÷ prie to, kad išsivyst÷ MASA, kurios nešiotojais gali būti tiek žmon÷s, tiek gyvūnai.

2) Yra ištirti keli MASA štamai, kurie gali būti perduoti iš žmogaus gyvūnui ir iš gyvūno žmogui.

3) ST398 MASA atmaina nustatyta įvairiems žem÷s ūkio ir naminiams gyvūnams, aptinkama vištų auginimo ir skerdimo vietose, o Vokietijoje nustatytas ir žmon÷ms. Tod÷l galima teigti, kad šis stamas yra gyvūnin÷s kilm÷s ir gali būti perduodamas gyvūnų žmon÷ms.

(13)

13

3. Mokslinio darbo schema ir metodika

3.1. pav. Mokslinio darbo schema.

3.1. pav. Pavaizduota mokslinio darbo schema. Nurodoma kiek ir iš kokių paukščių grupių buvo imami m÷giniai. M÷ginių tyrimo eiga ir nuoseklumas.

Mėginių ėmimas iš vištinių paukščių. Iš kloakos, gerklės ir nuo plunksnų.

Vištos dedeklės iš komercinių ūkių

n = 51

Naminės vištos dedeklės n = 63

Viščiukai broileriai n = 99

Persėjimas ant mitybinių terpių.

Patogeniškų S. aureus nustatymas nVD = 17 Patogeniškų S. aureus nustatymas nNVD = 31 Patogeniškų S. aureus nustatymas nVB = 4 MASA nustatymas nVD = 2 MASA nustatymas nNVD = 1 MASA nustatymas nVB = 0 MASA patvirtinimas PGR nVD = 2 MASA patvirtinimas PGR nNVD = 1 MASA patvirtinimas PGR nVB = 0

(14)

14 3.1. Medžiagos ir metodai

Tyrimai buvo atliekami nuo 2010 m. spalio m÷n. iki 2011 m. birželio m÷n. M÷giniai buvo imami iš įvairių ūkių, - tiek pramoninių, tiek smulkių ūkių (tenkinančių asmenines reikmes) (3.1. pav.). Tiriamoji medžiaga buvo imama iš įvairaus amžiaus vištų dedeklių ir viščiukų broilerių. Iš kiekvienos vištos buvo įmami trys m÷giniai: nuo plunksnų, po kairiuoju sparnu, iš kloakos ir gerkl÷s ir tirti mikrobiologijos laboratorijoje (LVA, Užkrečiamųjų ligų katedra).

M÷giniai buvo imami į sterilias transportines terpes, TRANSWAB® (Amies, Liofilchem, Italija) (3.2. pav.) nuo plunksnų, iš gerkl÷s ir kloakos, įvedus sterilų tampon÷lį į kiekvieną angą apie 0,5–1cm.

3.2. pav. Transportin÷ terp÷ TRANSWAB®

Iki prad÷jimo tirti m÷giniai buvo laikomi +4ºC temperatūroje. Prad÷ti tirti per dvi dienas.

3.2. Staphylococcus genties mikroorganizmai išskirti iš viščiukų broilerių ir dedeklių vištų

Visi vištų m÷giniai buvo s÷jami į Petri l÷kšteles su kraujo agaru (KA) (Oxoid, Anglija) ir selektyvin÷mis mitybin÷mis terp÷mis: Drigalskio ar Levino, TEA, Manito, Kanamicino (Oxoid, Anglija) terpių ir Baird-Parker agaro (Staphylococcus spp. nustatymui) (Liofilchem, Italija). Užs÷tos Petri l÷kštel÷s kultivuojamos 24 – 48 val. aerobin÷mis sąlygomis, esant 37ºC temperatūrai. Išaugusios pavien÷s bakterijų kolonijos, tarpusavyje panašios savo savyb÷mis ir morfologija, pers÷jamos ant maitinamojo agaro (MA) (Oxoid, Anglija). Užs÷tos l÷kštel÷s kultivuojamos termostate 37ºC temperatūroje 24 – 48 val. Vertinamos mikroorganizmų kultūrin÷s, morfologin÷s ir biochemin÷s savyb÷s. Išaugusių kultūrų morfologijai tiriama preparatus nudažius Gramo metodu („Diagnostica Merck“, Vokietija) ir mikroskopavus.

(15)

15 1. Ant fiksuoto tepin÷lio užpilama spiritinio genciano violetinio tirpalo. Po 1 – 2 min. dažų likučiai nupilami.

2. Ant preparato užpilama Lugolio tirpalo (laikoma 1 – 2 min.). Plaunama distiliuotu vandeniu.

3. Preparatas blukinamas 96° etanoliu (30 – 60 sek.). Plaunama distiliuotu vandeniu. 4. Preparatas dažomas safranino dažais (1 – 2 min.). Nuplaunamas distiliuotu vandeniu, nusausinamas ir tiriamas mikroskopu imersine sistema.

5. Gramteigiami mikroorganizmai nusidažo violetine spalva, o gramneigiami – raudona spalva

Gramo metodo atvaizdavimas yra pateiktas 3.3. paveiksle.

[http://biology200.gsu.edu/houghton/4595%20%2704/figures/lecture1/Gram-stain.jpg (žiūr÷ta 2011 09 24)]

3.3. pav. Dažymas pagal Gramą: a) užpilama genciano – violetinio; b) užpilama lugolo tirpalo; c) blukinama etanoliu; d) užpilama safrino dažų

(16)

16 3.3. Staphylococcus aureus padermių identifikavimas

Stafilokų identifikavimui stebimas mikroorganizmų kultūrų augimas ant KA, Manitolio druskos (Oxoid, Anglija) ir Baird-Parker (Liofilchem, Italija) agarų. Kraujo agare stebima visiška arba dalin÷ hemoliz÷. Staphylococcus aureus identifikavimui nuo kitų Staphylococcus spp. stebimas augimas ant Manitolio druskos ir Baird-Parker (Liofilchem, Italija) agarų. L÷kštel÷s kultivuojamos termostate +37oC temperatūroje, 24–48 val. Jei po kultivavimo Manitolio druskos agaras pagelsta, tai reiškia, kad tiriamasis mikroorganizmas yra S. aureus, kuris skaido manitą. Baird-Parker agare Staphylococcus aureus skaidydamas teluritą sudaro juodos spalvos kolonijas.

