LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Justas Šateika
C- REAKTYVIOJO BALTYMO KONCENTRACIJOS
KORELIAVIMAS SU LEUKOCITŲ KIEKIU SERGANČIŲ ŠUNŲ
KRAUJYJE
C- REACTIVE PROTEIN LEVEL CORRELATION WITH
LEUCOCYTES IN SICK DOGS‘ BLOOD
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Doc. dr. Vaida Andrulevičiūtė
2
DARBAS ATLIKTAS BIOCHEMIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „C- reaktyviojo baltymo koncentracijos koreliavimas su leukocitų kiekiu sergančių šunų kraujyje“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
2016-01-07 Justas Šateika (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2016-01-07 Justas Šateika (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
2016-01-07 Doc. dr. Vaida Andrulevičiūtė (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
2016-01-07 Prof. Laima Ivanovienė (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) Doc.dr. Gintaras Zamokas 2) Prof. dr. Vaidas Oberauskas
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 91.1 Ūminės fazės reakcija ... 9
1.2. Ūminės fazės baltymai ... 10
1.2.1. Ūminės fazės baltymų klasifikacija ir funkcijos ... 11
1.2.2. Ūminės fazės baltymų reikšmė klinikinėjė praktikoje ... 12
1.3 C- reaktyvusis baltymas ... 13
1.3.1 C- reaktyvaus baltymo struktūra, savybės ir funkcijos ... 13
1.3.2. C- reaktyvaus baltymo sąveika su uždegiminiais rodikliais ... 14
1.4. Šunų C- reaktyvusis baltymas ligų diagnostikoje ... 16
1.4.1 Kliniškai sveiki šunys ... 16
1.4.2 Sergantys šunys ... 17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
3. TYRIMO REZULTATAI ... 23
3.1 C- reaktyviojo baltymo ir leukocitų pasiskirstymas tarp ligų ... 24
3.1.1. Parazitinės ligos (erkių platinamos ligos) ... 24
3.1.2. Piometra ... 25
3.1.3. Pankreatitas ... 25
3.1.4. Visos kitos diagnozuotos ligos ... 26
3.2. Temperatūros pokyčiais ir jos įtaka kraujo rodikliams ... 27
3.3.1. C- reaktyviojo baltymo ir temperatūros koreliavimas... 28
3.3.2. Leukocitų kiekio ir temperatūros koreliavimas ... 28
3.4. C-reaktyviojo baltymo ir leukocitų koreliacija ... 29
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 30
5. IŠVADOS ... 32
4
SANTRAUKA
C- reaktyviojo baltymo koncentracijos koreliavimas su leukocitų kiekiu sergančių šunų kraujyje
Justas Šateika
Magistro baigiamasis darbas
Tyrimo metu buvo siekiama įvertinti sergančių šunų C- reaktyvaus baltymo koncentracijos koreliavimą su leukocitų kiekiu kraujyje, įvertinti leukocitų kiekį kraujyje ir kūno temperatūros pokyčius, kaip tradicinius uždegiminius rodiklius.
Tyrimas atliktas 2015 m. liepos mėn. – 2015 m. gruodžio mėn. Veterinarijos klinikoje UAB “Veterinarai”, kuri yra įsikūrusi Šiauliuose. Tiriami gyvūnai buvo atrinkti atsižvelgiant į jų anamnezės duomenys, klinikinio tyrimo rezultatus, didesnį dėmesį skiriant temperatūros rodikliui. Šunims kraujas buvo imamas iš priekinės kojos poodinės venos (V. cephalica) ir iš užpakalinės kojos šoninės poodinės venos (V. saphena). Kraujo buvo imama 3–5 ml į atitinkamus mėgintuvėlius su EDTA antikoaguliantu arba be antikoagulianto. Atliekami morfologiniai ir biocheminiai kraujo tyrimai. Biocheminis kraujo tyrimas buvo atliktas diagnostinėje laboratorijoje UAB “Rezus‘‘. Buvo paimta ir ištirta 14 šunų kraujo mėginiai. Kraujas buvo imamas neatsižvelgiant į šuns lytį, amžių, svorį, veislę ar kitus fiziologinius rodiklius. Atsižvelgus į gautus rezultatus ir gyvūnams nustatytas diagnozes suskirstyti į keturias grupes: parazitinės ligos (n=3), piometros (n=2), pankreatitai (n=2), kitos ligos (n=4) ir gauti rezultatai buvo lyginami su kliniškai sveikais šunimis (n=3).
Nustatyta, kad sergančių šunų C- reaktyvusis baltymas svyravo nuo 0,17 iki 32,012 mg/l. Didžiausi C- reaktyviojo baltymo koncentracijos padidėjimas buvo nustatytas šunims, kuriems buvo diagnozuota piometra (32,012 mg/l; 24,286 mg/l), pankreatitas (27,14 mg/l; 18,56 mg/l) ir babeziozės (22,425 mg/l) atveju. Tuo metu sergančių šunų leukocitai svyravo nuo 7,3 iki 30,8 x109/l. Nustatyta, kad leukocitų kiekis kraujyje labiausiai padidėjo sergant: piometra (30,8 x109/l; 25,7 x109/l), pankreatitu (26,3 x109/l). Didžiausi temperatūros šuoliai užfiksuoti sergant piometra (39,4–39,9 oC), babeziozės metu (39,7–40 oC), pankreatitu (39,5–39,7 oC). Tarp C- reaktyviojo baltymo ir leukocitų buvo nustatytas vidutinio stiprumo ryšys (r= 0,708) tarp tiriamų ligų.
