Šunų leišmaniozė. Diagnostika, gydymas ir rizikos veiksniai

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Eglė Špučytė

Šunų leišmaniozė. Diagnostika, gydymas ir rizikos

veiksniai

Canine leishmaniasis. Diagnostics, treatment and risk

factors

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

Darbo vadovas: doc. dr. Vida Babrauskienė

2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šunų leišmaniozė. Diagnostika, gydymas ir rizikos veiksniai“. 1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE

(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

3 TURINYS SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SUTRUMPINIMAI ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Šunų leišmaniozė ... 10 1.2. Sukėlėjas ... 10 1.3. Imuninis atsakas ... 11 1.4. Diagnozė ... 12 1.5. Gydymas ... 16 1.6. Klasifikacija ... 21 2. METODOLOGIJA ... 24

2.1. Duomenų rinkimui naudoti metodai ... 24

2.2. Naudota medžiaga ... 24

2.3. Duomenų analizė ... 26

3. TYRIMO REZULTATAI ... 27

3.1. Šunų leišmaniozės tyrimo rezultatai ... 27

3.2. Lytinis šunų leišmaniozės pasiskirstymas ... 28

3.3. Leišmaniozės priklausomybė nuo amžiaus ... 28

3.4. Veislės jautrumas šunų leišmaniozei ... 29

3.5. Palyginamoji CanL 5 metų studija... 30

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32

5. IŠVADOS ... 35

5 SANTRAUKA

Magistrinio darbo pavadinimas: Šunų leišmaniozė. Diagnostika, gydymas ir rizikos veiksniai.

Darbo autorė: Eglė Špučytė, darbo vadovė: doc. dr. Vida Babrauskienė.

Baigiamojo darbo parametrai: apimtis 49 puslapiai, darbe yra 1 lentelė, 10 paveikslų, 113 literatūros šaltinių.

Darbo tikslas: įvertinti šunų leišmaniozės paplitimą X klinikoje, Maltoje bei nustatyti galimus rizikos veiksnius, kurie predisponuoja Leishmania infantum sukeliamą infekciją šunims.

Darbo apibūdinimas:

 atliktas sergančių šunų kokybinis tyrimas veterinarijos klinikoje, Maltoje  ištirti ir uţregistruoti šunys sergantys šunų leišmanioze.

Tyrimo metodika:

 sukaupti duomenys apie tirtų pacientų skaičių per pastaruosius 2013 - 2014 metus  įvertinti galimi rizikos veiksniai

 palyginimui analizuoti ir ankstesnių metų duomenys nuo 2009 metų

 tyrimai atlikti greituoju imunochromatografiniu testu BVT Ehrli/Leish™ nustatant L.

infantum antikūnų buvimą

 duomenys tikrinti ir suvesti į vidaus duomenų bazę Vet Net Soft

 tyrimo rezultatai atliekant analizę perkelti į Microsoft Office Excel programą. Rezultatai ir išvados:

 per 2013 - 2014 metus X klinikoje buvo ištirti 887 gyvūnai, įtariant šunų leišmaniozę, iš kurių uţsikrėtę L.infantum buvo 140 šunų

 patinai jautresni šunų leišmaniozei (61%)

 tyrime, kuriame nustatomas amţinis pasiskirstymas, jautriausi šunys, kurių amţius yra nuo 4 iki 6 metų (40% visų tirtųjų priklauso šiai amţiaus grupei)

 leišmaniozė taip pat nevienodai veikia ir skirtingas veisles, Maltoje ypač jautri neseniai ten atveţta mopsų veislė, taip pat foksterjerai, labradorai, kiek maţiau bokseriai, Čihuahua, pitbulterjerai, mišrūnai. Ibizos šuo, išskirtinė veislė, kuriai leišmaniozė nėra nustatoma

6 SUMMARY

The Title of the Master Thesis: Canine Leishmaniasis. Diagnostics, treatment and risk factors.

The Student: Eglė Špučytė. The Tutor: Doc. Dr. Vida Babrauskienė

Key Features of the Final Paper: 49 pages total, 1 table, 10 pictures, 113 reference books used.

The Objectives of the Final Paper: to estimate the prevalence rate of Canine Leishmaniasis at X Clinic in Malta, to define possible risk factors that predispose Leishmania infantum infection in dogs.

The Description of Acivities:

 performing qualitative analysis of infected dogs at one clinic in Malta

 examining the dogs for Canine Leishmaniasis, registering and filing the cases The Methods of Research:

 the collection of data about the number of patients in 2013-2014  the analysis and estimation of possible risk factors

 the comparison of findings with records available since 2009

 the application of speed imunochromatographic test BVT Ehrli/Leish™ for rationing the presence L. infantum of antibodies

 the usage of internal data base Vet Net Soft to verify and store the data  moving the research results to Microsoft Office Excel.

The Results and Conclutions:

 887 animals were examined for Canine Leishmaniasis at the clinic in 2013-2014, 140 animals found positive with L. infantum

 male dogs have greater predisposition to L.infantum (61%)

 the research carried out showed, that the most sensitive dogs are aged 4 to 6 years (40% of the dogs examined were susceptable to the disease)

 not all breeds of dogs are equally predisposed to Canine Leishmaniasis; newly introduced Pug, also Fox-Terrier, Labrador are more susceptable; less susceptable are Boxers, Chihuahua, Pit Bull Terrier, crossbreeds. Ibiza Dog is a unique breed never diagnosed with Canine Leishmaniasis

7 SUTRUMPINIMAI

 CanL - Šunų leišmaniozė

 L. infantum - Leishmania infantum  L. chagasi - Leishmania chagasi  Leishmania spp. - Leishmania rūšys

 Phlebotomine - smėlinių muselių pošeimis, priklausantis Psychodidae šeimai  IV - į veną

8 ĮVADAS

Leišmaniozė - tai liga, kurią sukelia kelios parazitinių pirmuonių rūšys, priklausančios

Leishmania genčiai. Ji perduodama ţmonėms ir gyvūnams per kraujasiurbes phlebotomine smėlinių

musyčių pateles. Leishmania infantum yra ūmios zoonotinės ligos sukėlėjas tiek šunims, tiek ţmonėms (11). Šunys yra pagrindiniai šių infekciją sukeliančių parazitų šeimininkai (96). Šunys infekuoti L.infantum kelia didelę grėsmę gyvūnų ir visuomenės sveikatai dėl ligos zoonotinės kilmės (25). Moskitai L.infantum uţsikrečia siurbdami uţsikrėtusių ţmonių, gyvūnų kraują ar tarpląstelinį skystį. Esant odos leišmaniozei, moskitai uţsikrečia nuo pūslelių ar opų, esančių ant paţeistos ţmogaus ar gyvūno odos.

Susirgimai registruojami visuose ţemynuose, išskyrus Australiją, Antarktidą ir Ramiojo vandenyno salas. Leišmaniozės sukėlėjai skirstomi į dvi dideles grupes: Naujojo pasaulio

Leishmania spp. ir Senojo pasaulio Leishmania spp. (1 priedas). Leišmanijos aptinkamos Azijoje,

Afrikoje ir Europoje, vadinamos Senojo pasaulio leišmanijomis, Lotynų Amerikoje aptinkamos leišmanijos – Naujojo pasaulio leišmanijomis. Artimai susijusios padermės grupuojamos į kompleksus (12).

Leišmaniozės plitimui turi įtakos didėjanti tarptautinė migracija – kelionės, imigracija, emigracija, uţsienio karinės pratybos. L.infantum prisitaikė parazituoti šunų organizme, todėl miestuose pasitaiko didelių leišmaniozės protrūkių: uţsikrečia dešimtys ar šimtai ţmonių. Epidemijos metu netoli ţmonių gyvenantys šunys, kurie yra leišmanijos ciklo dalis, nulemia ir ţmonių uţsikrėtimo intensyvumą. Ir atvirkščiai, kai moskitai maitinasi toli nuo ţmonių gyvenamųjų rajonų gyvenančių šunų krauju, ţmonių sergamumas būna nedidelis.

CanL kliniškai yra lėtinė sisteminė liga pasireiškianti plačiu nespecifinių poţymių spektru (2 priedas). Ligos sunkumas dėl šeimininko imuninio atsako gali būti labai skirtingas. Uţkrato plitimas ţidiniuose priklauso nuo moskitų skaitlingumo ir suaugusių vabzdţių pasiskirstymo populiacijoje. Kuo daugiau moskitų ir kuo didesnis ilgaamţių patelių skaičius, tuo intensyviau vyksta epidemiologinis procesas. Moskitų skaitlingumas ir suaugusių vabzdţių populiacijos pasiskirstymas priklauso nuo klimatinių sąlygų ir gyvūnų, kurių krauju maitinasi moskitai, gausos.

9 Darbo tikslas:

įvertinti šunų leišmaniozės paplitimą X klinikoje, Maltoje bei nustatyti galimus rizikos veiksnius, kurie predisponuoja Leishmania infantum sukeliamą infekciją šunims.

Norint pasiekti darbo tikslą buvo iškelti uţdaviniai:

1. Nustatyti per pastaruosius metus ištirtų ir sirgusių šunų leišmanioze pacientų skaičių X klinikoje Maltoje.

2. Įvertinti ar lytis gali būti rizikos faktorius.