Beta – laktamazių nustatymas atliekamas naudojant specialius komercinius testus. Staphylococcus aureus ß – laktamazę sintezuojančioms paderm÷ms nustatyti atliekamas Beta – Laktamaz÷s testas. Staphylococcus aureus kolonijos uždedamos ant testo juostel÷s ir po 5 – 10 min. užlašinami 2 lašai beta – laktamaz÷s reagento. Jei susidaro raudona spalva su m÷lynu žiedu - tiriamoji stafilokokų paderm÷ gamina fermentą beta – laktamazę.

Koaguliaz÷s testu nustatyti koaguliazei teigiami (KTS) – patogeniniai ir koaguliazei neigiami – sąlyginai patogeniniai stafilokokai (KNS). Ši reakcija atliekama m÷gintuv÷liuose su triušių kraujo plazma, praskiedus fiziologiniu tirpalu (santykis 5:1). Į 0,5 ml skiestos plazmos s÷jama viena tiriamoji mikroorganizmo kolonija nuo KA. Plazmos koaguliacijos laipsnis nustatomas po 1, 2, 3, 4, 18 ir 24 val. nuo inkubavimo, +37oC temperatūroje, pradžios. Plazmos koaguliaz÷s reakcija yra teigiama, jei koaguliavo ne mažiau kaip trys ketvirtadaliai plazmos.

Patogeniniams stafilokokams identifikuoti iki rūšies taip pat naudotas „Staphytest Plius“ (Oxoid, Anglija) testas. „Staphytest“ – tai lateksagliutinacijos reakcija aptikti Proteinui A ir rišamajam faktoriui, kurį dažniausiai gamina Staphylocooccus aureus ir taip diferencijuoti nuo kitų Staphylococcus spp. mikroorganizmų. Šiai reakcijai atlikti gaminamos specialios standartin÷s sistemos iš latekso dalelių, turinčių absorbuotus ant jų paviršiaus specifiškus polikloninius antikūnus, kiaulių fibrinogeną ir triušių IgG. Ant „Staphytest Plius“ juostelių užlašinus šio specialaus reagento ir prid÷jus tiriamąjį pavyzdį, kuriame yra mikroorganizmų antigenų (Staphylococcus aureus), matoma latekso dalelių agliutinacija, t.y., įvyksta reakcija tarp: fibrinogeno ir rišamojo faktoriaus, IgG Fc fragmento ir proteino A, kuris yra specifiškas IgG (Oxoid kompanijos instrukcija).

(17)

17 Staphylococcus spp. identifikacijai nuo Streptococcus spp. atliekamas katalaz÷s testas, kuriam naudojamas 3% vandenilio peroksidas (H2O2). Ant objektinio stiklelio kilpele uždedame tiriamosios kolonijos nuo KA ir užlašiname 1 lašą vandenilio peroksido tirpalo. Jeigu sumaišius pradeda skirtis dujos (kilti burbuliukai) – mikroorganizmas gamina katalazę, kuri skaido vandenilio peroksidą į vandenį ir dujinį deguonį, reakcija yra teigiama. Teigiamą reakciją rodo stafilokokai.

3.4. Meticilinui atsparių Staphylococcus aureus padermių nustatymas 3.4.1. Diskų difuzijos metodas

Bakterijų jautrumas antibakterin÷ms medžiagoms nustatomas pagal modifikuotą Kirby-Bauer metodą, s÷jant bakterijas į specialią „Mueller Hinton II Agar“ (Oxoid, Anglija) terpę [Internetin÷ prieiga: http://www2.bc.cc.ca.us/bio16/10_Antimicrobials.htm (žiūr÷ta 2011 09 24)].

Iš mikroorganizmų kultūros, kurios buvo inkubuojamos ant KA 37oC temperatūroje, po 24 – 48 val. su sterilia kilpa atrenkamos 3 - 5 vienodos, gerai izoliuotos kolonijos ir perkeliamos į m÷gintuv÷lį su steriliu fiziologiniu tirpalu. Suspensijos drumstumas prilyginamas 0,5 Mc Farlando standartui. Mikroorganizmų kiekis McFarland vienetais įvertintas McFarland Densitometer 1 („Biosan“, Olandija) aparatu. Po to į suspensiją įmerkiamas sterilus vatos tamponas, pasukamas kelis kartus ir prispaudus jį prie vidin÷s m÷gintuv÷lio sienel÷s pašalinamas skysčio perteklius. Mueller Hinton terpę užs÷jame tamponu braukiant per sterilaus agaro paviršių. Ši procedūra kartojama 3 kartus, kiekvieną kartą l÷kštelę pasukant maždaug 60o kampu, kad būtų užtikrintas tolygus inokuliato pasiskirstymas. L÷kštel÷ uždengiama, trumpai palaikoma ir tada ant agaro paviršiaus prispaudžiami antimikrobinių vaistų diskas, mes naudojome Oxacilino diskus (1µg).

Išsiaiškinti ar Staphylococcus aureus yra Meticilinui atsparus, S. aureus s÷jame ant MASA agaro, kultivuojame 24 val. 37oC temperatūroje. Esant teigiamam rezultatui, steb÷jome rausvos spalvos kolonijas (3.4.pav) (http://www.bd.com/ds/productCenter/215084.asp (žiūr÷ta: 2012 01 20). MASA būdingas kolonijas nuo MASA (CHROMagar, France) agaro sterilia vienkartine kilpele pers÷jame ant nuožulniojo maitinamojo agaro.

(18)

18 3.4. pav. Meticilinui atsparaus S. aureus kolonijos ant MASA agaro.

(19)

19 3.5. Molekuliniai tyrimo metodai

3.5.1. Polimeraz÷s grandinin÷ reakcija

PGR naudojome nustatant mecA geną [Kitai et al, 2005]. DNR išskyrimas su Chelex.

