2 MATERIALI E METODI
2.1 Soluzioni
PBS 10x Il PBS (phosphate buffered saline) è costituito da NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 8 mM, e da KH2PO4 2 mM. Per la sua preparazione si utilizzano tavolette di PBS già pronte (Sigma). Per ottenere un litro di PBS concentrato 10 volte si sciolgono 50 tavolette in un litro di H2O milliQ.
Paraformaldeide 20% (PFA) Per preparare 800 ml di paraformaldeide 20% si pesano 160 gr di PFA in microsfere e si pongono in un beaker di vetro. Questa e le successive fasi di preparazione avvengono sotto cappa e con l’utilizzo di guanti, camice e mascherina. Si aggiunge H2O (<800 ml) e si scalda a 55°C. Si aggiungono 800 µl di NaOH 10N e si porta a volume. Quando la soluzione diventa limpida viene filtrata con carta 3MM, aliquotata in tubi da 50 ml e conservata a -20 °C.
Soluzione di ibridazione La soluzione di ibridazione nella quale si diluisce la sonda ad RNA è composta da 50% formammide, 10% destran solfato, 1mg/ml di RNA di lievito, 1x Denhardt’s, 1x salt mix (10x salt mix: NaCl 114g/litro, TrisHC l14,04g/litro, Tris base 1,34g/litro, NaH2PO4.2H2O 7,8 g/litro, Na2HPO4 7.1 g/litro, EDTA 50 mM).
Soluzione di lavaggio per in situ La soluzione di lavaggio (hybridization wash solution) è costituita da 50% formammide e 1x SSC (0.15 M NacCl, 0.015 Na citrato).
MABT 1x Il MABT (maleic acid buffer) viene utilizzato lavaggi dell’ibridazione in situ. E’ composto da 100 mM acido maleico, 150 mM NaCl, Tween 20 0,1%, pH 7.5.
Blocking solution Si scioglie il blocking reagent Roche® al 2% in MABT 1x, si aggiunge siero di capra inattivato (NGS, 10% finale), si porta a volume con H2O e si scalda a 50 °C fino a completa dissoluzione.
Alkaline phosphatase (AP) Buffer La soluzione in cui si diluiscono i substrati cromogeni per la fosfatasi alcalina (NBT/BCIP Roche®) è costituita da NaCl 100mM, MgCl2 50mM, Tris pH9,5 100mM, Tween 20 0,1% e Levamisole 5 mM.
Soluzioni vetreria e materiale “RNase free” (RF) Quando si lavora con gli RNA si utilizzano soluzioni RF per evitare contaminazioni da RNAsi. In particolare, nel protocollo di ibridazione si utilizzano H2O e PBS 10x RF (trattati cioè con dietilpirocarbonato – DEPC – 1/1000 per alcune ore e poi autoclavate). La vetreria RF viene trattata in stufa a 180°C per almeno 4-5 ore. I puntali delle Gilson, le eppendorf, le scatoline porta vetrini vengono invece autoclavati.
2.2 Animali da esperimento
Gli animali utilizzati per gli esperimenti sono ratti maschi Sprague-Dawley (Charles River Italia) di età compresa tra i 35 e i 40 giorni. I ratti vengono mantenuti, in singole gabbie, in un ambiente controllato (21°C; umidità 60%) a cicli alternati giorno/notte di 12 ore, con cibo ed acqua sempre a disposizione.
2.3 Induzione delle crisi epilettiche negli animali
Una volta pesati, ai ratti viene somministrata una dose convulsiva (12 mg/kg) di acido kainico (KA; Ocean Produce International, Shelburne, Nova Scotia, Canada) per via intraperitoneale.
2.4 Analisi comportamentale delle crisi
I ratti trattati con KA (tipicamente, n = 8 per esperimento) vengono posti in camere di plexiglas trasparente. Due animali trattati con soluzione salina vengono utilizzati come controlli. Ciascun animale viene osservato ogni 5 minuti per un periodo di circa 4 ore dalla somministrazione di KA seguendo una scala definita da 6 stadi comportamentali (Schauwecker e Steward, 1997; Bozzi et al., 2000): stadio 0, comportamento normale; stadio 1, immobilità; stadio 2, postura rigida con estensione della coda; stadio 3, tremori (“head bobbing”, “wet dog shaker”); stadio 4, singole crisi motorie limbiche (drizzamento sulle zampe posteriori con successiva perdita di equilibrio; Limbic Motor Seizure, LMS); stadio 5, LMS ripetute (status epilepticus, SE); stadio 6, morte dell’animale. Solo gli animali che raggiungono lo stato epilettico entro 1-2 ore vengono utilizzati per gli esperimenti successivi, e divisi in due gruppi. I ratti acuti vengono sacrificati entro 3 ore dal trattamento con KA; quelli cronici vengono osservati per alcune settimane per controllare che sviluppino crisi spontanee ricorrenti, e sacrificati 5 settimane dopo il trattamento con KA.