10 1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Šunų leišmaniozė

Šunų leišmaniozė yra grėsminga gyvybei zoonotinė liga, kurią sukelia kelios rūšys pirmuonių parazitų, priklausančių Leishmania genčiai. Ši liga plačiai paplitusi visame pasaulyje, aptinkama daugiau nei 70 šalių (31). Dar XX amţiaus pradţioje Leishmania pirmuonys buvo nustatyti tik Vidurţemio baseine, po kiek laiko Vidurio Rytuose, Kinijoje, Afrikoje, Centrinėje Azijoje. Pranešimas apie Vietnamą, o 2008 metais apie Taivaną įspėja apie anksčiau Azijoje nenustatytos ligos pavojų (87). Genetiškai L. infantum ir L. chagasi yra neatskiriamos, pastaroji paplitusi Amerikoje, daugiausia Brazilijoje bei Lotynų Amerikoje, naujų ţidinių neišvengta ir Šiaurės Amerikoje (41). Pietvakarių Europoje uţfiksuota maţiausiai 2,5 milijono infekuotų šunų (16.7%) (71). Liga pradėjo plisti ir į Šiaurės Europą (82). Paplitimas per paskutinį dešimtmetį šiaurės kryptimi siejamas su globalizacija, augintiniai iš vienos šalies į kitą keliauja kartu su šeimininkais (6, 82). Šis faktorius turėjo įtakos naujų ţidinių atsiradimui į šiaurę nuo įprastinių endeminių regionų (61). Leišmaniozės paplitimas sparčiai plečiasi į naujas geografines teritorijas.

1.2. Sukėlėjas

Leišmaniozė perduodama šunims, taip pat ir ţmonėms per kraujasiurbes phlebotomine moskitų - smėlinių musyčių pateles (51, 81). Leishmania infantum yra sunkios zoonotinės ligos sukėlėja, kurios pagrindinis šeimininkas yra naminis šuo (41). Šuo sergantis leišmanioze yra pavojaus šaltinis ne tik kitiems gyvūnams, bet ir grėsmė visuomenės sveikatai (10). Leišmaniozės sukėlėjai priklauso Protozoa (pirmuonių) tipui, Flagella (ţiuţelinių) klasei, Trypanosomatidae (tripanosomatidţių) šeimai, Kinetoplastida rūšiai, Leishmania genčiai, kuri pasiţymi mitochondrinėmis DNR organelėmis (kinetoplastais). Leishmania gyvybinis ciklas vyksta keičiant šeimininkus. Vystymosi metu Leishmania esti dviejų formų: amastigotinės ir promastigotinės. Ţiuţelinės (promastigotinės) - judrios formos parazitai dauginasi kraujasiurbių phlebotomine smėlinių musyčių patelių ţarnyne. Pabaigęs virškinti kraują, parazitas migruodamas link skrandţio virsta į nereplikacinę promastigotę (metaciklogenezė). Vėliau per moskito įkandimo vietą

Leishmania deponuojasi naujo šeimininko dermoje. Dermos makrofagai aktyviai fagocituoja

11 vis daugiau fagocitų (23). Parazitų išplatinimas kūne priklauso nuo infekuoto šuns imuninio atsako stiprumo. Šunų leišmaniozės infekcijos paplitimas Vidurţemio protrūkiuose svyruoja tarp 2 ir 40 procentų. Tačiau atliktų tyrimų metu su specifiniu Leishmania ląsteliniu imunitetu, paplitimas buvo ţenkliai didesnis, dėl ko galima teigti, jog realiai paplitimas yra daug didesnis (3, 23, 41).

Pagrindiniams phlebotomus vektoriams priklauso P.(Phlebotomus) perniciosus, P. ariasi, P.

perfiliewi, P. neglectus and P.tobbi rūšys (15, 35, 49, 54, 58, 59, 60), jiems būdingas naktinis

aktyvumas, stipriausiai pasireiškiantis nuo vėlyvo pavasario iki vėlyvo rudens (4). Spėjama, kad leišmanioze šunys gali uţsikrėsti ir vienas nuo kito, tai paaiškintų Amerikoje įvykusį fokshaundų veislės šunų leišmaniozės protrūkį (33).

1.3. Imuninis atsakas Leišmaniozės infekcija turi tris svarbias patogenines ypatybes:

1. Parazitas geba savarankiškai prasiskverbi į savo taikinį - makrofagą.

2. Ligos pasireiškimas ir vystymasis priklauso nuo šeimininko uţdegiminio bei imuninio atsako.

3. Infekcija išgyvena audiniuose.

Leishmania geba lokalizuotis visuose audiniuose su didesniu nei įprasta monocitinių -

12 kompleksų nusėdimus, kurie veda į glomerulonefritą, vaskulitą, poliartritą, uveitą, meningitą bei auto-antikūnų gamybą prieš eritrocitus bei trombocitus (3). Sergančių, tačiau nerodančių jokių poţymių, šunų su būdingu humoraliniu atsaku diagnostika atliekama ir pagal parazitų paplitimą kūne, sumaţėjusį T limfocitų CD4+ skaičių bei imunosupresiją (3, 43). T limfocitų CD4+ skaičius yra atvirkščiai proporcingas ir seropozityvumo daţnis tiesiogiai susijęs su phlebotomus uţkrečiamumu (44).

1.4. Diagnozė

Šunų leišmaniozės diagnozavimas pagrįstas visuma, kurią sudaro būdingi poţymiai, anamnezės duomenys, klinikinių tyrimų bei laboratorinės analizės rezultatai, kurie nustato parazito buvimą ar įvertina šeimininko imuninį atsaką.

1.4.1. Poţymiai ir anamnezė

Tyrimo metu svarbu atkreipti dėmesį į faktorius, kurie turi įtakos ligos paplitimui:

 Beveik visų veislių šunys gali sirgti leišmanioze, tačiau praktika parodė, kad kai kurios jų yra jautresnės ( 1, 90).

 Egzistuoja ir priklausomybė nuo lyties, patinai turi daugiau rizikos susirgti nei patelės (20, 34), panašūs dėsniai galioja ţmonių bei Sirijos ţiurkėnų tarpe (19, 103).

 Šunys gali uţsikrėsti bet kokio amţiaus, tačiau ir čia vyrauja skirtinga rizika, priklausanti nuo gyvūno amţiaus. Dalis tyrėjų teigia, jog vyrauja bimodalinis (dviejų viršūnių) pasiskirstymas, kurio viena viršūnė pasiekiama šuniui iki 3 metų amţiaus, o antroji 8-10 metų amţiaus (19).

 Kadangi liga paplitusi plačiai pasaulyje, būtina išsiaiškinti kur šuo gyvena ar į kurią endeminę vietą keliavo.

 Svarbu išsiaiškinti ar šuniui buvo naudotos profilaktinės priemonės nuo moskitų, ar taikytas gydymas, kuris galėtų trikdyti imuninio atsako stiprumą.

 Surenkami visi anamnezės duomenys susiję su leišmanioze, pvz.: svorio netekimas, odos paţeidimai, poliuria, polidipsia, epistaksis.

1.4.2. Klinikinė apţiūra

13 1 pav. Leišmanioze sergantiems šunims daţniausiai nustatomi sutrikimai (tyrime dalyvavo 140 šunų), (paveikslas iš internetinės svetainės: www.veterinaryrecord.bmj.com)

Kai kurie iš jų, pvz. hepatosplenomegalija, nustatomi diagnostiniais vaizdiniais tyrimais: rentgenu, magnetiniu rezonansu. Surinkus visus duomenis galima padaryti išvadas apie uţsikrėtimą

Leishmania parazitais. Visais atvejais pravartu atlikti laboratorinius tyrimus.

1.4.3. Laboratoriniai tyrimai

Pagrindiniai laboratoriniai testai yra CBC (bendras kraujo tyrimas), biocheminė serumo analizė, serumo baltymų elektroforezė ir šlapimo tyrimai. Šie tyrimai padeda aptikti vieną ar daugiau pakitimų susijusių su leišmanioze (94, 99). Galimi ir papildomi laboratoriniai tyrimai remiantis šių pagrindinių tyrimų rezultatais (17, 21, 64).

1.4.4. Specifiniai laboratoriniai tyrimai - etiologinė diagnozė

14 Diagnostiniai metodai sąlyginai yra suskirstyti į dvi pagrindines kategorijas:

 Tiesioginiai (citologinis vertinimas, histologinis vertinimas, organizmų kultyvavimas, PGR tyrimas bei ksenodiagnozė).

 Netiesioginiai (serologinis testavimas ir ląstelinio imuninio atsako vertinimas).  Citologinis vertinimas

Citologinis vertinimas leidţia paveiktų audinių makrofaguose mikroskopiškai nustatyti

Leishmania amastigotes. Ruošiant tepinėlį labiausiai infekuotos ląstelės gali suirti, todėl parazitai

gali būti aptinkami ir tarpląseliniame tarpe. Biopsijos ar aspirato tepinėlių mikroskopinio vertinimo metu taip pat gali būti nustatomi citologiniai pakitimai susiję su leišmanioze, tokie kaip limfoplazmocitinis ar granuliominis - piogranuliominis uţdegimas, limfmazgių reaktyvi hiperplazija, mieloido hiperplazija ar eritrocitų hipoplazija. Atliekant citologinį tyrimą aspiratą reikia imti iš mazginių, pūslinių, opinių odos ţaizdelių, kai pasireiškia tokie klinikiniai poţymiai kaip anemija, limfoadenopatija imami ir iš kaulų čiulpų, limfmazgių. Taip pat tinka bet kokie biologiniai skysčiai iš paţeistos vietos, pavyzdţiui artrito ar poliartrito atveju sinovinis skystis ar neurologinių poţymių atveju- CSF (cerebrospinalinis skystis), (70).