Pasigaminame 5 % Chelex tirpalą (priklausomai nuo m÷ginių skaičiaus). 0.5 ml 5 % Chelex tirpalo x N skaičiaus m÷ginių + 1 „ekstra“ m÷ginys.

Pvz.: 24 m÷giniams vandens ir Chelex‘o:

0.5 ml 5 % Chelex tirpalo x (24 + 1) = 12.5 ml (vandens).

5 g Chelex‘o --- 100 ml vandens X = 0.625 g (Chelex‘o) X g Chelex‘o ---12.5 ml vandens

Atsv÷riame 0.625 g Chelex‘o patalpiname į 12.5 ml bidistiliuoto sterilaus vandens ir nuolat maišant supilstome į sterilius ependorfinius m÷gintuv÷lius po 500 µl (naudojame 1000 µl antgalius).

DNR išskyrimas:

1. Nuo l÷kštel÷s kilpele surenkame 10 µl grynos bakterijų kultūros ir perkeliaea į 500 µl Chelex‘o tirpalą. Gerai išmaišome.

2. M÷gintuv÷liai inkubuojame 56 oC temperatūroje 30 minučių. 3. Su maišykle maišome 5 – 10 s.

4. Inkubuojame 95 oC temperatūroje 10 min. Atv÷siname. 5. V÷l pakartjame maišymo procedūrą.

6. Centrifuguojame 2 – 3 min. esant 10 000 rpm.

7. 300 – 350 µl supernanto, atsargiai nesiekiant Chelex‘o, perkeliame į m÷gintuv÷lius. 8. Centrifuguojame 2 – 3 min. esant 10 000 rpm.

9. 100 – 120 µl supernanto atsargiai perkeliame į 0.2 ml m÷gintuv÷lį ir užšaldome minus 20 oC temperatūroje.

PGR reakcijos mišinys: Vienam m÷giniui:

5 µl 10x Bufer (laikomas -20 oC temperatūroje); 5 µl MgCl2 (laikomas -20 oC temperatūroje);

(20)

20 4 µl DNTP;

0.5 µl oligo‘ (mecI 5‘ –ACAAGTGAATTGAAACCGCC-3); 0.5 µl oligo“ (mec2 5‘ –GAAGGTATCATCTTGTACCC-3); 0.3 µl Tag.

15.3 µl reagentų

Mix 50 µl – 1 µl DNR = 49 µl;

49 µl – 15.3 µl Tag = 33.7 µl bidistiliuoto vandens.

Pasiruošiame tiek ependorfinių m÷gintuvelių, kiek turime m÷ginių (+ kontrol÷). Į vieną didesnį ependorfinį m÷gintuv÷lį atmatuojame vandenį ir kitus ingrientus, ir DNR. Viską gerai išmaišome ir išmilstome į pasiruoštus ependorfinius m÷gintuv÷lius.

Dedame į termociklerį (amplifikatorius) - ciklinio temperatūros keitimo įrenginį, galintį greitai ir tiksliai padidinti ar sumažinti tirpalo temperatūrą pagal užduotą ciklą. Meticilinui atsparių Staphylococcus aureus (MASA) PGR ciklai: 94 oC 5 min., 94 oC 1 min. – 55 oC 2 min. – 72 oC 3 min. –25 ciklai. Paskutinis – 72 oC 10 min.

Eletroforez÷

Pasiruošiame agaroz÷s gelį. PGR gelis 1.3 %

140 ml 1x TEA + 1.69 g agaroz÷s fermento.

PGR produktų elektroforez÷ atliekama TAE buferyje (40 mM Tris, 20 mM acto rūgštis 1mM EDTA), naudojant 11 µl PGR produkto, leidžiant 100 V elektros srovę 60 min. PGR amplifikacijos produktai analizuojami 1,2 proc. „Top Vision LE GQ“ agaroz÷s gelyje (MBI, Fermentas) su 1,3 proc. etidžio bromidu UV lempos spinduliuose. Tyrimo metu naudojamas „GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder“ (MBI, Fermentas) markeris.

Paruoštą gelį kaitiname 3 minutes po to atvesiname iki 56 oC temperatūros ir įlašiname 6.5 µl Eth bromido. Išmaišius, atsargiai (kad neliktu oro burbuliuku) supilame į paruoštą stovelį su šakut÷mis. Paliekame stingti 20 min.

Sustingus geliui 11 µl produkto sumaišome su 2 µl dažų (6x laoding) ir įleidžiama į šulin÷lius, kuriuos paliko išimtos šakut÷s. Į šulin÷lius dedame tokiu eiliškumu: markeris, MASA m÷giniai, teigiama MASA kontrol÷, neigiama kontrol÷, markeris. Paleidžiame 100 V srovę ir paliekame 1 valandai TEA buferyje.

(21)

21

4. Statistinis duomenų apdorojimas

Duomenų analiz÷ atlikta naudojantis Microsoft Excel 2010 programų paketu. Darbe

patiekti tiesin÷s koreliacijos, koreliacijos koeficiento r x x y y

x x y y xy i i i i = − − − ⋅ −

∑

( )( ) ( )2 ( )2

skaičiavimas. D÷l galimyb÷s, kad koreliacijos koeficientas gali būti nepatikimas, tod÷l reikia atlikti koreliacijos koeficiento patikimumo skaičiavimą. Tikrinant rxy patikimumą koreliacijos koeficientą rxy tenka transformuoti į dydį z. Dydžiai z skirstosi normaliai.

Jeigu imties tūris mažesnis nei 25 objektai, dydį z reikia transformuoti Hotelingo transformacija: z z z r n * ( ) = − + − 3 4 _{1 .}

atlikus z ir Hotelingo transformacijas skaičiuojamos Normuotasis nuokrypis:

1 * * * − ⋅ = = z n s z t z z .

Patikimumas p nustatomas integruojant standartinį normalųjį skirstinį, gautas dydis yra rxy reikšmingumo lygmuo. Jeigu p<0,05, tuomet rxy yra patikimas.

