LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS ODOS IR VENERINIŲ LIGŲ KLINIKA

1

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

ODOS IR VENERINIŲ LIGŲ KLINIKA

Kamilija Tvaronavičiūtė

AUKŠTO DAŽNIO ULTRAGARSINIO MIKROSKOPO

PRITAIKYMAS ODOS MELANOMOS VAIZDINIMUI

EX VIVO

Medicinos vientisųjų studijų programos baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas:

Prof. dr. Skaidra Valiukevičienė

TURINYS

1. SANTRAUKA ... 3

2. SUMMARY ... 4

3. PADĖKA ... 5

4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 5

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5

6. SANTRUMPOS ... 6

7. SĄVOKOS ... 7

8. ĮVADAS ... 8

9. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 9

10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

10.1 Skenuojantis akustinis mikroskopas (SAM) ... 10

10.2 SAM veikimo mechanizmas ... 10

10.3 Aukšto dažnio ultragarso pritaikymas biologinių audinių tyrimui ... 11

10.4 Odos melanomos morfologiniai tipai ... 12

10.5 Breslau storis ... 13 10.6 Klarko lygis ... 14 11. TYRIMO METODIKA ... 15 12. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 20 13. IŠVADOS ... 24 14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 25 15. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 26

3

1. SANTRAUKA

Darbą atliko: Kamilija Tvaronavičiūtė

Darbo pavadinimas: aukšto dažnio ultragarsinio mikroskopo pritaikymas odos melanomos

vaizdinimui ex vivo.

Tyrimo tikslas: Įvertinti odos melanomos (OM) pažeistų audinių ir aplinkinės odos struktūrų

vaizdinimo ypatumus ex vivo aukšto dažnio skenuojančiu akustiniu mikroskopu (SAM) ir patologinio tyrimo metu.

Uždaviniai: 1. Įvertinti skirtingų tipų OM ir aplikinės odos vaizdinimo ypatumus, tiriant 110

ir 230 MHz dažnio SAM davikliais ir patologinio tyrimo metu. 2. Nustatyti galimybę išmatuoti odos melanomos gylį pagal Breslau, panaudojant 110 MHz ir 230 MHz dažnio SAM daviklį (uT) ir patologinio tyrimo preparato programinį vertinimą (pT). 3. Palyginti OM ląstelių kiekybinių ultragarso parametrų raišką, panaudojant SAM ir patologinio tyrimo rezultatus.

Metodai: Retrospektyviai iš duomenų bazės, sudarytos LSMU Odos ir venerinių ligų klinikos

ir KTU UI mokslininkų ir tyrėjų per „SkinTech“ projekto vykdymą, atrinkti 5 pacientų išoperuoti OM atvejai. Jų patologiniai preparatai skaitmenizuoti į panoraminius vaizdus naudojant automatinį Pannoramic midi skaitytuvą. Tų pačių OM atvejų parafino blokai ištirti 110 ir 230 MHz dažnio SAM davikliais ir palyginti su patologinio tyrimo rezultatais. Tiriant skaitmenintus vaizdus, nustatytas OM ir kitų ląstelių skaičius (patologiniame preparate dviejų tyrėjų) bei SAM vaizdo intensyvumas (pagal histogramos rodiklius) pasirinktame to paties dydžio 1 mm2 ploto žymenyje, pasitelkiant ImageJ programinį vertinimą.

Tyrimo rezultatai: Tyrimo rezultatai rodo, jog nuo vandens ir parafino ribos paviršių

atsispindi didžioji dalis sklindančios ultragarso (UG) bangos, todėl SAM vaizde stebimas didelio intensyvumo (baltas) vaizdas, o odos audiniai - heterogeniškos struktūros. Nustatėme, kad SAM (110 MHz ir 230 MHz) vaizde kuo didesnis UG keitiklio dažnis (tikėtina ir erdvinė skyra geresnė), tuo odos struktūrų vaizdinimas yra geresnės raiškos.

Išvados: Tiriamų audinių parafino bloke vaizdinimas SAM metodu geba išskirti odos

sluoksnius (epidermis, tikroji oda) ir odos priedus bei naviko ribas, panašiai kaip patologinio preparato tyrimas. Tyrimo rezultatai rodo tendenciją, kad naudojant 230 MHz SAM daviklį vertintas naviko gylis (uT) yra artimas pT matavimui. SAM vaizdo intensyvumas koreliuoja su naviko ląstelių skaičiumi, įvertintu per patologinį tyrimą.

2. SUMMARY

Title: High-frequency ultrasound microscopy of cutaneous melanoma imaging ex vivo.

Aim: To evaluate the peculiarities of damaged tissue in cutaneous melanoma and the structure

of surrounding skin ex vivo. Imaging is performed with high-frequency scanning acoustic microscopy (SAM) and pathological examination.

Objectives: 1. To evaluate the imaging properties of different types of cutaneous melanoma

and surrounding skin with SAM sensor frequencies of 110 and 230 MHz and the use of pathological examinations. 2. To establish whether it is possibile to measure cutaneous melanoma thickness based on Breslow, while using 110 MHz and 230 MHz SAM sensor (uT) frequencies and the evaluation (pT) of the pathological examination preparation software. 3. To compare the resolution of the cutaneous melanoma whilst quantitatively assessing cell ultrasound parameters via SAM and pathological findings.

Methods: A retrospective study from a database was performed. LSMU Skin and Venerology

disease clinic scientists and researchers from KTU UI were included in project “SkinTech”. Five patients who underwent melanoma surgery were selected. Their pathological preparations were digitalized to the panoramic images using automatic Pannoramic midi reader. The paraffin blocks of these patients suffering from melanoma were explored, with 110 and 230 MHz frequency sensor and compared with pathological examination results. The number of cutaneous melanoma cells and number of other various cells were evaluated using the SAM resolution images selected within 1 mm2 area using ImageJ software.

Results: Study results showed, that the most of the propagated ultrasound (US) waves reflected

from water and paraffin surfaces. SAM images looked like high intensity (white) images, and the skin tissue - had a heterogeneous structure. It was found that by increasing the SAM image UG frequency sensor (higher resolution), provided enhanced visualization the skin structure.

