LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Dovilė Vidrevičiūtė
Šunų parvovirusų diagnostika taikant polimerazės
grandininės reakcijos metodus
Canine parvovirus diagnosis using polymerase chain
reaction methods
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Raimundas Lelešius
2 DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šunų parvovirusų diagnostika taikant polimerazės grandininės reakcijos metodus“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1. Šunų parvovirusų atsiradimo istorija ir paplitimas ... 10
1.2. Parvovirusų charakteristika ir plitimo keliai ... 10
1.3. Būdingi klinikiniai požymiai ... 11
1.4. Motininių antikūnų sąlygojamas imunitetas parvovirusams ... 12
1.5. Diagnozavimas ... 12
1.6. Gydymas ... 14
1.7. Profilaktinė vakcinacija ... 14
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 16
2.1. Klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai ... 16
2.2. Patologinės medžiagos mėginių ėmimas ... 17
2.3. Molekulinės biologijos tyrimai ... 17
2.3.1. DNR išskyrimas ... 17
2.3.2. PGR ... 18
2.4. Statistiniai metodai ... 20
3. TYRIMO REZULTATAI... 21
3.1. Klinikinių ir epidemiologinių tyrimų rezultatai ... 21
3.2. PGR tyrimų rezultatai ... 21
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 34
5
SANTRAUKA
Šunų parvovirusų diagnostika taikant polimerazės grandininės reakcijos metodus Dovilė Vidrevičiūtė
Magistro baigiamasis darbas
Šunų parvovirusas (CPV) yra pagrindinis enterito sukėlėjas jauniems šuniukams, tačiau gali pasitaikyti ir suaugusių šunų tarpe. Lietuvoje jau buvo atlikti preliminarūs enteritu sergančių šunų tyrimai ir nustatytas užsikrėtimas CPV. Tačiau nebuvo tirti kliniškai sveiki šunys ir nustatytas jų užsikrėtimas parvovirusais. Todėl šio darbo tikslas buvo nustatyti CPV paplitimą sveikų ir sergančių šunų populiacijoje naudojant polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodus.
Darbas buvo atliktas 2013-2015 metais. Buvo surinkti 123 kliniškai sveikų ir sergančių šunų išmatų mėginiai ir ištirti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute naudojant PGR metodus.
Iš viso buvo surinkti ir ištirti 50 sveikų šunų ir 73 viduriuojančių šunų išmatų mėginiai. CPV rečiau buvo nustatytas sveikiems (16,0 proc.) nei sergantiems šunims (67,1 proc.) (p<0,01). Sergančius šunis, remiantis klinikinių tyrimų duomenimis, suskirsčius į dvi grupes paaiškėjo, kad parvovirusai dažniau nustatyti grupėje, kurioje buvo įtartas parvovirusinis enteritas (93,3 proc.) nei grupėje, kurioje parvovirusinis enteritas nebuvo įtartas (25,0 proc.) (p<0,01). Sergančių šunų grupėje iš 45 šunų, kuriems buvo įtartas parvovirusinis enteritas, 24 (53,3 proc.) buvo atlikti greitieji testai. Šių testų pagalba parvovirusai buvo nustatyti 66,6 proc. tirtų šunų. Ištyrus tuos pačius mėginius PGR metodu, buvo nustatyta daugiau parvovirusų atžvilgiu teigiamų mėginių (91,7 proc.) nei buvo naudojant greituosius testus (p<0,05). Apskaičiuotas greitųjų testų jautrumas buvo 72,7 proc. Daugiausia parvovirusai nustatyti šunims amžiaus grupėse iki 6 mėnesių amžiaus, kuriems buvo nustatyta preliminari parvovirusinio enterito diagnozė (85,7-100,0 proc.). Lyties įtaka užsikrėtimui nebuvo nustatyta (p>0,05). Atsižvelgiant į atliktą vakcinaciją, virusas dažniausiai buvo nustatytas nevakcinuotiems šunims (87,5 proc.), tačiau buvo atvejų, kai užsikrėtę buvo ir vakcinuoti šunys (14,3 proc.) (p<0,01).
6
SUMMARY
Canine parvovirus diagnosis using polymerase chain reaction methods Dovilė Vidrevičiūtė
Master‘s Thesis
Canine parvovirus (CPV) is the main cause of enteritis in young dogs, however it can also occur in adult dogs. Preliminary studies of dogs with enteritis was already done in Lithuania to identify infection with CPV. Even so infection with parvoviruses has not yet been detected in clinically healthy dogs. Therefore the objective of this study was to determine the prevalence of CPV in healthy and clinically affected dog population using polymerase chain reaction (PCR) methods.
The research was carried out in 2013-2015. There were 123 fecal samples of clinically healthy and clinically affected dogs collected and examined in Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Microbiology and virology institute using PCR methods.
A total of 50 fecal samples from healthy dogs and 73 fecal samples from clinically affected dogs were obtained and examined. CPV was less often detected in healthy (16.0%) than in clinically affected dogs (67.1%) (p<0.01). Clinically affected dogs, based on the results of clinical examination, were divided into two groups and it turned out that parvoviruses were identified more often in the group, where parvoviral enteritis was suspected (93.3%) than in the group where parvoviral enteritis was not suspected (25.0%) (p<0.01). In clinically affected group, where was suspected parvoviral enteritis, for 24 out of 45 dogs (53.3%) rapid tests were performed. Using these tests parvoviruses were determined in 66.6% of tested dogs. After investigating the same samples using PCR method, more samples were confirmed positive for parvoviruses (91.7%) than using rapid tests (p<0.05). Calculated sensitivity of rapid tests was 72.7%. Parvoviruses were identified mostly in groups where dogs were less than 6 months old and preliminary diagnosis was determined as parvoviral enteritis (85.7-100.0%). No influence by dogs sex was observed (p>0.05). Considering performed vaccination, virus was mostly detected in unvaccinated dogs (87.5%), although there were cases when vaccinated dogs also infected (14.3%) (p<0.01).
7
SANTRUMPOS
CPV – šunų parvovirusas
FPV – kačių panleukopenijos virusas MEV – audinių enterito virusas MVC – šunų minutės virusas MDA – motininiai antikūnai IC - imunochromatografija HA - hemagliutinacija VI – viruso izoliacija
PGR – polimerazės grandininė reakcija DNR – deoksiribonukleorūgštis;
RNase A – endoribonukleazė, kurios paskirtis suskaidyti viengrandinę DNR; dNTPs – deoksiribonukleotidtrifosfatas;
8
ĮVADAS
Šunų parvovirusinis enteritas yra labai užkrečiama liga, kuri pasireiškia visame pasaulyje, tačiau vis dar vystosi (1). Nuo pat savo atsiradimo aštuntojo dešimtmečio pabaigoje, CPV-2 greitai evoliucionavo ir originalų virusą pakeitė du nauji antigeniniai variantai, CPV-2a ir CPV-2b, kurie greitai paplito šunų populiacijoje visame pasaulyje (2). Trečias variantas, CPV-2c, buvo nustatytas 2000 metais Italijoje (3) ir vėliau buvo rastas kitose Europos šalyse, taip pat Azijoje, Amerikoje ir Afrikoje (2).
CPV yra pavojingiausias ir labiausiai užkrečiamas virusas, kuris paveikia neapsaugotus šunis. CPV infekcija pavojingiausia šuniukams nuo atjunkymo pradžios iki 6 mėnesių amžiaus (4). Suaugę šunys taip pat gali užsikrėsti parvovirusais (5). Viduriavimas pasireiškia bet kokio amžiaus šunims, tačiau daug stipresnis būna šuniukams. Taip pat būdingi simptomai yra depresija, apetito praradimas, vėmimas, karščiavimas. Ligos eiga būna įvairi ir priklauso nuo infekcinės viruso dozės ir klinikinių simptomų bei paprastai pasireiškia po 3-5 dienų po užsikrėtimo ir trunka 5-7 dienas. Sergamumas ir mirtingumas skiriasi priklausomai nuo amžiaus, ligos sunkumo ir gretutinių ligų pasireiškimo, todėl svarbu laiku diagnozuoti ligą (4).