5
SUMMARY
C- reactive protein level correlation with leucocytes in sick dogs‘ blood
Justas Šateika Master‘s Thesis
The study aims to evaluate C- reactive protein level correlation with leucocytes in sick dogs‘ blood, also to assess white blood cell count and body temperature changes, as the traditional indicators of inflammation.
The study was conducted in 2015 July - 2015 December at veterinary clinic UAB “Veterinarai”, which is located in Šiauliai. Animals for study were selected according to their anamnesis data, clinical trial results, a greater emphasis on the temperature indicator. Dogs blood was taken from the front legs subcutaneous vein (V. cephalic) and the rear leg side subcutaneous vein (V. saphena). 3-5 ml of blood was drawn into respective test tubes containing EDTA anticoagulant or without it. Performed morphological and biochemical blood tests. It was taken and analyzed blood samples of 14 dogs. Blood was taken regardless of the dog's sex, age, weight, breed or other physiological indicators. Taking into account the results obtained and the animals established diagnoses are divided into four groups: a parasitic disease (n=3), pyometra (n=2), pancreatitis (n=2), other diseases (n=4). The results were compared with clinically healthy dogs (n=3) blood samples.
It was found that in dogs C- reactive protein ranged from 0,17 to 32,012 mg/l. Increasing of C- reactive protein concentration in dogs diagnosed with pyometra (32,012 mg/l; 24,286 mg/l), pancreatitis (27,14 mg/l; 18,56 mg/l), babesiosis (22,425 mg/l). Meanwhile in dogs leucocytes concetration ranged from 7,3 to 30,8 x109/l. It was found that leucocytes concetration increased the most with: pyometra (30,8 x109/l; 25,7 x109/l), pancreatitis (26,3 x109/l). The highest temperature in tested dogs was recorded in animals suffering from pyometra (39,4 to 39,9 °C), babesiosis (39,7 to 40 °C), pancreatitis (39,5 to 39,7 °C). Moderate cerrelation between leukocytes and C reactive protein was set (r = 0,708) in case of investigated diseases.
6
SANTRUMPOS
AGP– α– rūgšties glikoproteinas CP– ceruloplazminas CRB– C- reaktyvusis baltymas HP– haptoglobinas IL-1– interleukinas 1 IL-6– interleukinas 6 IL-8– interleukinas 8 SAA– serumo amiloidas A SAP– serumo amiloidas P
TNF– α– naviko nekrozės faktoriaus alfa ENG– eritrocitų nusėdimo greitis
7
ĮVADAS
Uždegimas yra sudėtinga organizmo reakcija prieš patogeninius mikroorganizmus, kurie sukelia infekciją pažeidimo vietoje. Uždegimo reakcija susideda iš daugybės mechanizmų, pradedant nuo leukocitų patekimo į uždegimo vietą, baigiat patogenų sunaikinimu (1). Patekus patogeniniam mikroorganizmui ar įvykus traumai organizme įsijungia imuninė sistema ir atsiranda ūminės uždegimo fazės reakcija, kuri yra sudėtinga sistema susidedanti iš biocheminių, fiziologinių, metabolinų mechanizmų. Dar kitaip vadinama ankstyvos apsaugos sistema, kuri atsiranda po traumos, infekcijos, streso, neoplazijos ar uždegiminių procesų (2). Svarbiausias ūminės fazės reakcijos funkcija yra atkurti normalią organizmo homeostazę po atsiradusių patologinių procesų (3).
Ūminės uždegiminės reakcijos metu išskirti citokinai hepatocituose skatina ūminės fazės proteinų sintezę, kurių susidomėjimas per pastaruosius kelis dešimtmečius suintensyvėjo. Buvo nustatyta, kad atliekant jų koncentracijos nustatymus krauje, galima vertinti gyvūno sveikatos būklę ir prasidėjusius patologinius procesus (4).
Vienas iš pagrindinių ir labiausiai ištyrinėtas ūminės fazės proteinas yra C- reaktyvusis baltymas (CRB). Šis ūmios fazės proteinas – vadinamas stipraus veikimo baltymu (pagrindiniu), kurio lygis kraujyje padidėja nuo 10 iki 100 ar net 1000 kartų per keletą valandų po traumos ar infekcijos (2).
Lyginant ūmios fazės proteinus su tradiciniais uždegimo nustatymo metodais (leukocitozė, klinikiniai požymiai, eritrocitų nusėdimo greitis ir kt.) buvo padaryta išvada, kad CRB yra jautresni, platesnio diapazono ir jo koncentracija kraujyje daug greičiau padidėja uždegimo metu nei leukocitų (WBC) ar neutrofilų (5). Taip pat nustatyta, kad C-reaktyviojo baltymo koncentracija kraujyje smarkiai skyrėsi tarp skirtingų ligų. Vienų ligų metu CRB koncentracija kraujyje pakilo ženkliai, o kitų ligų padidėjo nežymiai arba išliko normos ribose, lyginant su WBC kiekiu kraujyje. (6,7).