Conclusion: The SAM method of investigation with paraffin blocks are capable of separating

layers of the skin (epidermis, dermis) and accessory structures, as well as, tumour boundaries, similar to the preparation of pathological examination. The study results show a tendency that when using the SAM sensor at 230 MHz assessment of tumour depth (uT) is comparable to pT measurements. The SAM image intensity also correlate with the tumour cells evaluated during pathological examination.

5

3. PADĖKA

Pirmiausia noriu padėkoti mokslinio darbo vadovei prof. dr. Skaidrai Valiukevičienei už kantrybę, palaikymą, suteiktas žinias ir pasitikėjimą, naudingus patarimus ir skirtą laiką, padedant man ruošti šį mokslinį darbą. Už atliktus odos navikų histologinius tyrimus, jų skenavimą bei pagalbą juos interpretuojant dėkoju LSMU Patologinės anatomijos klinikos vadovei prof. habil. dr. Daliai Pangonytei ir doc. Jurgitai Makštienei. Už patologinių parafino blokų skaitmenizavimą SAM davikliais, suteiktas žinias bei nuoširdų bendravimą - KTU UI mokslo darbuotojai dr. Kristinai Andrėkutei.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Šis mokslinis tyrimas yra sudėtinė dalis LSMU Odos ir venerinių ligų klinikos 2014– 2015 m. „SkinTech“ ir „SkinTechSoft“ projektų, kurių vykdymui gautas Kauno regioninio bioetikos tyrimų komiteto (KRBTEK) leidimas 2014 lapkričio 18 d. Nr. P2-BE-2-25/2009.

6. SANTRUMPOS

AJCC - Amerikos jungtinis vėžio komitetas (angl. The American Joint Committee on

Cancer).

ALM - Akrolentiginė melanoma (angl. acral lentiginous melanoma). ex vivo - Tyrimas vykstantis, gyvo organizmo išorėje.

HT - Histologinis tyrimas.

KTU UI - Kauno technologijos universitetas prof. K. Baršausko Ultragarso mokslo institutas. LSMU - Lietuvos sveikatos mokslų universitetas.

OM - Odos melanoma.

pT - Histologiškai išmatuotas naviko gylis milimetrais pagal Breslau. SAM - Skenuojantis akustinis mikroskopas.

UBM - Ultragarsinis biomikroskopas. UG - Ultragarsinis mikroskopas.

7

7. SĄVOKOS

Histograma - tai yra atsispindėjusios ultragarso bangos amplitudės vaizdinimo reikšmė. Pjezoelektrinis keitiklis - tai keitiklis, kuriam veikiant, generuojami mechaniniai virpesiai. Bendras ląstelių skaičius - tai melanomos ląstelės ir limfocitai esantys 1 mm2 ploto žymenyje.

8. ĮVADAS

Odos melanoma (OM) - greitai augantis ir plintantis piktybinis odos navikas, kuris išsivysto iš pakitusių pigmentinių odos ląstelių (melanocitų). Vėžio registro duomenimis, 2012 m. Lietuvoje nustatyta 9,0 vyrų ir 11,7 moterų naujų OM atvejų iš 100 000 gyventojų. Remiantis tarptautinio vėžio instituto duomenimis, 2014 m. Amerikoje buvo užregistruota 43,9 vyrų ir 32,2 moterų naujų atvejų 100 000 gyventojų per metus [1]. Nustatyta didėjanti mirtingumo nuo šios ligos tendencija. Nuo 2001 iki 2005 metų mirtingumas dėl OM Lietuvoje padidėjo nuo 2,0 iki 2,9 vyrams ir nuo 2,6 iki 3,0 moterims atvejų 100 000 gyventojų [2]. Išsivysčiusiose šalyse OM yra šeštoje vietoje pagal diagnozuojamų piktybinių navikų dažnumą [3]. OM sudaro 4 % visų piktybinių odos navikų, o sergančiųjų mirtingumas siekia 80 %, todėl ankstyva OM diagnostika yra labai svarbi [4].

Tikslesnę priešoperacinę pigmentinių odos navikų diagnostiką lemia klinikinėje praktikoje įdiegtas kompleksinis paciento ištyrimas, sujungiantis klinikinį tyrimą, dermatoskopiją ir aukšto dažnio (>20 MHz) ultragarsinį tyrimą [5]. Skenuojantis akustinis mikroskopas (SAM) yra inovatyvus, naujas bei jautrus tyrimo metodas, kuris gali padėti nustatyti odos naviko įsiskverbimo gylį, struktūrines bei elastines skirtingo tankio audinių savybes ex vivo [6]. SAM veikimas paremtas aukšto dažnio (120 - 230 MHz) ultragarso bangų sklidimu. Kai kurie autoriai naudojo net iki 1 GHz dažnio ultragarsinius daviklius audinių struktūrų tyrimui [7]. Remiantis palyginamaisiais patologinių tyrimų duomenimis (pastarieji yra iki šių dienų – auksinis audinių morfologijos diagnostikos standartas), SAM įgauna vis didesnę reikšmę tiriant audinių elastines savybes kaule, kremzlėje, sausgyslėse bei širdies ir kraujagyslių sistemoje ex vivo [6]. Mūsų duomenimis iki šiol atliktas tik vienas tyrimas, kuris nustatė skenuojančio akustinio mikroskopo galimybę „konkuruoti“ su patologiniu tyrimu, nustatant odos karcinomos rūšį. Iki šiol SAM nebuvo taikytas odos melanomos gyliui ex vivo nustatyti. Tikėtina, kad SAM tyrimas galėtų sutaupyti laiko, žmogiškųjų išteklių ir resursų, reikalingų biopsinės medžiagos audinių dažymui ir patologinio histologinio preparato parengimui, kurį vertina gydytojas patologas. Todėl šio metodo pritaikymas ir išvystymas yra perspektyvi mokslinė ir praktinė sritis onkodermatologijoje.

9

9. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI

Tikslas: Įvertinti melanomos pažeistų audinių ir aplinkinės odos struktūrų vaizdinimo

ypatumus ex vivo aukšto dažnio skenuojančiu akustiniu mikroskopu (SAM) ir patologinio tyrimo metu.

Uždaviniai:

1. Įvertinti skirtingų tipų odos melanomos ir aplikinės odos vaizdinimo ypatumus, tiriant 110 ir 230 MHz dažnio SAM davikliais ir patologinio tyrimo metu.