2.5 Dissezione dei cervelli dagli animali
I ratti vengono decapitati dopo anestesia mediante iniezione intraperitoneale di cloralio idrato. I cervelli vengono espiantati, privati posteriormente del cervelletto ed anteriormente della regione compresa tra i bulbi olfattivi ed il chiasma ottico, e divisi in due parti uguali eseguendo un taglio sagittale in prossimità del seno sagittale superiore. Una metà viene inclusa in “tissue-teck (OCT)”, congelata in ghiaccio secco e conservata a -80°C; l’altra metà viene fissata in PFA 4% e conservata a 4°C fino all’utilizzo.
2.6 Dissezione di specifiche aree del cervello dagli animali
La metà di encefalo congelata a fresco in ghiaccio secco viene prelevata dal frigo a – 80°C e posta all’interno del criostato precedentemente regolato su una temperatura di - 20°C. Il tessuto già
incluso viene fatto aderire su un’apposita superficie, orientato in senso antero-posteriore e inserito nel blocco da taglio del criostato. Una volta pronto, il tessuto viene tagliato in fette coronali dello spessore di 50 µm fino alla comparsa dell’ippocampo dorsale al livello del quale, utilizzando della carta millimetrata, si effettua un’incisione con il bisturi profonda 2 mm. Seguendo con precisione il perimetro anatomico dell’ippocampo dorsale si procede alla completa asportazione dell’area sotto forma di tassello. Dopodichè l’encefalo viene pareggiato e di nuovo tagliato fino alla comparsa dell’ippocampo ventrale al livello del quale si effettua un’incisione prossimità della corteccia entorinale. Le due aree del cervello così ottenute vengono messe in tubi eppendorf’ RF ed utilizzate per estrarre l’RNA.
2.7 Estrazione di RNA
Ai tasselli di corteccia entorinale e di ippocampo viene aggiunto 1 ml (ogni 50-100 mg di tessuto) di Trizol® Reagent (Invitrogen), una soluzione di lisi contenente guanidina tiocianato e fenolo acido. Utilizzando un pestello RF, i campioni vengono poi omogeneizzati, e successivamente incubati per 5 minuti a temperatura ambiente per permettere la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici. Quindi vengono aggiunti 0,2 ml di cloroformio per 1 ml di Trizol.
Dopo incubazione di 2-3 minuti a temperatura ambiente, i campioni vengonoi centrifugati ad una velocità di 12000 x g per 15 minuti a 4 °C. Al termine della centrifugazione la fase acquosa viene trasferita in tubi puliti RF, e vengono aggiunti 0,5 ml di alcool isopropilico per 1 ml di Trizol Reagent di partenza. Dopo incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente, i campioni vengono centrifugati a 12000 x g per 10 minuti a 4° C. Rimosso il sovranatante, il pellet di RNA viene lavato con etanolo al 70% e risospeso in 100 µl di acqua RF. La purezza dell’RNA viene verificata mediante elettroforesi su gel d’agarosio e la sua concentrazione viene dosata allo spettrofotometro.
2.8 Reazione di DNAsi
Per eliminare possibili contaminazioni degli RNA da parte di DNA, i campioni sono stati trattati con DNAsi secondo quanto riportato di seguito:
RNA totale 3 μg
Perkin Elmer 10x buffer 3 μl RNAse inhibitor (40u/μl) 1 μl Invitrogen DNAsi I (10 u/ μl) 1 μl
H20 RF a volume
Volume finale 30 μl
I campioni sono stati poi incubati 30 minuti a 37° C. Successivamente sono stati aggiunti 30 µl di H2O RF, 30 µl di fenolo acido e 30 µl di cloroformio/alcool isoamilico 49:1. Dopo aver vortexato, centrifugato 5 minuti a 13000 rpm, si sono recuperati 60 µl di fase acquosa. A questo volume sono stati aggiunti 1 µl di glicogeno (10 µg/µl), 6 µl di 2M NaCl RF e 165 µl di 100% etanolo (=2,5 voll). Il volume finale della precipitazione è di 232 µl contenenti circa 3 µg di RNA totale. Gli RNA così trattati sono stati conservati a -20° C.