Užsienio šalyse vis dažniau tradicinius uždegimo nustatymo metodus pakeičia serumo CRB nustatymas. Labiau išsivysčiusiose šalyse CRB koncentracijos nustatymas kraujyje vis labiau pritaikomas veterinarinėje praktikoje, kaip vienas iš pagrindinių rodiklių vertinant organizme prasidėjusius patologinius procesus. Tuo tarpu Lietuvoje CRB labiau ištyrinėtas ir pritaikytas žmonių medicinoje, o veterinarinėje praktikoje CRB nustatymas nėra pakankamai ištyrinėtas ir gan nepopuliarus, tad pagrinde taikomi tradiciniai uždegimo diagnozavimo metodai.
8
Darbo tikslas: įvertinti sergančių šunų C- reaktyvaus baltymo koncentracijos koreliavimą su
leukocitų kiekiu kraujyje.
Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie šunų serumo C-reaktyvaus baltymo koncentracijos
kitimo priežastis ir koreliacijas;
2. Atlikti sergančių šunų C-reaktyvaus baltymo tyrimus;
3. Nustatyti sergančių šunų leukocitų kiekį kraujyje ir kūno temperatūros pokyčius; 4. Palyginti C-reaktyvaus baltymo ir leukocitų koncentracijų koreliavimą ligos atveju.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Ūminės fazės reakcija
Ūmios fazės atsakas yra sudėtingas mechanizmas, kuris susideda iš: fiziologinių, biocheminių, neurohumoralinių ir metabolinių procesų (1). Gyvūno organizmui yra būdinga dviejų tipų imuninė reakcija į patologinius procesus. Viena iš jų yra specifinė imuninė reakcija, kurios metu dalyvauja antikūnai, kovojantys su patologiniais antigenais, ir kita, įgimta, nespecifinė imuninė reakcija, kuriai būdingas karščiavimas, citologinės reakcijos ir kiti požymiai. Ši įgimta, nespecifinė organizmo imuninė reakcija dar žinoma kaip ūminės fazės reakcija (4).
Ūminės fazės proteinų sintezė ir jų sudėties pokyčiai yra greiti procesai, kurie atsiranda prasidėjus ūminės fazės reakcijai. Ši reakcija pasireiškia iškart atsiradus patogeniniams pokyčiams (uždegimui, traumai, imuninės sistemos sutrikimams, bakterinei, virusinei, parazitinei infekcijai ar neoplazijai) (8).
Patekus į organizmą bakteriniams produktams putliosios ląstelės infekcijos vietoje išskiria citokinus, kurie skatina neutrofilų patekimą į pažeidimo vietą, atsiranda uždegiminė reakcija (1). Esant uždegimui, ūminės fazės atsako atsiradimą skatina išsiskyrę citokinai: interleukino 1 (IL–1), interleukino-6 (IL–6), ir auglio nekrozės faktoriaus α (TNF–α). Šiuos citokinus išskiria makrofagai ir monocitai esantys uždegimo vietoje arba prasidėjus infekcijai (9). Šiems priešuždegiminiams citokinams yra būdingas parakrininis veikimas, kuomet yra veikiamos gretimos ląstelės ir skatinamas citokinų išsiskyrimas kol galiausiai yra sukeliamas sisteminis citokinų išskyrimas. Ženkliai padidėjusi citokinų cirkuliacija kraujyje pradeda stimuliuoja hepatocitus ko pasekoje įvyksta ūminės fazės reakcija (10). Taip pat, nervinė ir endokrininė sistema turi tam tikrą įtaką ūminės fazės baltymų sintezėje per gliukokortikoidinius ir steroidinius hormonus (8). Pagrindinis ūminės fazės reakcijos tikslas yra išlaikyti normalią homeostazę ir audinių gyjimą (4).
Atsižvelgiant į ūminės fazės reakcijos sudėtingumą, kuris apima didelį kiekį fiziologinių, immunologinių, ir biocheminių reakcijų ir pokyčių, būtų galima išskirti tris pagrindines savybes, kurios turi praktinę reikšmę klinikiniu požiūriu (2).
• Ūminės fazės reakcija yra labai greita, pasireiškianti dar prieš specifinio imuniteto stimuliavimą ir daugeliu atveju prieš pirmųjų klinikinių simptomų pradžią. Todėl ūminės fazės reakciją galima laikyti kaip vieną iš pagrindinių rodiklių patologiniams procesams ar kai kurioms ligoms.
• Ūminės fazės reakcija yra nespecifinė, todėl kad ji išsivysto prie daugelio organizmo pakitimų ar atsiradus audinių pažeidimui (infekcijos, imunologiniai sutrikimai, neoplazija, traumos, ir kiti procesai sutrikdantys normalia organizmo homeostazę).
10 • Taip pat ūminės fazės reakcija yra atsakinga už ūminės fazės proteinų gamybą ir jų koncentracijos palaikymą kraujyje, priklausomai nuo gyvūno rūšies (11).
1.2. Ūminės fazės baltymai
Iki 1990-ųjų metų ūminės fazės proteinai gyvūnams buvo tiriami tik moksliniams darbams. Nuo 1991-ųjų metų ūminės fazės baltymai įgijo svarbą veterinarinėje medicinoje ir iki šios dienos yra naudojamas praktikoje, kaip vienas iš pagrindinių rodiklių identifikuoti uždegimo procesus (4,10).