2. Nustatyti galimybę išmatuoti odos melanomos gylį pagal Breslau (pT), panaudojant 110 MHz ir 230 MHz dažnio SAM daviklį (uT) ir patologinio tyrimo preparato programinį vertinimą (pT).

3. Palyginti OM ląstelių kiekybinių ultragraso parametrų raišką, panaudojant SAM ir patologinio tyrimo rezultatus.

10. LITERATŪROS APŽVALGA

Akustinio mikroskopo sąvoka pirmą kartą panaudota 1973 m. R. A. Lemons ir C. F. Quate. Šis tyrimo metodas paremtas aukšto dažnio ultragarso bangų taikymu kietųjų ir biologinių medžiagų mikrostruktūrų atvaizdavimui. Skiriami trys pagrindiniai akustinio mikroskopo tipai: skenuojantis akustinis mikroskopas (angl. Scanning acoustic microscope, SAM), konfokalinis skenuojantis mikroskopas ir C - tipo skenuojantis mikroskopas [8,9]. SAM turi keletą privalumų, lyginant su kitais mikroskopais. Visų pirma, jis gali būti taikomas histologinių preparatų peržiūrai parafino bloke ir nereikalauja specialios dažymo technikos, jo skleidžiamos ultragarso bangos prasiskverbia į tiriamąją medžiagą be jos pažaidos. Audinių struktūrų vaizdas užregistruotas SAM priklauso nuo akustinių medžiagos savybių (tankumas, standumas) bei audinio topografinių savybių. Kitas SAM tyrimo privalumas yra tai, kad jis padeda įvertinti tiriamo audinio echogeniškumą (ultragarso bangų atspindėjimą), kuris yra svarbus atliekant sonografiją in vivo. Trečia, SAM suteikia informacijos apie biomechanines audinių ir ląstelių savybes [6]. Kiekviena ląstelė turi tik jai būdingas biomechanines savybes (elastingumas, standumas), dėl kurių akustinis vaizdas tampa panašus į optinį. Aukšto dažnio ultragarsinis tyrimas su SAM gali atkartoti paviršiaus struktūras ir yra sėkmingai taikomas mokslinėje praktikoje, atvaizduojant akies, odos, kraujo elementus bei tiriant pelės embriono vystymąsį [10], bei užima svarbią vietą odos pažeidimų tyrimuose.

10.2 SAM veikimo mechanizmas

Aukšto dažnio ultragarso (UG) bangos atspindžio nuo tiriamo parafino bloko paviršiaus principas pavaizduotas 1 pav. [6]. Patologinis parafino blokas fiksuotas SAM viduje esančioje talpoje, kuri užpildyta distiliuotu vandeniu. Mėginys turi kontaktuoti su skysčiu, nes oras yra prastas laidininkas aukšto dažnio UG bangoms. Tiriamoji medžiaga sugeria dalį aukšto dažnio UG bangų, tačiau didesnioji dalis jų dėl impedansų skirtumo atsispindi nuo tiriamojo paviršiaus ir užregistruojamos tuo pačiu keitikliu (aido-impulsinis metodas, angl. pulse-echo) [6]. Aukšto dažnio ultragarso bangų keitiklis yra statmenas parafino bloko paviršiui ir skenavimas SAM keitikliu atliekamas x ir y kryptimis, nustatytu žingsniu, kiekvienam taške užregistruojant atsispindėjusios UG bangos amplitudės reikšmę. Vienas svarbiausių SAM elementų yra pjezoelektrinis keitiklis, kuris elektrinį signalą paverčia į garso bangas arba garso bangas į elektrinį signalą [6]. Ultragarso banga skenavimo metu fokusuojama į parafino bloko paviršių. SAM vaizdas priklauso nuo skirtingo tankio audinių, įlietų į parafiną akustinių savybių.

11

1 pav. Skenuojančio akustinio mikroskopo duomenų registravimo schema C-tipo ultragarso vaizdo

gavimui. Adaptuota pagal [6].

UG vaizdo skyra priklauso nuo naudojamo daviklio centrinio dažnio, kuris gali būti nuo 20 iki 1200 MHz [11, 12]. Naudojant 100 MHz ultragarsinį keitiklį pasiekiama apie 15 µm ašinė skyra [6], atitinkamai naudojant 110 MHz ultragarsinį keitiklį ji siekia 11 µm, o 230 MHz – 8 µm. Teoriškai UG keitiklio skyra nustatoma pagal formulę [13]:

f

c

=

_p

_D

d

2

ln

2

f

Fc

=

d

čia c yra ultragarso bangos greitis (kai vandens temperatūra 22 o_{C, c= 1487.9 m/s), Δf yra} keitiklio juostos plotis ties -6dB lygiu, nurodomas gamintojo, F (F=z0/D) yra F-numeris, kuris priklauso nuo atstumo iki fokuso (z0) ir keitiklio apertūros (D). Kuo didesnis ultragarsinio keitiklio dažnis, tuo erdvinė skyra geresnė ir SAM vaizdas stebimas geresnės raiškos, bet sumažėja bangų įsiskverbimo į audinius gylis dėl netiesinės slopinimo charakteristikos [14].

10.3 Aukšto dažnio ultragarso pritaikymas biologinių audinių tyrimui

L. I. Petrella ir kt. [15] ištyrė skirtingų tipų odos epidermio navikų (bazalinių ląstelių karcinoma (n=20), plokščialąstelinė karcinoma (n=4) ir Boveno liga (n=2)) biopsinę mežiagą

ex vivo naudojant 45 MHz ultragarsinį biomikroskopą (UBM) ir gautus rezultatus palygino su

histologiniu tyrimu (HT). Tyrime įrodyta, kad UBM identifikuoja naviko ląstelių sankaupas ir kitus morfologinius požymius (stromą, uždegimo ląstelių infiltraciją, eritrocitų sankaupas, epidermio būklę) bei pagal echogeniškumą galima nustatyti ir odos karcinomos tipą.