Jei nėra jokių leišmaniozei būdingų poţymių, aspiratas imamas iš audinių, kuriuose yra didţiausia tikimybė rasti Leishmania pirmuonis: kaulų čiulpų, limfmazgių, bluţnies, leukocitų iš periferinio kraujo (išvardinta maţėjančia tvarka diagnostiniui jautrumui), (92).

 Histologinis vertinimas

15  Pirmuonių kultyvavimas

Leishmania vystymosi ciklo ţiuţelinė stadija yra išskirtinė Leishmania rūšiai dėl gyvybingų

promastigočių, todėl parazitų kultūrų atpaţinimas yra labai specifiškas. Kultūrų auginimui gali būti naudojamos komercinės terpės, tokios kaip RPMI ar Shneider Drosophila, tačiau jos tinkamos promastigočių kultūros palaikymui, bet ne pačių parazitų išskyrimui. Tinkamiausia yra kraujo - agaro terpė. Nepatogumų kyla dėl rezultatų gavimo laiko, kadangi promastigotės kultūrai gauti reikia 30 dienų (65).

 PGR analizė

PGR (polimerazinės grandininės reakcijos) analizei naudojamas švieţias ar uţšaldytas 95 proc. etilo alkoholyje fiksuotas mėginys. Mėginys fiksuotas formaline, impregnuotas parafine nebėra geros kokybės. Polimerazės grandininė reakcija leidţia amplifikuoti specinines Leishmania genų sekas. Metodas yra labai jautrus, ypatingai dauginant DNR sekas, tokias kaip maţi rRNR subvienetų genai. Tokiu būdu tampa įmanoma aptikti labai maţus pirmuonių DNR kiekius biologinėje medţiagoje (37,53, 89, 65). Molekulinė technika gali būti lengvai panaudota keliems biologiniams mėginiams (55). Šunims su geru imuniniu atsaku į Leishmania, infekcija gali būti nesiejama su parazitų paplitimu, taigi teigiami PGR rezultatai iš odos mėginių endeminiuose regionuose, kai nėra odos paţeidimų, nebūtinai yra susiję su ligos buvimu (65). Šunims su leišmanijos klinikiniais poţymiais, bet esant neigiamiems citologiniams bei histologiniams tyrimo rezultatams, atliekamas PGR tyrimas (72, 88).

 Ksenodiagnozė

Ksenodiagnozės metu šuniui atliekama sedacija, gyvūnas patalpintas į gardą su laboratoriškai veistais phlebotomine vektoriais, kurie maitinasi šuns krauju. Po įkandimo ir kraujo suvirškinimo, moskitų ţarnynai yra tiriami dėl promastigočių aptikimo. Šis metodas yra labai jautrus bei specifiškas. Tinkamų vektorių naudojimas gali būti labai efektyvi terpė kultūrai augti, nors ji netaikoma įprastinėje klinikinėje praktikoje (26).

 Serologinis metodas

16 šuns organizme, antikūnų titras pradeda augti. Sergančių CanL šunų antikūnų titrai yra labai skirtingi (2pav.).

Prieinamos kelios serologinės tyrimo technikos: IFAT, ELISA, greitosios imunochromatografinės testo juostelės. Rinkoje parduodami greitai veikiantys kelių rūšių komerciniai rinkiniai, kuriuos sudaro imunochromatografinės testo juostelės. Šiais testais labai lengva naudotis, tačiau jų diagnostinis tikslumas maţesnis nei ELISA ar IFAT. O jautrumas bei specifiškumas vyrauja 30% - 70% ribose (37, 65, 83). Problema iškyla dėl galimai klaidingų neigiamų rezultatų. Kai greitojo leišmaniozės testo atsakymas neigiamas, nors įtariama, kad šuo gali sirgti leišmanioze, būtina atlikti jautresnius metodus. Dar daugiau, teigiami rezultatai nenurodo specifinių antikūnų titro. Greitųjų imunochromatografinių testų, kurių sudėtyje yra specifiniai rekombinantiniai Leishmania antigenai, privalumas yra tas, jog jie sugeba atskirti serologines

Leishmania ir Trypanosoma Cruzi reakcijas (71).

2 pav. Leišmanioze sergančių šunų antikūnų titrai, atvejų procentinė išraiška (paveikslas iš internetinės svetainės: www.veterinaryrecord.bmj.com)

1.5. Gydymas

17 Visi iki šiol ţinomi ir išbandyti vaistai sukelia laikiną ar pastovų klinikinių poţymių sumaţėjimą, bet nei vienas jų nepašalina infekcijos (5). Pradţioje buvo sukurti vaistai ţmonių leišmaniozei gydyti, vėliau jie pritaikyti ir šunų gydyme.

Leišmaniozės gydymas yra nukreiptas į parazitų skaičiaus maţinimą, parazitų sukeltą organų ţalos atstatymą, imuniteto stiprinimą, klinikinės būklės stabilizavimą bei recidyvų šalinimą.

 N-methyl-glukamino (meglumino) antimoniatas yra plačiausiai naudojamas vaistas tiek šunų, tiek ţmonių leišmaniozei gydyti. Vaistas selektyviai slopina leišmaninę glikolizę bei riebalų rūgščių oksidazę. Ţmonių leišmaniozės atveju, 94 - 95% pacientų pasveiksta skyrus gydymą 20 mg Sbv (meglumino antimoniato) 28 dienas (38,39). Meglumino antimoniatas turi trumpą pusininį eliminacijos periodą: 21, 42 ir 122 minutės atitinkamai, kai aplikuojama IV, IM, SC. 80- 95% vaisto po 6 - 9 valandų nuo aplikavimo yra pašalinami per inkstus (102, 105). Dauguma tyrimų parodė labai gerą vaisto efektyvumą. Gydymo metu klinikinis pagerėjimas pastebimas jau po vienos ar kelių savaičių, kartu pagerėjant hematologinėms bei serumo biocheminėms vertėms. Serumo baltymų atsistatymui reikia daugiau laiko, be to jis labiau priklausomas nuo vaisto dozės (5). Keli autoriai nurodė, jog gydymas meglumino antimoniato buvo neefektyvus ir nepašalino visų

Leishmania organizmų iš infekuotų šunų. Dar ir po kelių mėnesių nuo pasveikimo, šuns audiniuose

galima rasti šių parazitų (47, 74). Daţniausiai klinikiniai recidyvai atsiranda po gydymo praėjus laikotarpiui nuo mėnesio iki 1-2 metų bei kai pats gydymas trunka maţiau 4 savaites.

Gydymas, kurio sudėtyje yra Sbv, sumaţina bendrą parazitų invaziją bei kartu iššaukia trumpalaikį ląstelinį imuninį atsaką (24). Taip pat sukeliamas specifinių serumo antikūnų titro sumaţėjimas (5). Vaistų leidimo vietoje esantis skausmas bei patinimas nurodomas kaip daţniausias nepageidaujamas šalutinis efektas antimonialiniams vaistams. Kartais pasireiškia karščiavimas, diarėja, apetito stoka (30, 95). Aprašomi ir keli ūmaus pankreatito atvejai atsiradę dėl Sbv vartojimo (8). Iki šiol nenustatyta ţala inkstams dėl antimonialų vartojimo. Pranešta apie trumpalaikį serumo alanino aminotransferazės ir amilazės aktyvumo padidėjimą (48, 77).

18  Preparatas Allopurinol- FDA (Maisto ir vaistų valdyba) patvirtina, kad vaistas gali būti skirtas šunų leišmaniozės gydymui. Allopurinolb _{struktūrinis hipoksantino analogas, kuris} stabdo ksantino oksidazės aktyvumą, enzimo, kuris katalizuoja ksantino gamybą iš hipoksantino bei šlapimo rūgšties iš ksantino. Šis prieš Leishmania nukreiptas veikimas yra susiejamas su parazitų nesugebėjimu susintetinti purino iš naujo, tuo būdu purinas turi būti paimamas iš šeimininko organizmo.

Kai allopurinol patenka į ląstelėje esančią Leishmania amastigotę, jis virsta toksiniu (4-amino-pyrazolio-pyrimidinu), kuris nuţudo parazitą. Ţmonių praktikoje gydymas vien allopurinol nėra toks veiksmingas. Tokiu atveju naudojamas kombinuotas gydymas allopurinol bei antimonialais, kas leidţia sumaţinti Sbv dozę (32).

Kai šunims skiriamas tik Allopurinol gydymas minimalų laikotarpį, t.y. 2-3 mėnesius, gaunamas vidutinis klinikos pagerėjimas ir dalinis, kai kurių laboratorinių rezultatų atsistatymas, kaip antai ūmios uţdegiminių baltymų fazės metu (93, 107). Tai pat kaip ir gydant antimonialiniais preparatais, nėra pasiekiamas pilnas parazitologinis pasveikimas ir kai gydymas nutraukiamas galimi recidyvai. Dėl šios prieţasties, daţniausiai Allopurinol skiriamas ilgiems gydymo mėnesiams (21). Vaisto toleravimas yra puikus, be to pastebimas inkstų funkcijos blogėjimo pristabdymas šunims su proteinurija (be inkstų nepakankamumo), (79). Praktikoje labiausiai paplitusi Allopurinol dozė yra 5 - 20 mg/kg PO kas 12 valandų 2 - 24 mėnesius iš eilės (8).

