TRANSFEROSOMŲ MODELIAVIMO IR PRITAIKYMO RESVERATROLIO SKVARBAI Į ODĄ TYRIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

IGNAS JAZUKEVIČIUS

TRANSFEROSOMŲ MODELIAVIMO IR PRITAIKYMO

RESVERATROLIO SKVARBAI Į ODĄ TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Vientisųjų studijų programa „Farmacija“, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis „Farmacija“

Darbo vadovas:

Lekt. Dr. Vaida Kurapkienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data (metai, mėnuo, diena)

TRANSFEROSOMŲ MODELIAVIMO IR PRITAIKYMO

RESVERATROLIO SKVARBAI Į ODĄ TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Vaida Kurapkienė 2021-05-19

Recenzetas Vardas, pavardė, parašas

Data (metai, mėnuo, diena)

Darbą atliko Magistrantas Ignas Jazukevičius 2021-05-19

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Lipidiniai nanonešikliai ... 11

1.1.1. Liposomos ... 11

1.1.2. Transferosomos ... 12

1.1.3. Lipidinių nanonešiklių vertinimas in vitro ... 13

1.2. Resveratrolis ir jo pritaikymas ... 14

1.2.1. Stilbenų apžvalga ... 14

1.2.2. Natūralūs resveratrolio šaltiniai ... 14

1.2.3. Cheminės resveratrolio savybės ... 14

1.2.4. Resveratrolio absorbcija ir bioprieinamumas ... 15

1.2.5. Resveratrolio metabolizmas ... 16

1.2.6. Resveratrolio biologinis poveikis ... 18

1.3. Lipidinių nanonešiklių pritaikymas antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų skvarbai į odą ... ... 19

2. TYRIMO METODAI ... 21

2.1. Tyrimo objektas ... 21

2.2. Reagentai ir medžiagos ... 21

2.3. Tyrime naudota įranga ... 21

2.4. Lipidinių nešiklių gamyba ... 22

2.4.1. Lipidinių nanonešiklių gamyba tiesioginio sonikavimo metodu ... 22

2.4.2. Transferosomų su resveratroliu gamyba tiesioginio sonikavimo metodu ... 22

2.5. Eksperimentinio planavimo pritaikymas transferosomų sudėčių modeliavime ... 22

2.6. Resveratrolio įterpimo į transferosomas efektyvumo nustatymas ... 23

2.7. Lipidinių nešiklių kokybinių parametrų nustatymas ... 24

2.8. Transferosomų fizikinių–cheminių savybių vertinimas laikymo metu ... 24

2.9. Resveratrolio skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimai ... 25

3. REZULTATAI IR JŲ APIBENDRINIMAS ... 27

3.1. Lipidinių nanonešiklių atranka ... 27

3.2. Transferosomų fizikinių–cheminių savybių nustatymas ... 29

3.3. Transferosomų su resveratroliu modeliavimas ir fizikinių–cheminių savybių vertinimas ... 31

3.3.1. Transferosomų su resveratroliu fizikinių–cheminių savybių vertinimas keturių savaičių laikotarpyje ... 32

3.3.2. T12 formuluočių fizikinių–cheminių savybių kitimo vertinimas keturių savaičių laikotarpyje ... 33

3.3.3. T16 formuluočių fizikinių–cheminių savybių kitimo vertinimas keturių savaičių laikotarpyje ... 34

3.4. Resveratrolio inkorporavimo į transferosomas efektyvumo nustatymas ... 37

3.5. Resveratrolio skvarbos į žmogaus odą iš transferosomų ex vivo tyrimai ... 38

4. IŠVADOS ... 40

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42

SANTRAUKA

I. Jazukevičiaus magistro baigiamasis darbas „Transferosomų modeliavimo ir pritaikymo resveratrolio skvarbai į odą tyrimas“/ mokslinis vadovas lekt. dr. V. Kurapkienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas: sumodeliuoti stabilius lipidinius nanonešiklius (transferosomas) su

resveratroliu ir įvertinti jų kokybę fizikiniais-cheminiais ir biofarmaciniais tyrimais. Tyrimo objektas: sumodeliuotos transferosomos be veikliosios medžiagos ir transferosomos su resveratroliu. Metodai: pritaikant eksperimentinį planavimą D-optimalaus dizaino modelį, sumodeliuotos transferosomų sudėtys. Transferosomos gaminamos taikant tiesioginio sonikavimo metodą. Transferosomų vidutinis dalelių dydis, polidispersiškumo indeksas ir zeta potencialas įvertinti dinaminės šviesos sklaidos metodu, jų pH matuotas pH–metru. Inkorporavimo efektyvumas ir resveratrolio kiekis transferosomose nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu. Biofarmacinis resveratrolio skvarbos į odą ex vivo tyrimas atliktas naudojant Bronaugh tipo pratakias difuzines celes.

Rezultatai: pritaikius eksperimentinį planavimą pagaminta 20 skirtingų sudėčių transferosomų, kurių

SUMMARY

Final master‘s thesis of I. Jazukevičius “Study of transferosomes modelating and application for resveratrol skin penetration”. Scientific supervisor lect. Dr. V. Kurapkienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Departament of Clinical Pharmacy. Kaunas.

The aim of study: to modelate stable lipid nanocarriers (transferosomes) containing

resveratrol and evaluate their quality by physico–chemical and biopharmaceutical tests. Object of the

study: modelated transferosomes without active substance and transferosomes with resveratrol. Methods: transferosomes compositions were modeled using experimental planning in a D-optimal

PADĖKA

Noriu padėkoti darbo vadovei lekt. dr. Vaidai Kurapkienei už palaikymą, suteiktas žinias ir nuolatinę pagalbą, rengiant magistro baigiamąjį darbą. Dėkoju lekt. dr. Modestui Žiliui už pagalbą ir pasidalijimą žiniomis, atliekant eksperimentinį planavimą.

SANTRUMPOS

IE – inkopuravimo efektyvumas MTL – mažo tankio lipoproteinai OH – hidroksilo grupė

PDI – polidispersiškumo indeksas PEG 400 – polietilenglikolis 400 RES – resveratrolis

SIRT1 – (ang. silent mating type regulation 2 homologue 1) sirtuinas 1 UV – ultravioletiniai spinduliai

ĮVADAS

Šiomis dienomis ieškoma naujų farmacinių formų, kurios padėtų pernešti veikliąsias medžiagas į odą ir gebėtų apsaugoti odą nuo ultravioletinės (UV) spinduliuotės poveikio [1, 2]. UV spinduliuotė sukelia ląstelių oksidaciją, todėl jų apsaugai yra naudojami antioksidantai [3]. Antioksidantai, kurie naudojami apsaugoti ląsteles nuo UV pažaidos, dažnai pasižymi prastu tirpumu. Praktikoje naudojami antioksidantai dažnai pasižymi lipofiliškumu, jautrumu šviesos poveikiui, dėl to prastėja jų biologinis pasisavinimas. Siekiant išspręsti šias problemas, ieškoma inovatyvių farmacinių formų. Viena iš jų galėtų būti – lipidiniai nanonešikliai [1].

Lipidiniai nanonešikliai yra plačiai naudojami tiek hidrofilinių, tiek hidrofobinių medžiagų pernašai [4]. Liposomos yra sferinės pūslelės, susidedančios iš lipidinių dvisluoksnių. Jos pasižymi unikalia struktūra, dėl kurios hidrofobinės medžiagos gali prasiskverbti pro hidrofilinį barjerą ir būti apsaugotos nuo skilimo [5, 6]. Nauja nanonešiklių rūšis – transferosomos, lyginant su liposomomis, pasižymi didesniu efektyvumu gerinant veikliųjų medžiagų skvarbą į odą [6].

Tiriamajame darbe resveratrolis buvo pasirinktas kaip modelinė veiklioji medžiaga. Resveratrolis pasižymi antioksidaciniu, priešvėžiniu ir kitais poveikiais, dėl kurių gali būti taikomas dermatologinių ligų prevencijoje bei odos apsaugai nuo UV pažaidos [1, 7, 8]. Platesnį resveratrolio naudojimą medicinoje riboja mažas jo tirpumas vandenyje, prastas biologinis pasisavinimas, jis nėra pakankamai stabilus šviesoje [1]. Resveratrolis yra polifenolinis junginys, savo struktūroje turintis dvigubą stireno žiedą. Dėl šio žiedo resveratrolis turi trans- ir cis- izomerines formas, kurio aktyvioji forma yra trans- [9, 10].

Teorinė ir praktinė reikšmė – siekiant sumažinti eksperimentų skaičių, buvo pritaikytas eksperimentinis planavimas stabilių lipidinių nanonešiklių – transferosomų modeliavimui. Eksperimentinis planavimas leido suformuoti transferosomas, kurios atitiko joms keliamus kokybės reikalavimus. Atrinktos kokybės parametrus atitinkančios transferosomos buvo pritaikytos resveratrolio įterpimui. Atliktas biofarmacinis resveratrolio skvarbos į odą ex vivo tyrimas parodė, kad sumodeliuotos transferosomos su resveratroliu pagerino jo skvarbą į odą, lyginant su kontroline formuluote. Analizuojant mokslinę literatūrą, nebuvo rasta informacijos apie resveratrolio skvarbos į odą iš transferosomų tyrimus. Pirmą kartą Lietuvoje atliktas transferosomų su resveratroliu modeliavimas.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – sumodeliuoti stabilius lipidinius nanonešiklius (transferosomas) su resveratroliu ir

įvertinti jų kokybę fizikiniais–cheminiais ir biofarmaciniais tyrimais.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti lipidinių nanonešiklių atranką.