M. Miysaka ir kolegos [16] atliko saulės pažeistos (ausies išorėje) ir nepažeistos (už ausies) odos tyrimą. Iš šių sričių odos biopsinės medžiagos paruošti patologiniai parafino blokai ištirti naudojant SAM (80 MHz). Tyrimo rezultatai parodė, kad UG bangos sklidimo greitis daugiausia priklauso nuo kolageno skaidulų. Jis padidėja riboje tarp bazalinio epidermio sluoksnio ir papiliarinės dermos, kur tankiai išsidėsčiusios kolageno skaidulos.

K. Miura ir kolegos [17] atliko tyrimą, kurio metu palygino SAM (400 MHz) ir šviesinio mikroskopo gebą atvaizduoti ląstelių morfologiją. Tyrimo metu paimtos ląstelių kultūros iš ascito, pleuros ir perikardo ertmės ir buvo paruoštas vieno ląstelių sluoksnio citologinis tepinėlis. Tyrimo metu SAM vaizduose buvo gilinamasi į ląstelės storį, dydį, kraštus, ląstelės struktūras ir lyginami šie vaizdai su vaizdais matomais naudojant šviesinį mikroskopą (1 lentelė). Pastebėta, kad SAM gali nustatyti ląstelės dydį, kraštus bei jungtis panašiai kaip ir šviesinis mikroskopas. Tyrėjai nustatė, kad SAM gali patikimai identifikuoti piktybines ląsteles prieš atliekant tyrimą su šviesiniu mikroskopu [17].

1 lentelė. SAM ir šviesinio mikroskopo citologinių radinių palyginimas. Lentelėje esančių ženklų

reikšmės: - puikiai matosi; ◊ - gerai matosi; ∆ - sunkiai matosi; X - galimai matosi [17]

Citologinė analizė SAM Šviesinis mikroskopas

Branduolys Dydis Pažeidimas Chromatino tankis ∆ X X Citoplzma Dydis Kraštai Turinys Pažeidimas Storis ◊ ◊ ◊ ∆ ∆ Ląstelės jungtys

10.4 Odos melanomos morfologiniai tipai

Mūsų darbo tiriamasis objektas – odos melanoma. Tyrimui pasirinkome keletą dažniausių jos morfologinių formų bei siekėmė SAM nustatyti OM storį, kuris yra reikšmingas ligos prognozei.

Remiantis literatūros duomenimis, paviršiumi plintanti OM yra pati dažniausia klinikinė ir morfologinė forma, kuri sudaro daugiau nei pusę (59 %) visų OM, atitinkamai mazginė OM sudaro 21 %, lentigo maligna melanoma - 11 %, akrolentiginė OM - 4 % [18].

13

Paviršiumi plintanti melanoma. Ji pasireiškia kaip netaisyklingos formos pigmentinė dėmė.

Apie 50 % jų turi funkcinę mutaciją BRAF gene ir 15–25 % NRAS gene [19]. Melanomos, kurios turi NRAS geno mutacijų būna storesnės ir turi didesnį mitozių skaičių, nei atvejai be šių mutacijų [20]. Šiai OM formai būdinga tai, jog melanomos „pedžetoidinės“ ląstelės išsidėsto epidermyje pradžioje horizonatalia kryptimi ir tik vėliau plinta vertikaliai į dermą [21]. Šiam tipui būdingos pakitusios epiteliodinės ląstelės, kurios turi hiperchromatinį branduolį ir šviesią citoplazmą su melanino “dulkėmis’’ [22].

Mazginė melanoma. Greitai epidermyje auganti ir vertikalia kryptimi į dermą plintanti OM

forma. Apie 50 % atvejų turi funkcinių mutacijų BRAF gene ir 20 % NRAS gene [23]. Šiai formai būdingos atipinės ląstelės epiteloidinės arba verpstiškos formos [24].

Lentigo maligna melanoma. Šios formos melanoma dažniausiai atsiranda nuolatinio saulės poveikio srityse vyresnio amžiaus baltaodžiams [24]. Pagal klinikinius požymius sunku atskirti lentigo maligna melanomą nuo piktybinio pigmentinio šlako, todėl būtina atlikti histologinį tyrimą [25]. Šiai formai būdingi atipinių melanocitų su pleomorfiniais branduoliais proliferacija ir jų telkiniai epidermio pamatiniame sluoksnyje bei plitimas pagal odos priedus, epidermio atrofija, dermos soliarinė elastozė [26].

Akrolentiginė melanoma (angl. acral lentiginous melanoma, ALM). Dažniausia OM forma

juodaodžių populiacijoje. Jos lokalizacija yra delnai, padai ir nago plokštelė. Būdinga mutacija C-kit gene [23]. Histologiniame tyrime matyti, jog odos navikas auga horizontalia ir vertikalia kryptimi. ALM prasideda epidermio ir dermos jungtyje, melanomos ląstelės pedžetoidinės formos, verpstės tipo, su hiperchromatiniu branduoliu, ryški limfocitų imuninė reakcija dermoje [24,27].

10.5 Breslau storis

Pagrindinis sergančiųjų melanoma prognozės veiksnys - naviko gylis (mm), išmatuotas pagal Breslau, atliekant histologinį tyrimą [28]. Tai yra vertikalus OM gylis, kuris matuojamas nuo granuliacinio odos sluoksnio viršaus iki giliausio melanocito invazijos lygio į odą [29]. Šio rodiklio vertinimas turi mažiausią atsikartojamumo paklaidą tarp skirtingų tyrėjų [30]. Kai OM paviršius išopėjęs, jos gylio viršutinė riba matuojama nuo opos dugno. Patologinio tyrimo duomenimis, būna atvejų, kai OM ląstelės dėstosi pagal plauko folikulą. Tokiu atveju OM storis matuojamas nuo plauko folikulo centro iki tolimiausiai vertikalia kryptimi įsiskverbusios melanomos ląstelės [31].

10.6 Klarko lygis

Kitas svarbus ligos prognozei rodiklis yra OM įsiskverbimo gylio į odos sluoksnius lygis pagal Klarką (angl. Clark level). Remiantis autoriaus pasiūlyta metodika, I lygis – tai melanoma in situ, kuri neišplinta už epidermio ribų ir nemetastazuoja; II lygis - naviko invazija iki speninio dermos sluoksnio; III lygis – melanomos ląstelės užpildo speninį dermos sluoksnį; IV lygis - invazija į retikulinį dermos sluoksnį; V lygis - invazija į poodį [32]. Didėjant Klarko lygiui, sergančiųjų OM išgyvenamumas mažėja: esant II lygiui – tikimybė išgyventi 5-erius metus siekia 95 %, III ir IV lygiui - 80-85 %, V lygiui -55 % [33].