Ūminės fazės baltymai – tai tokie imuninės sistemos baltymai, kurie nuolatos cirkuliuoja kraujyje ir turi glaudų ryšį su įgimta imunine sistema. Ūminės fazės proteinai daugiausia gaminami hepatocituose, tačiau gali būti sintezuojami ir kituose organizmo ląstelėse. Šių baltymų gamybą inicijuoja audinio sužalojimas, dar prieš prasidedant uždegiminei fazei (5). Taip pat nustatyta, kad ūminės fazės baltymų koncentracija kraujyje padidėja dar prieš pasireiškiant pirmiesiems ligos simptomams. Kadangi ūminės fazės baltymai priklauso nespecifinei imuninei reakcijai jie negali būti naudojami konkrečios ligos diagnozavimui, bet gali būti naudojami kaip rodiklis, kuris parodo organizme vykstančius patologinius procesus, bei kaip tinkamas įrankis sveikatos stebėjimui (4).
Daugumos ūminės fazės proteinų biocheminės struktūros ir savybės yra skirtingos, daugelis jų yra glikoproteininės kilmės. Glikozilinimo reakcija vyksta hepatocituose atsiradus ūminės fazės reakcijai. Išimtys yra CRB ir serumo amiloidas A (SAA), svarbiausi ūmios fazės proteinai, kurie nėra glikozilinti dariniai. SAA yra būdinga apolipoproteininė struktūrą ir SAA gamina ne hepatocitai, o kitos organizmo ląstelės (8).
Patekus į organizmą bakteriniams produktams putliosios ląstelės infekcijos vietoje išskiria citokinus ir kitus mediatorius (histaminą, serotoniną ir kt.), kurie skatina neutrofilų patekimą į pažeidimo vietą (1). Ūminės reakcijos atsaką sužadina monocitai ir makrofagai po sąlyčio su patogenu. Jie išskiria citokiną IL-1, endogeninį pirogeną, kuris sukelia temperatūros reakciją, skatina kitų citokinų IL-6, TNF-α sintezę. Šie citokinai patenka į kepenys ir hepatocituose skatina ūminės fazės baltymų sintezę. Tuo pačiu metu hepatocituose sumažėja kitų baltymų sintezė: albuminų, transportinių, lipoproteinų (1,10,11).
Ūminės fazės proteinų sintezė ir jų sudėties pokyčiai yra greiti procesai, kurie atsiranda prasidėjus ūminės fazės reakcijai. Ši reakcija pasireiškia iškart atsiradus patogeniniams pokyčiams (uždegimui, traumai, imuninės sistemos sutrikimams, bakterinei, virusinei, parazitinei infekcijai ar neoplazijai) (8).
11
1.2.1. Ūminės fazės baltymų klasifikacija ir funkcijos
Ūminės fazės reakcijos metu kraujo serume ar plazmoje tam tikros rūšies baltymų kiekis gali padidėti, o kitos rūšies sumažėti. Tai priklauso nuo jų specifiškumo ir atsako į patologinius procesus. Šie proteinai yra žinomi kaip ūminės fazės baltymai (12). Vieni iš šių baltymų yra proteazės inhibitoriai (α1 antitripsino, α1 antichimotripsino), kraujo krešėjimo baltymai (fibrinogenas, protrombinas), komplemento baltymai (C2, C3, C4, C5), transportiniai baltymai (haptoglobinas, ceruloplazminas, hemopeksinas) ir kitos rūšies baltymai, pavyzdžiui, C-reaktyviojo baltymo (CRB), serumo amiloidas A (SAA), serumo amiloidas P (SAP), α-rūgšties glikoproteinas (AGP) ir kiti (4).
Ūminės fazės baltymai yra skirstomi į teigiamus arba neigiamus ir pagal savo atliekamas funkcijas: (5).
• Plazminius baltymus, kurių koncentracija kraujyje padidėja per ūmios fazės reakciją (teigiami). Šiems baltymams priskiriami proteazės inhibitoriai (antitripsinas, α1-antichemotripsinas); koaguliacijos baltymai (fibrinogenas, protrombinas, plazminogenas); transportiniai baltymai (haptoglobinas (HP), hemopeksinas); kiti baltymai (CRB, SAA, AGP, CP) (4,8).
• Plazminius baltymus, kurių koncentracija kraujyje sumažėja per ūminės fazės reakciją (neigiami baltymai). Tai proteazės inhibitoriai (α1-antitrypsin); lipoproteinai (lipoproteinai su aukštu tankiu ir su žemu tankumu); kiti baltymai (albuminas, prealbuminas, transferinas) (4,8).
Serume esantys baltymai, kurių lygis padidėja nuo 10 iki 100 ar net 1000 kartų per keletą valandų po traumos, vadinami stipraus veikimo baltymais (pagrindiniai) (2). Šių baltymų didžiausia koncentracija pasiekiama po 24–48 valandų. Pagrindinių ūmios fazės baltymų koncentracija išlieka padidėjusi visą uždegimo laikotarpį, tačiau kai uždegiminis procesas blėsta, šių baltymų koncentracija labai sparčiai mažėja ir po 24–48 valandų grįžta į normą. Šunų pagrindiniai ūmios fazės baltymai yra CRB ir SAA, o kačių SAA ir AGP (2,5,8).