(22)

22

5. Darbo rezultatai

5.1. Staphylococcus genties mikroorganizmai iš paukštienos

Atlikus pas÷lių ant mitybinių terpių analizę, nustat÷me, kad iš 51 viščiukų broilerių ištirto m÷ginio 36 m÷giniuose (70,59 proc.) yra Staphylococcus genties mikroorganizmų, iš 63 tirtų komercinių vištų dedeklių ūkių –29 (46,03 proc.) m÷giniai. Iš 99 naminių vištų dedeklių - 47 (47,47 proc.) (5.1. lentel÷).

5.1. Lentel÷. Staphylococcus genties padermių nustatymas tirtuose m÷giniuose.

Išskirta Staphylococcus spp. Ištirtas m÷ginių skaičius Bendrai: 29 Plunksnos 9 Kloaka 9 Dedekl÷s iš komercinių ūkių Gerkl÷ 11 63 Bendrai: 47 Plunksnos 12 Kloaka 8 Namin÷s dedekl÷s Gerkl÷ 27 99 Bendrai: 36 Plunksnos 9 Kloaka 14 Viščiukai broileriai Gerkl÷ 13 51

(23)

23

5.2. Satphylococcus aureus išskirti iš vištinių paukščių

Siekiant ištirti S.aureus vištiniuose paukščiuose buvo paimta 213 m÷giniai iš 71 paukščio: iš 17 viščiukų broilerių paimtas 51 m÷ginys, iš 21 dedeklių vištų – 63, iš 33 naminių dedeklių vištų – 99 m÷giniai. Koaguliazei teigiami S. aureus aptikti 52 m÷giniuose: viščiukų broilerių tarpe – 4; dedeklių – 17; namin÷se dedekl÷se – 31 m÷ginys (3.1. pav.).

5.1. pav. S. aureus pasiskirstymas tirtose vištų grup÷se, proc. n = 52

Stahylococcus aureus buvo nustatin÷jami ÷minius s÷jant ant kraujo ir Braid-Parker agarų ir Manitolio druskos. Po 24 valandų inkubacio laikotarpio vertinome kultūrų morfologiją. Kolonijas, kurios hemolizavo eritrocitus, skald÷ teluritą ir manitą, atrinkome ir dar÷m÷ tepin÷lius, daž÷me Gramo būdu, mikroskopavome. Po mikroskopavimo su atrinktomis kolonijomis atlikome kataz÷s testą su vandenilio peroksidu. Komersiniais testais nustat÷me baltymą A, fermento ß - laktamaz÷s gamybą. Iš visų ištirtų m÷ginių (n = 213), S. aureus nustatytas tik 52 (23,94 proc.). Iš tirtų grupių didžiausia S.aureus padermių nešiotojos buvo smulkiuose ūkiuose laikomos vištos dedekl÷s, tai sudar÷ 31,31 procentą. Kiek mažiau infekuotos

(24)

24 buvo komerciniuose ūkiuose laikomos vištos dedekl÷s – 26,98 proc., o broilerių tarpe rodikliai gerokai mažesni – 7,84 proc. (6 pav.) (p < 0,0001 – statistiškai patikimas).

5.2. pav. S.aureus nustatymas m÷giniuose pagal m÷ginių lokalizaciją ir paukščių grupę.

Analizuojant 5.2. paveikslą galima teigti, kad m÷giniuose iš gerkl÷s daugiausiai išskiriama Staphylococcus aureus padermių (56 proc.). Nuo plunksnų išskirti mikroorganizmai sudar÷ – 23,5 proc., m÷giniai iš kloakos – 21,5 proc. KTS išskirti iš gerkl÷s: 9 atvejai vištose dedekl÷se iš komercinių ūkių, 1 – viščiukuose broileriuose, 19 – namin÷se dedekl÷se. KTS išskirti nuo plunksnų: 3 atvejai vištose dedekl÷se iš komercinių ūkių, 2 – viščiukuose broileriuose, 7 – namin÷se dedekl÷se. KTS išskirti iš kloakos: 5 atvejai vištose dedekl÷se iš komercinių ūkių, 1 – viščiukuose broileriuose, 5 – namin÷se dedekl÷se. Užsikr÷timas KTS visuose trijuose m÷giniuose (nuo plunksnų, iš gerkl÷s ir kloakos) pasitvirtino tik vienu atveju – dedekl÷se iš komercinių ūkių (1 priedas, dedkl÷s iš komercinių ūkių, 18 višta) (5.2. pav).

(25)

25 29 9 9 11 47 12 8 27 36 9 14 13 17 3 5 9 45 12 9 24 10 3 3 4 17 3 5 9 31 7 5 19 4 2 1 1 0 10 20 30 40 50 B endrai: P lunks nos K loaka G erklė B endrai: P lunks nos K loaka G erklė B endrai: P lunks nos K loaka G erklė D e d e k lė s i š k o m e rs in ių ū k ių N a m in ė s d e d e k lė s V iš č iu k a i b ro il e ri a i

S taphy tes tas Β -laktamaz ė K atalaz ė Manito agaras K raujo agaras K T S

Staphylococcus genties ir S. aureus palyginimas

pagal tiriamuosius rodiklius

5.3. pav. Staphylococccus genties ir S. aureus palyginimas pagal tiriamuosius rodiklius.

Lyginat S. aureus rodiklius su Staphylococcus padermių nustatymu (5.3. pav.) galime pasteb÷ti, kad Staphylococcus paderm÷s, iš komercinių dedeklių vištų ūkių, buvo aptiktos 29 m÷giniuose, iš kurių 17 (58,62 proc.) nustat÷me koaguliazei teigiamus S. aureus. Kitokią situaciją pamat÷me ištyrę dedeklių vištų m÷ginius iš ne komercinių ūkių. Staphylococcus genties mikroorganizmų aptikome 45 m÷giniuose, iš kurių 31 (68,88 proc.) m÷ginyje nustat÷me koaguliazei teigiamus stafilokokus. Iš 10 viščiukų broilerių m÷ginių koaguliazei teigiamus Staphylococcus nustat÷me 4 m÷giniuose (40 proc.).