Meglumino antimoniato - Allopurinol kombinacija daţniausiai skiriama šunų leišmaniozei gydyti, tačiau ir tai nesukelia visiško parazitologinio pasveikimo. Tyrimų metu paaiškėjo, kad šunys gydyti šia kombinacija turi ilgesnį klinikinių poţymių remisijos laikotarpį nei gydyti vienu iš pasirinktų vaistų (30). Daţniausiai laikomasi protokolo, kuriame skiriama meglumino antimoniato SC 100mg/kg kartą per dieną, 1 - 2 mėnesius kartu su Allopurinol PO 10mg/ kg kas 12 valandų keletą mėnesių. Šalutinis poveikis nesiskiria nuo to, kurį sukelia abu vaistai naudojami atskirai (8).

19 iš eilės kartu su meglumino antimoniatu 60mg/kg IM kas 12 valandų 4 savaites iš eilės. Ši kombinacija padeda pasiekti geresnių klinikinio bei parazitologinio gijimo rezultatų (74). Dėl toksinio inkstų bei vestibuliarinio aparato veiklos sutrikdymo vaistas vartojamas labai ribotai.

 Amfotericinas B (FDA patvirtina, kad vaistas gali būti skirtas šunų leišmaniozės gydymui) - polieninis amfotericinas Bd sąveikauja su grybelio membranos steroliais, o geriausiai su ergosteroliais. Kaip ir grybelis, Leishmania rūšys turi ergostaną, kuris sudaro sterolinės membranos pagrindą. Tai paaiškina amfotericino B efektyvumą gydant leišmaniozę. Kartu su dideliu efektyvumu, amfotericinas B turi ir stiprų šalutinį poveikį, kuris pasireiškia inkstų veiklos sutrikdymu, pireksija, pykinimu, anoreksija. Kasdienė 0,5 mg/kg dozė IV kas antrą dieną 4 savaites iš eilės sukelia 97% parazitologinį pagerėjimą ţmonėms, sergantiems leišmanioze (28).

Gydant šunis, amfotericinas B naudojamas pagaminant emulsiją su steriliu druskos (0,9% NaCl) tirpalu ir sojų aliejumi IV. Nors naudojant šį metodą kliniškai pasveiksta beveik visi šunys, vis dėl to amfotericinas B nėra naudojamas kaip rutininis gydymas dėl paruošimo bei administravimo sunkumų. Nuo 1990 metų liposominės formos amfotericinas B buvo svarbiausias ţmonių leišmaniozės gydymo vaistas vakarų šalyse. Besivystančiose šalyse dėl aukštos kainos jis vartojamas retai. Liposominis amfotericinas B gydant ţmonių leišmaniozę yra ţymiai maţiau toksinis nei standartinės formos, nors efektyvumas vienodas abiem atvejais (39). Toks pat principas yra ir gydant šunis, nors po pagerėjimo visada seka ligos poţymių pasikartojimas (73). PSO (Pasaulio Sveikatos Organizacija) įspėja apie šio vaisto naudojimą dėl galimai beatsirandančių naujų Leishmania padermių atsparių amfotericinui B.

 Miltefosinas - Miltefosinase yra alkilfosfocholinas, FDA nepatvirtintas šunų leišmaniozės gydymui. Jis buvo sukurtas ţmonių gydymui nuo vėţio, o vėliau pradėtas naudoti ir nuo leišmaniozės. Keliose Europos šalyse šis vaistas neseniai įregistruotas ir nuo šunų leišmaniozės skiriant oraliai. Tiek in vivo, tiek in vitro Miltefosinas pasireiškia veikimu prieš Leishmania, nes slopina ląstelės membranos sintezę bei signalo perdavimo kelius, kas veda į parazito ţūtį (52).

20 mėnesių laikotarpį (nuo vaisto vartojimo) mokslininkai nepastebėjo sunkaus šalutinio poveikio, tik retais atvejais vėmimą ir diarėją (63). Dėl selektyviai atsparių naujų Leishmania padermių atsiradimo tyrimų atlikta nebuvo arba duomenys neskelbiami.

 Pentamidinas (FDA patvirtina šunų leišmaniozės gydymui) - Pentamidinasf yra aromatinis diamidinas, kuris 1980 metais buvo naudojamas Indijoje, tačiau nustačius daugybę šalutinių poveikių (vėmimas, viduriavimas, hipersalivacija, sisteminė hipotensija, anafilaktinis šokas) jo vartojimas buvo nutrauktas (50, 84).

 Spiramicino - metronidazolio derinys - metronidazolis, bet ne spriramicinas yra FDA patvirtintas šunų leišmaniozės gydymui. Keli mokslininkai atliko in vitro tyrimą su 13 leišmanioze uţsikrėtusių šunų dėl metronidazolio veikimo prieš Leishmania, kuriuo siekė įvertinti spiramicino ir metronidazolio derinio efektyvumą (76). Rezultatai buvo lyginami su kita grupe, kurią sudarė 14 leišmanioze uţsikrėtusių šunų, bet gydytų antimonialo – Allopurinol deriniu, abi grupės gydytos 90 dienų. Kliniškai pagerėjusių atvejų mastas tarp lyginamų grupių nebuvo ţenklus.

 Marbofloksacinas (FDA patvirtina šunų leišmaniozės gydymui) - Marbofloksacinasf yra sintetinis trečios kartos fluorochinolonas, sukurtas veterinariniam naudojimui. Jis turi stiprų poveikį prieš kai kurias bakterijų rūšis ir daţniausiai skiriamas plataus spektro Gram+ ir Gram- bakterinėms infekcijoms gydyti. Kaip ir kiti kvinolonai, marbofloksacinas slopina bakterijų enzimų DNR girazę. Tripanosomatidė, tokia kaip Leishmania infantum, turi labai panašią genominę struktūrą kaip ir bakterija. Atliktų tyrimu metu, buvo įrodytą marbofloksacino nauda, kai jo dozė 2 mg/kg PO kartą dienoje 28 dienas iš eilės, kartu derinant su kitais vaistais nuo leišmaniozės (21).

 Enrofloksacinas (FDA patvirtina šunų leišmaniozės gydymui) - Enrofloksacinasi yra fluorochinolonas in vitro gebantis padidinti makrofagų ţudymo aktyvumą nukreiptą prieš

Leishmania rūšis. Buvo įvertintas enrofloksacino veiksmingumas prieš leišmaniozę vieno ar

derinant su metronidazoliu, visi atvejai turėjo laikiną arba dalinį pagerėjimą (16).

21 a. Glucantime, Merial, Milanas, Italija.

b. Zyloprim, GlaxoWellcome, Filadelfija.

c. Humatin, Monarch Pharmaceuticals, Bristolis. d. AmBisome, Astellas Pharma, Deerfield’as. e. Impavido, Zentaris, Frankfurtas, Vokietija. f. Pentam 300, LyphoMed, Melrose Park. g. Spyramicin, CLL Pharma, Nice, Prancūzija. h. Zeniquin, Pfizer, Kalamazoo, Mich’as. i. Baytril, Bayer, Shawnee, Kan’as.

j. Motilium, Janssen-Cilag, Baar, Šveicarija.

1.6. Klasifikacija

Kol išryškėja klinikiniai poţymiai Leishmania infantum sukelta infekcija gali vystysis nuo kelių savaičių iki keliolikos mėnesių, be to ne visada lengva klasifikuoti šunis pagal specifines kategorijas. Kad būtų tinkamai parinktas gydymas bei išvengta ligos progresavimo į ūmesnę stadiją, diagnozavus leišmaniozę, veterinarijos gydytojas ligą ar infekciją priskiria reikiamai parazitologinei ir klinikinei stadijai.

CLWG (canine leishmaniasis working group) - veterinarų grupė dirbanti su leišmanioze, atlikusi išsamius tyrimus, pasiūlė šunis su serologiniais teigiamais rezultatais suskirstyti į 4 klinikines stadijas:

 A: neapsaugoti šunys

 B: uţsikrėtę šunys

 C: sergantys šunys (šunys su klinikiniais leišmaniozės įrodymais)

 D: sunkiai sergantys šunys.

22 1 lentelė. Šunų leišmaniozės suskirstymas į stadijas bei gydymo parinkimas

Leišmaniozės stadija Savybės Gydymas

A: neapsaugoti šunys Šunys su neigiamais citologiniais, histologiniais, parazitologiniais ir molekuliniais testų rezultatais, dėl maţų

Leishmania antikūnų titrų. Klinikiškai šunys

atrodo sveiki arba turi kitų ligų poţymių. Daţniausiai tokie Leishmania veikiami šunys yra tie, kurie gyvena ar gyveno ilgiau nei vieną sezoną geografiniame regione, kuriame buvo patvirtinti Leishmania

vektoriai.

Gydymas nereikalingas. Įtariamai sergantis šuo 2-4 mėnesius po rasto maţo antikūnų titro turi būti tikrinamas serologiškai. Jei toliau

pastebimas poţymių

progresavimas, numatomi parazitologiniai tyrimai naudojant tiesioginius metodus.

B: uţsikrėtę šunys Kategorija šunų, kuriems buvo patvirtinti parazitai tiesioginiais metodais, pvz. mikroskopine analize, PGR tyrimu ir kurie turi maţus Leishmania antikūnų titrus. Tokie šunys gali būti sveiki arba turėti kitos ligos klinikinių ar patologinių poţymių.

Gydymas reikalingas tuo atveju, jei tiesiogiai nustačius parazitų buvimą yra padidėjęs antikūnų titras praėjus kelioms savaitėms po pirmos serologinės diagnozės. Jei infekuoto šuns kraujo parodymuose neįvyksta serokonversija, gydymas neindikuojamas. Tokiu atveju šuo serologiškai tikrinamas kas 2- 3 mėnesius.