Pirmosiomis šuniukų gyvenimo savaitėmis motininiai antikūnai (MDA) yra vienintelė specifinė sisteminė apsauga nuo CPV. Sisteminiai MDA titrai mažėja su amžiumi (6). Imunitetas gali trukti iki 16 šuniuko gyvenimo savaitės (7). Todėl siekiant apsaugoti šunis nuo parvovirusinio enterito yra taikoma profilaktinė vakcinacija. Tačiau nustatyta, kad gali užsikrėsti ir vakcinuoti šunys (5). To priežastis gali būti sąveika su MDA, kai vakcinuojami jauni šuniukai. MDA trukdo susidaryti aktyviam imunitetui po vakcinacijos ir susidaro maži antikūnų titrai. Todėl šuniukai gali būti jautrūs parvovirusinei infekcijai (8).
9 Darbo tikslas
Įvertinti ir palyginti šunų parvovirusų paplitimą ir vaidmenį kliniškai sveikų ir sergančių šunų populiacijoje.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti virškinimo trakto ligomis, pasižyminčiomis įvairiais klinikiniais požymiais, sergančių šunų užsikrėtimo parvovirusais dažnumą.
2. Atlikti sveikų ir sergančių šunų klinikinius tyrimus bei nustatyti preliminarią diagnozę remiantis surinkta anamneze, klinikinių tyrimų, greitųjų diagnostinių testų duomenimis bei palyginti apsikrėtimo šunų parvovirusais dažnumą priklausomai nuo įvairių veiksnių.
3. Įsisavinti PGR metodus ir jais naudojantis nustatyti šunų parvovirusais užsikrėtusius gyvūnus bei palyginti greitųjų diagnostinių testų ir PGR metodų jautrumą ir specifiškumą.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Šunų parvovirusų atsiradimo istorija ir paplitimas
Šunų parvovirusinis enteritas yra labai užkrečiama ir sunki liga. Ją sukelia virusas, kuris užkrečia jaunų šuniukų, suaugusių šunų ir laukinių šuninių šeimos atstovų virškinamojo trakto ląsteles (9). Virusas priklauso Parvovirus genties Parvoviridae šeimai, kuriai taip pat priklauso kačių panleukopenijos virusas (FPV) ir audinių enterito virusas (MEV) (10).
CPV pirmą kartą nustatytas 1978 metais Jungtinėse Amerikos Valstijose pasireiškus gastroenterito ir miokardito protrūkiui (11). Vėliau virusas buvo išskirtas ląstelių kultūrose ir pavadintas CPV-2, kad būtų galimą jį atskirti nuo nesusijusio šunų minutės viruso (MVC arba CPV-1), kuris sukelia naujagimių šuniukų mirtį (12). Manoma, kad CPV-2 kilo iš į FPV panašaus viruso, kuris sutinkamas pas laukinius mėsėdžius (11). Praėjus keliems metams po viruso nustatymo atsirado nauja viruso padermė, kuri pavadinta CPV-2a. 1984 metais atsirado dar viena antigeninė padermė, kuri buvo pavadinta CPV-2b (13). Abi šios padermės paplito šunų populiacijoje visame pasaulyje (11).
2000 metais Italijoje aptiktas naujas CPV tipas, pavadintas CPV-2c, kuris skiriasi viena amino rūgštimi nuo CPV-2b (3). Nuo tada šis tipas buvo aptiktas ir Portugalijoje (14), Švedijoje (15), Bulgarijoje (16), Argentinoje (17), Jungtinėse Amerikos Valstijose (18), Indijoje (19) bei kitose šalyse. Šunims užsikrėtusiems šia viruso paderme buvo pastebėti silpnesni klinikiniai požymiai nei užsikrėtusiems CPV-2a ir CPV-2b (20). Tačiau kiti autoriai teigia, kad užsikrėtusiems šia viruso paderme pastebėti sunkesni klinikiniai požymiai bei didesnis mirtingumas, net ir vakcinuotų šunų (3).
1.2. Parvovirusų charakteristika ir plitimo keliai
Virusas yra mažas, turintis viengubą DNR grandinę, be apvalkalo ir sugebantis formuoti naujus tipus (21). CPV replikacija vyksta tik tam tikrose greitai besidalijančiose ląstelėse, tokiose kaip žarnų kriptų epitelio ląstelėse, miokardiocituose, kamieninėse kaulų čiulpų ląstelėse. To pasėkoje ląstelės žūsta ir dėl mitozės susilpnėjimo yra prarandamos (22). CPV yra labai atsparus aplinkos veiksniams ir gali išgyventi net didelius temperatūros skirtumus ir džiovinimą. Todėl CPV gali išlikti aplinkoje mėnesius ar net metus (21).
11 amerikiečių pitbulterjerų, vokiečių aviganių, labradoro retriverių veislės šuniukai (22,23). CPV į organizmą patenka fekaliniu-oraliniu būdu arba per nosį dėl tiesioginio kontakto su užkrėstomis išmatomis ar netiesioginio kontakto su virusais užkrėstais daiktais. Buvo pastebėtas ligos sezoniškumas. Dažniau šunys sirgo pavasarį ir rudenį (21).
Viremija stebima 1-5 dieną po užsikrėtimo ir klinikiniai požymiai pasireiškia po inkubacinio periodo, kuris trunka 3-7 dienas (24). Patekęs į organizmą virusas paveikia žarnyno kriptų epitelį, taip sukeldamas epitelio destrukciją ir gaurelių irimą. To pasėkoje normali ląstelių kaita (1-3 dienos plonojoje žarnoje) yra sutrikdoma, dėl ko atsiranda būdingi sutrumpėjusių ir atrofuotų gautelių patologiniai pažeidimai. Dėl gaurelių atrofijos sumažėja plonosios žarnos gaurelių absorbcinės galimybės (22). Virusas intensyviai platinamas su išmatomis 7-12 dienų, tačiau galimas ilgą laiką trunkantis viruso išskyrimas (25).
1.3. Būdingi klinikiniai požymiai
Skiriamos dvi parvovirusinio enterito formos: enterito ir miokardito. Miokarditas pasitaiko vis rečiau ir gali išsivystyti šuniukams užsikrėtusiems gimdoje arba jaunesniems nei 8 savaičių amžiaus (23). Dažniausiai sutinkama enterito forma (22,24), kuri pasireiškia depresija, anoreksija, letargija, karščiavimu, vėmimu, leukopenija ir gleivinga ar hemoragine diarėja (22,23,27), nors gali pasireikšti ir lengvesni simptomai ar subklinikinė forma. Gyvūnas gali būti atvežamas į kliniką dėl anoreksijos, depresijos ir/arba vėmimo, bet ne dėl viduriavimo. Diarėja dažnai nestebima pirmas 24-48 valandas ligos valandas arba, jei vis dėlto pasireiškia, gali būti be kraujo priemaišų. Karščiuoja tik sunkiai sergantys šunys, o sergantys lengvesne forma karščiuoja rečiau (23). Pastebėta, kad nepriklausomai nuo amžiaus, gyvūnų mirtį įtakojo mažas kūno svoris (22).
Klinikinių požymių sunkumas priklauso nuo viruso virulentiškumo, užkrato kiekio, šuniuko amžiaus, veislės, organizmo apsauginių savybių, aplinkos ir patiriamo streso, antrinių bakterinių infekcijų bei žarnyno parazitų ar kartu pasireiškiančių kitų infekcijų (21,23). Dėl kamieninių kaulų čiulpų ląstelių pažeidimo organizmas tampa imlus antrinei bakterinei infekcijai (23). Atlikus tyrimus buvo nustatyta, kad iš 36 viduriuojančių šunų mėginių, kuriuose buvo rastas daugiau nei vienas infekcinis sukėlėjas, net 21 mėginyje buvo nustatytas ir CPV-2 (58,3 proc.). CPV-2 buvo vyraujantis infekcinis faktorius susijęs su kitais sukėlėjais viduriuojančių šunų išmatose. Kartu su CPV-2 dažniausiai buvo nustatomas Clostridium perfringens alfa toksinas, Cryptosporidium spp, ir Giardia
12 eliminavimą iš organizmo ir norint atstatyti organizmo elektrolitų, rūgščių ir šarmų balansą, maistinių medžiagų trūkumą, galimą sepsį ir kitas metabolines pasekmes (28).