Baltymai, kurių kiekis didėja 2–10 kartų, o jų koncentracija sumažėja iki normalios po ilgesnio periodo vadinami vidutinio veikimo baltymais (11). Vidutiniai ūminės fazės baltymai, pasireiškus uždegimui, piką pasiekia tik po 4–7 dienų. Jų veikimas panašus į pagrindinių baltymų: padidėja atsiradus uždegiminiui stimului ir sumažėja nykstant uždegiminiam procesui. Dažniausiai katėms ir šunims matuojamas HP (2,5,8).
Baltymai, kurie nežymiai padidėja plazmoje (maždaug 2 kartus ar mažiau) yra vadinami silpno veikimo ir didesnės įtakos diagnostikoje bei gydyme neturi. Vidutinio ir silpno veikimo ūmios fazės baltymai labiau dominuoja lėtinio uždegimo metu (2). Džniausiai labiausiai ištirtas ir nustatomas CP (8).
12 Teigiami ūminės fazės baltymai yra svarbus optimizuojant ir naikinant mikroorganizmus bei jų produktus, laisvuosius radikalus, aktyvuojant komplemento sistemą, sujungiant ląstelių likučius, tokius kaip branduolinio frakcijas ir juos sunaikina, neutralizuoja proteolitinius fermentus ir dalyvauja reguliuojant šeimininko imuninį atsakas. (1,5,9,11).
E. Tirziu (8) teigimu, svarbiausios ūminės fazės proteinų funkcijos: homeostazės atkūrimas ir bakterijų vystymosi sustabdymas. Ūminės fazės proteinai kartu su audinių ir kraujagyslių ląstelėmis dalyvauja mažindami pažeidimų intensyvumą, didindami organizmo pasipriešinimą, atlieka opsonizaciją, slopina uždegimines reakcijas, dalyvauja atstatant morfopatologinius pakitimus audiniuose ir atlieka audinių apsaugą per antiproteazes. Šios funkcijos glaudžiai koreliuoja su citokinais ir kitų ląstelių išskirtais mediatoriais; Taip pat, šitie mediatoriai aktyvina paviršinius ląstelių receptorius, ko pasekoje sukeliamas sisteminis organizmo atsakas.
1.2.2. Ūminės fazės baltymų reikšmė klinikinėjė praktikoje
Remiantis atliktais tyrimais su gyvūnais buvo patvirtinta, kad ūminės fazės baltymų matavimas kraujo plazmoje ir serume gali padėti nustatyti infekcinius susirgimus, prasidėjusias uždegimines reakcijas ar kitus patologinius pakitimus (9). Ūminės fazės proteinų koncentracijai kraujyje būdingas specifiškumas tarp gyvūnų rūšių. CRB yra pagrindinis ūminės fazės baltymas, kuris nustatomas pas žmones, šunis ir kiaules, tuo tarpu atrajotojams ir katėms jo koncentracija serume pasireiškus uždegimui pakinta nežymiai. Tačiau HP yra pagrindinis ūminės fazės proteinas atrajotojų tarpe, o katėms SAA (8,10,13). Ūmios fazės baltymų gamyba ir atliekamos funkcijos yra panašios tiek šunų tiek ir kačių, tačiau yra nustatyti keli skirtumai. Pavyzdžiui HP, SAA ir AGP yra priskiriami teigiamiems ūmios fazės baltymams abiejose gyvūnų rūšyse, tuo tarpu CRB kaip teigiamas ūmios fazės proteinas priskiriamas šunims, o katėms didesnės svarbos nesudaro (3).
Kiti veiksniai įtakojantys ūmios fazės proteinų kiekį kraujyje: kai kurios šunų veislės pavyzdžiui Miniatiūriniams šnauceriams yra būdinga didesnė CRB koncentracija nei kitiems sveikiems šunims. Nustatyta, kad Greihaundams būdinga mažesnė HP ir AGP koncentracija kraujyje, lyginat su kitomis šunų veislėmis (14). Kai kurių ūminės fazės baltymų koncentracija yra mažesnė jaunesnių šunų nei suaugusių. Kalėms SAA ir CRB koncentracija kraujyje rujos metu nepakinta, tačiau HP, CP ir fibrinogeno koncentracija buvo padidėjusi nėštumo metu, lyginant su nenėščiomis kalėmis (5).
Stresas turi įtakos homeostazei, dėl ko jin sutrinka ir priveda prie imunosupresijos. Pasireiškus imunosupresijai nusilpsta gyvūno imuninė sistema ir gyvūnas tampa imlesnis uždegimui. Ištyrus transportuojamų šunų kraują pastebėta, kad padidėja ūminės fazės proteinų koncentacija kraujyje. Dėl to galima spręsti, kad gyvūnai patyrė sterą ir sutriko normali organizmo homeostazė (15). Nustatant ūminės fazės proteinus būtina vertinti ir gyvūno gerovę, ir ar aplinka
13 nesukelia gyvūnui streso. Vertinant ūminės fazės proteinus galima daug greičiau nustatyti ar nepažeidžiama gyvūno gerovė, negu pasireiškia elgesio sutrikimai (3).
Ūmios fazės baltymų koncentracija kraujyje pakyla esant bakteriniams, virusiniams, parazitiniams infekcijoms, autoimuninės sistemos sutrikimams ir pasireiškus neoplaziniams procesams (kaip limfoma) (2).