C: sergantys šunys Kategorija apimanti šunis su teigiamais citologiniais rezultatais bei aukštu

Leishmania antikūnų titru. Pastebimi vienas

ar daugiau klinikinių leišmaniozės poţymių. Nors ir nepastebima apţiūros metu klinikinių poţymių, bet hematologiniai, biocheminiai, šlapimo pakitimai rodo leišmaniozės buvimą, šuo vis tiek laikomas sergančiu.

Reikalinga tikslingas gydymas, o atlikus nuodugnią klino-patologinę patikrą gali būti priskirtas ir papildomas gydymas.

D: sunkiai sergantys šunys

Sergantys šunys su sunkia klinikine būsena, kuri pasiţymi proteinurine nefropatija ar lėtiniu inkstu nepakankamumu, vienu metu sekančiais negalavimais: regėjimo

23 sutrikimas, ūmus sąnarių paţeidimas

apsunkinantis judėjimą. Tai reikalauja imunosupresinio gydymo bei greta esančių infekcijų, neoplazijų, endokrininių, metabolinių ligų gydymo. (3)

nepakankamumo ar

hepatopatijos.

E-a: sergantys šunys, neatsakantys į paskirtą gydymą

Prieš priskiriant šiai kategorijai, visų pirma reikia įvertinti ar tinkamai buvo parinkti vaistai, dozė, administravimo daţnis, gydymo trukmė. Pakartotinai atliekami laboratoriniai tyrimai.

Jei minėti veiksmai patvirtina leišmniozės egzistavimą, paskiriamas alternatyvus gydymas.

E-b: sergantys šunys, kuriems iškart po rekomenduoto

gydymo pabaigos pasireiškia recidyvai

Kaip ir E-a atveju, kartojami ankščiau minėti tyrimai.

Dar kartą patvirtinus Leishmania, skiriamas alternatyvus specifinis gydymas.

Rekomenduojamas ir labiausiai paplitęs šunų leišmaniozės gydymui protokolas sudarytas iš meglumino antimoniato ir Allopurinol derinio. Jis gali būti skiriamas visiems šunims, kurie priklauso B, C, D stadijoms. Meglumino antimoniato duodama po 100 mg/kg SC kartą per dieną keturias savaites iš eilės, o Allopirinol 10mg/kg PO kas 12 valandų maţiausiai 6 mėnesius iš eilės. Meglumino antimoniato dozė gali būti padalinta į dvi lygias dalis po 50 mg/kg ar skiriama nuo 4 iki 8 savaičių laikotarpiui.

Daugumai šunų tinkamai skiriant šį protokolą B ir C stadijų atvejais, pasiekiamas klinikinis pasveikimas, kuris išlieka stabilus daugiau nei vienerius metus.

24 2. METODOLOGIJA

2.1. Duomenų rinkimui naudoti metodai

Atliktas kokybinis tyrimas, kurio metu buvo tirti šunys vienoje gyvūnų klinikoje Maltoje, kurioje atlikau klinikinę praktiką. Duomenys kaupti visus metus (nuo 2013-09-24 iki 2014-09-24). Šunys buvo patikrinami ar serga leišmanioze bei erlichioze (naudojamas vienu metu abi ligas nustatantis testas). Didelė dalis šunų yra gyvūnų gerovės pareigūnų atveţti į kliniką reguliariam patikrinimui arba radus juos suţeistus gatvėje. Apţiūros metu kiekvienas pareigūnų atveţtas šuo tikrinamas ar nėra uţsikrėtęs leišmanioze ar erlichioze. Benamių šunų patikrinimui lėšos skiriamos iš Maltos vyriausybinio projekto fondo, sergantys šunys gydomi, o vėliau siunčiami į prieglaudą arba surandami nauji šeimininkai, daţnai jauni šunys siunčiami į Vokietiją. Tačiau niekada nepaleidţiami atgal į gatves.

Palyginimui surinkti duomenys ir iš ankstesnių metų: 2013 m., 2012 m., 2011 m., 2010 m., 2009 m.

2.2. Naudota medţiaga

Tyrimui naudotas greitasis BVT Ehrli/Leish™ testas. Kiekvieno šuns duomenų kortelė (lytis, veislė, amţius, svoris, šeimininkas, adresas, apsilankymo data, atliktos procedūros, nuotraukos) surašoma ir saugoma kompiuterinėje programinėje sistemoje Vet Net Soft (VNS), kuria naudojasi veterinarijos gydytojai bei slaugos darbuotojai.

Kraujo paėmimas:

Prieš imant kraują šuo visada nuraminamas, kad procedūros metu patirtų kuo maţiau streso ir nesukeltų sunkumų kraujo ėmimui. Aplink mėginio ėmimo vietą kailis nukerpamas ir toliau vadovaujamasi aseptine technika: švariomis rankomis, naudojant įprastas procedūrines pirštines, etilo alkoholyje suvilgyta vata nuvalomas odos plotelis, iš kur bus imamas kraujas. Kraujas, esant įprastoms sąlygoms, imamas iš poodinės venos (v.cephalica)naudojant 21G dydţio adatą bei 1 ml. švirkštą, paimant apie 0,1 ml. kraujo.

BVT testas:

BVT Ehrli/Leish™ testus gamina Virbac® kompanija. Testas pagrįstas membranų imunochromatografija. Analizės metu nustatomi antikūnai (IgG) nukreipti prieš Leishmania

infantum. Uţlašinamas vienas lašas paimto kraujo ant paţymėtos vietos testo plokštelėje - šulinėlyje

25 3 pav. BVT Ehrli/Leish™ testo galimi rezultatai (paveikslas iš BVT Ehrli/Leish™ informacinio vadovo)

4 pav. BVT Ehrli/Leish™ testo teigiamas rezultatas (autoriaus nuotrauka)

Laukiama 20 minučių, per kurias išryškėja viena juostelė - neigiamas rezultatas, jei gyvūnas sveikas (3 pav. kairėje) arba dvi, jei kraujyje cirkuliuoja leišmaniozės antikūnų - rezultatas teigiamas (3 pav. dešinėje, 4 pav.). Esant abejonei, labai silpnam teigiamam rezultatui, testas kartojamas 6 - 10 savaičių laikotarpyje. Jei per 20 minučių atsiranda viena (kontrolinė) juostelė, su bet kokiais spalviniai pakitimais, netgi blankiais, uţregistruojamas teigiamas rezultatas. Testas laikomas negaliojančiu tik tokiu atveju, jei neišryškėja nei viena juostelė. Kompanija nurodo tyrimo patikimumą: jautrumas 98.8%, specifišumas 87%. Leišmanijos serokonversija yra pakankamai lėta, dėl šios prieţasties, esant abejonei dėl neigiamo rezultato, klinikoje testas pakartojamas po kelių savaičių.

26 2.3. Duomenų analizė

Sukaupti pastarųjų metų (2013 - 2014 m.) duomenys analizės metu perkelti ir apdoroti Microsoft Office Excel programoje. Kurioje patikrinti šunys sugrupuoti pagal rezultatų išvadas: teigiami, neigiami, silpnai teigiami ar abejotini atvejai, kiekvienoje grupėje atskirai taip pat nustatytas lytinis pasiskirstymas. Teigiamų atvejų atskirai nustatytas ir atvejų daţnumas pagal amţių, 8 grupės: 0-2 metai, 2-4 metai, 4-6 metai, 6-8 metai, 8-10 metai, 10-12 metų, 12-14 metų, 14-16 metų. Taip pat priklausomybė nuo veislės, siekiant rasti jautriausias leišmaniozei iš bokserių, čihuahua, malamutų, foksterjerų, taksų, labradoro retriverių, karaliaus Čarlzo spanielių, kokerspanielių, Tal- kacca, mopsų, Jorkšyro terjerų, pointerių, haskių, pitbulterjerų, prancūzų buldogų, anglų buldogų, anglų springerspanielių bei mišrūnų. Taip pat palyginimui paimti duomenys nuo 2009 metų apie kasmet tirtų šunų skaičių, teigiamų, neigiamų, abejotinų bei 2012 - 2013 metais ir silpnai teigiamų tyrimo rezultatų duomenis.

27 3. TYRIMO REZULTATAI

Tyrime dalyvavo 887 pacientai, kuriems buvo atliktas šunų leišmaniozės tyrimas. Pagrindiniai duomenys surinkti per laikotarpį nuo 2013- 09- 24 dienos iki 2014- 09- 24 dienos.

Statistinė analizė:

Tolimesnės lentelės bei diagramos parengtos pagal duomenis surinktus tyrimo metu, siekiant pavaizduoti esamą dabartinę šunų leišmaniozės situaciją.

3.1. Šunų leišmaniozės tyrimo rezultatai

5 pav. Tirtų CanL šunų rezultatai procentine išraiška

28 3.2. Lytinis šunų leišmaniozės pasiskirstymas

6 pav. Šunų leišmaniozės priklausomybė nuo lyties

Lytinis pasiskirstymas sveikų šunų grupėje: 43% patelių, 57% patinų. Sergančių leišmanioze tarpe: 39% patelių (55 patelės iš 140 šunų), 61% patinų (85 patinų iš 140 šunų), (p<0,05), silpnai teigiamų rezultatų tarpe: 55% patelių, 45% patinų, abejotinų: 37% patelių, 63% patinų.