15

11. TYRIMO METODIKA

Tyrimo objektas. Retrospektyviai iš duomenų bazės, sudarytos LSMU Odos ir venerinių ligų

klinikos ir KTU UI mokslininkų grupės „SkinTech“ projekto vykdymo metu (2014–2015 m), atsitiktiniu būdu buvo atrinkti 5 pacientų išoperuoti OM atvejai: paviršiumi plintanti (n=3), mazginė (n=1) ir pailgųjų ląstelių (n=1). Pacientų amžius svyravo nuo 37 iki 79 metų. Įtraukimo į tyrimą kriterijus - naviko storis ≥1 mm, išmatuotas atliekant histologinį tyrimą pagal Breslau (pT). Tyrimui vykdyti gautas Kauno regioninio bioetikos tyrimų komiteto leidimas Nr. P2-BE-2-25/2009.

Patologinio preparato vertinimas. Atrinkti OM patologiniai preparatai (n=5), dažyti

hematoksilinu ir eozinu, skaitmenizuoti naudojant automatinį Pannoramic midi skaitytuvą (3DHISTECH, Vengrija) LSMU Kardiologijos institute. Jis geba pasiekti 96x raišką. Skaitmenizuoti panoraminiai vaizdai analizuoti Pannoramic viewer programa (3DHISTECH, Vengrija). Darbo autoriaus (K.T.) ją instaliavo per laisvą internetinę prieigą į personalinį kompiuterį. Apmokytas patyrusio patologo (J.M.), jis patologiniame vaizde, naudojant

Pannoramic viewer programą, identifikavo melanomos ląsteles bei limfocitus ir įvertino jų

bendrą skaičių 1 mm2 ploto žymenyje (2 pav.). Melanomos ląstele laikyta tokia ląstelė, kuri yra stambi, branduolys pleomorfiškas, atipiškas, su didokais eozinofiliškais branduolėliais, asimetrinės formos [38, 41]. Sugretintai OM ir kitų ląstelių skaičius 1 mm2 ploto žymenyje kiekvienam atvejui atskirai apskaičiuotas LSMU Patologinės anatomijos klinikoje patologijos gydytojo rezidento (L.G.) kartu su šio darbo autoriumi, pasitelkiant ImageJ (National Institutes of Health, JAV) programą (instaliuota per laisvą internetinę prieigą). ImageJ programa palengvina ląstelių skaičiavimą originaliame patologiniame vaizde. Ji turi specialų taškinį žymeklį, kuriuo pažymėjus kompiuterio pele ląsteles, jos automatiškai yra suskaičiuojamos. Originalus patologinis vaizdas įkeltas į ImageJ programą. Darbo autorius (K.T.), padedant patologijos gydytojui rezidentui (L.G.), atžymėjo ir automatiniu būdu apskaičiavo OM ir limfocitų skaičių (toliau darbe - bendras ląstelių skaičius) 1 mm2 ploto žymenyje. Patologiniame preparate tyrėjai taip pat išmatavo melanomos gylį (3 pav.) pagal Breslau, naudojant automatinę QCapture Pro 7™ programą (QImaging, Kanada).

2 pav. Mazginės melanomos panoraminė patologinio tyrimo nuotrauka: A) 1x padidinimas ir joje

atžymėtas tyrimui atrinktas kvadrato formos (1 mm2 ploto) žymuo (juoda spalva); B) pažymėto 1 mm2 ploto žymens vaizdas 40x padidinimu naudotas ląstelių kiekybiniam vertinimui.

3 pav. Mazginės melanomos gylis pagal Breslau išmatuotas gydytojo patologo, imtinai nuo raginio

sluoksnio apačios iki giliausio naviko taško, pT=2,56 mm.

Tyrimas ultragarsiniu mikroskopu. Bendradarbiaujant su Kauno technologijos universiteto

prof. K. Baršausko Ultragarso mokslo institutu (KTU UI), tų pačių melanomos atvejų parafino blokai (n=5) ištirti aukšto dažnio skenuojančiu akustiniu mikroskopu "KSI V8" (Kraemer Sonic Industries, Vokietija) (4 pav.). Parafino blokai gauti iš LSMU Patologinės anatomijos klinikos biopsinės medžiagos archyvo. Tyrimui naudoti 110 ir 230 MHz fokusuoti vieno elemento SAM ultragarsiniai davikliai.

Parafino blokas fiksuotas naudojant nerūdijančio plieno laikiklį (4 pav. B.) ir panardintas į SAM viduje esančią vandens vonelę, kuri užpildyta distiliuotu vandeniu. Nerūdijantis plieno laikiklis buvo pagamintas pagal originalius KTU UI mokslininkų brėžinius šio tyrimo uždavinių sprendimui vykdant LSMU Mokslo fondo finansuotą SkinTechSoft projektą (2015 m.). Tokiu būdu paruošta medžiaga ištirta 110 MHz ir 230 MHz SAM davikliais. Parafino blokas bei 110 MHz ir 230 MHz centrinio dažnio davikliais užregistruotų SAM vaizdų pavyzdžiai pateikti 5 paveiksle.

A _B

17

A

B

4 pav. Ultragarsinis mikroskopas "KSI V8" (Kraemer Sonic Industries, Vokietija) su aukšto dažnio

fokusuotais vieno elemento ultragarsiniais keitikliais (A), tyrimams KTU UI laboratorijoje pagamintas nerūdijančio plieno laikiklis parafino bloko fiksavimui distiliuoto vandens terpėje (B).