Gyvūnams ūminės fazės baltymai nustatomi: tikrinant sveikatos būklę; norint nustatyti uždegimines reakcijas ir jų intensyvumo laipsnį; stebint uždegiminį aktyvumą gydymo metu, kontroliuojant vaistų veiksmingumą; sekant pooperacinio laikotarpio metu atsiradusias komplikacijas. Paprastai ūminės fazės baltymų koncetracija pradeda mažėti po chirurginės procedūros praėjus 48–72 valandos. Jei nesumažėja, galima įtarti, kad paskirtas netinkamas gydymas ar blogai atlikta procedūra (4).
R. Bell ir C. Wilson (5) teigimu, ūminės fazės proteinų privalumai yra šie: jautrus ir labiau patikimas rodiklis ūminio ir lėtinio uždegimo metu, patikimas rodiklis atliekant pooperacinę stebėseną. Trūkumai: mažas specifiškumas diagnozuojant ligas, brangus tyrimas.
1.3 C- reaktyvusis baltymas
Pirmasis ūmios fazės baltymas – CRB – buvo nustatytas 1930 metais beždžionėms ir žmonėms, kurie buvo užsikrėtę pneumokoku ir jiems pasireiškė infekciniai požymiai (13). Jis pavadintas taip dėl jo gebėjimo sudaryti precipitatus su gramneigiamų bakterijų (pneumokokų) C grupės polisacharidu. Taip pat vėliau buvo nustatyta, kad CRB turi trauką bakterijos sienelėje esančiam fosfocholinui dėl to turi giminingą ryšį su membranos lipidais (13). Šunų analogas žmogaus CRB buvo ištirtas iš šunų serumo 1960, šunų CRB buvo izoliuotas 1970 ir nustatinėti pradėtas 1972 su specifinių antikūnų pagalba. Tačiau, šunų CRB kruopščiau buvo pradėtas tyrinėti moksliniuose darbuose nuo 1990 pradžios (16).
1.3.1 C- reaktyvaus baltymo struktūra, savybės ir funkcijos
CRB – tai yra ciklinis pentamerinis oligoproteinas, sudarytas iš penkių identiškų polipeptidinių subvienetų (monomerų) 20 kDa, susijungusių nekovalentinėmis jungtimis. Kiekvienas monomeras sudarytas iš 180 aminorūgščių. Jie sujungti taip, kad suformuotu toje pačioje plokštumoje penkiakampę figūrą, šią kombinaciją galima pamatyti naudojant elektroninį mikroskopą. Kiekvienas iš CRB subvienetų turi atskirą ligando prisitvirtinimo vietą (13). Vienintelis pagrindinis skirtumas, atrastas tarp žmogaus ir šunų CRB, yra tas, kad šunų CRB susideda iš penkių subvienetų tarp kurių du subvienetai yra glikozilinti, o kiti trys neglikozilinti ir
14 bendra baltymo molekulinė masė yra apie 100– 150 kDa (16). Tuo tarpu žmogaus CRB yra visiškai neglikozilintas, kurio bendra molekulinė masė maždaug 120 kDa (17).
Žmogaus CRB turi platų traukos diapazoną molekulėms ir turi gludų ryšį su kai kuriomis ląstelėmis. CRB ligando trauka gali būti priklausoma nuo Ca2+
jonų arba nepriklausoma nuo Ca2+ jonų arba priklausoma nuo ankstesnio ligando sudarytų ryšių. Šios CRB savybės buvo nustatytos ir šunims, tad šunų ir žmogaus CRB ypatybes galima laikyti labai panašiomis (16).
Kepenys yra pagrindinis šaltinis kuriame yra sintetinami ūminės fazės proteinai (16). Kai uždegimo ląstelės (makrofagai ar granulocitai) yra aktyvuojami uždegimo dirgiklių, pasireiškia ūminės fazės reakcija ir uždegiminės ląstelės išskiria įvairius citokinus ( IL-6, IL-8, IL-1 ir TNF- α). Šie citokinai ir ypač IL-6, skatina C-reaktyvaus baltymo gamybą kepenyse, kuris susiformuoja maždaug per 4–6 valandas. C-reaktyvus baltymas koncentracijos piką kraujyje pasiekia per 48 valandas ir pranykus uždegiminiam stimului grįžta į normalų lygį per 1–2 savaites (16,17). IL-1 ir TNF-alfa, taip pat priskiriami prie pagrindinių citokinų kurie iš dalies skatina CRB sintezę kepenyse. Šie citokinai veikdami atskirai nesugeba sužadinti ūmios fazės proteinų sintezę kepenyse, tačiau jie dalyvauja kaip pagalbiniai stimuliatoriai (16).
CRB yra gaminamas hepatocituose, kaip atsakas į uždegiminius dirgiklius (audinių pažeidimą ar infekcijas) (17). CRB dalyvauja reguliuojant tam tikrų ląstelių veikla ir jų funkcijas. Dažniausiai CRB funkcija yra aktyvuoti kitų ląstelių veiklą, tačiau taip pat gali ir stabdyti (16). CRB poveikis įvairioms uždegiminėje reakcijoje dalyvaujančioms ląstelėms: monocitus ir makrofagus aktyvuoja per opsonizacijos reakciją, skatina chemotaksį, padidina endotelio adheziją; neutrofilams slopina jų chemotaksį, slopina degranuliaciją, slopina endotelinę adheziją; aktyvuoja kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles (11,16,17).