1.4. Motininių antikūnų sąlygojamas imunitetas parvovirusams
Atjunkymo periodas yra kritiškai svarbus šuniukams. Gaudamas imunoglobulinų prisotintas krekenas, šuniukas kartu gauna ir motininių antikūnų (MDA), kurie yra esminis faktorius apsaugojant šuniuką nuo infekcijų ir mirties pirmomis jo gyvenimo savaitėmis (8). Su krekenomis gauti antikūnai sudaro apie 90,0 proc. visų šuniuko gaunamų MDA (1). Gautas MDA kiekis priklauso kalės turimo imuniteto parvovirusams (15). Motininiai antikūnai gali būti aptinkami iki 16 šuniuko gyvenimo savaitės (7). Tačiau atjunkymo laikotarpiu MDA gali trukdyti susidaryti aktyviam imuniniam atsakui po vakcinos panaudojimo. Todėl susidarę maži antikūnų titrai gali neapsaugoti nuo virulentiškų viruso padermių. Dėl šios priežasties šuniukai yra jautrūs parvovirozei (8), nes jų motininis imunitetas būna sumažėjęs, o jie dar nesugeba suformuoti pakankamo imuniteto kaip atsako į vakcinaciją (29). Todėl yra įprasta naudoti daugkartines vakcinų dozes, pradedant vakcinuoti nuo 6-8 mažiaus savaitės ir baigiant 12-16 savaičių amžiaus (7).
1.5. Diagnozavimas
Preliminari diagnozė dažnai nustatoma remiantis klinikiniais požymiais, tokiais kaip depresija, vėmimas, viduriavimas, anoreksija ir karščiavimas. Tyrimai turėtų būti atlikti visiems viduriuojantiems šunims, kuriems taip pat pasireiškė sisteminės ligos simptomai: vėmimas, letargija, karščiavimas, apetito praradimas, dehidratacija, arba šunims su neįprastai gausiu, dvokiančiu ar kraujingu viduriavimu, arba bet kuriam šuniui, kuris žinoma, kad turėjo kontaktą su parvovirusais per paskutines 14 dienų iki viduriavimo pradžios (4)
13 Testai nustatantys viruso antigenus, naudojant antikūnais pagrįstus metodus yra tinkami CPV diagnozuoti veterinarinėje praktikoje ir yra dažniausiai naudojami šioje srityje. Tačiau nustatyta, kad jų jautrumas, kaip ir kitų tradicinių diagnostinių metodų, žemesnis lyginant su molekuliniais tyrimais. Palyginus imunochromatografinio (IC) testo jautrumą su molekuliniais metodais nustatyta, kad testo jautrumas neviršijo 50 proc., kai molekulinių metodų specifiškumas buvo 100 proc. Žemas IC testo jautrumas buvo siejamas su išskiriamais mažais viruso kiekiais vėlesnėse infekcijos stadijose bei ankstyvais dideliais CPV antikūnų titrais (24).
Alternatyvūs metodai, tokie kaip hemagliutinacija (HA) ar viruso izoliacija (VI) gali būti atliekami tik specializuotose laboratorijose. HA yra paprastas ir greitas metodas aptikti CPV išmatose (4). Rezultatai stebimi praėjus 4 valandoms. Tyrimams atlikti reikalingi švieži eritrocitai. Dažniausiai naudojami kiaulių, rezusų ar kačių eritrocitai, tačiau tai kelia daug sunkumų, nes reikia nuolatinio ir geros kokybės šių eritrocitų šaltinio. VI reikalingos ląstelių kultūros, kurios gali būti propaguojamos tik laboratorijose su specializuotu personalu ir įranga. Be to, VI užima daug laiko, reikalingas ilgas inkubacijos periodas (5-10 dienų) ir papildomi tyrimai naudojant imunofluorescenciją ar HA tam, kad aptikti viruso antigenus. Tačiau pagrindinis HA ir VI trūkumas yra mažas jautrumas, greičiausiai dėl antikūnų, aptinkamų sergančių šunų žarnų spindyje, kurie gali surišti virionus ir neleisti įvykti HA ar viruso prisijungimui prie ląstelės receptorių (30). Tyrimai parodė, kad tiek natūralios, tiek eksperimentinės infekcijų atveju, CPV aptinkamas tik keletą dienų po infekcijos pradžios naudojant HA ar VI, kadangi metodai gali pateikti netikrai neigiamus rezultatus, nepaisant didelių virusinės DNR kiekių, nustatytų naudojant PGR (20,30).
Imunofermentinis ELISA metodas yra pagrįstas antigenų-antikūnų sąveika su specifiniais monokloniniais antikūnais. Šis metodas yra greitas, palyginti nebrangus ir gali būti atliekamas bet kurioje veterinarijos klinikoje. Neseniai buvo nustatyta, kad naudojant ELISA metodą CPV antigenams išmatose aptikti, sukėlėją galima nustatyti esant vos 1,5ng viruso. ELISA metodas tapo dažniausiai naudojamu tyrimu parvovirusų nustatymui šuniukų išmatose (4).
14 metodai, ypač realaus laiko PGR, reikalauja brangios įrangos, reagentų ir specialistų, todėl šių metodų naudojimas veterinarinėje praktikoje nėra galimas (30).
Vien tik teigiamų PGR rezultatų negana norint diagnozuoti parvovirusinį enteritą. Diagnozė turėtų būti pagrįsta atsižvelgiant į anamnezę, klinikinius požymius, laboratorinių tyrimų rezultatus (ypač leukopeniją) ir teigiamus išmatų tyrimų rezultatus. Iš esmės, kai gaunami teigiami greitojo testo rezultatai tikėtina, kad parvovirusinio enterito diagnozė yra teisinga. Tačiau neigiamas testo rezultatas nepašalina parvovirozės kaip galimos diagnozės šunims, kuriems pasireiškė hemoraginis enteritas. Tokiais atvejais papildomi tyrimai turėtų būti apsvarstyti, geriausia išmatų mėginius ištiriant PGR (25).
1.6. Gydymas
Šunų parvovirusinio enterito gydymas iš esmės toks pat kaip esant bet kokiam sunkiam infekciniam enteritui. Būtina skysčių ir elektrolitų terapija, kurią įprasta taikyti kartu su antibiotikais. Daugumai šunų tokio gydymo pakanka ir jie pasveiksta. Tačiau jauniems šuniukams, jautresnių veislių šuniukams ar tiems, kuriems pasireiškė sisteminis uždegiminis sindromas (SIRS) prognozė turėtų būti atsargesnė (23).
Elektrolitų ir skysčių balanso atstatymas yra svarbiausias terapijos tikslas. Sergantiems šunims turėtų būti skirta plataus veikimo spektro antibiotikų (ampicilino, eritromicino, gentamicino ir kt.). Simptominis gydymas naudojant steroidinius vaistus nuo uždegimo, plataus veikimo spektro antibiotikus ir skysčius bei elektrolitus gali išgelbėti šuns gyvybę. Skysčių terapija turėtų būti pradedama kuo anksčiau. Jei viduriavimas labai sunkus, gali pasireikšti metabolinė acidozė ir kalio papildai privalės būti naudojami kalio chlorido pavidalu, norint atstatyti elektrolitų balansą. Esant vėmimui reikėtų skirti antiemetinių preparatų. Nuolat vemiančiam šuniui nereikėtų duoti pašaro kol neatslūgs vėmimas ir viduriavimas (4).
1.7. Profilaktinė vakcinacija
16
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Darbas atliktas 2013-2015 metais. Iš viso buvo ištirti 123 šunys.