2. Sumodeliuoti transferosomas pritaikant eksperimentinį planavimą ir atlikti fizikinių– cheminių parametrų vertinimą.

3. Pritaikyti atrinktas transferosomas resveratrolio įterpimui ir įvertinti jų fizikines– chemines savybes laikymo metu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Lipidiniai nanonešikliai

1.1.1. Liposomos

Pirmą kartą liposomas atrado 1960 m. Kembridžo universitete, Anglijoje. A. D. Banghamas, atlikdamas tyrimus apie fosfolipidus ir kraujo krešėjimą, pastebėjo fosfolipidų gebėjimą sudaryti uždaras daugiasluoksnes pūsleles vandeninėje terpėje – liposomas [11, 12]. Liposomos mokslinėje literatūroje apibrėžiamos kaip sferinės pūslelės, suformuotos iš lipidinių dvisluoksnių, pasižyminčios unikalia struktūra, dėl kurios hidrofobinės medžiagos gali praeiti pro hidrofilinį barjerą ir būti apsaugotos nuo skilimo [5].

Liposomos yra klasifikuojamos pagal sudėtį, tarpląstelinį veikimą, dydį ir fosfolipidų dvisluoksnių skaičių.

Pagal sudėtį ir tarpląstelinį veikimą liposomos yra klasifikuojamas į penkis tipus: įprastas liposomas; liposomas, kurios jautrios pH pokyčiams; katijonines liposomas; imunoliposomas; ilgai cirkuliuojančias liposomas [12].

Pagal dydį ir fosfolipidų dvisluoksnių skaičių liposomos yra klasifikuojamos į dvi pagrindines grupes. Pirmoji – monolameliarinės pūslelės. Šios grupės atstovės pasižymi vienu fosfolipidų dvisluoksniu ir, pagal dalelių dydį, skirstomos į: mažas monolameliarines pūsleles, kurių dydis yra nuo 20 nm iki 100 nm; dideles monolameliarines pūsleles, kurių dydis yra iki 1000 nm; milžiniškas monolameliarines pūsleles, kurios yra didesnės nei 1000 nm. Antroji grupė – daugialameliarinės pūslelės. Šios grupės atstovės pasižymi daugiau nei vienu fosfolipidų dvisluoksniu ir pagal dalelių dydį skirstomos į: oligolameliarines pūsleles, kurių dydis svyruoja nuo 100 nm iki 500 nm; multilameliarines pūsleles, kurios yra didesnės nei 500 nm [12, 13].

Hidrofilinė galvutė

Hidrofobinė uodegėlė

1 pav. Liposomos molekulė [14]

Paviršiaus įtampa taip pat svarbi liposomų fzikocheminė savybė. Liposominės membranos gali būti neutralios, teigiamai ar neigiamai įkrautos. Nuo krūvio priklauso jų poveikis in vivo. Mokslinių tyrimų metu buvo nustatyta, kad liposominės membranos, turinčios neigiamą krūvį, trumpiau cirkuliuoja kraujyje nei turinčios neutralų krūvį. Taip pat buvo nustatyta, kad teigiamai įkrautos liposominės membranos yra toksiškesnės nei neutralaus ar neigiamo krūvio membranos [14, 15].

1.1.2. Transferosomos

Naujai atrasta nanonešiklių atmaina yra transferosomos. Pasak mokslininkų, šios deformuojamos liposomos yra efektyvesnės už įprastas liposomas, kadangi jos gali prasiskverbti pro odos sluoksnius iki kraujotakos, taip pagerindamos įvairių medžiagų patekimą per odą. Paprastų liposomų gamyboje naudojami fosfolipidai, o transferosomų – papildomai naudojami surfaktantai, kaip, pavyzdžiui, Span 80, Tween 80 [6]. Gamyboje naudojamos medžiagos pasižymi tam tikromis funkcijomis: fosfolipidai naudojami pūslelių formavimui, o surfaktantai suteikia lankstumo bei veikia kaip membraną minkštinančios medžiagos [16]. Transferosomų veikimo mechanizmas nėra tiksliai žinomas, tačiau pagrindinė teorija yra susijusi su osmosiniu slėgiu. Mokslininkai teigia, kad transferosomai patekus ant odos, yra sukuriama dehidratacija, dėl ko susidaro osmosinis slėgis tarp vidinio ir išorinio odos paviršiaus. Šis mechanizmas leidžia įsiskverbti transferosomoms į stratum

corneum bei gilesnius sluoksnius [17, 18].

struktūrinių savybių, transferosomos yra labiau tinkamos vaistinių medžiagų, pasižyminčių skirtingu tirpumu, pernešimui [19]. Dėl šių savybių, resveratrolio pernešimui, transferosomos yra patikimesnės nei liposomos.

1.1.3. Lipidinių nanonešiklių vertinimas in vitro

Atliekant lipidinių nanonešiklių kokybės ir kiekybės vertinimus, stebimi įvairūs parametrai ir atliekami įvairūs testai, tokie, kaip: paviršiaus įkrovimo matavimas, dalelių dydžio ir jų pasiskirstymo tyrimas ir kita.

 Dalelių dydžio analizė. Dalelių dydžio analizė atliekama naudojant dinaminį šviesos

sklaidymo metodą (angl. dynamic light scattering – DLS), dydžio išskyrimo chromatografiją ir įvairius mikroskopinius tyrimus [11]. Elektroninės mikroskopijos metu galima nustatyti tikslų nanonešiklio dalelių dydį, vizualiai apžiūrėti pavienes daleles. Tačiau tokie tyrimai yra gana brangūs ir sudėtingi [20]. DLS tyrimas yra paprastesnis ir greitesnis nei elektroninio mikroskopavimo tyrimas. DLS tyrimo metu matuojami signalai tarp išsklaidytos šviesos intensyvumo svyravimų ir lipidinio nanonešiklio dalelių judėjimo. Nanonešiklio dalelės juda netvarkingai, chaotiškai. Intensyvumo svyravimų analizė leidžia nustatyti vidutinį dalelių dydį. Dydžio išskyrimo chromatografija vyksta pagal eliuavimo principą. Įvairaus dydžio dalelės juda pro tam tikro dydžio angas. Didesnės dalelės lieka išorėje ir greičiau išplaunamos iš kolonėlės, o maženės juda toliau. Šiuo metodu yra nustatomas dalelių dydis ir jų kiekis [11].

 Zeta potencialas. Zeta potencialas dažniausiai matuojamas, tiriant lipidinio nanonešiklio

1.2. Resveratrolis ir jo pritaikymas

1.2.1. Stilbenų apžvalga

Stilbenai yra vieni iš daugybės polifenolinių junginių, randamų augaluose. Stilbenai pasižymi antioksidantiniu veikimu ir randami daugybės augalų šeimose, kaip, pavyzdžiui, Vynmedinių (lot.

Vitaceae), Pušinių (lot. Pinaceae), Miglinių (lot. Poaceae), Pupinių (lot. Fabaceae). Polifenolių grupei

būdinga labai didelė cheminė įvairovė, tačiau stilbenų molekulių įvairovė nėra plati. Stilbenų grupės atstovų pagrindą sudaro resveratrolio struktūros kompozicija. Stilbenai svarbūs augalams dėl savo fitoaleksinio veikimo, kuris padeda apsisaugoti augalams nuo išorinių pažeidimų, kaip, pavyzdžiui, augalo atsparumo įgijimas po sąlyčio su mikroorganizmais. Stilbenai pasižymi antimikrobiniu, antibakteriniu veikimu bei priešgrybeliniu poveikiu prieš tokias grybelių padermes, kaip Cladosporium

cuccumerinum, Plasmopara viticola, Sphaeropsis sapinea ir kt. [22, 23].

1.2.2. Natūralūs resveratrolio šaltiniai

Resveratrolio randama daugybėje augalų, jų vaisiuose. Mokslininkų ištirta, kad daugiausiai resveratrolio turi Japoninis pelėvirkštis (lot. Polygonum cuspidatum) – 0.524 mg/g-1

bei didelis resveratrolio kiekis yra randamas sausose pontinių rabarbarų (Rheum rhaponticum) šaknyse – 3.9 mg/g-1. Vynuogių uogose, lyginant su kitomis uogomis, yra didžiausia resveratrolio koncentracija – nuo 0.16 µg/g-1 iki 3.54 µg/g-1, o džiovintose vynuogių odelėse vidutiniškai randama 24.06 µg/g-1. Kitose uogose resveratrolio koncentracija ženkliai mažesnė: mėlynese iki 32 ng/g-1_{, šilauogėse iki 16}

ng/g-1, bruknėse iki 7 ng/g-1. Didesni resveratrolio kiekiai randami ir vynuogių produktuose. Baltųjų vynuogių sultyse resveratrolio kiekis vidutiniškai yra 0.05 mg/l-1_{, o raudonųjų vynuogių sultyse}

vidutiniškai – 0.50 mg/l-1_{, o raudonajame vyne nustatytas didžiausias reveratrolio kiekis – iki 14.3}

mg/l-1. Resveratrolis aptinkamas ir riešutuose. Apskritai riešutuose resveratrolio kiekis svyruoja nuo 0.02 µg/g-1 iki 1.92 µg/g-1. Jo kiekis priklauso nuo riešutų paruošimo. Pavyzdžiui – skrudintuose riešutuose yra 0.055 µg/g-1

, o virtuose – 5.1 µg/g-1. Pistacijų riešutuose randama iki 1.67 µg/g-1 [17].

1.2.3. Cheminės resveratrolio savybės

etanolis, pagerina resveratrolio tirpumą [26]. Struktūroje yra dvigubas stireno ryšys tarp dviejų fenolio žiedų, dėl ko resveratrolis egzistuoja keliose izomerinėse formose: trans-resveratrolis (2 pav. (A)) ir

cis-resveratrolis (2 pav. (B)). Dėl ultravioletinės spinduliuotės vyksta trans-resveratrolio izomerizacija

į cis-resveratrolį. Trans-resveratrolis – tai dažniausiai randama izoforma augaluose bei pasižymi didesniu biologiniu aktyvumu ir stabilumu nei cis-resveratrolis. Taip pat gamtoje randami ir kiti dariniai, tokie, kaip trans- ir cis-resveratrolio glikozidai, kurie dar vadinami trans- ir cis-piceidais [9, 10].