1.3.2. C- reaktyvaus baltymo sąveika su uždegiminiais rodikliais
Klinikiniai uždegimo požymiai. Uždegimas – tai sudėtinga organizmo apsauginė reakcija
prieš patogeninius mikroorganizmus, kuri pasireiškia funkciniais, morfologiniais ir imuninias pokyčiais ląstelėse ir kraujagyslėse (8). Pagrindiniai klasikiniai uždegimo sukeliami simptomai: paraudimas, patinimas, temperatūros pakilimas, skausmas ir funkcijos praradimas (1).
Uždegimo metu yra išskiriama apie 15 skirtingos molekulinės masės citokinų iš aktyvuotų leukocitų ir yra atsakingi už ūmios fazės reakcijos atsaką, kuri pasireiškia padidėjusia temperatūra, leukocitoze, padidintos adrenokortikotropinių hormonų sekrecijos ir ūminės fazės baltymų gamyba (1).
Svarbiausias uždegiminės reakcijos simptomas – temperatūra. Ūminės fazės reakcija sužadina endogeninių pirogenų sintezę neutrofiluose, monocituose, makrofaguose. Pirogeniniu poveikiu
15 pasižymi IL-1, IL-6, TNF-α, interferonai α ,β ir γ. Šie citokinai veikia simpatinį pagumburio centrą, kuris reguliuoja temperatūros kitimą (10).
Buvo atliktas mokslinis tyrimas kurio metu buvo lyginama kūno temperatūra ir CRB koncentracija kraujyje. Šio tyrimo metu buvo ištirti 825 šunys. Nustatyta, kad tarp temperatūros ir CRB koncentracijos koreliacijos nebuvo. Buvo lyginamos dvi gyvūnų grupės norint įvertinti CRB koncentraciją. Gyvūnai suskirstyti į dvi grupes: pirmoji grupė su padidėjusia temperatūra (83 šunys), antra grupė be temperatūros pokyčių (773 šunys). Nustatyta, kad CRB koncentracija kraujyje buvo žymiai didesnė pirmoje grupėje, kadangi temperatūros pokyčiai dažniausiai pasireiškia prasidėjus uždegiminiam procesams (6).
Kiti ūminės fazės proteinai. Gyvūnų rūšims yra būdinga ūminės fazės baltymų variacija,
pavyzdžiui šuniui ir kiaulei CRB yra priskiriamas prie pagrindinių ūminės fazės baltymų ir jo koncentracija serume gali greitai padidėti nuo 5 mg/l iki 100 mg/l ar net daugiau. Kitų rūšių gyvūnams, tokiems kaip galvijai ir katės buvo nustatyta, kad CRB ligų atveju padidėja nežymiai ir nėra labai patikimas rodiklis norint nustatyti uždegiminius procesus organizme (13).
Pagrinde šunų diagnostikoje ir gydyme yra nustatomas CRB, tuo tarpu kiti ūminės fazės baltymai, tokie kaip SAA, HP ar fibrinogenas nustatomi daug rečiau. Šis baltymas pasirinktas dėl savo jautrumo uždegiminiam procesui, kadangi jo koncentracija serume padidėja nuo 10 iki 100 ar net 1000 kartų per keletą valandų po traumos (2,17).
Mokslininkai atlikę tyrimus padarė išvadą, kad ūminės fazės proteinai yra daug labiau jautresni negu tradiciniai metodai (leukocitų nustatymas kraujyje, somatinių ląstelių skaičiaus nustatymas piene ir kt.) norint nustatyti uždegimines reakcijas. Taip pat Pradeep teigia, kad norint gauti patikimesnius rezultatus reikėtų tirti ne vieną, bet kelis ūmios fazės proteinus (4).
Eritrocitų nusėdimo greitis. Eritrocitų nusėdimo greitis (ENG) priklauso nuo pačių
eritrocitų ir plazmos fizinių bei cheminių savybių. Uždegimo reakcijos metu pakinta plazmos kiekis, dėl to kad padidėja baltymų (fibrinogeno, globulino) kiekis plazmoje. ENG greitėja, nes baltymai veikia eritrocitų membranos molekules, dėl to sumažėja jų paviršiaus krūvis ir jie agreguojasi. Taip būna sergant infekcinėmis ligomis ar pasireiškus uždegiminiam procesui (17,18).
Prasidėjus uždegimui ENG padidėja praėjus 2–4 dienom, lyginant su CRB, kurio koncentracija kraujyje padidėja po 2–4 valandų. Taip pat ENG nėra patikimas rodiklis kuomet uždegimo procesas pažeidžia eritrocitus. Buvo atlikta studija šunų babeziozės atveju, kuri parodė kad CRB koncentracijos nustatymas buvo optimalesnis testas negu ENG, kontroliuojant šios ligos eigą ir gydymo tikslumą (17,19).
Leukocitai. Uždegimas yra sudėtinga organizmo reakcija prieš patogeninius
16 daugybės mechanizmų, pradedant nuo leukocitų patekimo į uždegimo vietą, baigiant patogenų sunaikinimu (1).