Mėginiai buvo rinkti trijose privačiose Kauno veterinarijos klinikose. Tyrimams buvo pasirinkti sergantys įvairaus amžiaus šunys, kuriems pasireiškė enteritas. Išmatų mėginiai buvo imami tiesiai iš analinės angos. Iš viso buvo surinkti 73 sergančių šunų fekalijų mėginiai.
Sveikų šunų išmatų mėginiai buvo surinkti Kauno, Kėdainių, Prienų ir Trakų rajonuose. Tyrimams buvo pasirinkti kliniškai sveiki, nuosavų namų teritorijoje gyvenantys, įvairaus amžiaus suaugę šunys. Iš viso buvo surinkta 50 sveikų šunų fekalijų mėginių.
Laboratoriniai tyrimai buvo atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute ir gauti rezultatai išanalizuoti šunų parvovirusų atžvilgiu.
2.1. Klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai
Prieš imant išmatų mėginius buvo surenkama anamnezė apie gyvūną ir įvertinama jo sveikatos būklė. Buvo renkama informacija apie gyvūno laikymo sąlygas, šėrimą, dehelmintizaciją, vakcinaciją. Jei mėginiai imti iš sergančių šunų, buvo išsiaiškintas pasireiškusių klinikinių požymių pobūdis ir trukmė.
Surinkus anamnezę buvo atlikta bendra klinikinė apžiūra: išmatuota kūno temperatūra, įvertinta gleivinių spalva, įmitimas, dehidratacijos laipsnis, pilvo palpacija siekiant nustatyti skrandžio ir žarnų būklę, skausmingumą, turinio konsistenciją. Sergantiems šunims, esant poreikiui ir galimybėms, papildomai atlikti kraujo morfologiniai ir biocheminiai tyrimai.
Diagnozės patvirtinimui, esant įtariamai parvovirozei, pagal galimybes buvo atliekami Anigen firmos CPV Ag/CCV Ag greitieji testai skirti parvo ir koronavirusų antigenų išmatose nustatymui. Tyrimai atlikti vadovaujantis gamintojo instrukcija.
17
2.2. Patologinės medžiagos mėginių ėmimas
Mėginiai imti klinikinio tyrimo metu, prieš tai įvertinus gyvūno būklę. Tada iš analinės angos paimtas nedidelis kiekis išmatų ir patalpintas į specialius mėgintuvėlius. Mėginiai buvo laikomi +4°C temperatūroje iki pristatymo į laboratoriją. Laboratorijoje mėginiai buvo užšaldyti iki -20ºC temperatūros ir laikomi iki tolimesnių tyrimų.
2.3. Molekulinės biologijos tyrimai
2.3.1. DNR išskyrimas
DNR buvo išskirta naudojant Genomic DNA Purification kit (kat. nr. K0512, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), ir GeneJET Genomic DNA Purification kit (kat. nr. K0721, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), DNR išskyrimo rinkinius. Antrasis rinkinys naudotas nutraukus gamintojui pirmojo rinkinio gamybą.
DNR išskyrimas naudojant Genomic DNA Purification rinkinį
DNR išskyrimas buvo atliekamas pagal gamintojo instrukciją. Į mėgintuvėlį įdedama 200 µl tiriamojo mėginio bei pridedama 400 µl lizuojančio tirpalo (Lysis Solution). Mėgintuvėliai patalpinami į termomikserį ir mišinys inkubuojamas 65ºC 5 min. Tada pridedama 600 µl chloroformo ir mėgintuvėliai sumaišomi juos apverčiant 3-5 kartus. Tuomet centrifuguojama 2 min. 12000 x g. Susidariusi viršutinė vandeninga fazė, kurios sudėtyje yra DNR, perkeliama į naują mėgintuvėlį. Tada atskiedžiamas precipitacijos tirpalas (Precipitation Solution). Sumaišoma 720 µl vandens be nukleazių ir 80 µl koncentruoto precipitacijos tirpalo. Į kiekvieną mėgintuvėlį pridedama 800 µl atskiesto precipitacijos tirpalo ir maišoma 1-2 min. Mėgintuvėliai centrifuguojami 2 min. 12000 x g. Tirpalas iš mėgintuvėlių nupilamas. Mėgintuvėlio dugne likusi DNR atskiedžiama 100 µl NaCl tirpalo. Pridedama 300 µl šalto etanolio ir leidžiama įvykti DNR precipitacijai (10 min. -20ºC). Tuomet mėgintuvėliai centrifuguojami 4 min. 12000 x g. Tirpalas iš mėgintuvėlių nupilamas ir susidariusios nuosėdos kartą plaunamos 70% šaltu etanolio tirpalu. DNR ištirpinama pridedant 100 µl vandens. Surinkta išgryninta DNR naudojama DNR tyrimui.
DNR išskyrimas naudojant GeneJET Genomic DNA Purification rinkinį
18 Tada pridedama 20 µl proteinazės K tirpalo ir maišoma vartant mėgintuvėlį iki vienalytės masės. Mėgintuvėliai patalpinami į termomikserį ir inkubuojami 56°C temperatūroje 15 min. Po to mėginiai išimami iš termomikserio ir į mišinį pridedama 20 µl RNase A tirpalo. Mėgintuvėlių turinys sumaišomas juos vartant ir 10 min. inkubuojama kambario temperatūroje. Tada į mišinį pridedama 200 µl lizuojančio tirpalo (Lysis Solution). Mišinys maišomas vartant mėgintuvėlius 15s. iki homogeninio mišinio susidarymo. Į mėgintuvėlį pridedama 400 µl 50% etanolio ir viskas sumaišoma vartant. Gautas mišinys perkeliamas į specialius GeneJET Genomic DNA Purification mėgintuvėlius. Tada mėgintuvėliai centrifuguojami 1 min. 6000 x g. Apatinė mėgintuvėlio dalis su jame esančiu tirpalu išmetama, o viršutinė dalis su filtru patalpinama į naują 2 ml surenkamąjį mėgintuvėlį. Tada pridedama 500 µl plovimui skirto buferinio tirpalo (Wash Buffer I) ir centrifuguojama 1 min 8000 x g. Nufiltruotas mišinys išpilamas iš apatinėje dalyje esančio surenkamojo mėgintuvėlio. Ant viršutinės mėgintuvėlio dalies užpilama 500 µl antrojo plovimui skirto buferinio tirpalo (Wash Buffer II) ir centrifuguojama 3 min. 12000 x g. Po to viršutinė mėgintuvėlio dalis perkeliama į naują 1,5 ml mėgintuvėlį. Į mėgintuvėlį įlašinama 200 µl specialaus išplovimo buferinio tirpalo (Elution Buffer), skirto DNR išplauti iš filtro. Mėgintuvėliai inkubuojami 2 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojami 1 min 8000 x g. Po to viršutinė mėgintuvėlio dalis išmetama, o apatinėje dalyje surinkta išgryninta DNR naudojama PGR tyrimui arba užšaldoma - 20°C temperatūroje.
2.3.2. PGR
Buvo išbandytos paprastos ir lizdinės PGR metodikos, aprašytos Kumar et al. (32), taip pat mūsų modifikuotas Kumar aprašytas paprastos PGR metodas. Pastarasis metodas ir naudotas darbe.
1 lentelė. Informacija apie naudotus pradmenis.
Pradmenys Sekos (5‘→3‘) Pozicija Produkto dydis
pCPV-2N (F) TGA GCT GCA TTT AGT TAG TTT TGA 3188-3211
19 Reakcijos mišinį (50µl) sudarė:
5 µL DNR
5 µL 10 x PGR buferinio tirpalo (MgCl2) (10 Mm Tris- HCl [Ph 8,3] 50 Mm KCl, 1,5 Mm
MgCl2, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva),
12 µL MgCl2 (25mM) (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva),
0,8 µM (40 pmol) pCPV-2N (F) pradmuo, 0,8 µM (40 pmol) pCPV-2N (R) pradmuo,
4 µL (0,8 µM) dNTP (10 mM) mišinio (R0192) (dNTP Mix (10 mM each), kat.nr. R0192, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva),
1µL (2,5 vnt.) Taq DNR polimerazė (rekombinantinė) (Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U/µL), kat. Nr EP0402, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva).,
H2O be nukleazių (R0582) iki 50 µL (water, nuclease-free, kat. nr. R0581, UAB "Thermo Fisher
Scientific Baltics", Lietuva),
PGR atlikti naudotas termocikleris Eppendorf Mastercycler Personal.