2 pav. Resveratrolio izoformos: A – trans-resveratrolis; B – cis-resveratrolis [10]

1.2.4. Resveratrolio absorbcija ir bioprieinamumas

Resveratrolis pasižymi lipofilinėmis savybėmis bei, dėl savo cheminės struktūros ypatumų, pasižymi prastu tirpumu vandenyje (< 0.05 g/ml). Šios savybės turi įtakos resveratrolio absorbcijai. Norint padidinti resveratrolio tirpumą, reikia naudoti organinius tirpiklius. Šiam tikslui dažniausiai naudojamas etanolis. Mokslinėje literatūroje aprašomas kitas būdas, naudojamas resveratrolio absorbcijos didinimui žarnyne – hidroksilo grupių sterifikacija alifatinėmis molekulėmis. Naudojant šį būdą, susidaro įvairūs organiniai junginiai. Moksliniais tyrimais buvo nustatyta, jog resveratrolio acetilinimo metu padidėja jo absorbcija bei ląstelių pralaidumas, neprarandant aktyvumo [27].

junginys yra atskiriamas. Resveratrolio absorbcija antruoju būdu – sudarant kompleksus su membraniniais nešikliais, vyksta kepenyse. Kepenys yra vienas iš pagrindinių organų, kuris labai svarbus resveratrolio biologiniam prieinamumui. Be pasyvios difuzijos pagalbos, resveratrolis gali patekti į kepenų ląsteles aktyviu būdu. Aktyvios pernašos metu dalyvauja organinius anijonus pernešančių polipeptidų grupės atstovų nešikliai. Šios grupės atstovais gali būti daugiaspecifiniai pernešėjai arba albuminus surišantys baltymai, kurie sudaro junginius tarp resveratrolio ir albumino. Junginius išardžius, laisvas resveratrolis patenka į ląsteles. Resveratrolio absorbcijos kiekis priklauso nuo kepenų funkcijos, žarnyno mikrofloros metabolinio aktyvumo, resveratrolio vartojimo būdo bei kartu vartojamo maisto [10, 27, 28].

Mokslininkas J. Gambini su komanda atliko tyrimus in vitro ir nustatė, kad daugiau nei 90 proc. laisvojo trans-resveratrolio jungiasi prie žmogaus plazmos lipoproteinų. Tokius rezultatus lėmė resveratrolio gebėjimas sąveikauti su riebalų rūgštimis. Riebalų rūgštys padidina lipofilinę aplinką, kuri skatina resveratrolio jungimąsi. Tyrimo in vivo metu rezultatai nepasikeitė ir buvo nustatyti polifenoliniai junginiai izoliuotame MTL iš sveikų savanorių kraujo mėginių [27].

Resveratrolis pasižymi prastu biologiniu prieinamumu. Dėl šios priežasties jo efektyvumas sumažėja. Biologinis prieinamumas gali priklausyti nuo daugelio veiksnių. Vienas iš jų yra lipofilinės resveratrolio savybės, kurios lemia didesnę resveratrolio absorbciją. Taip pat bioprieinamumas priklauso nuo vartojamos izoformos. Trans-resveratrolis pasižymi didesniu biologiniu prieinamumu, nes cis-resveratrolio gliukuronizacija vyksta nuo 5 iki 10 kartų greičiau. Biologiniam prieinamumui įtakos turi hidroksilo grupių buvimas struktūroje. Esant OH- grupėms sudaromi junginiai tarp polifenolių ir baltymų ar kitų maistinių medžiagų, kurių tirpumas lemia resveratrolio fiziologinį poveikį. Tirpūs junginiai gali būti absorbuojami plonojoje žarnoje, o netirpūs – pašalinami su išmatomis, sumažinant resveratrolio biologinį prieinamumą. Taip pat, resveratrolio bioprieinaumą galima padidinti kartu vartojant flavonoidus. Flavanoidai, tokie kaip kvercetinas, gali būti gaunami su maistu. Jie pasižymi savybėmis, kurios inhibuoja resveratrolio sulfatinimą ir gliukuronizaciją kepenyse bei žarnyno audiniuose [27, 29].

1.2.5. Resveratrolio metabolizmas

resveratrolio monosulfatas, dvi resveratrolio monogliukuronido izomerinės formos, monosulfato dihidroresveratrolis, monogliukuronido dihidroresveratrolis [27, 30]. Tokios modifikacijos kaip gliukurinidacija ir sulfatinimas padeda sumažinti ląstelių pralaidumą medžiagoms ir palengvina jų išsiskyrimą. Šie procesai vyksta labai greitai ir efektyviai tiek kepenyse, tiek žarnyne [25].

2 pav. Sulfatinimo metu gaunami trans-resveratolio metabolitai: S1 - trans-resveratrol-3-O-4'-O-disulfatas; S2 - trans-resveratrol-4'-O-sulfatas; S3 - trans-resveratrol-3-O-sulfatas [10]

II fazės resveratrolio ar jo metabolitų metabolizmas vyksta kepenyse. Tulžyje vyksta enterohepatinė recirkuliacija, kurios metu vyksta grįžtamieji procesai į plonąją žarną. Plonojoje žarnoje resveratrolio metabolitai gali būti dekonjuguojami, reabsorbuojami ar pašalinami su išmatomis. Šio enterohepatinio ciklo metu sumažinama laisvo resveratrolio koncentracija. Taip pat pats resveratrolis gali sukelti savo paties metabolizmą, padidindamas II fazės kepenų detoksifiningementų aktyvumą. Dėl tokių metabolizmo mechanizmų nustatomi maži resveratrolio kiekiai kraujyje [10, 24, 27].

Resveratrolio metabolizmas žarnyne vyksta žarnyno mikrobiotos dėka. Žarnyno bakterijos didina resveratrolio biologinį prieinamumą, resveratrolio pirmtakus metabolizuojant į resveratrolį. Žarnyno bakterijos hidrolizės metu iš piceidų glikozidinės dalies pašalina aglikonus. Yra dvi bakterijos atsakingos už resveratrolio gamybą iš piceidų, t.y. Bifidobacterium infantis ir Lactobacillus

1.2.6. Resveratrolio biologinis poveikis

Šiomis dienomis labai išaugo susidomėjimas augaluose esančiais biologiškai aktyviais junginiais ir jų fiziologiniais veikimais. Vienas iš labiausiai tiriamų junginių yra stilbenų grupės atstovas – resveratrolis. Resveratrolis buvo atrastas 1940 m. didžialapio čemerio (lot. Veratrum

grandiflorum) šaknyse. Vėliau, apie 1963 metus, buvo rasta ir Japoninio pelėvirkščio (lot. Polygonum cuspidatum) šaknyse. Kaip ir minėjau anksčiau, pastarasis augalas pasižymi didžiausiu resveratrolio

kiekiu, randamu augaluose. Resveratrolis gali būti vartojamas daugeliu ligų gydymui ir profilaktikai [31, 32, 33]. Mokslinėje literatūroje yra aprašomi šie resveratroliui būdingi poveikiai:

 Priešvėžinis poveikis. Tyrimų in vitro metu pirmiausiai buvo pastebėtas resveratrolio

kancerogenezę slopinamasis poveikis pelių ir odos vėžio modelyje. Tyrimas pirmąkart buvo atliktas 1997 m., kurio metu vietinis resveratrolio veikimas sumažino odos navikinių ląstelių skaičių 98 proc. Vėlesnių tyrimų metu buvo įrodytas resveratrolio citotoksinis poveikis daugeliui žmogaus navikinių ląstelių, įskaitant mieloidinio ir limfoidinio vėžio ląsteles, taip pat krūties, odos, prostatos, storosios žarnos, kepenų ir skydliaukės karcinomos ląsteles. [8, 17, 31]. Mokslininkai teigia, kad resveratrolis veikia įvairiais vėžio etapais – nuo pradžios iki progresavimo, kurių metu kontroliuoja ląstelių augimą dalijimąsi, apoptozę, metastazes ir angiogenezę [34, 35].

 Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Resveratrolis pasižymi savybėmis, kurios

tinka širdies ir kraujagyslių ligų prevencijai. Jis apsaugo kraujagyslių sieneles nuo oksidacijos, uždegiminių procesų, trombocitų oksidacijos bei trombų susidarymo [36].

 Neuroprotekcinis poveikis. Resveratrolis pasižymi neuroprotekcinėmis savybėmis

neurodegenreacinių ligų, tokių kaip Parkinsono, Alzheimerio ir kitų ligų gydyme, kurios atsiranda dėl sutrikusio deguonies perdavimo. Vienas iš pagrindinių resveratrolio neuroprotekcinių mechanizmų yra SIRT1 aktyvavimas, kuris vyksta smegenų neuronuose. SIRT1 reguliuoja substratų, kurie mažina β-amiloido (Aβ) kaupimąsi, aktyvumą. Resveratrolio suaktyvintas SIRT1 apsaugo smegenis nuo Aβ sukeltos mikrogliukozės mirties. Neurodegeneracinių ligų atveju, SIRT1 aktyvavimas pagerina mitochondrijų disfunkciją [37].

 Antioksidacinis veikimas. Tyrimų metu buvo nustatytas veiksmingas laisvųjų radikalų

1.3. Lipidinių nanonešiklių pritaikymas antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių

medžiagų skvarbai į odą

Odos ląstelės yra nuolat veikiamos įvairių veiksnių: oksidacinio streso, ultravioletinės (UV) spinduliuotės, reaktyviųjų deguonies radikalų. Šie veiksniai daro įtaką odos vėžio atsiradimo/vystymosi bei odos senėjimo procesams [38]. Labiausiai odos vėžys ir senėjimas susijęs su reaktyviais deguonies radikalais, ypač po ultravioletinių A (UV-A) tipo spindulių apšvietimo. Oksidacinių pažeidimų prevencijai, ypač odos senėjimo atveju, yra būtini antioksidantai, kurie naudojami vietiniu poveikiu [39, 40]. Pagrindinės antioksidantų funkcijos yra UV spindulių poveikio neutralizavimas bei apsauga nuo oksidacinio streso. Šiomis dienomis yra naudojama daug įvairių antioksidantų, kaip, pavyzdžiui, vitaminai E ir C, resveratrolis ir kt. Vitaminas E pasižymi odos barjerą stabilizuojančiu poveikiu, taip pat apsaugo nuo UV spindulių sukeliamų pažeidimų [38, 41]. Vitaminas C pasižymi foto apsauginiu poveikiu, atkurdamas fiziologines odos funkcijas bei apsaugodamas nuo UV-A ir UV-B tipų spindulių. Taip pat mokslininkų komanda tyrimo metu nustatė sinergiją tarp vitamino E ir vitamino C. Laisviesiems radikalams oksiduojant vitaminą E, nustatyta, kad vitaminas C sugeba jį regeneruoti [39, 42].