Nerūdijančio plieno laikiklis

Aukšto dažnio UG ketiklis

Vandens vonelė

Nerūdijančio plieno laikilis Polimero plėvelė

Odos mėginys mėginys

5 pav. Mazginės melanomos parafino blokas (A); B) ir C) 110 MHz ir 230 MHz keitikliais

užregistruoti C-tipo ultragarsiniai vaizdai atitinkamai, skenuojant to paties atvejo parafino bloką. Skaitmenizuoti C-tipo ultragarso vaizdai analizuoti ImageJ (National Institutes of Health, JAV) programa. Analizę atliko šio darbo autorius (K.T.). Originalus kalibruotas SAM vaizdas buvo įkeltas į ImageJ programą. Naudojant linijinį žymeklį, pelės klavišu atžymėta menamoji naviko viršutinė riba ir apatinė jo riba ties giliausia jo įsiskverbimo į dermą sritimi (6 pav.). Po šios atžymos automatiniu būdu apskaičiuotas OM gylis milimetrais (mm). Siekiant įvertinti ultragarso bangų atspindžio priklausomybę nuo melanomos ląstelių skaičiaus ir jų sandaros tipo, SAM vaizde siekta nustatyti identiškos lokalizacijos 1 mm2 _{ploto žymenį kaip} patologinėje panoraminėje nuotraukoje. Tuo tikslu SAM skaitmeninis vaizdas užkeltas ant panoraminės patologinės nuotraukos vaizdo, pasitelkiant Visio professional (Microsoft Corporation, Amerika) programą (instaliuota per laisvą internetinę prieigą į personalinį kompiuterį). SAM vaizde atrinkto referentinio 1 mm2 ploto kvadrate įvertinti vaizdo intensyvumo pikseliais histogramos rodikliai, naudojant ImageJ programą. Histograma - tai C-topo vaizdo pikselių reikšmių pasikartojimo grafinis atvaizdavimas, jos forma atspindi vaizdo intensyvumą, kuris priklauso nuo atsispindėjusios UG bangos amplitudės C-tipo vaizde, atsirandančio dėl akustinių impedansų skirtumo tarp vandens ir mėginio (parafinas ar audiniai). Akustinis impedansas (Z=ρc) yra medžiagos savybė, kuri priklauso nuo medžiagos tankio (ρ) ir ultragarso bangos sklidimo greičio toje medžiagoje (c) (7 pav.).

A

B a

19

6 pav. SAM 230 MHz ultragarsiniu davikliu tiriamas tos pačios (kaip pateikta 2 pav.)

mazginės melanomos parafino blokas ir gautame vaizde išmatuotas naviko gylis uT=2,16 mm naudojant ImageJ programą.

Parafinas Z1 Audinys įlietas į parafiną Z2

7 pav. Atsispindėjusios ultragarso bangos priklausomybė nuo medžiagos akustinio

impedanso, rausva rodyklė žymi krentančią UG bangą, o žalsva – atsispindėjusią bangą nuo ribos vanduo/mėginys

12. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Mūsų tyrimo rezultatai rodo, jog nuo vandens ir parafino ribos paviršių atsispindi didžioji dalis krentančios UG bangos, dėl to užregistruotame vaizde stebėtas didelio intensyvumo (baltas) vaizdas (pikselio vertė lygi 255 reikšmei), o odos audiniai - heterogeniškos struktūros. Todėl šiame darbe nuspręsta analizuoti audinių vaizdo histogramą, kuri gali būti susijusi su melanomos ląstelių tankiu ir/arba jų sandaros tipu. Vaizdo histogramos X ašis rodo pikselio reikšmes nuo 0 iki 255, kur 0 atitinka juodą spalvą, o 255 - baltą). Histogramos Y ašis rodo tiriamų audinių vaizdo intensyvumo pikselių skaičių pažymėtame lange (8 pav.).

Pasitelkus Pannoramic viewer programą, išanalizuoti patologinio tyrimo melanomos vaizdai ir jų struktūros rezultatai pateikti 2 lentelėje. Atitinkamai ieškota šių struktūrų SAM vaizduose (9,10 pav.).

8 pav. a) 230 MHz keitikliu užregistruotas SAM vaizdas su atrinktu tyrimui referentiniu 1 mm2

žymeniu; b) išdidintas atrankinis žymuo, naudojant ImageJ programą; c) ImageJ programa gauta histograma, kuri rodo b vaizdo pikselių skaičių (angl. Count), jų vidurkį (Mean), standartinį nuokryptį

(StdDev), minimalią vertę (Min), maksimalią vertę (Max) bei modą - dažniausiai pasikartojančią reikšmę (Mode).

a

b b_a

c b

21

2 lentelė. Odos melanomos (n=5) morfologiniai ypatumai patologiniame tyrime

Atvejo

numeris Diagnozė Lokalizacija

Infiltrato riba Imuninio atsako intensyvu mas Melanofagai Odos

priedai Mitozių skaičius

1

Paviršiumi plintanti melanoma

Žastas Matosi Ryškus Matosi Nesimato Vidutinis 2 Mazginė

melanoma Nugara Matosi Ryškus Matosi Nesimato Gausus 3 Pailgųjų ląstelių

melanoma

Žastas Matosi Nėra Nesimato Nesimato Vidutinis

4

Paviršiumi plintanti melanoma

Nugara Nesimato Ryškus Matosi Matosi Vidutinis 5 Paviršiumi plintanti

melanoma

Nugara Nesimato Ryškus Nesimato Nesimato Gausus

Pradiniame tyrimo etape nustatėme, kad SAM (110 MHz ir 230 MHz) vaizde stebėta tendencija, kuo didesnis ultragarsinio keitiklio dažnis (tikėtina ir erdvinė skyra geresnė), tuo odos struktūrų vaizdinimas, pasitelkiant SAM yra geresnės raiškos. Todėl tolesnė vaizdų analizė atlikta su SAM 230 MHz centrinio dažnio davikliu užregistruotais C-tipo ultragarso vaizdais. Iš 9 ir 10 paveikslų matyti, jog SAM (230 MHz) C tipo vaizde, tiriant OM parafino blokus, panašiai kaip patologiniame preparate, aiškiai išsiskiria odos sluoksniai (epidermis ir tikroji oda) ir naviko ribos, gerai matyti homogeniškos struktūros odos priedai (plauko maišeliai).

9 pav. Mazginės melanomos 230 MHz keitikliu užregistruotas C-tipo ultragarsinis vaizdas A) ir B)

patologinio tyrimo to paties naviko vaizdas panoraminėje nuotraukoje. Navikas Epidermis Epidermis Tikroji oda Tikroji oda A b B a

10 pav. Paviršiumi plintanti melanoma: A) 230 MHz keitikliu užregistruotas C-tipo ultragarsinis

vaizdas ir B) patologinio tyrimo to paties naviko vaizdas panoraminėje nuotraukoje.