2 lentelė. PGR etapai.
Etapas Temperatūra, ºC Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 94 5 min 1
Denatūracija 94 30 s
30
Hibridizacija 50 1 min
Ekstensija 72 1 min
Galutinė ekstensija 72 5 min 1
Atvėsinimas 18 - 1
20 mikrobangų krosnelėje, o po to pridedama etidžio bromido 1 µL/10 ml agarozės gelio (Ethidium
bromide solution 1 %, 2218.1, kat. Nr. 2218.1, Carl Roth, Vokietija).
Sustingus agarozės geliui, po 1 val. 10 µL PGR DNR produktai buvo sumaišomi su 2 µL dažais (DNA Gel Loading Dye (6X), Kat. nr. R0611, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva) ir lašinami į agarozės duobutes. Tada agarozės gelis dedamas į vonelę su TAE 1X tirpalu. Elektroforezė atliekama 35-40 min. Tada buvo stebimi rezultatai.
Teigiama reakcija, kai matomas 442bp PGR DNR produktas.
1 pav. Šunų parvovirusų PGR tyrimų rezultatai.
2.4. Statistiniai metodai
Rezultatai buvo apdoroti Social Science Statistics internetine statistikos programa
(http://www.socscistatistics.com/tests/ztest/Default2.aspx). Z-testas buvo panaudotas įvertinti tyrimo
rezultatų skirtumų patikimumą tarp pasirinktų skirtingos klinikinės būklės, amžiaus, lyties, turimų vakcinacijos duomenų šunų grupių bei tarp skirtingų diagnostinių metodų.
21
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Klinikinių ir epidemiologinių tyrimų rezultatai
Klinikinių tyrimų metu iš viso buvo ištirti 123 šunys.Remiantis klinikinių tyrimų duomenimis, šunys buvo suskirstyti į kliniškai sveikus (n=50) ir sergančius įvairios kilmės virškinimo trakto ligomis (n=73). Kliniškai sveikų šunų mėginiai buvo surinkti 4 rajonuose, 11 gyvenviečių.
Sergantys virškinimo trakto ligomis šunys papildomai buvo suskirstyti į dvi grupes:
Pirma grupė, šunys, kuriems remiantis anamneze, klinikinių ir diagnostinių tyrimų duomenimis bei informacija apie vakcinaciją įtariamas šunų parvovirusinis enteritas (n=45),
Antra grupė, šunys, kuriems įtariama kita virškinimo trakto ligą sukėlusi priežastis (n=28).
Pirmos grupės šunys sirgo virškinimo trakto ligomis ir nebuvo vakcinuoti nuo šunų parvovirusinio enterito. Šių šunų klinikiniai požymiai įvairavo, dažnai nesiskyrė nuo antros grupės, bet pagrindinis kriterijus juos priskirti šiai grupei buvo duomenys apie netaikytas specifines profilaktikos priemones (vakcinaciją) nuo šunų parvovirusinio enterito.
Antros grupės šunys sirgo virškinimo trakto ligomis, bet buvo vakcinuoti nuo šunų parvovirusinio enterito. Šių šunų klinikiniai požymiai įvairavo, dažnai nesiskyrė nuo pirmos grupės, bet pagrindinis kriterijus juos priskirti antrai grupei buvo duomenys apie atliktą vakcinaciją.
Klinikinių tyrimų metu, dalis pirmos grupės šunų buvo ištirti naudojant greitąjį testą, skirtą šunų parvovirusinio enterito ir šunų koronavirusinio enterito diagnozei patvirtinti.
Iš viso buvo ištirti 24 šunų išmatų mėginiai, iš kurių 16 mėginių buvo teigiami.
3.2. PGR tyrimų rezultatai
22
67,1% 32,9%
Sergantys
Teigiami atvejai Neigiami atvejai
2pav. Sergančių enteritu šunų PGR tyrimų rezultatai parvovirusų atžvilgiu, proc.
16,0%
84,0%
Kliniškai sveiki
Teigiami atvejai Neigiami atvejai
3pav. Kliniškai sveikų šunų PGR tyrimų rezultatai parvovirusų atžvilgiu, proc.
23 Kliniškai sveikų šunų išmatų mėginiai buvo imami keturiuose skirtinguose Lietuvos rajonuose ir ištirti parvovirusų atžvilgiu. Rezultatai pateikiami 3 lentelėje. Gauti rezultatai leidžia palyginti viruso paplitimą tarp sveikų, nuosavų namų teritorijoje gyvenančių šunų skirtinguose regionuose.
3 lentelė. Sveikų šunų išmatų PGR tyrimų rezultatai skirtinguose rajonuose ir gyvenvietėse.
Rajonas Gyvenvietė Teigiami mėginiai Neigiami mėginiai Iš viso paimta mėginių n proc. n proc. Kauno Viršužiglis 0 0,0 5 100,0 5 Piliuona 2 40,0 3 60,0 5 Panevėžiukas 3 60,0 2 40,0 5 Kaniūkai 3 60,0 2 40,0 5 Daugėliškiai 0 0,0 5 100,0 5 Miškalaukis 0 0,0 4 100,0 4 Pagiriai 0 0,0 1 100,0 1 Prienų Išlaužas 0 0,0 5 100,0 5 Pakuonis 0 0,0 5 100,0 5 Kėdainių Sviliai 0 0,0 5 100,0 5 Trakų Aukštadvaris 0 0,0 5 100,0 5 Iš viso 8 16,0 42 84,0 50
Pagal 3 lentelės duomenis matome, kad iš keturių tirtų Lietuvos rajonų, parvovirusas nustatytas tik Kauno rajone. Piliuonoje nustatyti 2 teigiami, Panevėžiuke ir Kaniūkuose – po 3 teigiamus atvejus. Visi tose pačiose gyvenvietėse nustatyti užsikrėtę parvovirusais šunys buvo skirtingų šeimininkų. Kituose rajonuose sveikų šunų populiacijoje virusas nebuvo nustatytas. Tačiau dėl mažo ištirtų mėginių skaičiaus negalima teigti, kad šiuose rajonuose sveiki šunys neužsikrėtę parvovirusu.
24 42 7 8 45 28 50 0 10 20 30 40 50 60 Įtartas parvovirusinis enteritas Neįtartas parvovirusinis enteritas Kliniškai sveiki Mė gi n ių sk ai či u s, vn t. Teigiami Tirti mėginiai
4 pav. PGR teigiamų parvovirusų atvejų skaičius šunų grupėse, sudarytose remiantis klinikiniais
simptomais. 93,3% 25,0% 16,0% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0% Įtartas parvovirusinis enteritas Neįtartas parvovirusinis enteritas Kliniškai sveiki N ust at yt as parvovi rusas , proc.
5pav. PGR rezultatų palyginimas skirtingose šunų grupėse, sudarytose remiantis klinikiniais
25 Remiantis tyrimų rezultatais (4 ir 5 pav.) matome, kad 42 iš 45 (93,3 proc.) įtariamų parvovirusinio enterito atvejų pasitvirtino. Tuo tarpu tarp 28 viduriuojančių šunų, kuriems nebuvo įtartas parvovirusinės kilmės enteritas, teigiami buvo 7 mėginiai (25,0 proc.). Skirtumas lyginant dvi sergančių šunų grupes buvo statistiškai reikšmingas (p<0,01). Iš 50 kliniškai sveikų šunų mėginių teigiami buvo 8 (16,0 proc.).