Resveratrolis pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, kurios slopina UV spindulių sukeltą lipidų peroksidaciją. Šis poveikis buvo lyginamas su vitaminais E ir C. Buvo nustatyta, kad resveratrolis pasižymėjo geriausiu efektyvumu – 95 proc., o vitamino E ir vitamino C efektyvumas atitinkamai buvo – 65 proc. ir 37 proc.. Taip pat tyrimų metu buvo nustatytas resveratrolio gebėjimas slopinti ląstelių proliferaciją bei sumažinti reaktyviųjų deguonies radikalų lygį [7, 40]. Antioksidantai svarbūs apsaugant odą nuo senėjimo reiškinių, stabdant oksidacinį stresą bei apsaugant nuo ultravioletinių spindulių.

Analizuojant mokslinę literatūrą, galima rasti nemažai pavyzdžių apie lipidinių nanonešiklių pritaikymą, gerinant resveratrolio skvarbą į odą:

 Wu P.S. ir kiti mokslininkai atlikdami tyrimus pastebėjo, kad resveratrolio skvarba buvo didesnė, įterpiant į lipidinius nanonešiklius - transferosomas. Tyrimo rezultatai parodė, kad optimalus transferosomų dalelių dydis turi būti mažesnis nei 100 nm [43].

 Devi P. su kolegomis tyrimo metu nustatė, kad tiek liposomos, tiek transferosomos pagerina resveratrolio skvarbą į odą. Taip pat buvo nustatyta, kad transferosomos yra žymiai lankstesnės nei liposomos. Tyrimo rezultatai parodė, kad lipidiniai nanonešikliai, kurių dalelių dydis mažesnis nei 116 nm, pagerina resveratrolio skvarbą iki 70 proc., lyginant su įprasta resveratrolio skvarba [44].

vertinamas jo stabilumas, esant skirtingoms sąlygoms (tamsoje 4 o

C ir 37 oC temperatūroje 48 valandas ir 4 oC temperatūroje šaldytuve du mėnesius). Tyrimo rezultatai parodė, kad praėjus vertinimų laikui, resveratrolio stabilumas buvo 95 proc., o liposomos liko nepakitusios [26].

 Kadangi resveratrolis pasižymi labai prastu tirpumu, mokslininkas Pund S. su kolegomis atliko resveratrolio tirpumo tyrimą pagalbinėse medžiagose. Tyrimo rezultatai parodė, kad resveratrolio tirpumas pagalbinėse medžiagose buvo žymiai didesnis, lyginant su tirpumu vandenyje. Resveratrolio tirpumas vandenyje 30 µm/ml, o surfaktantuose – kaprilokaproilo makrogol-8 gliceride (labrasol®) ir tween 20, atitinkamai – 207 mg/ml ir 190 mg/ml. Taip pat resveratrolis tyrimo metu gerai tirpo etanolyje (50 mg/ml) [45].

2. TYRIMO METODAI

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – sumodeliuotos transferosomos be veikliosios medžiagos ir transferosomos su resveratroliu.

2.2. Reagentai ir medžiagos

Alyvuogių aliejus (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija) Avokadų aliejus (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija) Dejonizuotas vanduo (LSMU laboratorija)

Etanolis (96 proc.) (AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva) Fosfolipidas S100 (Lipoid AG, Steinhausen, Šveicarija) Išgrynintas vanduo (LSMU laboratorija)

Kaprilokaproilo makrogol-8 gliceridas (Labrasol®) (Gattefose, Saint-Priest, Prancūzija) Lecitinas (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Vokietija)

Metanolis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Vokeitija) Natrio chloridas (Carl Roth GmbH, Kalsruhe, Vokietija)

Natrio azidas (PoCh, Gliwice, Lenkija)

Polietilenglikolis (PEG400) (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Karlsruhe, Vokietija) Resveratrolis (Naturex, Avignon, Prancūzija)

Span 80® (Sigma-Aldrich, Vokietija)

2.3. Tyrime naudota įranga

Analitinės svarstyklės (Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)

Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi (IKA C-MAG HS 7 control, IKA-Werke GmbH and Co, Vokietija)

pH–metras (pH–meter 766 su stikliniu elektrodu Knick SE 104 N (Knick Elektronische Messgerate GmbH and Co., Vokietija)

Sonikatorius „Bandelin Sonopuls“ (BANDELIN elctronic GmbH & Co. KG, Berlynas, Vokietija) Ultragarso vonelė USC 1200 THD (VWR, Malaizija)

2.4. Lipidinių nešiklių gamyba

2.4.1. Lipidinių nanonešiklių gamyba tiesioginio sonikavimo metodu

Tiesioginio sonikavimo ultragarso zondu metodu lipidiniai nanonešikliai buvo gaminami, naudojant sonikatorių „Bandelin Sonopuls“. Lipidinius nanonešiklius sudarantys komponentai buvo atsveriami į stiklinį buteliuką ir apsukti aliuminio folija, apsaugant nuo šviesos. Sudėtinės dalys maišomos 30 ± 1 o_{C temperatūroje, naudojant magnetinę maišyklę. Tiesioginio sonikavimo metu buvo}

pasirinktas ciklinis režimas, esant 30 ± 1 proc. galios amplitudei. Atliekama 20 ciklų (1 min. sonikuojama, 1 min. pertrauka).

2.4.2. Transferosomų su resveratroliu gamyba tiesioginio sonikavimo metodu

Transferosomas sudarantys komponentai: fosfolipidas S100, avokadų aliejus ir labrasol® buvo atsveriami į stiklinį buteliuką. Atsveriamas resveratrolis ir 5 proc. koncentracijos etanolis. Resveratrolis ištirpinamas 5 proc. koncentracijos etanolyje ir supilama į stiklinį buteliuką. Sudėtinės dalys maišomos 30 ± 1 o_{C temperatūroje, naudojant magnetinę maišyklę. Tiesioginio sonikavimo metu}

buvo pasirinktas ciklinis režimas, esant 30 ± 1 proc. galios amplitudei. Atliekama 20 ciklų (1 min. sonikuojama, 1 min. pertrauka). Svėrimo ir gaminimo metu stikliniai buteliukai buvo apsukami aliuminio folija, apsaugant resveratrolį nuo šviesos poveikio.

2.5. Eksperimentinio

planavimo

pritaikymas

transferosomų

sudėčių

modeliavime

1 lentelė. Sugeneruotos transferosomų formuluočių sudėtys

Formuluotės pavadinimas

Formuluotės komponentai (proc.) Fosfolipidas

S100 Avokadų aliejus Labrasol® 5 proc. etanolis

T1 3,50 2,00 1,80 92.70 T2 8,50 1,10 1,80 88.60 T3 13,50 0,20 0,98 85.33 T4 3,50 2,00 0,15 94.35 T5 3,50 0,20 1,80 94.50 T6 6,00 0,65 0,56 92.79 T7 6,00 1,55 1,39 91.06 T8 11,00 1,10 0,98 86.93 T9 8,50 2,00 0,98 88.53 T10 3,50 2,00 0,15 94.35 T11 8,50 1,10 0,56 89.84 T12 13,50 2,00 1,80 82.70 T13 3,50 0,20 1,80 94.50 T14 13,50 2,00 0,15 84.35 T15 3,50 2,00 1,80 92.70 T16 3,50 1,10 0,98 94.43 T17 3,50 0,20 0,15 96.15 T18 8,50 0,20 0,15 91.15 T19 13,50 0,20 0,98 85.33 T20 13,50 2,00 0,15 84.35

2.6. Resveratrolio įterpimo į transferosomas efektyvumo nustatymas

Resveratrolio įterpimo į transferosomas efektyvumas nustatomas dializės būdu, naudojant vamzdelio formos membranas (OrDial D14 MWCO 12000 – 14000, regenerated cellulose dialysis tubing, Orange Scientific). Membranos iš pradžių paliekamos 30 min. išgrynintame vandenyje. Išmirkytos membranos vienas galas sandariai užspaudžiamas spaustuku, o per atvirą galą į vidų supilama 400 µl transferosomos su resveratroliu ir užspaudžiamas galas spaustuku. Mėginys yra įdedamas į akceptorinę terpę: 100 ml išgryninto vandens. Akceptorinės terpės tūris parinktas toks, kad neribotų resveratrolio tirpumo. Akceptorinė terpė maišoma 1 valandą, esant kambario temperatūrai (18 – 25 o_{C). Dializės metu neįterptas resveratrolis pereina pro pusiau laidžią membraną į akceptorinę}

Resveratrolio inkorporavimo efektyvumas pagal šią formulę:

x 100

1 lygtis. Resveratrolio įterpimo efektyvumo į transferosomas apskaičiavimo lygtis. IE – resveratrolio (RES) įterpimo efektyvumas (proc.); RES kiekis po dializės – nustatytas resveratrolio kiekis transferosomose po dializės, skysčių chromatografijos metodu; RES kiekis prieš dializę – nustatytas resveratrolio kiekis tiriamajame mėginyje prieš dializę, skysčių chromatografijos metodu.

2.7. Lipidinių nešiklių kokybinių parametrų nustatymas

Polidispersiškumo indekso (PDI) ir vidutinio dalelių dydžio (VDD) nustatymas. Sumodeliuotų lipidinių nanonešiklių PDI ir VDD nustatomas dinaminiu šviesos sklaidos metodu. Prieš matavimą mėginiai buvo praskiedžiami dejonizuotu vandeniu (50 µl mėginio į 1950 µl dejonizuoto vandens), suplakami ir patalpinami į stiklinę kiuvetę. Kiuvetė su mėginiu patalpinama į dalelių dydžio matavimo analizatorių Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Jungtinė Karalystė) ir ekvilibruojama 25 oC temperatūroje. Gauti duomenys apdorojami Malvern V programine įranga. Kiekvienas mėginys buvo matuojamas ne mažiau kaip 6 kartus.