(26)

26 5.4. pav. S. aureus pasiskirstymas tarp tirtų vištų.

Iš 5.3. paveiksl÷lio, matome, kad mažiausias m÷ginių skaičius su S. aureus paderm÷mis yra viščiukų broilerių tarpe, o didžiausias – naminių dedeklių. Tokios pat koaguliazei teigiamų stafilokokų tendencijos išlieka tarp tirtų vištų grupių (5.4. pav.). Matome, kad S. aureus nustatytas 4 viščiukams broileriams (17,64 proc.), dedekl÷ms iš komercinių ūkių – 11 (52,38 proc.), ir didžiausias rodiklis – 26 (78,79 proc.) namin÷s dedekl÷s, kurios turi S. aureus.

5.3. Meticilinui atsparių S. aureus padermių nustatymas ir patvirtinimas

naudojant PGR

Visi m÷ginai, kuriuose aptikome ir išgryninome S. aureus kultūras buvo s÷jami į mitybines terpes ir dedami antibiotikų diskeliai, taip pat s÷jama ant komercin÷s MRSA terp÷s. Pra÷jus 24 – 48 val., po kultyvavimo, vertinome rezultatus. Nustačius atsparumą meticilinui ir tipišką MASA augimą ant MASA terp÷s atrinkome būdingas konijas ir atlikome PGR (5.1. lentel÷). Iš 11 komercinių ūkių vištų dedeklių m÷ginių PGR tyrimui atrinkome 4 m÷ginius (gerkl÷, kloaka ir

(27)

27 gerkl÷, plunksnos) iš 3 vištų, MASA pasitvirtino dvejose vištose (gerkl÷, plunksnos) ir tai sudar÷ 9,52 proc. (n = 21). Iš 26 naminių vištų dedeklių m÷ginių atrinome 6 m÷ginius (iš 6 vištų) PGR tyrimui iš kurių 1 (iš gerkl÷s) pasitvirtino kaip MASA, tai sudar÷ 3,03 proc. (n = 33). PGR tyrimui atrinkome 4 viščiukų broilerių m÷ginius (iš 3 vištų – plunksnos ir kloaka, gerkl÷, plunksnos), nei vienas m÷ginys nepasitvirtino.

5.1. lentel÷. PGR tyrimo apžvalga: vištų skaičius su S. aureus, m÷giniai atrinkti PGR tyrimui ir meticilinui atsparių Staphylococcus aureus buvimas paukštienoje.

Vištų skaičius su S. aureus M÷giniai atrinkti PGR Vištų skaičius, kurios turi MASA

MASA vištienoje, proc. Vištos dedekl÷s iš komersinių ūkių 11 4 2 9,52 Namin÷s dedekl÷s 26 6 1 3,03 Viščiukai broileriai 4 4 0 0

Iš 5.1. lentel÷s matome, kad PGR tyrimui buvo atrinkta: 4 vištų dedeklių iš komercinių ūkių m÷giniai, 6 – naminių dedeklių, 4 – viščiukų broilerių. PGR tyrimas patvirtino, kad dviejuose vištų dedeklių iš komercinių ūkių m÷giniuose (vienos vištos iš gerkl÷s ir vienos nuo plunksnų) aptiktas mecA genas ir viename (iš gerkl÷s) naminių dedeklių (1 priedas, 1, 2 lentel÷s).

(28)

28 5.5. pav. Meticilinui atsparaus S. aureus PGR tyrimo rezultatai.

M÷giniai išskirti iš koaguliazei teigiamų Staphylococcus spp. mec A genui identifikuoti. 2 – mecA geną turinti paderm÷ - 1G20110420 iš gerkl÷s; 3 – mecA geną turinti paderm÷ -

3G20110228 iš gerkl÷s; 4 - mecA geną turinti paderm÷ - 4Pl20110228 (nuo plunksnų) (1 priedas, 1, 2 lentel÷s) (5.5. pav) (5.2. lentel÷).

Pastaba: M – molekulin÷s mas÷s žymeklis 3000 bp (GeneRuler TM 100 bp Plus DNA Ladder; MBI, Fermentas); 1 – neigiama kontrol÷; 2, 3, 4 – mecA geną turinčios paderm÷s.

5.2. Lentel÷. MASA m÷ginių iš vištų gerklių ir nuo plunksnų charakteristika.

M÷ginio pavadinimas

Savyb÷s

2 – 1G20110420/ dedekl÷s vištos iš ne

komercinio ūkio (iš gerkl÷s)

3 - 3G20110228/dedekl÷s

vištos iš komercinio ūkio (iš gerkl÷s)

4 - 4Pl20110228/ dedekl÷s vištos iš komercinio ūkio (nuo

(29)

29 mecA genas + + + Koaguliaz÷s produkcija + + + ß-laktamaz÷s produkcija + + +

Iš gautų rezultatų galima teigti, kad visi m÷giniai turi mec A geną (5.2. lentel÷).

5.3. Jautrumas oksacilinui

5.3. lentel÷. mec A geną turinčių padermių jautrumo oksacilinui tyrimas.

M÷ginys

(mecA geną turinčios paderm÷s) Jautru (13 mm) Vidutiniškai jautru (11-12 mm) Atsparu (10 mm) 1G20110420 - - + 4Pl20110228 - - + 4Pl20110228 - - +

Jautrumas oksocilinui buvo nustatomas diskų difuzijos metodu. Tyrimui buvo atrinkta trys mecA geną turinčios paderm÷s. Visi trys m÷giniai buvo atsparūs meticilinui, nes inhibicin÷ zona buvo 10 mm (5.3. lentel÷). Jei paderm÷s atsparios oksacilinui, tai bus atsparios kitam penicilino dariniui - meticilinui.

(30)

30

6. Aptarimas ir išvados.

6.1. Tyrimų duomenų palyginimas su literatūros duomenimis

Cefai C (1994) apraš÷, kad egzistuoja MASA perdavimas tarp gyvūnų ir žmonių, ir yra susijęs su užkr÷stais naminiais gyvūnais ir jais besirūpinančiais asmenimis.