2.9 Reazione di RT-PCR
Dagli RNA a -20° C sono state prelevate due aliquote da 80 µl (circa 1 µg) per ogni campione in modo da avere di ognuno il controllo negativo. Dopo centrifugazione (15 minuti a 13000 rpm), il pellet è stato lavato con etanolo al 70% e risospeso in 10 µl di acqua RF. Ogni tubo contenente 1µg di RNA è stato quindi sottoposto a retrotrascrizione secondo quanto riportato di seguito: RNA totale 1 μg /10 μl 25 µM oligo dT 1 μl 10 mM dNTPs 1 μl 5x 1st strand buffer 4 μl 0,1M DTT 2 μl 5 minuti a 65° C (denaturazione)
RT RT- (controllo negativo) RNAsi out (40u/µl) 1 µl 0
Super Script RT II 1 µl 0 Volume finale 20 µl 60 minuti a 42° C (retrotrascrizione)
15 minuti a 70° C (inattivazione)
Per la reazione di PCR, sono stati utilizzati i seguenti oligonucleotidi: importina β1 di ratto(Genbank NM_017063):
rat_impβ1_short_for accaccctggtcattatgga rat_impβ1_short_revccaacacttccaccagtgtg importina α1 di ratto (Genbank NM_198726): rat_impα1_short_for ggaaatagggcacagatcca rat_impα1_short_rev gccatttagggcaactctgta
Questi oligonucleotidi permettono di amplificare rispettivamente una banda di 271 bp per l’importina β1 (compresa tra nucleotidi 1647 e 1915 della sequenza NM_017063) ed una banda di 237 bp x bp per l’importina α1 (compresa tra i nucleotidi 1102 e 1338 della sequenza NM_198726).
Come controllo interno, nelle reazioni di PCR è stato co-amplificato un gene costitutivo di riferimento, l’RNA polimerasi I. I primers utilizzati permettono di amplificare una banda di 372 bp compresa tra i nucleotidi 4062 e 4433 della sequenza di Genebank NM_031772:
rat_RNApolI4_for caggagaagtgcctgagacc rat_RNApolI4_rev ggcaccttcacctttgatgt
La reazione di PCR è stata assemblata secondo quanto riportato di seguito Ogni tubo contiene:
RT o RT-
Oligo importina_forward 10µM Oligo importina_reverse10µM Oligo gene standard_ for 10µM Oligo gene standard_ rev 10µM 10x buffer PCR
10mM dnTPs
5x Q buffer QIAGEN H2O
Hot Start Taq 5u/µl
1 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 5 µl 1 µl 5 µl 22,4 µl 0,6 µl Volume finale 50 µl
Sono stati utilizzati 3 programmi diversi di PCR che prevedevano rispettivamente 27, 30 e 33 cicli di amplificazione, ognuno costituito da denaturazione (94°C, 30 secondi), annealing (54° C, 30 secondi) e estensione (72°C, 30 secondi). Alla fine di ogni ciclo di amplificazione (27, 30, 33) sono stati prelevati 10 µl di prodotto di PCR.
2.9 Analisi densitometrica delle reazioni di RT-PCR
Al termine delle reazioni di RT-PCR, 10µl di prodotto di PCR sono stati caricati su gel di agarosio al 2% contenente bromuro di etidio. Le bande sono state visualizzate mediante UV e l’immagine fotografica della corsa elettroforetica è stata digitalizzata e caricata sul programma IMAGE J (NIH free software; http://rsb.info.nih.gov/ij/), che permette l’analisi dell’intensità luminosa delle bande. Per ogni campione, è stata calcolata l’intensità delle bande dell’importina e della RNA Polimerasi I, ed il valore di ciascun campione è stato quindi espresso come rapporto tra le intensità delle due bande (importina/RNA Pol). Sia per la corteccia entorinale che per l’ippocampo sono stati analizzati 1 campione di controllo, 1 acuto e 2 cronici.