Melanomos gylio, vertinto SAM vaizde (tirtas parafino blokas) ir to paties naviko patologiniame tyrime palyginamieji rezultatai pateikti 3 lentelėje. Tyrimo rezultatai rodo tendenciją, kad naudojant SAM 230 MHz ultragarsinį keitiklį lyginant su 110 MHz keitikliu, apskaičiuotos uT rodiklių vertės turi mažesnį nukrypimą nuo pT. Vertinant 3 atvejo naviko gylio paramterus, matyti ženklus pT ir uT rodiklių skirtumas. Tai galėjo lemti tai, kad registruojant aukšto dažnio vaizdus buvo naudotas skirtingas patologinis naviko pjūvis parafine, nei pjūvis, kurį naudojo patologas histologiniam ištyrimui. Tyrimo metu pastebėta mažiausia matavimo paklaida tarp pT ir uT parametrų paviršiumi plintančios melanomos tirtuose vaizduose (1, 4, 5 atvejai). Galima daryti prielaidą, kad OM imuninio atsako intensyvumas turi įtakos SAM vaizdo homogeniškumu ir tai leidžia tyrėjui tiksliau išmatuoti naviko gylį SAM vaizde. Mūsų turimomis žiniomis iki šiol nėra publikuotų duomenų apie melanomos gylio pagal Breslau palyginimą, tiriant jį SAM ir patologinio tyrimo vaizduose.

3 Lentelė. Melanomos (n=5) gylio (pT, milimetrais) palyginimas patologiniame preparate ir C-tipo

ultragarso vaizde Atvejo numeris pT, mm uT110MHz, mm uT230MHz, mm 1 1,22 1,02 1,06 2 2,56 2,16 2,16 3 2,7 1,63 1,67 4 1,65 1,48 1,66 5 1,62 1,52 1,58

pT – naviko gylis išmatuotas patologinio tyrimo metu , uT110 MHz naviko gylis išmatuotas skenuojančio akustinio

mikroskopo pagalba užregistruotam C-tipo vaizde, naudojant 110 MHz centrinio dažnio keitiklį, o uT230 MHz -

naudojant 230 MHz centrinio dažnio keitiklį.

A b B a Plauko maišeliai tikrojoje odoje

23 Tyrimo pradžioje manyta, kad SAM vaizdo intensyvumui reikšmės turi melanocitų kiekis, tačiau tyrimo eigoje pastebėta, kad tiriamų audinių intensyvumas SAM vaizde priklauso nuo bendro ląstelių skaičiaus. Todėl, norint nustatyti veiksnius, darančius įtaką audinių intensyvumui SAM vaizde, ieškota ryšio tarp bendro ląstelių skaičiaus ir šio vaizdo intensyvumo, pasitelkiant histogramų vidurkius (11 pav.). Iš 11 pav. pastebėta tendencija, jog kuo didesnis bendras ląstelių skaičius nustatomas patologinio preparato vaizde, tuo tiriami SAM vaizdo intensyvumas yra mažesnis (juoda spalva). Todėl galima daryti prielaidą, kad SAM vaizdo histogramos rodikliai gali būti informatyvūs odos naviko ląstelių tankio prognostinei vertei. Vertinant tirtų penkių OM atvejų SAM vaizdų histogramų vidurkius pastebėta, kad jis yra atvirkščiai proporcingas bendram ląstelių skaičiui (11 pav.). Tyrimo metu nustatyta, kad didesnę reikšmę SAM vaizdo intensyvumui turi bendras ląstelių skaičius, o ne melanomos ląstelių skaičius. Tai pagrindžia, SAM histogramos vidurkis, nes jis koreliuoja su bendru ląstelių skaičiumi (4 lentelė).

11 pav. Histogramos vidurkio ir bendro ląstelių skaičiaus priklausomybė.

4 Lentelė. Ląstelių skaičius 1 mm2 _{ploto žymenyje (40x) ir SAM C-tipo vaizdo (230 MHz)}

histogramos parametrai žymenyje, atitinkančiam atrinką žymenį optiniame naviko vaizde

Atvejo numeris

Bendras ląstelių

skaičius Melanomos ląstelių skaičius SAM vaizdo histogramos

vidurkis (SN) 1 186 175 91,27 (66,42) 2 163 154 129,43 (52,51) 3 124 124 156,09 (60,17) 4 188 188 133,34 (53,23) 5 234 18 82,53 (51,60) SN – standartinis nuokrypis 0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 Be nd ra s l ąs te lių sk ai či us SAM vaizdo histogramos vidurkis

13. IŠVADOS

1. Tiriamų audinių parafino bloke vaizdinimas SAM metodu geba išskirti odos sluoksnius (epidermis, tikroji oda) ir odos priedus bei naviko ribas, panašiai kaip tiriant paruoštą patologinį preparatą šviesiniu mikroskopu.

2. Tyrimo rezultatai rodo tendenciją, kad naudojant 230 MHz SAM daviklį vertintas naviko gylis yra artimas naviko gyliui išmatuotam patologinio tyrimo metu pagal Breslau.

3. SAM vaizdo intensyvumas koreliuoja su bendru naviko ląstelių skaičiumi, įvertintu atliekant patologinį tyrimą.

25

14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

SAM inovatyti technologija, kurios išvystymas pagal tęstinius mokslinių tyrimų rezultatus didesnėje tyrimo atvejų imtyje galėtų būti panaudotas perspektyvoje ir praktikoje. Odos naviko parafino bloko ištyrimas SAM metodu sutaupo laiko, žmogiškųjų išteklių ir resursų, reikalingų biopsinės medžiagos audinių dažymui ir patologinio preparato paruošimui. Todėl ateityje šis metodas gali būti naudingas odos naviko struktūrų vaizdinimui ex vivo.

15. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Tarptauptinis vėžio institutas. Interneto prieiga https://seer.cancer.gov/statfacts/html/ melan.html [žiūrėta 2017-01-12].