Kwon et al., (2006), Lee (2006) atliko tyrimą ir nustat÷, kad žalioje m÷soje, taip pat ir vištienoje, gali būti Meticilinui atsparių S. aureus paderm÷mių.

Agyirey-Kwakye et al., MASA aptiko tiek m÷soje, tiek vištienoje.

De Neeling AJ (2007) tyrimas patvirtino, kad ST398 MASA paderm÷ yra iš gyvūnų. O Cuney C. (2006 m) Vokietijoje ir Ip M (2005 m) Honkonge ST398 atmainą nustat÷ žmon÷ms. EFSA (2009 m) duomenimis ST398 atmaina nustatoma skerdyklose ir šviežioje m÷soje, labiausiai paplitusi broilerių, m÷sinių galvijų ir kiaulių laikymo vietose. Gyvūnų augintojai taip pat gali platinti meticilinui atsparias Staphylococcus aureus bakterijas. Meticilinui atsparios Staphylococcus aureus bakterijos nustatytos arkliams, šunims, kat÷ms ir kitiems augintiniams. LA-MASA paderm÷s labiausiai plinta d÷l gyvūnų jud÷jimo ir tiesioginio kontakto.

Inge van Loo (2007) atrinko m÷ginius iš 35 paciento tur÷jusio sąlyti su gyvūnais (fermeriai, veterinarai, naminių gyvūnų augintojai ar žmon÷s dirbantys su gyvūnais) ir 76 iš pacientus aptarnaujančio personalo. Jautrumas antibiotikams nustatytas 32 pacientų ir 74 aptarnaujančio personalo m÷giniuose. Buvo atliktas PGR: 32-jų pacientų ir 74 -rių aptarnaujančio personalo izoliatuose nustatytas SCCmec genas.

Davy Persoons (2009) ištyr÷ 5 vištų dedeklių m÷ginius ir 5 broilerių viščiukų. Po 4 m÷nesių pertraukos, iš kitų pulkų, tose pačiose patalpose m÷giniai buvo paimti iš 50 dedeklių vištų ir 75 viščiukų broilerių kloakų ir nosies ertmių. MASA nebuvo aptikta dedeklių vištų m÷giniuose, o buvo aptikta 8-nuose viščiukų broilerių m÷giniuose (2-juose iš 14 atrinktų ūkių). M÷giniai iš ūkių buvo imami du kartus ir abu kartus buvo aptikta MASA. Iš 8 - MASA teigiamų viščiukų broilerių (16 m÷ginių), buvo rasta visuose m÷giniuose išskyrus 1 kloakos tepin÷lį. Viso 15 (93,75 proc.) teigiamų MASA m÷ginių.

(31)

31 6.2. Išvados

1. Visose tirtose vištinių paukščių grup÷se nustatyti Staphylococcus genties mikroorganizmai: viščiukų broilerių – 70,79 proc., dedeklių vištų iš komercinių ūkių – 46,03 proc., ir dedeklių vištų iš nekomercinių ūkių m÷giniuose – 47,47 proc.

2. Koaguliazei teigiamos S. aureus buvo nustatytos 52 (24,21 proc.) m÷giniuose: 4 (7,69 proc.) – viščiukų broilerių , 17 (32,69 proc.) – vištų dedeklių iš komercinių ūkių ir 31 (59,62 proc.) - dedeklių vištų iš nekomercinių ūkių.

3. Meticilinui atsparus S. aureus nustatytas trijuose (5,77 proc.) vištinių paukščių m÷giniuose. Dviejuose iš komercinių ūkių vištų dedeklių (iš gerkl÷s ir nuo plunksnų), namin÷s vištos dedekl÷s gerkl÷s. Šiose MASA paderm÷se buvo aptiktas mecA genas.

Literatūros sąrašas

1. Derek Butler „MRSA Action UK - The Threat from Superbugs in our food“, 2008 08 11. Internetine prieiga: http://www.politics.co.uk/opinion-formers/mrsa-action-uk/article/mrsa-action-uk-the-threat-from-superbugs-in-our-food 2012 02

(32)

32 2. R. Bagdonas „Nudegimo žaizdos infekcijos kontrol÷s galimyb÷s“, didertacija 2005m., Kaunas

3. Internetin÷ prieiga 2012 01 12: http://www.as-galiu.lt/lt/zinoti/MRSA-superbakterija1.php

4. Internetin÷ prieiga2012 01 15: http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus

5. A.Lasinskait÷ – Čerkašina, A. Pavilonis, V. Vaičiuv÷nas „Medicinos mikrobiologija ir virusologijos pagrindai“, KMU leidykla, 2003m

6. Tortora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christine L. “Microbiology”, III liedinys, 2002m. 323 -324 psl.

7. A. Pavilonis, A.Lasinskait÷ – Čerkašina, V. Vaičiuv÷nas „Diagnostin÷ mikrobiologija“, KMU leidykla, 2007 m, 62-68 psl.

8. James G. Cappuccino, Natalie Sherman „Microbiology a labaratory manual“, 2011 m, 425-430 psl.

9. Paul G. Engelkirk, Janet Duben-Engelkirk „Labaratory diagnosis ofinfectious diseases Essentials of Diagnostic Microbiology“, Iiliedimas, 2008m, 217-224 psl.

10. Samuel Baron, M. D., „Medical Microbiology“ Addison-Wesley Publishing company, Inc 1982m., 239-247 psl.

11. Inge van Loo, Xander Huijsdens, Edine Tiemersma, Albert de Neeling, Nienke van de Sande-Bruinsma, Desiree Beaujean, Andreas Voss, and Jan Kluytmans „Emergence of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus of Animal Origin in Humans“ 2007 12 12. Internetin÷ prieiga 2012 02: http://www.medicalnewstoday.com/releases/90525.php

12. Huijsdens XW, Van Dijke B, Spalburg E, van Santen-Verheuvel MG, Heck ME, Pluister GN, „Community-acquired MRSA and pig-farming. Ann Clin Microbiol Antimicrob“. 2006;5:26.

13. Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Louie T, Conly JM. Novel „multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.“ J Clin Microbiol. 2005;43:5026–33.

14. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Wayne (PA): The Committee; 2006.

15. De Neeling AJ, Van den Broek MJM, Spalburg EC, Van Santen-Verheuvel MG, Dam-Deisz W, Boshuizen HC, High prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus in pigs. Vet Microbiol. 2007;122:366–72.

(33)

33 16. Duquette RA, Nuttall TJ. „ Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in dogs and cats: an emerging problem?“ J Small Anim Pract. 2004;45:591–7.

17. Cefai C, Ashurst S, Owens C. „ Human carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus linked with pet dog. Lancet.“ 1994;344:539–40.

18. Loeffler A, Boag AK, Sung J, Lindsay JA, Guardabassi L, Dalsgaard A,“ Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among staff and pets in a small animal referral hospital in the UK. J Antimicrob Chemother“. 2005;56:692–7.;

19. Weese JS, Archambault M, Willey BM, Heam P, Kreiswirth BM, Said-Salim B, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in horses and horse personnel, 2000–2002. Emerg Infect Dis. 2005;11:430–5

20. Baptiste KE, Williams K, Willams NJ, Wattret A, Clegg PD, Dawson S, Methicillin-resistant staphylococci in companion animals. Emerg Infect Dis. 2005;11:1942–4.

21. Cuney C. STrommenger B, Witte W. „Emergence of MRSA of multilocus sequence type ST398 in animals and in humans. In: Program and abstracts of the 12th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections“ Maastricht, the Netherlands; 2006 Sep 3–6

22. Ip M, Yung RW, Ng TK, Luk WK, Tse C, Hung P, Contemporary methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in Hong Kong. J Clin Microbiol. 2005;43:5069–73.

23. Pagal Europos maisto saugos tarnybą 2009 m. kovo 29 d. Internetin÷ prieiga: http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1211902408758.htm žiūr÷ta: 2011 11 02

24. Davy Persoons, Sebastiaan Van Hoorebeke Comments to Author, Katleen Hermans, Patrick Butaye, Aart de Kruif, Freddy Haesebrouck, and Jeroen Dewulf „Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Poultry“, 2009 03.

25. Steer JA, Papini RP, Wilson AP, Mc Craither DA, Parkhouse N. „quantitative microbiology in the management of burn patients. I. Correlation between quantitative and qualitative burn wound biopsy culture and suface alginate swab culture.“ Burns 1996.22:173-6

26. Heid CA,Stevens J, Livak KJ, Williams PH Real time quantitative PCR. Gename Res 1996; 6:986-94

27. Killgare GE, Holloway B, Tenover FC. "A5'nuclease PCR (TaqMan) high throughput assayfor detecion of the mecA gene in staphilococci. J. Clin. Mikrobiol. 2000; 38:2516-9

(34)

34 28. Lina G, Piemont Y, Godail-Gamot F, Bes M, Peter MO, Gauduchon V, Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis. 1999;29:1128–32.

29. Edwards-Jones V, Dawson MM, Childs C. A seurvey info toxic shock syndrome (TSS) in UK burns 2000; 26:323-33

30. Williams P, Camara M, Hardman A, et al, Qourum sensing and the population-dependent control of virulence. Philos R. Soc.Lond B Biol. Sci. 2000; 355:667-80

31. Satoru Kitai, Akira Shimizu, Junichi Kawano, Eri Sato, Chisa Nakato, Tatsuya Uji and Hiroshi Kitagava Characterization of methicillin – resistant S. aureus isolated fron retail raw chicken meat in Japan/J.vet. med. Sci 67(1):107-110, 2005;

32. Maželien÷, 2012 m. (Internetin÷ prieiga:

http://www.scribd.com/doc/78303741/Stafilokokai-streptokokai-1 (žiūr÷ta: 2012 05 10) )

33. A. Mickien÷, 2009 m. Internetin÷ prieiga: http://www.pasveik.lt/sveikatos-ir-medicinos-naujienos/nors-ir-auksine-bakterija-bet-infekcija-sukelia/44105 (žiūr÷ta 2012 03 15)

34. Mark D. Fielder, School of Life Sciences, Kingston University, Penrhyn Road, Kingston-Upon-Thames, Surrey KT1 2EE, UK, 2007.

35. Pantosi A. „Methicillin-reistant Staphylococcus aureus associated with animals and its relevance to human health“, Frontiers in microbiology, 2012.

1 Priedas: m÷ginių ÷mimo ir tyrimo rezultatų lentel÷s

(35)

35 Ei l. N r.: Viš tos Dedekl÷ s iš komerci nių ūkių/M÷ ginys Koagul iazei teigiam i Kraujo agaras Manit o agara s Katal az÷ Β-laktama z÷ Staphy testas MRSA agaras PGR Atspar umas OX/A MC 1 1Pl2010 1129 ne N÷ra hemoliz ÷s neskal do manit o

netirta netirta netirta netirta netirta netirta

2 1Kl2010 1129 ne N÷ra hemoliz ÷s neskal do manit o

3 1 1G2010 1129 ne N÷ra hemoliz ÷s neskal do manit o

4 2Pl2010 1129 ne N÷ra hemoliz ÷s neskal do manit o

10 4 4Pl2010 1129 ne N÷ra hemoliz neskal do

(36)

36 ÷s manit o 11 4Kl2010 1129 ne N÷ra hemoliz ÷s neskal do manit o

12 4G2010 1129 ne N÷ra hemoliz ÷s neskal do manit o

19 7Pl2010 1129 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas

netirta netirta netirta netirta netirta

21 7 7G2010 1129 ne N÷ra hemoliz neskal do manit

(37)