Taigi daugiausiai parvovirusai buvo nustatytas sergantiems šunims, kuriems pasireiškė būdingi klinikiniai simptomai (93,3 proc.), o mažiausiai virusas nustatytas sveikų šunų grupėje (16,0 proc.). Šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,01). Tuo tarpu lyginant rezultatus gautus kliniškai sveikų šunų grupėje su rezultatais grupėje, kurioje nebuvo įtartas parvovirusinis enteritas, matome, kad pastarojoje parvovirusai nustatytas dažniau (p<0,05).
Iš visų 45 šunų, kuriems buvo įtartas parvovirusų sukeltas enteritas, atsižvelgiant į šunų šeimininkų galimybes, 24 šunims (53,3 proc.) buvo atlikti greitieji testai, skirti viruso antigenams išmatose nustatyti, norint patvirtinti įtariamą diagnozę. Šie testo rezultatai palyginti su rezultatais gautais ištyrus tų pačių šunų išmatų mėginius PGR metodu. Rezultatai pateikti 6 paveikslėlyje.
66,6% 91,7% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0% Greitieji testai PGR N u st a ty ta s p a rv o v ir u sa s, p ro c.
26 Greitieji testai parodė teigiamą rezultatą 16 mėginių (66,6 proc.). Tuo tarpu PGR metodu buvo nustatyti 22 iš 24 teigiami mėginiai (91,7 proc.). Šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05). Taigi, galime teigti, kad PGR metodas pasirodė žymiai tikslesnis.
Norint įvertinti išmatų mėginių tyrimų rezultatus, gautus tiriant greitaisiais testais ir PGR (4 lentelė), buvo apskaičiuotas greitojo testo specifiškumas ir jautrumas.
4 lentelė. Greitųjų testų ir PGR rezultatų palyginimas.
16 0
TT (tikrai teigiami) NT (netikrai teigiami)
6
NN (netikrai neigiami) TN (tikrai neigiami)
2
Remiantis duomenimis pateiktais 4 lentelėje, greitojo testo diagnostinis specifiškumas buvo: Diagnostinis specifiškumas, proc. = x 100 = 100 proc.
Tuo tarpu diagnostinis jautrumas buvo:
Diagnostinis jautrumas, proc. = x 100 = 72,7 proc.
Gauti rezultatai parodė, kad PGR diagnostinis jautrumas didesnis nei greitųjų testų.
27 16 12 12 1 0 1 0 1 2 0 0 0 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Mė gi n ių sk ai či u s, vn t. Amžius
Įtartas parvovirusinis enteritas
Neigiami mėginiai Teigiami mėginiai
7pav. Skirtingo amžiaus šunų užsikrėtimas įtariant parvovirusinį enteritą.
1 3 1 2 0 0 0 4 4 2 5 4 0 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Mė gi n ių sk ai či u s, vn t. Amžius
Neįtartas parvovirusinis enteritas
Neigiami mėginiai Teigiami mėginiai
28 0 0 0 0 3 4 1 0 0 1 1 18 10 12 0 5 10 15 20 25 Mė gi nių skai či us, vnt. Amžius Kliniškai sveiki Neigiami mėginiai Teigiami mėginai
9pav. Skirtingo amžiaus kliniškai sveikų šunų užsikrėtimas parvovirusais.
Kaip matome tarp šunų, kuriems buvo įtartas parvovirusinis enteritas (7 pav.), daugiausia virusas nustatytas 5-6 mėn. amžiaus šunims. Teigiami buvo visi 12 tirtų mėginių. Taip pat didelis užsikrėtimas parvovirusu pastebėtas ir iki 2 mėnesių amžiaus bei 3-4 mėnesių amžiaus šuniukams, kur virusas nustatytas atitinkamai 16 iš 17 ir 12 iš 14 mėginių. Po vieną teigiamą mėginį buvo ir amžiaus grupėse nuo 7 iki 12 mėnesių bei nuo 1 iki 5 metų amžiaus.
Tarp viduriuojančių šunų, kuriems nebuvo įtartas parvovirusinis enteritas (8 pav.), daugiausia parvovirusai nustatyti 3-4 mėnesių amžiaus grupėje. Teigiami buvo 3 iš 7 tirtų mėginių. Nuo 7 iki 12 mėnesių amžiaus grupėje teigiami buvo 2 mėginiai, o iki 2 mėnesių amžiaus ir 5-6 mėnesių amžiaus grupėse buvo po 1 teigiamą mėginį. Remiantis tyrimų rezultatais, vyresniems nei 1 metų amžiaus šunims nebuvo nustatytas parvovirusų sukeltas enteritas.
29 Taip pat buvo išanalizuota amžiaus įtaka užsikrėtimui parvovirusais sergančių iki 1 metų amžiaus šunims (10 pav.).
Kliniškai sergantys iki 1m.
94,1% 85,7% 100,0% 100,0% 20,0% 42,9% 33,3% 28,6% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0% 0-2mėn. 3-4mėn. 5-6mėn. 7-12mėn. N ust at yt as parvovi rusas , proc.
Įtartas parvovirusinis enteritas Neįtartas parvovirusinis enteritas
10 pav. Amžiaus įtaka virškinimo trakto ligomis sergančių iki 1 metų amžiaus šunų užsikrėtimui
parvovirusais, proc.
30 Šunis suskirsčius į grupes atsižvelgiant į lytį buvo palygintas kliniškai sveikų ir sergančių šunų užsikrėtimas parvovirusais (11 pav.).
18,9% 7,7% 73,2% 59,4% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0%
Patinas Patelė Patinas Patelė
Sveiki Sergantys N ust at yt as parvovi rusas , proc.
11 pav. Skirtingos lyties kliniškai sveikų ir sergančių šunų užsikrėtimas parvovirusais, proc.
31 Taip pat buvo norima palyginti suaugusių šunų užsikrėtimą parvovirusais (12 pav.).
18,9% 40,0% 25,0% 100,0% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0%
Sveiki Sergantys Neįtartas
parvovirusinis enteritas Įtartas parvovirusinis enteritas N u st a ty ta s p a rv o v ir u sa s, p ro c.
Patinai vyresni nei 6mėn. amžiaus
12 pav. PGR rezultatų palyginimas tarp kliniškai sveikų ir sergančių vyresnių nei 6 mėnesių amžiaus
patinų, proc.
Iš 12 paveikslėlyje pateikto rezultatų palyginimo matome, kiek atvejų parvovirusas buvo nustatytas kliniškai sveikiems ir sergantiems patinams vyresniems nei 6 mėnesių amžiaus. Sveikų šunų grupėje teigiami buvo 7 iš 37 (18,9 proc.) tirtų mėginių, o sergančių šunų grupėje – 4 iš 10 (40,0 proc.) tirtų mėginių. Tarp sergančių patinų, įtarus jiems parvovirusinį enteritą, visi mėginiai (2/2) buvo teigiami (100,0 proc.). Tuo tarpu tarp patinų, kuriems buvo įtartas kitos kilmės enteritas, teigiami buvo 2 iš 8 mėginių (25,0 proc.). Tačiau dėl mažo mėginių skaičiaus, šie rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05).
32 35 12 2 40 19 14 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Nevakcinuoti Nepilnai vakcinuoti Vakcinuoti
Mė gi n ių sk ai či u s, vn t. Teigiami Tirti mėginiai
13 pav. Šunų užsikrėtimas parvovirusais atsižvelgiant į vakcinacijos duomenis.
87,5% 63,2% 14,3% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0%
Nevakcinuoti Nepilnai vakcinuoti Vakcinuoti
N u st a ty ta s p a rv o v ir u sa s, p ro c.
14 pav. Vakcinacijos įtakos palyginimas šunų užsikrėtimui parvovirusais, proc.