2.10 Clonaggio del cDNA dell’importina
β
1
2.10.1 RT-PCR
Il cDNA di dell’importine beta1 di ratto è stato clonato a partire da RNA di ippocampo di un ratto. L’RNA utilizzato aveva una concentrazione pari a 1.5 µg/µl. La reazione di retro-trascrizione è stata allestita come riportato di seguito.
RNA (0,5-1 µg) 25 µM dT 10 mM dNTPs 5x 1st strand buffer 0,1M DTT 1 µl 1 µl 1 µl 4 µl 2 µl 5 minuti a 65° C (denaturazione) RNAsi out (40 u/µl)
Super Script RT II H2O RF 1 µl 1 µl 9 µl Volume finale 20 µl 60 minuti a 42° C (retrotrascrizione) 15 minuti a 70° C (inattivazione)
Il cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione è stato sottoposto ad una reazione di amplificazione secondo un protocollo di PCR “hot start” automatica. Gli oligonucleotidi usati in questa PCR sono stati disegnati in base alla sequenza di importina beta 1 di ratto Genbank NM_017063 ed amplificano una banda di 1002 bp compresa tra i nucleotidi 948 e 1950:
rat_impβ1__L_for gtccaatgtctgtgatgaggaa rat_impβ1__L_rev gctttggaacatccttaacagg
La reazione è stata assemblata a temperatura ambiente come riportato di seguito. RT Oligo rat_impβ1__L_for 10 μM Oligo rat_impβ1__L_rev 10 μM 10x PCR buffer 10 mM dNTPs 5x Q buffer QIAGEN H2O
HOT STAR Taq 5 u/μl QIAGEN
5 μl 2,5 μl 2,5 μl 5 μl 1 μl 10 μl 23,25 μl 0,5 μl
Il programma di PCR utilizzato prevede: Attivazione della Taq
Denaturazione Annealing Estensione Estensione finale 95° C 94° C 56° C 72° C 72° C 4° C 15 min 1 min 1 min 1 min 10 min ∞
La reazione di PCR è stata portata avanti per 35 cicli. 2.10.2 Eluizione da gel di agarosio
Quaranta µl del prodotto di PCR sono stati caricati su un gel preparativo di agarosio, la banda attesa è di circa 1000 bp. La banda è stata ritagliata dal gel, pesata e quindi eluita utilizzando il kit NucleoTrap® (Clontech). Per ogni 100 mg di agarosio, si aggiungono 300 µl di buffer NT1 e 4 µl di sospensione contenente la resina a cui si lega il DNA. Il campione viene poi incubato a 50° C per 10 minuti vortexando brevemente ogni 2-3 minuti durante il periodo di incubazione. Dopo centrifuga a 10000 x g per 30 secondi a temperatura ambiente, si rimuove il sovranatante e si lava il pellet con 500 µl di buffer NT2, ripetendo due volte questa operazione. Si lava poi il pellet due volte con tampone NT3, ed infine lo si risospende in 20 µl di TE IX pH 8.0. Il DNA viene eluito incubandolo a 50°C per 10 minuti. Si centrifuga quindi il campione a 10000 x g per 30 secondi a temperatura ambiente, ed il sovranatante, contenente il frammento di DNA purificato, viene trasferito in un tubo pulito. Si controllano 2 µl su gel di agarosio e si stima la concentrazione della banda.
2.10.3 Reazione di ligasi, trasformazione e screening del clonaggio per PCR Il vettore pCRII® della Invitrogen possiede alle due estremità una T in grado di appaiarsi rispettivamente alle due A inserite dalla Taq polimerasi alle estremità della banda durante la reazione di PCR. Secondo un rapporto banda/vettore pari a 2:1 è stata assemblata la reazione di ligasi come riportato di seguito.
Banda (rat_impβ1_ 1,0 Kb, 5 ng/µl) pCRII® vector lineare
10x ligasi buffer H2O T4 DNA ligasi Campione n° 1 6 µl 2 µl 1 µl 0 µl 1 µl Controllo negativo 0 µl 2 µl 1 µl 6 µl 1 µl
La reazione di ligasi viene incubata a 14°C per tutta la notte. Per avere un rapporto di 2:1 banda/vettore si tiene conto del peso molecolare medio di una base (PMm) pari a 330. Il vettore è lungo 3948 bp mentre la banda è lunga 1000 bp, quindi: PMV/PMB=(3948x330)/(1000x330) ≈ 3.