3.3. Leišmaniozės priklausomybė nuo amţiaus

29 Leišmaniozė daţniausiai nustatoma šunims nuo 4 iki 6 metų (40 pacientų), kiek rečiau 2-4 metų (27 pacientai) bei 6-8 metų (29 pacientai) amţiaus grupėse. Jauniems šuniukams 0-2 metų amţiaus (11 pacientų) bei virš 10 metų (13 pacientų) Leishmania infantum aptinkama retai.

3.4. Veislės jautrumas šunų leišmaniozei

8 pav. Leišmaniozės pasireiškimas priklausomai nuo veislės

30 3.5. Palyginamoji CanL 5 metų studija

9 pav. 5 paskutinių metų šunų leišmaniozės tyrimų duomenys

31 10 pav. Šunų leišmaniozės testo rezultatai 2009-2013 metų laikotarpyje

32 4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šios studijos metu buvo nustatytas šunų leišmaniozės 16 procentų serologinis paplitimas, kuris yra labai artimas tyrimui, atliktam 2012 metais visose Maltos salose. Tuo metu teigiamų atvejų buvo 15,7% (tyrime dalyvavo 927 šunys). Tačiau šie duomenys ţenkliai skiriasi nuo dar anksčiau atliktų tyrimų (45), kuriuose paplitimas ţymiai didesnis. Šis skirtumas gali atsirasti dėl to, kad paskutiniu metu yra skiriamas didesnis dėmesys leišmaniozės kontrolei: tikslingesnis gydymo plano parinkimas, geresnis darbo organizavimas prieglaudose. Taip pat kiekvienas šuo su įtartinais klinikiniais poţymiais (jei šuo atveţtas gyvūnų gerovės pareigūnų, kiekvienas be išimties, kad ir be jokių poţymių) yra patikrinamas greituoju leišmaniozės testu, iš to seka, kad ligai dar nespėjus įsisenėti yra uţkertamas kelias jos plitimui. Vidurţemio regione vyravęs 30% paplitimas lėtai, bet maţėja (68, 71). Šie duomenys atitinka ir ţmonių visceralinės leišmaniozės paplitimo sumaţėjimą (42).

Nustatant lytinį jautrumą šunų leišmaniozei, rezultatai parodė, jog patinai yra paţeidţiamesni nei patelės (patinai 61%, tuo tarpu patelės 39%). Tai prisideda prie kitų studijų, kuriose nustatytas patinų didesnis polinkis sirgti šunų leišmanioze (67, 109, 110, 112). Viename tyrime rezultatai parodė, kad tik virš 7 metų amţiaus patinai turi didesnį polinkį šiai ligai nei patelės. Viena iš galimybių, kodėl patinų skaičius didesnis, galėtų būti didesnis patelių mirtingumas, ypač nėštumo, vedimo ar ţindymo laikotarpiu (34). Lyties, kaip rizikos faktoriaus, duomenys nesutampa su

Headington tyrėjų atlikta bandomąja studija Maltos salose 2002 metais. Tai galėjo nutikti dėl maţo

testuotų šunų skaičiaus minėtame tyrime (60 šunų), kas galėjo iškreipti tyrimo atsakymus. Tyrimai atlikti Graikijoje ir Ispanijoje taip pat nepabrėţė didelio skirtumo dėl serologiškai teigiamų rezultatų tarp patelių ir patinų (68). Įdomu lieka tai, jog visuose tyrimuose buvo nurodytas arba ţenklesnis patinų jautrumas, arba jokio skirtumo tarp lyčių, bet nei viena studija nepateikė duomenų apie didesnį seroteigiamų patelių skaičių (62, 109). Šis polinkis taip pat gali būti susijęs su lyties imuniniu atsaku bei atsparumu L. infantum. Skirtingas hormonų kiekis taip pat gali turėti teigiamos ar neigiamos įtakos infekcijos atsiradimui.

33 gyvenamoji aplinka, smėlinių muselių paplitimas. Kitiems tai priklauso nuo L.infantum adaptacijos trukmės. Ibizos šuo (ţinomas kaip Podenco Ibicenco) yra išskirtinis tyrinėjant šunų leišmaniozę, kadangi šie šunys yra visiškai nejautrūs L.infantum pirmuonims. Spėjama, kad tai galėjo išsivysti per kelis dešimtmečius. Dėl nesėkmingo humoralinio imuninio atsako, šie šunys genetiškai prisitaikydami pradėjo gaminti stiprų pirminį TH1 ląstelinį imuninį atsaką. Tai lėmė, kodėl ši liga neaptinkama Ibizos šunims. Šios veislės kraujyje mokslininkai aptinka labai maţus antikūnų titrus (vasario mėnesį jis buvo maţesnis nei 140), (CLWG tyrėjų grupės nario dr. A. Zatelli asmeninis komentaras). Todėl Ibizos šuo yra toliau tyrinėjamas ieškant veiksmingiausios vakcinos nuo leišmaniozės.

Kitos šunų grupės taip pat yra gabios padidinti atsako stiprumą, tačiau ne tokiais dideliais mastais kaip Ibizos šunys (97). Mopsai, turintis didţiausius šansus, yra nauja veislė Maltos salyne. Prieš 15 metų buvo uţregistruoti vos 15 mopsų veislės šunų, nuo 2002 metų atsiradus dideliam susidomėjimui bei populiarumui, iš Didţiosios Britanijos buvo pradėtas masinis mopsų veţimas į Maltą (Mr D.P. Scerri, Maltos mopsų klubo prezidento asmeninis komentaras). Tai rodo, kad natūralios atrankos spaudimas neturėjo pakankamai laiko veikti naujos populiacijos, kuri dar nebuvo susidūrusi su L.infantum. Iš to kyla spėjimas, jog šalys, dar esančios laisvos nuo leišmaniozės, tame tarpe ir Lietuva, atsiradus sukėlėjui, gali ţaibiškai atsidurti rizikingoje situacijoje.

Lieka studijų, kurių metu nebuvo nustatytas ryšys tarp veislės bei serologinio paplitimo (34, 68). Kitų tyrimu metu nebuvo kreipiamas dėmesys į veislę, o tik į kailio ilgumą. Tokių tyrimų rezultatai parodė, kad ryšio tarp seroteigiamumo bei kailio nėra (68). Kailio ilgumas gali būti nelabai tikslus ar patikimas rodiklis, nes dauguma šeimininkų vasaros metu kerpa šunis, kai leišmaniozės vektoriai yra aktyviausi, taigi duomenys gali būti iškreipti (101).

Kelių stebėjimų metu, buvo padaryta išvada, kad šunys, kurie daugiau laiko leidţia lauke, o ypač šunys, kurie miega lauke, turi didesnį seropaplitimą lyginant su gyvenančiais viduje (2, 62, 71, 109). Tai gali būti siejama su kai kurių veislių dideliu sergamumu, nes šie šunys laikomi dėl apsaugos lauke: pitbulterjerai, bokseriai, kartais labradoro retriveriai. Dar daugiau, neseniai atliktos studijos metu paaiškėjo, kad šuniui, auginamam kartu su vienu ar keliais seroteigiamais leišmaniozei šunimis, yra ţymiai didesnė tikimybė uţsikrėsti L.infantum nei laikant pavieniui (2).

34 pateiktų tyrimo duomenų kaip antai 2011 metais atlikto tyrimo metu nebuvo nustatyta jokios ţenklios priklausomybės ligos pasireiškimui nuo amţiaus (68). Kai kurie autoriai pateikia bimodalinį (dviviršūnį) pasiskirstymą, pirmasis pikas pasiekiamas jauname amţiuje, antrasis - seniems gyvūnams (67). Taip pat yra duomenų apie padidėjusi seroteigiamumą tik vyresniame amţiuje. Kaip ir patys autoriai paţymi, šios teorijos sąlyga yra ta, jog bėgant laikui vyksta akumuliacinis augimas, kai šuo yra veikiamas smėlinių musyčių (71, 98, 109). Dar vieni tyrimai rodo, maţėjantį susirgimų skaičių vyresnių šunų tarpe, tai siejama su uţsikrėtusiųjų dideliu mirštamumu (110). Tačiau CLWG- tyrimo grupė nurodo, kad daţniausiai paveikiami šunys nuo 3 iki 6 metų amţiaus.

35 5. IŠVADOS

1. Maltos saloje esančiame gyvūnų gerovės centre per 2013 rugsėjo 24 d. - 2014 rugsėjo 24 d. laikotarpį greituoju imunochromatografiniu testu buvo patikrinti 887 šunys su leišmaniozei būdingais klinikiniais poţymiais. Serologiškai teigiami buvo 140 šunų.

2. Nustatytas didesnis jautrumas leišmaniozei patinų tarpe. Teigiamų rezultatų grupėje 39% buvo patelės, likę 61% patinai.

3. Įvertinta, kad daţniausiai serga 4 – 6m metų amţiaus šunys. Jie sudarė 40 % visų sergančių šunų skaičiaus.

4. Ligai labai jautri neseniai į Maltos salas atveţta veislė - mopsai (11šunų iš 140 sergančiųjų), taip pat foksterjerai (11 šunų), labradorai (10 šunų), kiek maţiau Čihuahua (9 šunys), pitbulterjerai (7 šunys), bokseriai (7 šunys) bei mišrūnai (7 šunys). Visiškai nejautrūs šiam parazitiniam pirmuoniui yra Ibizos veislės šunys ( Podenco Ibicenco).