34
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Nuo savo atsiradimo šunų parvovirusas tapo vienu dažniausių virusų visame pasaulyje, sukeliančių stiprų virškinamojo trakto pažeidimą jauniems iki 6 mėnesių amžiaus šunims, nepaisant vykdomų vakcinacijos programų (4). Todėl dažniausiai šunų parvovirusų atžvilgiu tiriami enteritu sergantys jauni gyvūnai. Nors yra nemažai tyrimų apie parvovirusų vaidmenį virškinamojo trakto ligomis sergančių šunų populiacijoje, apie jų paplitimą sveikų šunų tarpe yra mažai žinoma (31). Šunys visame pasaulyje yra plačiai vakcinuojami ir gana dažna nuomonė, kad ilgalaikės vakcinacijos turėtų išstumti laukinius virusus. Tačiau veterinarijos gydytojai kliniškai diagnozuoja nemažai įvairios kilmės virškinimo trakto ligų. Viena iš dažniausių įtariamų ligų yra šunų parvovirusinis enteritas, ypač jeigu gyvūnai yra nevakcinuoti. Diagnozei patvirtinti jie gali naudoti greituosius testus, tačiau dėl jų kainos tik kas antras atvejis yra tiriamas.
Atlikus tyrimus matome, kad CPV Lietuvoje taip pat dažnai sutinkamas patogenas viduriuojančių šunų išmatose. Anksčiau jau buvo atlikti preliminarūs enteritu sergančių šunų išmatų tyrimai ir nustatytas užsikrėtimas CPV. Tačiau niekada anksčiau parvovirusų atžvilgiu nebuvo tirti kliniškai sveiki šunys, kuriems nepasireiškė jokie enteritui būdingi simptomai. Siekiant nustatyti CPV paplitimą sveikų ir sergančių šunų populiacijoje buvo atlikti išmatų tyrimai PGR metodo pagalba. Todėl buvo surinkta 50 sveikų šunų mėginių ir 73 enteritu sergančių šunų mėginiai bei palyginti gauti rezultatai tarp šių grupių.
35 Enteritu sergantys šunys pagal klinikinius požymius buvo suskirstyti į dvi grupes: kuriems įtariamas parvovirusinis enteritas ir kuriems įtariamas kitos kilmės enteritas. Įtariamai sergančių grupėje parvovirusas nustatytas 93,3 proc. tirtų mėginių, tuo tarpu neįtartų – 25 proc. tirtų mėginių (p<0,01).
Jautriausi CPV infekcijai yra 4-12 savaičių amžiaus šuniukai, kurie yra linkę užsikrėsti virusu mažėjant MDA. Manoma, kad suaugę šunys yra atsparūs infekcijai dėl su amžiumi sumažėjusio jautrumo virusui ir dėl specifinio imuniteto, kurį paskatino vakcinacija ar prieš tai buvusios (dažnai subklinikinės) infekcijos. Nors CPV enteritas dažniausiai siejamas su jaunais šunimis, tačiau neseniai tapo svarstoma problema ir suaugusių šunų tarpe (24).
Atsižvelgiant į šunų amžių matome, kad įtarus parvovirusinį enteritą dažniausiai CPV buvo nustatytas 5-6 mėnesių amžiaus grupėje, kur buvo teigiami visi 12 mėginių (100,0 proc.) bei iki 2 mėnesių amžiaus grupėje 16 iš 17 mėginių (94,1 proc.). Tuo tarpu neįtarus CPV, dažniausiai virusas nustatytas 3-4 mėnesių amžiaus grupėje – 3 iš 7 mėginių (42,9%). Taigi matome, kad dažniausiai parvovirusai nustatyti iki 6 mėnesių amžiaus šuniukams. Tačiau buvo atvejų, kai parvovirusinis enteritas nustatytas ir vyresnio amžiaus gyvūnams (4 teigiami atvejai).
Tuo tarpu kliniškai sveikų šunų grupėje parvovirusai dažniausiai nustatyti 5-10 metų amžiaus grupėje, kur teigiami buvo 4 iš 14 tirtų mėginių (28,6 proc.). Tačiau lyginti šių rezultatų su užsikrėtimu parvovirusais tarp sergančių šios amžiaus grupės šunų negalime, dėl surinkto mažo vyresnio amžiaus sergančių šunų mėginių skaičiaus.
Analizuojant skirtingos lyties gyvūnų užsikrėtimą parvovirusais nustatyta, kad virusas dažniau buvo nustatytas tiek sveikiems (18,9 proc.), tiek sergantiems patinams (73,2 proc.) nei patelėms. Tačiau šis skirtumas nebuvo statistiškai patikimas (p>0,05).
36 apsaugotų nuo infekcijos ir klinikinių požymių pasireiškimo. Net ir atsižvelgiant į šiuos tyrimus, nėra galutinių įrodymų, kad vakcinos neapsaugo nuo klinikinio ligos pasireiškimo. Manoma, kad pirminė priežastis dėl viruso paplitimo nepaisant vykdomos vakcinacijos yra MDA įsikišimas arba nepakankamas senų šunų imuniteto efektyvumas (5).
Šio tyrimo metu nustatyta, kad virusas dažniausiai nustatytas nevakcinuotiems šunims (87,5 proc.), rečiau – nepilnai vakcinuotiems (63,2 proc.). Šis skirtumas buvo statistiškai patikimas (p<0,05). Be to virusas buvo nustatytas ir 2 iš 14 vakcinuotų šunų (14,3 proc.), kas gali reikšti, kad vakcinacija nebuvo tinkamai atlikta ir dėl sąveikos su MDA nesusidarė pakankamas imunitetas CPV.
Iš 45 šunų, kuriems buvo įtartas parvovirusinis enteritas, 24 buvo atlikti greitieji testai viruso antigenams nustatyti. Gauti rezultatai palyginti su rezultatais gautais ištyrus tuos pačius mėginius PGR metodu. Greitieji testai parodė teigiamą rezultatą 16 mėginių (66,6 proc.). Tuo tarpu PGR metodu buvo nustatyti 22 iš 24 teigiami mėginiai (91,7 proc.). Šis skirtumas buvo statistiškai patikimas (p<0,05).
37
IŠVADOS
1. Šunų parvovirusai yra vieni iš pagrindinių šunų virškinimo trakto ligų sukėlėjų. Iš viso 67,1 proc. PGR metodu tirtų virškinimo trakto ligomis sergančių šunų buvo nustatytas užsikrėtimas parvovirusais.
2. Šunų parvovirusai buvo nustatyti skirtingų preliminarių diagnozių atvejais, tačiau statistiškai dažniau (p<0,05) kai buvo įtariamas šunų parvovirusinis enteritas (93,3 proc.) lyginant su atvejais, kai preliminari diagnozė buvo kita (25,0 proc.).
3. Imlūs šunys gali užsikrėsti parvovirusais ne tik nuo virškinimo trakto ligomis sergančių šunų, bet ir nuo kliniškai sveikų gyvūnų. PGR metodu buvo nustatyta, kad 16 proc. kliniškai sveikų šunų su išmatomis išskyrė parvovirusus. Lyginant su sergančių šunų grupę, kliniškai sveikiems šunims parvovirusai nustatyti statistikai rečiau (p<0,01).
4. Atskirose gyvenvietėse parvovirusams imlių šunų užsikrėtimo nuo kliniškai sveikų gyvūnų galimybės gali būti labai didelės. Tyrimai PGR metodu parodė, kad 40-60 proc. kliniškai sveikų šunų gali būti užsikrėtę parvovirusais..
5. Nustatytas greitųjų testų diagnostinis jautrumas buvo 72,7 proc., o diagnostinis specifiškumas buvo 100,0 proc.
6. Tarp šunų sergančių virškinamojo trakto ligomis imliausi parvovirusinei infekcijai buvo šunys iki 6 mėnesių amžiaus. Jiems pasireiškė įvairūs klinikiniai požymiai. Parvovirusai nustatyti dažniau, kai šunys sirgo sunkiau ir buvo nevakcinuoti lyginant su grupe, kurioje gyvūnai sirgo lengviau ar buvo vakcinuoti. (p<0,01).
7. Lyties įtaka užsikrėtimo dažnumui nebuvo nustatyta. Apsikrėtusių parvovirusais sergančių ir sveikų patinų ir patelių procentas statistiškai nesiskyrė (p>0,05).