Poiché il vettore ha un peso di 50 ng, 50/3 ≈16 ng di banda, sono sufficienti per avere un rapporto di 1:1. Per avere il doppio della banda si utilizzano 6 µl della stessa, tenendo conto che la sua concentrazione è di 5 ng/µl. L’inserimento della banda nel vettore è sito-specifico. Se si verifica l’inserimento, infatti, viene interrotto il gene per la β-galattosidasi contenuto nel sito di clonaggio del plasmide. Questo enzima, utilizzando X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside) come substrato, produce una colorazione blu nelle colonie dei batteri non ricombinanti. Le colonie ricombinanti assumono invece un colore bianco, poiché in esse il gene per la β-galattosidasi è interrotto.
B
Le cellule batteriche DH5α, rese competenti, vengono sottoposte al processo di trasformazione attraverso il quale il vettore contenente la banda viene introdotto nella cellula batterica. Cinquanta µl di sospensione batterica vengono incubati per 30 minuti in ghiaccio con 5 µl di reazione di ligasi, incubati 1’30” a 42 °C per lo shock termico e successivamente sottoposte a 40 minuti di precrescita in brodo LB (LB: NaCl 5 gr/litro, bacto-triptone 10 gr/litro, estratto di lievito 5 gr/litro) senza antibiotico. Infine vengono piastrati su piastre Petri riempite di LB/agar (agar 15 gr/litro) contenente ampicillina (100 μg/ml), X-GAL (100 µl di soluzione 100 mg/ml per piastra) e IPTG (25 µl di soluzione 100 mM per piastra). L’IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) è un induttore della sintesi della β-galattosidasi. La crescita avviene a 37 °C per tutta la notte.
Per individuare il giusto orientamento in cui è stato inserito il frammento si procede con una reazione di PCR utilizzando il primer interno rat_impβ1_L_for e il primer esterno T7, presente sul
vettore. Le colonie vengono scelte dalla piastra di clonaggio. Sono state prelevate 6 colonie bianche; dopo averle passate su una piastra grigliata con celle numerate da 1 a 6, le anse sono state introdotte nelle rispettive sei provette da PCR in cui è stata assemblata la reazione come riportato di seguito.
UP Primer (T7) 10 μM
Down Primer (rat_impβ1_for) 10 μM 10x PCR Buffer
10 mM dNTPs
5x Q Buffer QIAGEN Hot Start Taq QIAGEN H2O Volume finale 1,25 μl 1,25 μl 2,5 μl 0,5 μl 5 μl 0,3 μl 14,2 μl 25 μl
I prodotti della PCR sono stati corsi su gel di agarosio osservando in alcuni di essi la presenza di una singola banda della misura attesa di circa 1000 bp.
2.10.4 Preparazione di plasmide su larga scala
Dalla piastra grigliata si preleva un’ansata del clone positivo e si inocula in 5 ml di brodo LB contenente ampicillina (1000x). L’inoculo viene incubato per 8 ore a 37 °C a 300 rpm. Si procede con una successiva diluizione della coltura primaria di 1/1000 in 50 ml di brodo selettivo LB e si continua la crescita a 37° C per 12-16 ore a in agitazione. Al termine della crescita, si raccolgono i batteri mediante centrifugazione a 6000 x g per 15 minuti a 4°C.
Per estrarre il plasmide si utilizza il kit Maxi prep QIAGEN. Il pellet batterico ottenuto viene risospeso in 4 ml di soluzione P1 e dopo vortex si ripone in ghiaccio. Si aggiungono 4 ml di soluzione P2 alcalina, si mescola delicatamente per inversione 4 o 5 volte e si lascia riposare per 4 minuti in ghiaccio. Si aggiungono 4 ml di soluzione fredda P3, si mescola immediatamente per 4 o 5 volte e si incuba in ghiaccio per 15 minuti. Si centrifuga a 20000 x g per 15 minuti a 4 °C per ottenere un sovranatante limpido contenente il DNA plasmidico. Il buffer QBT (4 ml) viene fatto adsorbire alla colonna in modo da idratarla e successivamente si carica il sovranatante sulla
colonna, che trattiene solo il DNA. Successivamente la colonna viene lavata con 2 x 10 ml di soluzione QC. Si eluisce infine il DNA dalla colonna con 5 ml di soluzione QF. Il DNA viene poi precipitato aggiungendo all’eluato 3,5 ml di isopropanolo a temperatura ambiente, e centrifugando a 15000 x g per 30 minuti a 4 °C. Il pellet viene poi lavato con etanolo al 70% e risospeso in 150 μl di Tris-EDTA a pH 8.0. La purezza della preparazione è stata controllata mediante elettroforesi su gel d’agarosio e la concentrazione del DNA plasmidico determinata allo spettrofotometro.