36 LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Abranches P., Silva-Pereira M. C. D., Conceiçao-Silva F., et al. Canine leishmaniasis: pathological and ecological factors influencing transmission of infection. J Parasitol. 1991. P. 557– 561.

2. Alonso F., Gimenez Font P., Manchon M., et al. Geographical variation and factors associated to seroprevalence of canine leishmaniosis in an endemic Mediterranean area. Zoonoses and public health. 2010. P. 318-328.

3. Alvar J., Cañavate C., Molina R., et al. Canine leishmaniasis. Adv Parasitol. 2004. 88 p. 4. Amusategui I., Sainz A., Tesouro M. A. Effects of antimonial therapy for canine leishmaniasis on antibody titer. Ann N Y Acad Sci. 1998. P. 444–446.

5. Amusategui I., Sainz A., Tesouro M. A. Evolution of serum albumin/globulin ratio after antimonial therapy in canine leishmaniasis. Ann N Y Acad Sci. 1998. P. 447–449.

6. Antoniou M., Gramiccia M., Molina R., Dvorak V., Volf P. The role of indigenous phlebotomine sandflies and mammals in the spreading of leishmaniasis agents in the Mediterranean region. Euro Surveill. 2013.

7. Ashford R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. Int J

Parasitol. 2000. P. 1269-1281.

8. Aste G., Di Tommaso M., Steiner J. M., et al. Pancreatitis associated with N-methyl-glucamine therapy in a dog with leishmaniasis. Vet Res Commun. 2005. P. 269–272.

9. Athanasiou L. V., Kontos V. I., Saridomichelakis M. N., et al. A cross-sectional sero-epidemiological study of canine leishmaniasis in Greek mainland. Acta tropica. 2012. P. 291-295. 10. Baneth G., Aroch I. Canine leishmaniasis: a diagnostic and clinical challenge. Vet J. 2008. P. 14-15.

11. Baneth G., Koutinas AF., Solano-Gallego L., Bourdeau P., Ferrer L. Canine leishmaniosis - new concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. Trends Parasitol. 2008. P. 324-330. 12. Bartulienė A., Ţiliukienė J. Leišmaniozės epidemiologija, klinika, diagnostika, gydymo principai ir profilaktika (metodinės rekomendacijos). Uţkrečiamųjų ligų ir AIDS centras. Vilnius. 2011. 128 p.

37 14. Berczi I., Bertok L., Chow DA. Natural immunity and neuroimmune host defense. Ann N Y Acad Sci. 2000. P. 248–257.

15. Bettini S., Gramiccia M., Gradon L., Atzeni M.C. Leishmaniasis in Sardinia. Natural infection of Phlebotomus perniciosus Newstead by Leishmania infantum Nicolle. Med. Hyg. 2006. P. 54.

16. Bianciardi P, Fasanella A, Foglia Manzillo V, et al. The efficacy of enrofloxacin, alone or combined with metronidazole, in the therapy of canine leishmaniasis. Parasitol Res. 2004. P. 486– 492.

17. Bonfanti U., Zini E., Minetti E., et al. Free light-chain proteinuria and normal renal histopathology and function in 11 dogs exposed to Leishmania infantum, Ehrlichia canis, and

Babesia canis. J Vet Intern Med. 2004. P. 618–624.

18. Bourdoiseau G., Bonnefont C., Hoareau E., et al. Specific IgG1and IgG2 antibody and lymphocyte subset levels in naturally Leishmania infantum-infected treated and untreated dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1997. P. 21–30.

19. Brachelente C., Muller N., Doherr M. G., Sattler U., et al. Cutaneous leishmaniasis in naturally infected dogs is associated with a T helper-2 biased immune response. Vet Pathol. 2005. P. 166-175.

20. Brandonisio O., Carelli G., Ceci L., et al. Canine leishmaniasis in the Gargano promontory (Apulia, South Italy). Eur J Epidemiol. 1992. P. 273–276.

21. Cavaliero T., Arnold P., Mathis A., et al. Clinical, serologic, and parasitologic follow-up after long-term allopurinol therapy of dogs naturally infected with Leishmania infantum. J Vet Intern Med. 1999. P. 330–334.

22. Chamizo C., Moreno J., Alvar J. Semi-quantitative analysis of cytokine expression in asymptomatic canine leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol. 2005. P. 67-75.

23. Chance M. L., Evans D. A. The leishmaniases—the agent. In: Gilles HM, ed. Protozoal diseases. Arnold: London. 1999. P. 419–425.

24. Chapman W. L. Jr., Hanson W. L., Alving C. R., et al. Antileishmanial activity of liposome-encapsulated meglumine antimonate in the dog. Am J Vet Res. 1984. P. 1028–1030.

38 26. Cortes S., Rolao N., Ramada J., et al. PCR as a rapid and sensitive tool in the diagnosis of human and canine leishmaniasis using Leishmania donovani s.l.-specific kinetoplastid primers. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2004. P. 12–17.

27. Cringoli G., Rinaldi L., Capuano F., et al. Serological survey of Neospora caninum and Leishmania infantum co-infection in dogs. Veterinary parasitology. 2002. P. 307-313.

28. Davidson R. N. Practical guide for the treatment of leishmaniasis. Drugs. 1998. P. 1009– 1018.

29. Davidson R. N., Den Boer M., Ritmeijer K. Paromomycin. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2009. P. 653–660.

30. Denerolle P., Bourdoiseau G.. Combination allopurinol and antimony treatment versus antimony alone and allopurinol alone in the treatment of canine leishmaniasis (96 cases). J Vet Intern Med. 1999. P. 413–415.

31. Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2004. P. 305-318.

32. Di Martino L., Mantovani M. P., Gradoni L., et al. Low dosage combination of meglumine antimoniate plus allopurinol as first choice treatment of infantile visceral leishmaniasis in Italy.Trans R Soc Trop Med Hyg. 1990. P. 534–535.

33. Duprey Z. H., Steurer F. J., Rooney J. A., et al. Canine visceral leishmaniasis, United States and Canada, 2000–2003. Emerg Infect Dis. 2003. P. 440–446.

34. Fisa R., Gállego M., Castillejo S., et al. Epidemiology of canine leishmaniosis in Catalonia (Spain) the example of the Priorat focus. Vet Parasitol. 1999. P. 87–97.

35. Garifallou A., Hadjiantoniou M., Schnur L. F., Yuval B., et al. Epidemiology of human and canine leishmaniasis of the island of Zakinthos. In: Leishmaniasis. Ed: DT Hart Plenum Publishing Corporation. 1989. P. 1011-1015.

36. Gómez-Ochoa P., Castillo J. A., Gascón M., et al. Use of domperidone in the treatment of canine visceral leishmaniasis: a clinical trial. Vet J. 2009. P. 259–263.

37. Gradoni L. The diagnosis of canine leishmaniasis, in Proceedings. 2nd Int Canine Leishmaniasis Forum. 2002. P. 7–14.

38. Gradoni L., Bryceson A., Desjeux P. Treatment of Mediterranean visceral leishmaniasis. Bull World Health Organ. 1995. P. 191–197.

39 40. Gradoni L., Maroli M., Gramiccia M., et al. Leishmania infantum infection rates in

Phlebotomus perniciosus fed on naturally infected dogs under antimonial treatment. Med Vet

Entomol. 1987. 339–342.

41. Gramiccia M., Gradoni L. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. Int J Parasitol. 2005. P. 1169–1180.

42. Grech V., Mizzi J., Mangion M., et al. Visceral leishmaniasis in Malta--an 18 year paediatric, population based study. Archives of disease in childhood. 2000. P. 381-385.

43. Guarga J. L., Lucientes J., Peribanez M. A., Molina R., et al. Experimental infection of Phlebotomus perniciosus and determination of the natural infection rates of Leishmania infantum in dogs. Acta Trop. 2000. P. 203-207.

44. Guarga J. L., Moreno J., Lucientes J., Gracia M. J., et al. Canine leishmaniasis transmission: higher infectivity amongst naturally infected dogs to sand flies is associated with lower proportions of T helper cells. Res Vet Sci. 2000. P. 249-253.

45. Headington C. E., Barbara C. H., Lambson B. E., et al. Diagnosis of leishmaniasis in Maltese dogs with the aid of the polymerase chain reaction. Trans R Soc Trop Med Hyg 2002. P. 195-197. 46. Hinterberger-Fischer M. Prolactin as pro-inflammatory cytokine. Consideration on consolidated immunotherapy after high dosage therapy. Acta Med Austriaca Suppl. 2000. P. 16-20. 47. Ikeda-Garcia F. A., Lopes R. S., Marques F. J., et al. Clinical and parasitological evaluation of dogs naturally infected by Leishmania chagasi submitted to treatment with meglumine antimoniate. Vet Parasitol. 2007. P. 254–259.

48. Ikeda-Garcia F. A., Lopes R. S., Ciarlini P. C., et al. Evaluation of renal and hepatic functions in dogs naturally infected by visceral leishmaniasis submitted to treatment with meglumine antimoniate. Res Vet Sci. 2007. P. 105–108.

49. Izri M. A., Belazzoug S. Phlebotomus (Larroussius) perfiliewi naturally infected with dermotropic Leishmania infantum at Tenes, Algeria. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1993. P. 399. 50. Jha SN, Singh NKP, Jha TK. Changing response to diamidine compound in cases of kala-azar unresponsive to antimonials. J Assoc Physicians India. 1991. P. 314–316.