37 ÷s o 22 1Pl2010 1219 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

teigiamas teigiamas neigiam

as netirta netirta 23 1Kl2010 1219 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

as netirta netirta 24 8 1G2010 1219 ne N÷ra hemoliz ÷s neskal do manit o

27 9 2G2010 1219 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

as netirta netirta 28 3Pl2010 1219 ne hemoliz avo eritrocit us neskal do manit o

29 3Kl2010 1219 ne hemoliz avo eritrocit us neskal do manit o

30 10 3G2010 1219 ne hemoliz avo eritrocit us neskal do manit o

31 4Pl2010 1219 ne hemoliz avo eritrocit us neskal do manit o

32 11 4Kl2010 ne hemoliz avo neskal do

(38)

38 1219 eritrocit us manit o 33 4G2010 1219 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

35 5Kl2010 1219 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

as netirta netirta 36 12 5G2010 1219 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

39 13 6G2010 1219 ne hemoliz avo eritrocit us neskal do manit o

40 7Pl2010 1219 ne hemoliz avo eritrocit us neskal do manit o

as

(39)

39 43 1Pl2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

neigiamas netirta netirta netirta

44 1Kl2011 0228 ne hemoliz avo eritrocit us skaldo manita neigia mas

netirta netirta netirta netirta netirta

teigiamas teigiamas abejotin

as neigia mas netirta 46 2Pl2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

47 2Kl2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

48 16 2G2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

49 3Pl2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

50 3Kl2011 0228 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

teigiamas teigiamas abejotin

as neigia mas netirta 51 17 3G2011 0228 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

teigiamas teigiamas teigiam

as teigia mas teigiam as 52 4Pl2011 0228 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

teigiamas teigiamas teigiam

as teigia mas teigiam as 53 4Kl2011 0228 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

as netirta netirta 54 18 4G2011 0228 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

as

(40)

40 55 5Pl2011 0228 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

as netirta netirta 56 5Kl2011 0228 taip hemoliz avo eritrocit us skaldo manita teigia mas

as netirta netirta 57 19 5G2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

58 6Pl2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

as netirta netirta 61 7Pl2011 0228 ne N÷ra hemoliz ÷s skaldo manita neigia mas neigiama s

as netirta netirta Bendrai: 17 29 29 17 17 17 2 2 2 Plunksnos 3 8 9 3 3 3 1 1 1 Kloaka 5 10 9 5 5 5 0 0 0 Gerkl÷ 9 11 11 9 9 9 1 1 1

(41)

41 2 lentel÷: m÷ginių ÷mimas iš naminių dedeklių 2011 04 20; 2011 05 05

Eil. Nr.: Višto s Namin÷s dedekl÷s Koagul iazei teigia mi Stafilo kokai Krauj o agaras Mani to agara s Katal az÷ Β-laktama z÷ Staphy testas MRSA agaras PGR Atspar umas OX/A MC 1 1PL2011 0420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

netirta netirta netirta netirt

a netirta 2 1G20110 420 taip N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas teigiam as teigia mas teigiam as 3 1 1KL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 4 2PL2011 0420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 5 2G20110 420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 6 2 2KL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 8 3G20110 420 ne hemoli zavo eritroci tus skald o manit a neigia mas

a

(42)

42 10 4PL2011 0420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 11 4G20110 420 ne hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas neigiam as neigiama s netirta netirt a netirta 12 4 4KL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 13 5PL2011 0420 taip hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas abejoti nas neigia mas netirta 14 5G20110 420 ne hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas neigiam as neigiama s netirta netirt a netirta 15 5 5KL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 17 6G20110 420 ne hemoli zavo eritrioc itus skald o manit a teigia mas neigiam as neigiama s netirta netirt a netirta 18 6 6KL201 10420 ne hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas neigiam as neigiama s netirta netirt a netirta 19 7PL2011 0420 taip hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas abejoti nas neigia mas netirta 20 7 7G20110 420 ne hemoli zavo eritroci tus skald o manit a neigia mas

a

(43)

43 21 7KL201 10420 ne n÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas

a netirta 22 8PL2011 0420 ne n÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 23 8G20110 420 ne n÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 24 8 8KL201 10420 ne n÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 25 9PL2011 0420 ne hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas neigiam as neigiama s netirta netirt a netirta 26 9G20110 420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 27 9 9KL201 10420 taip hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas abejoti nas neigia mas netirta 28 10PL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as neigiama s netirta netirt a netirta 29 10G2011 0420 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 31 11 11PL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as

netirta netirta netirt

a

(44)

44 32 11G2011 0420 taip hemoli zavo eritroci tus skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas abejoti nas neigia mas netirta 33 11KL20 110420 ne N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as

a netirta 34 12PL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as

a netirta 35 12G2011 0420 ne N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as

a netirta 36 12 12KL20 110420 ne N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as

a netirta 37 13PL201 10420 ne N÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as

a netirta 38 13G2011 0420 ne n÷ra hemoli z÷s skald o manit a teigia mas neigiam as

a netirta 39 13 13KL20 110420 taip hemoli zavo eritricit us skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas abejoti nas neigia mas netirta 40 1KL201 10505 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 41 1G20110 505 taip hemoli zavo eritricit us skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas neigia mas netirt a netirta 42 14 1PL2011 0505 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a

(45)

45 43 2KL201 10505 taip N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o teigia mas teigiama s teigiamas neigia mas netirt a netirta 44 2G20110 505 taip hemoli zavo eritricit us skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas neigia mas netirt a netirta 45 15 2PL2011 0505 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 46 3KL201 10505 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 47 3G20110 505 taip hemoli zavo eritricit us skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas neigia mas netirt a netirta 48 16 3PL2011 0505 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 49 4KL201 10505 ne N÷ra hemoli z÷s neska ldo manit o netirt a

a netirta 50 4G20110 505 taip hemoli zavo eritricit us skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas neigia mas netirt a netirta 51 17 4PL2011 0505 ne hemoli zavo eritricit us neska ldo manit o neigia mas

a netirta 52 5KL201 10505 ne hemoli zavo eritricit us neska ldo manit o neigia mas

a netirta 53 18 5G20110 505 taip hemoli zavo eritricit us skald o manit a teigia mas teigiama s teigiamas neigia mas netirt a netirta