Lipidinių nanonešiklių paviršiaus zeta potencialo nustatymas. Prieš matavimą mėginiai buvo praskiedžiami dejonizuotu vandeniu (50 µl mėginio į 1950 µl dejonizuoto vandens), suplakami ir patalpinami į apgaubtąją kapiliarinę celę, kuri skirta zeta potencialui matuoti. Celė su mėginiu patalpinama į Zetasizer Nano ZS analizatorių (Malvern Instruments, Jungtinė Karalystė) ir ekvilibruojama 25 oC temperatūroje. Kiekvieno mėginio paviršiaus zeta potencialas buvo matuojamas ne mažiau kaip 6 kartus.

Lipidinių nešiklių pH reikšmės matavimas. Lipidinių nanonešiklių pH reikšmės vertintos naudojant pH–metrą (pH–meter 766 su stikliniu elektrodu Knick SE 104 N). Atliekamas pH nustatymas įmerkus elektrodą į mėginį. Kiekvienas matavimas atliekamas 3-jose skirtingose transferosomų serijose ir išvedamas vidurkis (n = 3).

2.8. Transferosomų fizikinių–cheminių savybių vertinimas laikymo metu

Transferosomų stabilumas vertinamas mėginius laikant šaldytuve, esant 4 – 8 o

savaitėms po pagaminimo, vertinant vidutinį dalelių dydį, polidispersiškumo indekso, zeta potencialo bei pH reikšmes. Fizikinių–cheminių savybių nustatymo metodika nurodyta 2.7 skirsnyje.

2.9. Resveratrolio skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimai

Tyrimai su žmogaus oda buvo atlikti remiantis Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimu (2016-07-14 Nr. BE-2-41) bei Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro leidimu nr. BEC-FF-46 (1 priedas). Tyrimai atlikti remiantis Klinikinės farmacijos katedroje išvystyta skvarbos metodika [46, 47]. Skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimai buvo atliekami su 25 – 40 metų amžiaus baltaodžių moterų oda, kuri buvo gauta po plastinių operacijų, atliktų Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Plastinės ir rekonstrukcinės chirurgijos klinikoje. Tyrimuose naudota oda buvo užšaldyta ir laikoma – 20 o_{C temperatūroje.}

Tyrimui atlikti buvo naudojamos Bronaugh tipo pratakios difuzinės celės. Pastovi celių temperatūra buvo palaikoma, įtvirtinant jas į metalinį stovą, kuriame buvo cirkuliuojama 37 ± 1 o

C temperatūros vanduo. Vandens temperatūra palaikoma, naudojant termostatinę cirkuliacinę vonelę Grant GD120 (Grant Instruments Ltd., Kembridžas, Jungtinė Karalystė).

Akceptorinė terpė buvo sudaryta iš 0,9 proc. natrio chlorido ir 0,0005 proc. natrio azido, kuris pasirinktas kaip konservantas. Tyrimo metu buvo palaikomas tolygus akceptorinės terpės tekėjimo greitis 0.6 ml/min., naudojant peristaltinį siurblį Masterflex® L/S® su daugiakanale siurblio galva (Cole–Parmer Instruments Co., Ilinojus, JAV).

Odos mėginių paruošimas. Odos mėginiai prieš tyrimą buvo atšildomi kambario

temperatūroje ir vizualiai įvertinami, ar nėra pažeidimų (įpjovų, žaizdelių). Iškerpamas 1,6 cm diametro odos gabalėlis ir įdedamas į celę. Vykdoma 1 valandos trukmės odos ekvilibracija, kurios metu po oda cirkuliuoja akceptorinė terpė. Po valandos akceptorinė terpė yra pakeičiama į šviežią akceptorinę terpę.

Tiriamieji mėginiai: transferosomos su resveratroliu, kontroliniai tirpalai 0,5, 1 ir 2 proc. resveratrolio PEG 400 ir distiliuoto vandens (1:1) mišinyje.

Mėginių uždėjimas ir nuėmimas. Ant paruoštos odos tolygiai užlašinama 1ml mėginio ir

uždengiamas parafilmu (PARAFILM®M). Praėjus 24 valandoms odos paviršius yra nuvalomas ir plaunamas 96 proc. etanolio (2 x 1ml) ir 0,9 proc. natrio chlorido (2 x 1ml) tirpalais.

Žmogaus odos mėginių po skvarbos tyrimo nuėmimas. Odos mėginiai nuvalomi, nuplaunami,

nusausinami ir išimami iš celių. Žmogaus odos mėginio epidermis nuo dermos atskiriamas, naudojant sauso karščio metodą. Odos gabalėlis epidermio puse priglaudžiamas prie įkaitinto metalinio paviršiaus ( iki 80 o

nulupamas pincetu nuo dermos. Atskirti odos sluoksniai sudedami į atskirus 1,5 ml tūrio užkemšamus plastikinius mėgintuvėlius, ekstrahentu naudojant 1 ml metanolio. Toliau vykdoma resveratrolio ekstrakcija iš odos 30 min. ultragarsu ultragarso vonelėje USC 1200 THD (VWR, Malaizija), esant 20 ± 2 o_{C temperatūrai. Gautas tirpalas filtruojamas pro nailoninius membraninius švirkštų mikrofiltrus}

(0,22 µm) į tamsaus stiklo chromatografinius buteliukus. Kiekybinė resveratrolio analizė odos mėginių ekstraktuose buvo atliekama efektyviosios skysčių chromatografijos metodu išvystytu ir validuotu klinikinės farmacijos katedroje.

2.10. Statistinis duomenų vertinimas

3. REZULTATAI IR JŲ APIBENDRINIMAS

3.1. Lipidinių nanonešiklių atranka

Siekiant sumodeliuoti stabilią farmacinę formą ir pritaikyti ją veikliosios medžiagos įterpimui bei skvarbos į odą gerinimui, buvo vykdoma farmacinių formų atranka. Išanalizavus mokslinės literatūros duomenis, išsiaiškinta, kad resveratrolio skvarbą į odą galėtų pagerinti lipidiniai nanonešikliai [5, 6, 16]. Šiame tyrime iš lipidinių nanonešiklių pasirinkta liposomos ir transferosomos. Liposomų gamybai buvo naudojamas išgrynintas vanduo, o alyvuogių aliejus ir lecitinas buvo pasirinkti kaip skvarbą gerinančios medžiagos. Transferosomų gamyboje buvo naudojamos kitos skvarbą gerinančios medžiagos: avokadų aliejus ir labrasol®. Liposomų ir transferosomų sudėtys buvo modeliuojamos, remiantis mokslininkų jau pagamintomis sudėtimis [47, 48, 49]. Pasirinktos lipidinių nanonešiklių sudėtys pateikiamos 2 ir 3 lentelėse. Lipidiniai nanonešikliai buvo gaminami tiesioginio sonikavimo metodu, kuris taikomas lipidinių nanonešiklių gamyboje [50]. Gamybos metodika aprašyta 2.4.1 skirsnyje. Pagaminus lipidnius nanonešiklius, buvo vertinamos jų fizikinės–cheminės savybės: VDD, PDI, zeta potencialas pagaminimo dieną ir praėjus savaitei po pagaminimo.

2 lentelė. Liposomų sudėtys

Formuluotės pavadinimas

Formuluočių komponentai (proc.)

Alyvuogių aliejus Lecitinas Išgrynintas vanduo

L1 7,5 91,00 1,50

L2 - 98,55 1,45

3 lentelė. Transferosomų sudėtys

Formuluotės pavadinimas

Formuluočių komponentai (proc.) Avokadų aliejus 5 proc. etanolis Fosfolipidas S100 Labrasol® Span80® T1 - 1,70 90,74 - 7,56 T2 3,84 0,51 84,69 10,96 -

4 lentelė. Lipidinių nanonešiklių fizikinių–cheminių savybės

Formuluotės

pavadinimas VDD PDI Zeta

L1 pagaminus _{98,03 ± 0,540} 0,249 ± 0,018 - 27,8 ± 3,270 L1 po 1 savaitės 112,62 ±1,630 0,251 ± 0,520 - 24,7 ± 4,250 L2 pagaminus 73,09 ± 0,154 0,247 ± 0,020 - 15,3 ± 1,940 L2 po 1 savaitės 96,10 ± 0,350 0,273 ± 0,751 - 15,1 ± 0,987 T1 pagaminus 96,57 ± 0,734 0,264 ± 0,005 - 76,5 ± 5,230 T1 po 1 savaitės 109,17 ±0,781 0,297 ± 0,300 - 25,2 ± 1,670 T2 pagaminus 62,72 ± 0,361 0,282 ± 0,040 - 2,59 ± 0,378 T2 po 1 savaitės 62,65 ± 0,210 0,28, ± 0,120 - 1,22 ± 0,094

Visi sumodeliuoti lipidiniai nanonešikliai po pagaminimo tenkino kokybės kriterijus, išskyrus T1 formuluotė, kurios zeta potencialas buvo -76,5 mV. Mažiausiu dalelių dydžiu 62,72 nm pasižymėjo T2 formuluotės transferosomos. Pagamintos sistemos buvo homogeniškos ir atitiko keliamus kriterijus, kadangi PDI < 0,5.