2.10.5 Trascrizione in vitro
Il plasmide circolare viene linearizzato con un appropriato enzima di restrizione per le successive trascrizioni in vitro. La digestione avviene in due punti differenti a seconda del tipo di sonda che si vuole ottenere. Per la sonda senso si utilizza l’enzima di restrizione BamHI, mentre per la sonda antisenso si utilizza l’enzima di restrizione XhoI. Le reazioni di trascrizione delle due sonde ad RNA marcate con digossigenina (Dig) vengono assemblate come riportato di seguito:
Sonda antisenso Impβ1/XhoI/SP6 Sonda senso Impβ1/BamHI/T7 DNA (1 μg/μl) 1 μl 1 μl 10x transcr. Buffer 2 μl 2 μl DTT 100 mM 2 μl 2 μl 10x Dig mix 2 μl 2 μl RNAsi 40 u/μl 1 μl 1 μl
RNA polimerasi 20 u/μl 2 μl 1 μl
H2O RF 10 μl 11 μl
I campioni vengono poi incubati per 2 ore a 37°C. Successivamente si aggiunge 1 μl di DNAsi I e si lascia incubare per 30 minuti a 37°C. Si precipita poi il trascritto aggiungendo 2 μl di EDTA 0,25 M, 2,5 μl di LiCl 4M, 75 μl di EtOH 100% e lasciando a -20°C per tutta la notte. Si centrifuga 15 minuti a 13000 rpm, si lava il pellet viene con etanolo 70% freddo, si centrifuga per 3 minuti alla stessa velocità e si risospende il pellet in 20 μl di H2O RF.
2.11 Ibridazione in situ
2.11.1 Espianto dei cervelli
Gli encefali utilizzati sono stati espiantati e conservati con lo stesso procedimento descritto nel paragrafo 2.5 .L’inclusione in OCT avviene in diversi modi, a seconda dell’orientamento del pezzo e in base al tipo di sezione che si vuole ottenere: coronale o sagittale.
2.11.2 Sezioni al criostato
Dopo aver prelevato i cervelli dal -80°C si ripongono per almeno 30 minuti a -20 °C e successivamente si montano sul blocco del criostato. Le sezioni, dello spessore di 20 µm, vengono raccolte su vetrini Superfrost, che sono già pronti per l’utilizzo. La raccolta delle sezioni è seriale; a seconda della grandezza del pezzo si decide il numero delle serie, ed ogni serie è contrassegnata da una lettera dell’alfabeto (A, B, C, etc.). Ogni serie è costituita da cinque o sei vetrini (A1, A2, A3, etc.). Le sezioni consecutive si raccolgono ognuna su un vetrino avente lo stesso numero di serie (A1, B1, C1, etc.) fino al completamento di tutte le serie. In questo modo ogni serie conterrà sezioni che disteranno tra loro di uno spessore costante a seconda dello spessore della singola sezione e del numero di serie. Le sezioni raccolte sui vetrini vengono fatte asciugare all’aria e quindi riposte nel frigo a -80°C fino al successivo utilizzo.
2.11.3 Pre-ibridazione
I vetrini vengono prelevati dal frigo -80 °C e lasciati scongelare a temperatura ambiente. Per i tessuti non fissati, cioè congelati freschi come in questo caso, si procede con un passaggio di post-fissazione immergendoli per 30 minuti in paraformaldeide 4% e PBS 1x. Seguono tre lavaggi in PBS 1x ognuno da 5 minuti a temperatura ambiente e successivamente si procede con un lavaggio di 5 minuti su agitatore in trietanolammina 0,1M a temperatura ambiente. A tempo scaduto nella stessa soluzione si aggiunge anidride acetica allo 0,25% lasciando in agitazione per 10 minti a
temperatura ambiente. Questo passaggio di acetilazione serve per ridurre il fondo. Dopo due successivi lavaggi in PBS 1x di 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente, i vetrini sono pronti per l’ibridazione. Tutte le soluzioni utilizzate in questa fase sono RF (paragrafo 2.1).