2. Nacionalinis vėžio institutas. Interneto prieiga http://www.nvi.lt/?page_id=9&lang=lt [žiūrėta 2017-02-15].

3. Lowe GC, Saavedra A, Reed KB, et al. Increasing Incidence of Melanoma among Middle-Aged Adults: An Epidemiologic Study in Olmsted County, Minnesota. Mayo Clinic proceedings. 2014;89(1):52-59.

4. Little EG, Eide MJ. Update on the current state of melanoma incidence. Dermatol Clin. 2012;30(3):355-61.

5. Krahn G, Gottlober P, Sander C, Peter RU. Dermatoscopy and high frequency sonography: two useful non-invasive methods to increase preoperative diagnostic accuracy in pigmented skin lesions. Pigment Cell Res 1998;11(3):151-4.

6. Mamou J, Oelze ML. Quantitative Ultrasound in Soft Tissues, Springer, London, 2013. 7. Xiaoning Xi, Xin Li, Miyasaka C, Kropf M and Tittmann BR. High Frequency Scanning

Acoustic Microscopy as Diagnostic Tool in Tissue Science. Journal of Biotechnology and Biomaterials 2013; 3:160:1-5.

8. Interneto prieiga http://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/References/Acoustics/Acoustic%20 Microscopy.pdf [žiūrėta 2017-01-06].

9. Sokolov SY. On the problem of the propagation of ultrasonic oscillations in various bodies. Elek Nachr Tech 1929, 6: 454-460.

10. Y. F. Zhou. Applications of high-frequency ultrasound microscopy in medicine and biology. Interneto prieiga http://www.microscopy7.org/book/34-44.pdf [žiūrėta 2017-12-19].

11. Strohm EM, Berndl ES, Kolios MC. High frequency label-free photoacoustic microscopy of single cells. Photoacoustics. 2013; 1(3-4):49-53.

12. Strohm EM, Moore MJ, Kolios MC. High resolution ultrasound and photoacoustic imaging of single cells. Photoacoustics. 2016;4(1):36-42.

13. Balasundra I. R. High frequency ultrasonic characterization of human skin In vivo, Massachusetts institute of technology, Thesis (Ph. D.) 2002.

14. Barr RJ, White GM, Jones JP, Shaw LB, Ross PA. Scanning Acoustic Microscopy of Neoplastic and Inflammatory Cutaneous Tissue Speciments. J Invest Dermatol. 1991; 96:38-42

27 15. Petrella LI, Valle HA, Issa PR, Martins CJ, Pereira WC, Machado JC. Study of cutaneous cell carcinomas ex vivo using ultrasound biomicroscopic images. Skin Res Technol. 2010;16(4):422-7.

16. Miyasaka M, Sakai S, Kusaka A, Endo Y, Kobayashi M, Kobayashi K, Hozumi N, Tanino R. Ultrasonic Tissue Characterization of Photodamaged Skin by Scanning Acoustic Microscopy. Tokai J Exp Clin Med. 2005;30(4):217-25.

17. Miura K, Yamamoto S. A scanning acoustic microscope discriminates cancer cells in fluid. Sci Rep. 2015:19:5:1-11.

18. Garbe C, Leiter U. Melanoma epidemiology and trends. Clinics in dermatology. 2009;27(1):3-9.

19. Davies M. A, Samuels Y. Analysis of the genome to personalize therapy for melanoma. Oncogene. 2010;29(41):5545-55.

20. Kelleher FC, McArthur GA. Targeting NRAS in melanoma. Cancer J. 2012; 18(2):132-36.

21. McGovern VJ. The classification of melanoma and its relationship with prognosis. Pathology. 1970;2(2): 5-98.

22. Petronic-Rosic V, Shea C. R, Krausz T. Pagetoid melanocytosis: when is it significant? Pathology. 2004; 36(5):435-44.

23. Flaherty K. T, Hodi F. S, Fisher D. E. From genes to drugs: Targeted strategies for melanoma. Nat. Rev. Cancer 2012;12(5):349–361.

24. Ferrara G, Improta G. The histhopathological diagnosis and reporting of malnoma: a new look at an old challenge. Austin Journal of Dermatology. 2016;3(1):1044.

25. Michalik E. E, Fitzpatrick T. B, Sober A. J. Rapid progression of lentigo maligna to deeply invasive lentigo maligna melanoma. Report of two cases. Arch. Dermatol. 1983;119(10):831-5.

26. Tsakok T, Sheth N, Robson A, Gleeson C, Mallipeddi R. Lentigo maligna mimicking invasive melanoma in Mohs surgery: a case report. F1000Research. 2014;3:25.

27. Arrington JH, Reed RJ, Ichinose H, Krementz ET. Plantar lentiginous melanoma. A distinctive variant of human cutaneous malignant melanoma. Am J Surg Pathol. 1977;1(2):131-43.

28. Balch CM, Soong S, Ross MI, Urist MM, Karakousis CP, Temple WJ, Mihm MC, Barnhill RL, Jewell WR, Wanebo HJ, Harrison. Long-term results of a multi-institutional randomized trial comparing prognostic factors and surgical results for intermediate

thickness melanomas (1.0 to 4.0 mm). Intergroup Melanoma Surgical Trial. Ann Surg Oncol 2000;7(2):87-97.

29. Balch C.M., Murad T.M., Soong S.J., Ingalls A.L., Halpern N.B., Maddox W.A. A multifactorial analysis of melanoma: prognostic histopathological features comparing Clark's and Breslow's staging methods. Ann Surg. 1978;188(6):732–742.

30. Keefe M, Mackie RM. The relationship between risk of death from clinical stage 1 cutaneous melanoma and thickness of primary tumour: no evidence for steps in risk. Scottish Melanoma Group. British Journal of Cancer. 1991;64(3):598-602.

31. Ivan D, Prieto V. G. An update on reporting histopathologic prognostic factors in melanoma. Arch Pathol Lab Med. 2011;135(7):825-9.

32. Clark W.H.Jr., Elder D.E., Guerry D., Braitman L.E., Trock B.J., Schultz D., Synnestvedt M., Halpern A.C. Model predicting survival in stage I melanoma based on tumor progression. J Natl Cancer Inst. 1989;81(24):1893–1904.

33. Homsi J., Kashani-Sabet M., Messina J.L., Daud A. Cutaneous Melanoma: Prognostic Factors. Cancer control. 2005;12(4): 223-229.