Atliekant statistinės reikšmės duomenų analizę, buvo nustatyta atvirkštinė labai stipri koreliacija tarp liposomose esančios pagalbinės medžiagos lecitino ir VDD (r = –1, p < 0,01). Koreliacija parodė, kad didėjant lecitino kiekiui, mažėja dalelių dydis. Taip pat buvo nustatyta atvirkštinė labai stipri koreliacija tarp transferosomų sudėtyje esančo avokadų aliejaus kiekio ir VDD (r = –1, p < 0,01). Didėjant avokadų aliejaus kiekiui, VDD mažėja. Taip pat buvo nustatytos dvi labai stiprios tiesioginės koreliacijos tarp transferosomų sudėtyse esančių 5 proc. etanolio ir fosfolipido S100 kiekių, t. y. didėjant šių sudėtinių medžiagų kiekiams, VDD didėja (r = 1, p < 0,01). Analizuojant liposomų PDI ir zeta potencialą nenustatyta statistiškai reikšmingų ryšių. Tiesioginė labai stipri koreliacija nustatyta tarp transferosomų sudėtyje esančio avokadų aliejaus ir PDI, t. y. didėjant avokadų aliejaus kiekiui, PDI irgi didėja ( r = 1, p < 0,01). Atvirkštinės labai stiprios koreliacijos nustatytos tarp 5 proc. etanolio ir fosfolipido S100 kiekių transferosomų formuluotėse, didėjant šių medžiagų kiekiams, PDI mažėja (r = –1, p < 0,01).

Įvertinus sumodeliuotų lipidninių nanonešiklių tyrimo metu gautus rezultatus, nuspręsta tolimesniems tyrimams pasirinkti T2 formuluotės transferosomas, nes jos atitiko pasirinktus kokybės kriterijus bei pasižymėjo geriausiu stabilumu tarp pagamintų visų lipidinių nanonešiklių

3.2. Transferosomų fizikinių–cheminių savybių nustatymas

Pagaminus eksperimentinio planavimo programos pasiūlytas formuluotes, buvo vertinami jų kokybės parametrai vizualiai bei pagal fizikines–chemines savybes.

Vizualinis vertinimas. Pagamintos formuluotės įvertintos vizualiai. Vizualinio vertinimo metu

nustatyta, kad susiformavusios transferosomos yra homogeniškos, nematyti fazių atsiskyrimo ar susidariusių nuosėdų.

Fizikinių–cheminių savybių vertinimas. Pagamintos transferosomos vertintos pagal šias

fizikines–chemines savybes: VDD, PDI, zetą potencialą ir pH. Vertinant sumodeliuotų transferosomų fizikines–chemines savybes buvo pasirinkti šie kriterijai: 1) VDD < 100 nm., kadangi mažesnis dalelių dydis pagerina veikliųjų medžiagų skvarbą [44]; 2) PDI < 0,5, siekiant pagaminti homogenišką sistemą [51, 52]; 3) zeta potencialas intervale nuo -30 iki 30 mV, siekiant sumodeliuoti stabilią sistemą [53, 54]; 4) pH intervale nuo 4,5 iki 7, kad sistema būtų tinkama vartoti ant odos. Moksliniuose šaltiniuose teigiama, kad apatinė pH reikšmės riba 4,5, o viršutinė 6,5, tačiau kai kurie mokslininkai teigia, kad formuluotes galima naudoti, kuomet viršutinė pH reikšmė yra 7 [55, 56]. Transferosomų sudėtys pateikiamos 1 lentelėje, o fizikinių–cheminių savybių tyrimo rezultatai pateikiami 5 lentelėje.

5 lentelė. Sumodeliuotų transferosomų fizikinės–cheminės savybės

Formuluotės

pavadinimas VDD PDI Zeta potencialas pH

5 lentelės tęsinys. Sumodeliuotų transferosomų fizikinės–cheminės savybės

T17 112,40 ± 1,604 0,333 ± 0,049 -2,64 ± 0.610 7,26

T18 125,30 ± 0,990 0,425 ± 0,030 -1,70 ± 0.151 7,21

T19 74,51 ± 0,824 0,416 ± 0,016 -1,00 ± 0.310 7,30

T20 128,60 ± 0,920 0,277 ± 0,009 -7,12 ± 0.600 7,41

VDD ir PDI nustatymas. Gaminant transferosomas, buvo siekiama pagaminti mažas daleles,

kurių VDD siektų iki 100 nm. Remiantis moksline literatūra, optimalus transferosomų dalelių dydis turi būti kuo mažesnis bei neturi būti didesnės nei 100 nm, kadangi tokio dydžio dalelės pagerina skvarbą [43, 44]. Pagamintų formuluočių dalelių dydis svyruoja nuo 63,65 nm iki 149,8 nm, todėl nevisos sudėtys atitinka pasirinktus reikalavimus. Nustatytos PDI reikšmės svyruoja nuo 0,271 iki 0,452 tai rodo, kad visos pagamintos transferosomos yra homogeniškos, kadangi nustatytas PDI < 0,5 [51, 52].

Statistinė tyrimų rezultatų analizė parodė, kad avokadų aliejaus ir labrasol® kiekis formuluotėje turi įtakos VDD, PDI. Nustatyta tiesioginė vidutinio stiprumo koreliacija, kuri parodė, kad didinant avokadų aliejaus kiekį, vidutinis dalelių dydis statistiškai reikšmingai padidėja (r = 0,496, p < 0,05). Statistinė duomenų analizė parodė, kad labrasol® kiekis turi įtakos VDD. Tarp jų nustatyta atvirkštinė vidutinio stiprumo koreliacija (r = –0,629, p < 0,01), didėjant labrasol® kiekiui, dalelių dydis mažėja. Atvirkštinė vidutinio stiprumo koreliacija nustatyta tarp avokadų aliejaus kiekio ir PDI reikšmės, kuri parodė, kad didėjant avokadų aliejaus koncentracijai transferosomų sudėtyse, polidispersiškumo indeksas mažėja (r = –0,531, p < 0,05). Tarp labrasol® ir PDI nebuvo nustatyta statistiškai reikšminga koreliacija.

Zeta potencialo nustatymas. Gauti zeta potencialo tyrimo rezultatai parodė, kad šis parametras

svyruoja intervale nuo -11,2 iki -1 mV, tai reiškia, kad formuluočių paviršiaus krūvis yra neigiamas. Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta atvirkštinė vidutinė koreliacija tarp avokadų aliejaus ir zeta potencialo, kuri parodė, kad didėjant avokadų aliejaus koncentracijai, zeta potencialas mažėja (r = –0,722, p < 0,01).

pH nustatymas. Pagamintų transferosomų pH reikšmės vyravo nuo 6,69 iki 7,41, todėl

3.3. Transferosomų su resveratroliu modeliavimas ir fizikinių–cheminių savybių

vertinimas

Į atrinktas T12 ir T16 transferosomų formuluotes buvo įterpta 0,5, 1 ir 2 proc. resveratrolio. Sudėtys pateikiamos 5 lentelėje.

6 lentelė. Transferosomų su resveratroliu formuluočių sudėtys

Formuluotės pavadinimas

Formuluotės komponentai (proc.) Fosfolipidas S100 Avokadų aliejus Labrasol® 5 proc. etanolis Resveratrolis T12R0.5 13,38 1,88 1,68 82,56 0,5 T12R1 13,25 1,75 1,55 82,45 1,0 T12R2 13,00 1,50 1,30 82,20 2,0 T16T0.5 3,38 0,98 0,86 94,28 0,5 T16R1 3,25 0,85 0,73 94,17 1,0 T16R2 3,00 0,60 0,48 93,92 2,0

Norint įvertinti resveratrolio įtaką transferosomų fizikinėms–cheminėms savybėms, buvo analizuojamos formuluotės be ir su resveratroliu. Transferosomų kokybės pokyčiai buvo vertinami pagal šių savybių pokyčius: VDD, PDI, zetą potencialą ir pH. Transferosomų formuluotės vertinamos pagaminant vienodos sudėties lipidinius nanonešiklius be ir su resveratroliu. Tyrimų rezultatai pateikfti 6 ir 7 lentelėse.

7 lentelė. T12 formuluotės ir T12 formuluočių su resveratroliu fizikinės–cheminės savybės

Formuluotės

pavadinimas VDD PDI Zeta potencialas pH

T12 81,62 ± 1,219 0,271 ±0,023 -3,23 ± 0,030 7,22

T12R0.5 96,79 ± 0,241 0,243 ± 0,020 -4,51 ± 0,142 7,25

T12R1 127,70 ± 0,940 0,220 ± 0,020 -1,22 ± 0,017 7,36

T12R2 151,80 ± 3,210 0,281 ±0,120 -10,80 ± 0,970 7,20

8 lentelė. T16 formuluotės ir T16 formuluočių su resveratroliu fizikinės–cheminės savybės

Formuluotės

pavadinimas VDD PDI Zeta potencialas pH

T16 71,53 ± 0,301 0,385 ±0,007 -6,23 ± 0,34 7,15

T16R0.5 150,70 ± 0,890 0,267 ± 0,260 -26,70 ± 2,41 6,65

T16R1 288,80 ± 3,570 0,379 ± 0,710 -20,30 ± 1,22 6,91

T16R2 168,70 ± 2,130 0,280 ± 0,520 -31,10 ± 2,35 6,88

Atlikus statistinę duomenų analizė nebuvo nustatyta statistiškai reikšmingų pokyčių. Įterpus resveratrolį į formuluotes, VDD padidėjo, lyginant su kontroline formuluote. T16R1 formuluotė išsiskyrė didžiausiu VDD, kuris buvo 288,8 nm. Pagamintos formuluotės buvo homogeniškos, nes PDI < 0,5 [51, 52]. Vertinant zeta potencialo reikšmes visos formuluotės turėjo neigiamą krūvį ir buvo intervale nuo -31,1 iki -6,23 mV. Įterpus resveratrolį pH sumažėjo nuo 7,15 iki 6,65.

Analizuojant abiejų formuluočių pagamintas transferosomas be ir su resveratroliu, galima teigti, kad T12 formuluotės transferosomos pasižymi geresnėmis fizikinėmis–cheminėmis savybėmis, kadangi pasižymi mažesniu VDD, pavyzdžiui, T12R0.5 VDD 96,79, o T16R0.5 VDD150,7. Taip pat T12 formuluotės transferosomos pasižymi mažesniu PDI, kuris yra iki 0,3, o tarp T16 formuluotės transferosomų buvo nustatyta atvejų, kai PDI > 0,3. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, galima daryti išvadą, kad sumodeliuotos T12 formuluotės transferosomos su resveratroliu pasižymi mažesniu dalelių dydžiu ir yra homogeniškesnės, nes įterpia mažiau resveratrolio, o T16 formuluotės įterpia daugiau resveratrolio ir dėl to pasižymi didesniu VDD ir PDI.