2.11.4 Ibridazione
Dopo aver prelevato i vetrini uno per volta dall’ultimo lavaggio in PBS, eliminando l’eccesso di liquido senza asciugare completamente le sezioni, si passa all’ibridazione. La sonda, preparata come descritto al punto 2.10.5, viene diluita a 1 ng/µl nella soluzione di ibridazione (paragrafo 2.1) e denaturata per 5 minuti a 75-85°C. A questo punto si pipettano 100 µl di sonda per vetrino, si copre con un coprioggetto e si lascia ibridare per tutta la notte in camera umida a 65°C.
2.11.5 Lavaggi
Un primo breve passaggio nella soluzione di lavaggio (paragrafo 2.1) a 65°C è sufficiente per far cadere il coprioggetto da ogni vetrino, si procede poi con due lavaggi da 30 minuti ed uno da 45 minuti a 65°C sempre nella stessa soluzione. Seguono due lavaggi in MABT 1x (paragrafo 2.1) da 45 minuti ciascuno a temperatura ambiente. A questo punto si pipettano 500 µl di soluzione blocking per vetrino e si lascia agire per 1-3 ore a temperatura ambiente e in camera umida.
2.11.6 Anticorpo primario
A tempo scaduto si diluisce 1:2000 l’anticorpo primario antidigossigenina coniugato con fosfatasi alcalina (Roche), in soluzione blocking (paragrafo 2.1) fresca e se ne pipettano 150 µl per vetrino coprendo con coprioggetto e lasciandolo agire per tutta la notte in camera umida a temperatura ambiente. L’anticorpo, infatti, in questo intervallo di tempo si lega alla digossigenina incorporata nella sonda attraverso uracili marcati al momento della trascrizione in vitro.
2.11.7 Rivelazione
Seguono tre lavaggi in MABT 1x da un’ora ciascuno a temperatura ambiente, al termine dei quali vengono poi pipettati 500 µl di soluzione AP buffer (paragrafo 2.1) su ogni vetrino per due volte ad intervalli di 10 minuti. Infine in soluzione AP buffer pulita si diluiscono i substrati cromogeni della fosfatasi alcalina (NBT/BCIP Roche, 20 µl/ml), che producono una colorazione blu visibile già dopo alcune ore. La reazione si sviluppa al buio e può procedere anche per tutta la notte.
2.12 Immunoistochimica
2.12.1 Fissazione e taglio al vibratomo
I cervelli sono stati espiantati e conservati come descritto nel paragrafo 2.5 .Prima di passare al taglio al vibratomo, vengono effettuati 3 lavaggi in PBS 1x, ciascuno di 15 minuti. Dopodichè i cervelli vengono inclusi in agarosio liquido al 2% e lasciati solidificare in ghiaccio all’interno di appositi contenitori di plastica. L’inclusione viene effettuata in base all’orientamento in cui si vuole tagliare il pezzo: antero-posteriore o postero-anteriore. Una volta che l’agarosio è polimerizzato si procede al posizionamento del pezzo sul blocco di taglio del vibratomo. Le fettine vengono tagliate di uno spessore di 100 µm e una volta liberate dall’agarosio vengono conservate a -20°C in metanolo assoluto.
2.12.2 Anticorpi
Gli anticorpi primari utilizzati sono: anticorpo monoclonale in topo anti-importina β1 MA-070 clone 3E9 (Affinity Bioreagents, Golden, CO), anticorpo per l’importinaα 1 (gentilmente fornito dal Dr. M. Kohler, Berlino); pERK 1/2 (H8159) monoclonale in topo (Sigma), anti-NeuN clone N52 (N-0142) monoclonale in topo (Sigma); anti-PV (Parvalbumina) clone PARV-19 (P3088) monoclonale in topo (Sigma); anticorpo anti-GFAP (Z334) policlonale in coniglio
(DAKO); anticorpo anti-SOM (somatostatina) policlonale in coniglio (Peninsula-Bachem, ICH 8004); anticorpo anti-NPY (neuropeptide Y) policlonale in coniglio (Peninsula-Bachem); anticorpo anti-OX42 monoclonale in topo (Pharmigen).