38
PADĖKA
Norėčiau padėkoti darbo vadovui dr. R. Lelešiui už konsultacijas, patarimus ir pastebėjimus atliekant magistro baigiamąjį darbą. Taip pat esu dėkinga už suteiktą galimybę naudotis reikalinga įranga ir atlikti tyrimus, reikalingus magistro baigiamąjam darbui, LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute.
39
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. De Cramer KG, Stylianides E, van Vuuren M. Efficacy of vaccination at 4 and 6 weeks in the control of canine parvovirus. Vet Microbiol. 2011 Apr 21;149(1-2):126-32.
2. Decaro N, Desario C, Billi M, Mari V, Elia G, Cavalli A, Martella V, Buonavoglia C. Western European epidemiological survey for parvovirus and coronavirus infections in dogs. Vet J. 2011 Feb;187(2):195-9.
3. Buonavoglia C, Martella V, Pratelli A, Tempesta M, Cavalli A, Buonavoglia D, Bozzo G, Elia G, Decaro N, Carmichael L. Evidence for evolution of canine parvovirus type 2 in Italy. J Gen Virol. 2001 Dec;82(Pt 12):3021-5.
4. Nandi S, Kumar M. Canine parvovirus: current perspective. Indian J Virol. 2010 Jun;21(1):31-44. 5. Decaro N, Desario C, Elia G, Martella V, Mari V, Lavazza A, Nardi M, Buonavoglia C. Evidence for
immunisation failure in vaccinated adult dogs infected with canine parvovirus type 2c. New Microbiol. 2008 Jan;31(1):125-30.
6. Mila H, Grellet A, Desario C, Feugier A, Decaro N, Buonavoglia C, Chastant-Maillard S. Protection against canine parvovirus type 2 infection in puppies by colostrum-derived antibodies. J Nutr Sci. 2014 Nov 13;3:e54.
7. Castro TX, Costa EM, Leite JP, Labarthe NV, Cubel Garcia RC. Monitoring of canine parvovirus (CPV) strains detected in vaccinated puppies in Brazil. Res Vet Sci. 2011 Apr;90(2):336-40.
8. Grellet A, Feugier A, Chastant-Maillard S, Carrez B, Boucraut-Baralon C, Casseleux G, Grandjean D. Validation of a fecal scoring scale in puppies during the weaning period. Prev Vet Med. 2012 Oct 1;106(3-4):315-23.
9. Touihri L, Bouzid I, Daoud R, Desario C, El Goulli AF, Decaro N, Ghorbel A, Buonavoglia C, Bahloul C. Molecular characterization of canine parvovirus-2 variants circulating in Tunisia. Virus Genes. 2009 Apr;38(2):249-58.
10. Parrish CR, Carmichael LE, Antczak DF. Antigenic relationships between canine parvovirus type 2, feline panleukopenia virus and mink enteritis virus using conventional antisera and monoclonal antibodies. Arch Virol. 1982;72(4):267-78.
11. Truyen U. Evolution of canine parvovirus--a need for new vaccines? Vet Microbiol. 2006 Oct 5;117(1):9-13.
40 13. Parrish CR, Aquadro CF, Strassheim ML, Evermann JF, Sgro JY, Mohammed HO. Rapid
antigenic-type replacement and DNA sequence evolution of canine parvovirus. J Virol. 1991 Dec;65(12):6544-52.
14. João Vieira M, Silva E, Oliveira J, Luísa Vieira A, Decaro N, Desario C, Muller A, Carvalheira J, Buonavoglia C, Thompson G. Canine parvovirus 2c infection in central Portugal. J Vet Diagn Invest. 2008 Jul;20(4):488-91.
15. Sutton D, Vinberg C, Gustafsson A, Pearce J, Greenwood N. Canine parvovirus type 2c identified from an outbreak of severe gastroenteritis in a litter in Sweden. Acta Vet Scand. 2013 Sep 10;55:64.
16. Filipov C, Decaro N, Desario C, Amorisco F, Sciarretta R, Buonavoglia C. Canine parvovirus epidemiology in Bulgaria. J Vet Diagn Invest. 2011 Jan;23(1):152-4.
17. Calderón MG, Romanutti C, D' Antuono A, Keller L, Mattion N, La Torre J. Evolution of canine parvovirus in Argentina between years 2003 and 2010: CPV2c has become the predominant variant affecting the domestic dog population. Virus Res. 2011 Apr;157(1):106-10.
18. Hong C, Decaro N, Desario C, Tanner P, Pardo MC, Sanchez S, Buonavoglia C, Saliki JT. Occurrence of canine parvovirus type 2c in the United States. J Vet Diagn Invest. 2007 Sep;19(5):535-9.
19. Nandi S, Chidri S, Kumar M, Chauhan RS. Occurrence of canine parvovirus type 2c in the dogs with haemorrhagic enteritis in India. Res Vet Sci. 2010 Feb;88(1):169-71.
20. Decaro N, Desario C, Campolo M, Elia G, Martella V, Ricci D, Lorusso E, Buonavoglia C. Clinical and virological findings in pups naturally infected by canine parvovirus type 2 Glu-426 mutant. J Vet Diagn Invest. 2005 Mar;17(2):133-8.
21. Bagshaw C, Isdell AE, Thiruvaiyaru DS, Brisbin IL Jr, Sanchez S. Molecular detection of canine parvovirus in flies (Diptera) at open and closed canine facilities in the eastern United States. Prev Vet Med. 2014 Feb 19. pii: S0167-5877(14)00059-2.
22. Schoeman JP, Goddard A, Leisewitz AL. Biomarkers in canine parvovirus enteritis. N Z Vet J. 2013 Jul;61(4):217-22.
23. Nelson RW, Couto CG. Canine parvoviral enteritis. In: Small animal internal medicine. 5th ed. St. Louis, MO : Elsevier/Mosby, 2014. p. 457-459.
41 25. Schmitz S, Coenen C, König M, Thiel HJ, Neiger R. Comparison of three rapid commercial Canine parvovirus antigen detection tests with electron microscopy and polymerase chain reaction. J Vet Diagn Invest. 2009 May;21(3):344-5.
26. Schulz BS, Strauch C, Mueller RS, Eichhorn W, Hartmann K. Comparison of the prevalence of enteric viruses in healthy dogs and those with acute haemorrhagic diarrhoea by electron microscopy. J Small Anim Pract. 2008 Feb;49(2):84-8.
27. Kumar M, Nandi S. Development of a SYBR Green based real-time PCR assay for detection and quantitation of canine parvovirus in faecal samples. J Virol Methods. 2010 Oct;169(1):198-201.
28. Gizzi AB, Oliveira ST, Leutenegger CM, Estrada M, Kozemjakin DA, Stedile R, Marcondes M, Biondo AW. Presence of infectious agents and co-infections in diarrheic dogs determined with a real-time polymerase chain reaction-based panel. BMC Vet Res. 2014 Jan 16;10:23.
29. Meers J, Kyaw-Tanner M, Bensink Z, Zwijnenberg R. Genetic analysis of canine parvovirus from dogs in Australia. Aust Vet J. 2007 Oct;85(10):392-6
30. Desario C, Decaro N, Campolo M, Cavalli A, Cirone F, Elia G, Martella V, Lorusso E, Camero M, Buonavoglia C. Canine parvovirus infection: which diagnostic test for virus? J Virol Methods. 2005 Jun;126(1-2):179-85.
31. Schulz BS, Strauch C, Mueller RS, Eichhorn W, Hartmann K. Comparison of the prevalence of enteric viruses in healthy dogs and those with acute haemorrhagic diarrhoea by electron microscopy. J Small Anim Pract. 2008 Feb;49(2):84-8.
32. M Kumar, S Chidri, S Nandi A sensitive method to detect canine parvoviral DNA in faecal samples by nested polymerase chain reaction. Indian J Biotechnol, 2011 Apr; 10: 183-187.