3.3.1. Transferosomų su resveratroliu fizikinių–cheminių savybių vertinimas

keturių savaičių laikotarpyje

Siekiant įvertinti pagamintų transferosomų be veikliosios medžiagos ir su resveratroliu fizikinių–cheminių savybių kitimą, tyrimas vykdytas 4 savaites. Analizuojant mokslinę literatūrą nustatyta, kad geriausias transferosomų laikymas nustatytas esant 4 ± 2 oC temperatūroje (šaldytuve). Dėl šios priežasties mėginiai buvo laikomi šaldytuve, esant 2 – 8 o_{C temperatūrai, apsukti aliuminio}

3.3.2. T12 formuluočių fizikinių–cheminių savybių kitimo vertinimas keturių

savaičių laikotarpyje

Stabilumo tyrimo metu vertinta kontrolinė (T12) formuluotė ir šios formuluotės su resveratroliu: T12R0,5, T12R1, T12R2. Tyrimo metu buvo vertinamas VDD ir PDI, o rezultatai pateikti 4 paveiksle.

4pav. T12, T12R0,5, T12R1 ir T12R2 transferosomų VVD ir PDI kitimas stabilumo tyrimo metu

Stabilumo tyrimo metu buvo vertinamas formuluočių be ir su resveratroliu dalelių dydis. Nustatytas formuluotės be resveratrolio statistiškai reikšmingas VDD ir PDI pokytis po savaitės (p < 0,05). VDD padidėjo nuo 81,62 iki 129,4 nm, o PDI nuo 0,271 iki 0,386. Statistiškai reikšmingi pokyčiai išliko viso tyrimo metu. Tačiau nepriklausomai nuo nustatytų pokyčių, sistemos liko homogeniškos ir atitiko transferosomoms keliamus reikalavimus, jog PDI < 0,5 [51, 52].

reikšmingas skirtumas (p < 0,01) nustatytas tarp pradinio taško ir ketvirtos savaitės T12R2 formuluotėje. Tyrimo metu VDD sumažėjo 11,39 proc. (nuo 151,8 iki 134,5 nm), o PDI sumažėjo 13,88 proc. (nuo 0,281 iki 0,242).

Siekiant nustatyti dalelių krūvį ir vertinant zeta potencialo kitimą keturių savaičių laikotarpyje, statistiškai reikšmingų pokyčių (p > 0,05) nebuvo nustatyta. Zeta potencialas nustatytas intervaluose: T12 padidėjo nuo -3,23 ± 0,030 mV iki -2,02 ± 0,120 mV; T12R0,5 padidėjo nuo -4,51 ± 0,142 mV iki -3,29 ± 0,097 mV; T12R1 sumažėjo nuo -1,22 ± 0,017 mV iki -2,29 ± 0,257 mV; T12R2 padidėjo nuo -10,8 ± 0,970 mV iki -9,24 ± 0,700 mV. Tyrimo rezultatai rodo, kad zeta potencialas nekito ir transferosomų krūvis išliko neutralus, kadangi buvo intervale - 10 – + 10 mV [54].

Tirtame laiko intervale pH kito intervaluose: T12 sumažėjo nuo 7,22 iki 7; T12R0,5 sumažėjo nuo 7,25 iki 7; T12R1 sumažėjo nuo 7,36 iki 6,5; T12R2 sumažėjo nuo 7,2 iki 6,8. Transferosomose su resveratroliu pH mažėjimas galėjo priklausyti nuo vykstančių resveratrolio pokyčių.

Apibendrinant tyrimo rezultatus galima teigti, kad formuluotės su 0,5 ir 1 proc. resveratroliu buvo stabilios ir homogeniškos, kadangi nebuvo nustatyta statistiškai reikšmingų VDD ir PDI pokyčių (p > 0,05) stabilumo tyrimo metu, o PDI išliko mažesnis nei 0,5. Didžiausi VDD ir PDI pokyčiai nustatyti transferosomose be resveratrolio. T12R2 formuluotė nebuvo stabili, nes nustatytas statistiškai reikšmingas pokytis matuojant VDD ir PDI reikšmes tyrimo laikotarpiu, tačiau sistema išliko homogeniška. Apibendrinant rezultatus galima daryti prielaidą, kad įterpiamas resveratrolio kiekis gali turėti įtakos transferosomų stabilumui, nes transferosomų be resvreatrolio ir su 2 proc. resveratrolio VDD ir PDI statistiškai reikšmingai kito, o su 0,5 ir 1 proc. nekito.

3.3.3. T16 formuluočių fizikinių–cheminių savybių kitimo vertinimas keturių

savaičių laikotarpyje

5 pav. T16, T16R0,5, T16R1 ir T16R2 transferosomų VVD ir PDI kitimas stabilumo tyrimo metu

Stabilumo tyrimo metu buvo vertinamas formuluočių be ir su resveratroliu dalelių dydis. Formuluotės be resveratrolio dydis tyrimo metu padidėjo 34,14 proc. (nuo 71,53 iki 95,95 nm). Polidispersiškumo stabilumo tyrimo rezultatai parodė, kad PDI visą tyrimo laiką mažėjo. Tyrimo metu T16 formuluotės PDI sumažėjo 40,52 proc. (nuo 0,385 iki 0,229). Tyrimo metu transferosomos išliko homogeniškos ir atitiko transferosomoms keliamus reikalavimus.

VDD tarp antros ir trečios tyrimo savaitės padidėjo 56,42 proc. (nuo 140,9 iki 220,4 nm), tačiau tarp trečios ir ketvirtos savaitės sumažėjo 21,91 proc. ( nuo 220,4 iki 172,1 nm). Tyrimo metu T16R2 formuluotės PDI reikšmė padidėjo nuo 0,280 ik 0,431. Nepriklausomai nuo statistiškai reikšmingų pokyčių, sistema liko homogeniška, nes PDI < 0,5 [51, 52].

Siekiant nustatyti dalelių krūvį ir vertinant zeta potencialo kitimą keturių savaičių laikotarpyje, statistiškai reikšmingų pokyčių (p > 0,05) nebuvo nustatyta. Zeta potencialas nustatytas intervaluose: T16 padidėjo nuo -6,23 ± 0,034 mV iki -5,11 ± 0,67 mV; T16R0,5 padidėjo nuo -26,70 ± 2,41 mV iki -10,00 ± 1,34 mV; T16R1 padidėjo nuo -20,30 ± 1,22 mV iki -11,80 ± 1,27 mV; T16R2 padidėjo nuo -31,10 ± 2,35 mV iki -19,30 ± 1,79 mV. Tyrimo rezultatai parodė, kad zeta potencialas nekito ir transferosomų su resveratroliu krūvis išliko neigiamas, kadangi buvo ≤ - 10 mV [54].

Tirtame laiko intervale pH kito intervaluose: T16 sumažėjo nuo 7,15 iki 6,00; T16R0,5 sumažėjo nuo 6,65 iki 6,00; T12R1 sumažėjo nuo 6,91 iki 6,32; T12R2 sumažėjo nuo 6,88 iki 6,21. Transferosomose su resveratroliu pH mažėjimas galėjo priklausyti nuo vykstančių resveratrolio pokyčių.

Apibendrinant tyrimo rezultatus galima teigti, kad kontrolinė formuluotė ir formuluotė su 0,5 proc. buvo stabili ir homogeniška, nes nebuvo nustatytų statistiškai reikšmingų VDD ir PDI pokyčių. Formuluotės su 1 ir 2 proc. nebuvo stabilios, tačiau išliko homogeniškos. Vertinant keturių savaičių laikotarpyje didžiausi VDD pokyčiai nustatyti formuluotėje be resveratrolio (34,14 proc. padidėjo), o mažiausi – formuluotėje su 2 proc. resveratrolio (1,84 proc. padidėjo). Didžiausi PDI pokyčiai keturių savaičių laikotarpyje nustatyti formuluotėje su 2 proc. resveratrolio (54,28 proc. padidėjo), o mažiausi formuluotėje su 1 proc. resveratrolio (3,96 proc. padidėjo).

3.4. Resveratrolio inkorporavimo į transferosomas efektyvumo nustatymas

Siekiant įvertinti, kaip transferosomos geba inkorporuoti veikliąją medžiagą, buvo atliktas veikliosios medžiagos inkorporavimo į transferosomas efektyvumo nustatymas. Inkorporavimui į transferosomų formuluotes buvo pasirinkti skirtingi resveratrolio kiekiai. Transferosomų inkorporavimo efektyvumas įvertintas nustatant resveratrolio kiekį prieš ir po dializės, efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Procentinis resveratrolio inkorporavimo į transferosomas efektyvumas pateikiamas 6 paveiksle.

6 pav. Resveratrolio inkorporavimo į transferosomas efektyvumas

Tyrimų rezultatai parodė, kad pagamintų transferosomų geba inkorporuoti resveratrolį varijuoja nuo 85,67 proc. iki 98,30 proc. Įterpus resveratrolį į T12 formuluotės transferosomas, inkorporavimo efektyvumas buvo nuo 85,67 proc. iki 96,04 proc., o resveratrolio inkorporavimo efektyvumas T16 formuluotės transferosomose buvo nuo 91,71 proc. iki 98,30 proc. Vertinant gautus duomenis nustatyta, kad didžiausiu efektyvumu išsiskyrė T16R0.5 formuluotė, kurios efektyvumas buvo 98,30 proc., o mažiausias – T12R2 formuluotės, kurios efektyvumas 85,67 proc..

Statistinė duomenų analizė nustatė statistiškai reikšmingą labai stiprią tiesioginę koreliaciją tarp 5 proc. etanolio kiekio formuluotėse ir inkorporavimo efektyvumo – mažėjant šios medžiagos kiekiui, resveratrolio inkorporavimo efektyvumas mažėja (r = 0,943, p < 0,01). Taip pat buvo nustatyta labai stipri atvirkštinė koreliacija tarp resveratrolio kiekio ir inkorporavimo efektyvumo (r = –1, p < 0,01). Didėjant resveratrolio kiekiui, inkorporavimo efektyvumas mažėja.