Gli anticorpi secondari utilizzati sono: goat anti-rabbit biotinilato (BA-1000) e anti-mouse biotinilato (BA-2001) Vectors Labs, amplificati con avidina-FITC o avidina-Cy3. Anti-mouse/rabbit Alexa 568 e 488, Molecolar Probes.
Gli anticorpi sono stati utilizzati con le seguenti diluizioni:
anti-impβ 1, 1:1000; anti-impα 1, 1:1000; anti-pERK 1/2 1:1000; anti-NeuN 1:200; anti-PV 1:5000; anti-GFAP 1:500; anti-SOM 1:5000; anti-NPY 1:5000; anti-OX42 1:500. Alexa 488 e 568 1:400; anti-mouse/rabbit biotinilati 1:500; avidina FITC o Cy3 1:1000.
2.12.3 Protocollo di immunoistochimica 2.12.3a Marcatura singola
Le fette vengono prelevate dal -20°C e reidratate mediante una serie di passaggi, ciascuno di 15 minuti, prima in metanolo al 60% e poi in metanolo al 30%. Dopodichè si effettuano tre lavaggi, di 10 minuti ciascuno, in PBS 1x. Una volta che le fette sono state lavate vengono messe in blocking (10% siero, 0,1% Triton in PBS 1x) per circa due ore a temperatura ambiente o a 4°C a seconda del tipo di anticorpo. Dopo due ore vengono messe in blocking (1% siero, 0,1% Triton in PBS 1x) al quale si aggiunge l’anticorpo primario alla giusta diluizione (vedi sopra) e si lasciano incubare tutta la notte a 4°C su bascula lenta. Il giorno seguente si effettuano 3 lavaggi di 10 minuti in PBS 1x e si rivela il segnale con anticorpo secondario, diluito in blocking, (1% siero, 0,1% Triton in PBS 1x, a seconda del tipo di anticorpo) lasciando per 2 ore a temperatura ambiente. Se la rivelazione non è diretta ma si esegue un amplificazione del segnale, dopo l’incubazione con l’anticorpo secondario si effettuano due lavaggi da 10 minuti in PBS 1x e si aggiunge il fluoroforo diluito (vedi sopra) in PBS 1x.
2.12.3.b Marcatura doppia
Se si effettuano doppie marcature avendo il primo anticorpo primario monoclonale ed il secondo policlonale, dopo aver rivelato il segnale con un anticorpo secondario diretto o indiretto si riparte dall’incubazione in blocking e si procede come descritto sopra. Se gli anticorpi primari utilizzati sono entrambi monoclonali, si segue lo stesso procedimento descritto sopra, ma dopo aver rivelato il segnale con l’anticorpo secondario si effettua un passaggio di 10 minuti in PFA al 4%, seguito da 3 lavaggi da 10 minuti in PBS 1x.
2.13 Acquisizioni al microscopio confocale
Una volta rivelato il segnale, le fettine vengono lavate in PBS 1x e poste su vetrini superfrost dove vengono lasciate tutta la notte ad asciugare a 4°C. Il giorno seguente vengono coperte con vetrino coprioggetto mediante l’aggiunta di Vectashield e chiuse con smalto trasparente.
Le acquisizioni al microscopio confocale Olympus sono state fatte ad ingrandimento primario 10x e 60x, Per ogni regione analizzata (CA1, CA3, giro dentato, corteccia entorinale) su fettine dei tre diversi gruppi sperimentali (controllo, acuto, cronico) sono stati utilizzati sempre gli stessi parametri di acquisizione (intensità del laser, offset, gain, fotomoltiplicatore, numero di scansioni, numero di sezioni ottiche sull’asse Z), in modo da poter confrontare l’intensità di segnale nei tre gruppi. Per le doppie marcature, ciascun fluorofore è stato acquisito sul rispettivo canale (verde/rosso), avendo cura di mantenere inalterato il piano focale di acquisizione nel passaggio da un canale all’altro. Le immagini ottenute sui due diversi canali sono state poi sovrapposte con Adobe Photoshop.