51. Killick-Kendrick R. Phlebotomine vectors of the leishmaniases: a review. Med Vet Entomol. 1990. 24 p.

40 53. Lachaud L., Marchergui-Hammami S., Chabbert E., et al. Comparison of six PCR methods using peripheral blood for detection of canine visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol. 2002. P. 210–215.

54. Léger N., Gramiccia M., Gradoni L., Madulo-Leblond G., et al. Isolation and typing of Leishmania infantum from Phlebotomus neglectus on the island of Corfu, Greece. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1988. P. 419-420.

55. Maia C., Campino L. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Vet Parasitol. 2008. P. 274–287.

56. Gradoni L., Gramiccia M. Leishmaniasis. In: OIE manual of standards for diagnostic tests and vaccine. 4th ed. Paris: Office International des Epizooties. 2000. P. 803–812.

57. Manna L, Reale S, Vitale F, et al. Real-time PCR assay in Leishmania-infected dogs treated with meglumine antimoniate and allopurinol. Vet J. 2008. P. 279–282.

58. Manna L., Vitale F., Reale S., et al. Study of efficacy of miltefosine and allopurinol in dogs with leishmaniosis. Vet J. 2009.P. 441–445.

59. Maroli M., Gramiccia M., Gradoni L. Natural infection of sandfly Phlebotomus perfiliewi with Leishmania infantum in a cutaneous leishmaniasis focus of the Abruzzi region, Italy. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2005. P. 596-598.

60. Maroli M., Gramiccia M., Gradoni L., Ready P., et al. Natural infections of phlebotomine sandflies with Trypanosomatidae in central and south Italy. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1988. P. 227-228.

61. Maroli M., Gramiccia M., Gradoni L., Troiani M., et al. Natural infection of Phlebotomus perniciosus with an enzymatic variant of Leishmania infantum in the Campania region of Italy.Acta Trop. 1994. P. 333-335.

62. Maroli M., Rossi L., Baldelli R., Capelli G., Ferroglio E., Genchi C., Gramiccia M., Mortarino M., Pietrobelli M., Gradoni L. The northward spread of leishmaniasis in Italy: evidence from retrospective and ongoing studies on the canine reservoir and phlebotomine vectors. Trop Med Int Health. 2008. P. 256-264.

63. Martin-Sanchez J., Morales-Yuste M., Acedo-Sanchez C., et al. Canine leishmaniasis in southeastern Spain. Emerging infectious diseases. 2009. P. 795-798.

41 65. Martìnez-Subiela S., Tecles F., Eckersall P. D., et al. Serum concentrations of acute phase proteins in dogs with leishmaniasis. Vet Rec. 2002. P. 241–244.

66. Mettler M., Grimm F., Capelli G., et al. Evaluation of enzyme linked immunosorbent assays, an immunofluorescent-antibody test, and two rapid tests (immunochromatographic-dipstick and gel tests) for serological diagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infections in dogs. J Clin Microbiol. 2005. P. 5515–5519.

67. Miranda S., Martorell S., Costa M., et al. Characterization of circulating lymphocyte subpopulations in canine leishmaniasis throughout treatment with antimonials and allopurinol. Vet Parasitol. 2007. P. 251–260.

68. Miranda S., Roura X., Picado A., et al. Characterization of sex, age, and breed for a population of canine leishmaniosis diseased dogs. Research in veterinary science. 2008. P. 35-38. 69. Miro G., Montoya A., Mateo M., et al. A leishmaniosis surveillance system among stray dogs in the region of Madrid: ten years of serodiagnosis (1996-2006). Parasitology research. 2007. P. 253-257.

70. Mirò G., Oliva G., Cruz I., et al. Multi-centre and controller clinical field study to evaluate the efficacy and safety of the combination of miltefosine and allopurinol in the treatment of canine leishmaniosis. Vet Dermatol. 2008. P. 7–8.

71. Mylonakis M. E., Papaioannou N., Saridomichelakis M. N., et al. Cytologic patterns of lymphadenopathy in dogs infected with Leishmania infantum. Vet Clin Pathol 2005. P. 243–247. 72. Moreno J., Alvar J. Canine leishmaniasis: epidemiological risk and the experimental model. Trends Parasitol. 2002. P. 399-405.

73. Muller N., Zimmermann V., Forster U., et al. PCR-based detection of canine Leishmania infections in formalin-fixed and paraffinembedded skin biopsies: elaboration of a protocol for quality assessment of the diagnostic amplification reaction. Vet Parasitol. 2003. P. 223–229.

74. Oliva G., Gradoni L., Ciaramella P., et al. Activity of liposomal amphotericin B (AmBisome) in dogs naturally infected with Leishmania infantum. J Antimicrob Chemother. 1995. P. 1013– 1019.

75. Oliva G., Gradoni L., Cortese L., et al. Comparative efficacy of meglumine antimoniate and aminosidine sulphate, alone or in combination, in canine leishmaniasis. Ann Trop Med Parasitol. 1998. P. 165–171.

42 in a cohort of naive dogs exposed to three consecutive transmission seasons. J Clin Microbiol. 2006. P. 1318-1322.

77. Pennisi M. G., De Majo M., Masucci M., et al. Efficacy of the treatment of dogs with leishmaniosis with a combination of metronidazole and spiramycin. Vet Rec. 2005. P. 346–349. 78. Pennisi M. G., Reale S., Giudice S. L., et al. Real-time PCR in dogs treated for leishmaniasis with allopurinol. Vet Res Commun. 2005. P. 301-303.

79. Pinelli E., Killick-Kendrick R., Wagenaar J., Bernadina W., et al. Cellular and humoral immune responses in dogs experimentally and naturally infected with Leishmania infantum. Infect Immun. 1994. P. 229-235.

80. Plevraki K., Koutinas A. F., Kaldrymidou H., et al. Effects of allopurinol treatment on the progression of chronic nephritis in Canine leishmaniosis (Leishmania infantum). J Vet Intern Med. 2006. P. 228–233.

81. Poli A., Sozzi S., Guidi G., et al. Comparison of aminosidine (paromomycin) and sodium stibogluconate for treatment of canine leishmaniasis. Vet Parasitol. 1997. P. 263–271.

82. Ready P.D. Biology of phlebotomine sand flies as vectors of disease agents. Annu Rev Entomol. 2013. P. 227-250.

83. Ready P.D. Leishmaniasis emergence in Europe. Euro Surveill. 2010. P. 19.

84. Reithinger R., Quinnell R. J., Alexander B., et al. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbent assay, and PCR. J Clin Microbiol. 2002. P. 2352–2356.

85. Rhalem A, Sahibi H, Lasri S, et al. Analysis of immune responses in dogs with canine visceral leishmaniasis before, and after, drug treatment. Vet Immunol Immunopathol. 1999. P. 69– 76.

86. Rodríguez A., Solano-Gallego L., Ojeda A., et al. Dynamics of Leishmania-specific immunoglobulin isotypes in dogs with clinical leishmaniasis before and after treatment. J Vet Intern Med. 2006. P. 495–498.

87. Rosypal A. C., Gogal R. M., Zajac A. M., et al. Flow cytometric analysis of cellular immune responses in dogs experimentally infected with a North American isolate of Leishmania infantum. Vet Parasitol. 2005. P. 45–51.

43

89. Roura X., Fondevila D., Sanchez A., et al. Detection of Leishmania infection in paraffin-embedded skin biopsies of dogs using polymerase chain reaction. J Vet Diagn Invest. 1999. P. 385– 387.

90. Roura X., Sanchez A., Ferrer L. Diagnosis of canine leishmaniasis by a polymerase chain reaction technique. Vet Rec. 1999. P. 262–264.

91. Sanchez-Robert E., Altet L., Sanchez A., et al. Polymorphism of SIc11 a1 (Nramp1) gene and canine leishmaniasis in a case-control study. J Hered. 2005. P. 755–758.

92. Santos-Gomes G. M., Rosa R., Leandro C., Cortes S., et al. Cytokine expression during the outcome of canine experimental infection by Leishmania infantum. Vet Immunol lmmunopathol. 2002. P. 21-30.

93. Saridomichelakis M. N., Mylonakis M. E., Leontides L. S., et al. Evaluation of lymph node and bone marrow cytology in the diagnosis of canine leishmaniasis (Leishmania infantum) in symptomatic and asymptomatic dogs. Am J Trop Med Hyg. 2005. P. 82–86.

94. Sasanelli M., Paradies P., de Caprariis D, et al. Acute-phase proteins in dogs naturally infected with Leishmania infantum duringand after long-term therapy with allopurinol. Vet Res Commun. 2007. P. 335–338.

95. Slappendel R.J. Canine leishmaniasis. A review based on 95 cases in The Netherlands. Vet Q 1988. 16 p.

96. Slappendel R. J., Teske E. The effect of intravenous or subcutaneous administration of meglumine antimonate (Glucantime) in dogs with leishmaniasis. A randomized clinical trial. Vet Q. 1997. P. 10–13.

97. Solano-Gallego L., Koutinas A., Miro G., Cardoso L., Pennisi MG., Ferrer L., Bourdeau P., Oliva G., Baneth G. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 2009. P. 1-18.

98. Solano-Gallego L., Llull J., Ramos G., et al. The Ibizian hound presents a predominantly cellular immune response against natural Leishmania infection. Veterinary parasitology. 2000. P. 37-45.

99. Solano-Gallego L., Morell P., Arboix M., Alberola J., Ferrer L. Prevalence of Leishmania

infantum infection in dogs living in an area of canine leishmaniasis endemicity using PCR on

several tissues and serology. J Clin Microbiol. 2001. P. 560-563.