Apibendrinant gautus tyrimo rezultatus nustatyta, kad įterpiamas resveratrolio kiekis turi įtakos jo inkorporavimui į transferosomas. Taip pat nustatyta, kad pagalbinės medžiagos turėjo įtakos resveratrolio inkorporavimui į transferomas, nes didesnis inkorporavimo efektyvumas nustatytas tais atvejais, kada transferosomų sudėtyje buvo didesni 5 proc. etanolio kiekiai. Reiko Yutani su kolegomis tyrė etanolio įtaką resveratrolio inkorporavimui iš mikroemulsijų. Tyrimo rezultatai parodė, kad formuluotės su etanoliu pagerina resveratrolio inkorporavimo efektyvumą 15 kartų, lyginant su formuluotėmis be etanolio [57]. Taip pat kiti mokslininkai tyrimo metu nustatė, kad papildomi tirpikliai, kaip, pavyzdžiui, etanolis, ne tik pagerina resveratrolio tirpumą, bet ir pagerina inkorporavimo efektyvumą [58, 59].

3.5. Resveratrolio skvarbos į žmogaus odą iš transferosomų ex vivo tyrimai

Mokslinės literatūros analizė parodė, kad resveratrolis yra lipofilinė medžiaga, todėl skvarba į gilesnius odos sluoksnius yra ribota [60]. Siekiant išspręsti šia problemą ir pagerinti resveratrolio skvarbą į odą, buvo sumodeliuotos transferosomos. Atliekant resveratrolio skvarbos į žmogaus odą ex

vivo tyrimą, vertinta transferosomų, kaip lipidinių nanonešiklių, geba tiekti resveratrolį į gilesnius odos

sluoksnius. Kontroliniai tirpalai buvo sudaryti iš PEG 400 ir distiliuoto vandens (1:1), įterpiant 0,5, 1 ir 2 proc. resveratrolio. Resveratrolio skvarbos į odą iš skirtingų formuluočių tyrimo rezultatai pateikti 7 paveiksle.

7 pav. Resveratrolio skvarba į epidermį ir dermą iš skirtingų formuluočių

0 5 10 15 20 25 30 35 40 Kontrolė 2% RES Kontrolė 1% RES Kontrolė 0.5% RES T16R2 T16R1 T16R0.5 T12R2 T12R1 T12R0.5

Resveratrolio skvarba į odą µg/cm2

Tyrimo rezultatai parodė, kad geresnė resveratrolio skvarba iš transferosomų yra į dermą nei į epidermį. Mokslinės literatūros analizė parodė, kad tam įtakos gali turėti pagalbinės medžiagos. Etanolis ir labrasol® naudojami kaip skvarbą gerinančios medžiagos [61, 62]. Formuluotė T12R0,5 nepasižymėjo resveratrolio skvarba nei į epidermį, nei į dermą. Geresnė resveratrolio skvarba į odą nustatyta iš T16 formuluočių transferosomų, esant skirtingiems resveratrolio kiekiams. T16R0,5, T16R1, T16R2 pasižymėjo geresnėmis skvarbos savybėmis, nes sudėtyje turėjo daugiau nei 5 proc. koncentracijos etanolio. Remiantis mokslininkų atliktų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad etanolis skatina resveratrolio skvarbą į odą [63]. Resveratrolio skvarba į epidermį iš T12R1 ir T16R1 formuluočių skyrėsi 1,8 karto (T12R1 – 4,4 µg/cm2

, T16R1 – 7,95 µg/cm2), o į dermą – 1,57 karto. T16R2 formuluotė resveratrolio skvarbą į epidermį pagerino 2,57 karto, lyginant su T12R2 formuluote, o į dermą – 2,35 karto. Tyrimo rezultatai parodė, kad T16R0,5 formuluotės skvarba į epidermį buvo 2,56 karto didesnė nei kontrolinio tirpalo su 0,5 proc. resveratrolio, o į dermą 1,06 karto. Kontrolinio tirpalo su 1 proc. resveratrolio skvarba į epidermį buvo 1,6 karto mažesnė nei T12R1 formuluotės ir 2,89 karto mažesnė nei T16R1 formuluotės, o į dermą 2,06 karto mažesnė nei T12R1 formuluotės ir 3,24 karto mažesnė nei T16R1 formuluotės. T12R2 formuluotės skvarba į epidermį buvo 1,51 karto didesnė, o T16R2 formuluotės 3,88 karto didesnė nei kontrolinio tirpalo su 2 proc. resveratrolio. Kontrolinio tirpalo su 2 proc. resveratrolio skvarba į dermą buvo 5,27 karto mažesnė nei T12R2 formuluotės ir 12,39 karto mažesnė nei T16R2 formuluotės.

Analizuojant gautus tyrimo rezultatus nustatyta, kad resveratrolio skvarba iš transferosomų priklauso nuo įterpiamo resveratrolio kiekio. Resveratrolio skvarba iš transferosomų į odą geresnė, kuomet įterpiamas didesnis veikliosios medžiagos kiekis. Nustatyta tiesioginė labai stipri koreliacija tarp įterpiamo resveratrolio kiekio ir skvarbos į odą – didėjant resveratrolio kiekiui, skvarba į odą didėja (r = 1, p < 0,01).

4. IŠVADOS

1. Įvykdžius lipidinių nanonešiklių atranką ir įvertinus jų fizikinių–cheminių savybių kitimą savaitės laikotarpyje, tolimesniems tyrimams pasirinktos transferosomos, kurios išliko stabilios ir atitiko joms keliamus kokybės kriterijus (VDD < 100 nm, PDI < 0,5, zeta potencialas nuo -30 iki +30 mV).

2. Pritaikant eksperimentinį planavimą, buvo sugeneruotos ir pagamintos 20 transferosomų formuluočių su fosfolipidu S100, labrasol®, avokadų aliejumi, 5 proc. etanoliu. Atlikus transferosomų fizikinių–cheminių savybių vertinimą, nustatyta, kad visos sumodeliuotos transferosomos atitiko joms keliamus kokybės reikalavimus. Pasirinktos transferosomų formuluotės T12 ir T16, nes jų VDD < 100 nm, pasižymėjo mažiausiu PDI, zeta potencialas intervale nuo – 30 iki + 30 mV.

3. Atrinktos T12 ir T16 transferosomų formuluotės pritaikytos resveratrolio įterpimui. Įterpiamas resveratrolio kiekis statistiškai reikšmingai padidino transferosomų VDD, tačiau neturėjo įtakos transferosomų PDI, zeta potencialui ir pH rekšmei. Keturių savaičių laikotarpyje visos transferosomos su resveratroliu išliko homogeniškos (PDI < 0,5), tačiau buvo nustatyti transferosomų T12R2 ir T16R1 statistiškai reikšmingi VDD pokyčiai (p < 0,01). Nors ir pakito transferosomų VDD, tačiau transferosomos su resveratroliu atitiko joms keliamus kokybės reikalavimus.

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Siekiant įvertinti transferosomų ir transferosomų su resveratroliu stabilumą, rekomenduojama atlikti stabilumo tyrimus skirtingomis laikymo sąlygomis, vertinant temperatūros ir šviesos poveikį resveratroliui.

2. Rekomenduojama atrinktų sudėčių transferosomoms pritaikyti kitą gamybos metodą, pavyzdžiui, plono sluoksnio drėkinimo metodą. Atlikti pagamintų transferosomų VDD ir PDI matavimus, siekiant įvertinti pasirinkto metodo galimybę formuoti mažesnio dydžio transferosomas.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Zu Y, Overby H, Ren G, Fan Z, Zhao L, Wang S. Resveratrol liposomes and lipid nanocarriers: Comparison of characteristics and inducing browning of white adipocytes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2018;164:414-23.

2. Zhang X, Xing H, Zhao Y, Ma Z. Pharmaceutical dispersion techniques for dissolution and bioavailability enhancement of poorly water-soluble drugs. Pharmaceutics. 2018;10(3):74.

3. Gęgotek A, Domingues P, Skrzydlewska E. Natural exogenous antioxidant defense against changes in human skin fibroblast proteome disturbed by UVA radiation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2020;2020.

4. Garg V, Singh H, Bimbrawh S, Kumar Singh S, Gulati M, Vaidya Y, Kaur P. Ethosomes and transfersomes: principles, perspectives and practices. Current drug delivery. 2017;14(5):613-33.

5. Xing H, Hwang K, Lu Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications [Internet]. Theranostics. Ivyspring International Publisher; 2016 [cited 2020Jun15]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4924503

6. Benson HA. Transfersomes for transdermal drug delivery. Expert opinion on drug delivery. 2006;3(6):727-37.

7. Patricia Farris MD, Jean Krutmann MD, Yuan-Hong Li MD, David McDaniel MD, Krolj Y. Resveratrol: A unique antioxidant offering a multi-mechanistic approach for treating aging skin. J Drugs Dermatol. 2013;12(12):1389-94.

8. Ko J-H, Sethi G, Um J-Y, Shanmugam MK, Arfuso F, Kumar AP, et al. The Role of Resveratrol in Cancer Therapy [Internet]. International journal of molecular sciences. MDPI; 2017 [cited 2020Jun1]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5751192/

9. Thapa SB, Pandey RP, Park YI, Kyung Sohng J. Biotechnological Advances in Resveratrol Production and its Chemical Diversity [Internet]. Molecules (Basel, Switzerland). MDPI; 2019 [cited 2020May16]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6680439/

10. R Neves A, Lucio M, LC Lima J, Reis S. Resveratrol in medicinal chemistry: a critical review of its pharmacokinetics, drug-delivery, and membrane interactions. Current medicinal chemistry. 2012;19(11):1663-81.

11. Giuseppina Bozzuto AM. Liposomes as nanomedical devices. International Journal of Nanomedicine. 2015.