Leukocitai (WBC) – tai kraujo ląstelių tipas, kurių sudėtyje nėra hemoglobino, todėl jos bespalvės, turi segmentuotą branduolį ir yra judrios. WBC yra didesni negu eritrocitai, o jų koncentracija kraujyje mažesnė ir padidėja uždegimo metu. Pagrindinė funkcija kovoti ir pašalinti į organizmą patekusius patogenus. WBC skirstomi į granuliocitus (citoplazmoje matomos granulės) ir agranuliocitus (citoplazmoje granulių nėra). Granuliocitai dar skirstomi į tris rūšis: neutrofilus, bazofilus ir eozinofilus. Agranuliocitams priskiriami limfocitai (T ir B limfocitai) ir monocitai (20).
Buvo atliktas tyrimas, kurio metu naudojant imunoturbidimetrijos metodą buvo nustatomas CRB kiekis kraujo serume. Šio tyrimo metu buvo ištirti 67 atvejai, kuriems buvo pasireiškė uždegiminiai procesai. Tyrimas parodė reikšmingą tačiau silpną koreliaciją tarp CRB koncentracijos ir neutrofilų skaičiaus. Pateikus išvadas buvo nustatyta, kad CRB diapazonas didesnis nei neutrofilų skaičiaus ir dėl to CRB tyrimas gali būti daug aktualesnis ir patikimesnis uždegiminės reakcijos metu (2,10).
Ūmios fazės proteinai yra jautresni, platesnio diapazono ir jų koncentracija kraujyje daug greičiau padidėja uždegimo metu nei leukocitų ar neutrofilų. Buvo nustatyta, kad kraujyje cirkuliuojantys ūmios fazės proteinai yra šešis kartu jautresni už leukocitus nustatant uždegimines reakcijas ankstyvoje stadijoje (5). Mokslininkai atliko ekspermentą, kurio metu tyrimui buvo paimta devyni šimtai sergančių šunų su uždegimo požymiais. Buvo nustatyta, kad C-reaktyvaus baltymo koncentracija smarkiai koreliavo tarp ligų, o tuo tarpu leukocitų koreliacija buvo nežymi arba visai jos nebuvo (6,7).
Taip pat buvo atlikta studija, kurios metu buvo stebėta CRB koncentracija kraujyje pooperaciniu metu. Buvo stebimos kalės, kurioms buvo atliktos gimdos šalinimo operacijos dėl pasireiškusios piometros. Pagrindinis stebėjimo tikslas buvo atsižvelgiant į CRB koncentraciją kraujyje nustatyti ar įvyko pooperacinės komplikacijos. Buvo padaryta išvada, kad esant žaizdos užkrėtimui CRB koncentracija kraujyje išlieka padidėjusi visą infekcijos laikotarpį, tik pradėjus gydymą buvo pastebėtas baltymo sumažėjimas. Tuo metu leukocitai neparodė didesnio jautrumo nei įprasta, dėl to galima teigti, kad CRB yra daug jautresnis vertinant uždegimines reakcijas (5).
1.4. Šunų C- reaktyvusis baltymas ligų diagnostikoje
1.4.1 Kliniškai sveiki šunysBuvo atlikti tyrimai su sveikais šunimis norint nustatyti CRB koncentraciją kraujyje atsižvelgiant į gyvūno lytį, amžių, veislę, kalių nėštumą. CRB koncentracija sveikų šunų kraujyje buvo labai žema arba nebuvo užfiksuota, lyginant su sergančiais šunimis. Taip pat buvo nustatyta,
17 kad taikant skirtingą CRB nustatymo metodą skyrėsi sveikų šunų normos diapazonas (16). V. M. Wong (14) teigia, kad vienas iš veiksnių, kuris gali įtakoti nežymų CRB koncetracijos padidėjimą yra šunų veislė. Kai kurios šunų veislės pavyzdžiui Miniatiūriniams šnauceriams yra būdinga didesnė CRB koncentracija nei kitiems sveikiems šunims.
Amžius ir lytis neturi didesnės įtakos CRB koncentracijai kraujyje, tačiau CRB, kaip jautrus rodiklis uždegiminiams procesams, nėra rekomenduojamas tirti jaunesniems kaip trijų mėnesių amžiaus šunims, dėl jų nepilnai išsivysčiusios imuminės sistemos (11,16,17).
Tirta CRB koncentracija rujojančių ir nėščių kalių kraujuje. Nustatyta, kad nėščių kalių kraujyje CRB padidėjo praėjus 21–55 dienų po ovuliacijos, lyginant su nenėščiomis kalėmis toje pačioje stadijoje po ovuliacijos. Buvo padaryta išvada, kad CRB padidėjimui įtakos turėjo uždegiminės reakcijos pasireiškimas embriono implantacijos gimdoje metu (16,21).
Labai aktyviems šunims ar intensyviai juos treniruojant, buvo nustatyta padidėjusi CRB koncentracija kraujyje, dėl organizme susikaupusiu metabolizmo produktų ir prasidėjusios sisteminės uždegiminės reakcijos (17). Tuo tarpu per pastaruosius 50 metų, nutukimo paplitimas progresyviai didėjo tarp kompanijos gyvūnų ir su nutukimo padidėjimu atsiranda vis daugiau medžiagų apykaitos ligų (diabetas ir kt.) (22). Trumpalaikis nutukimas CRB koncetracijai įtakos neturėjo, tačiau šunims, kuriems yra išsivystęs ilgalaikis nutukimas dėl blogos mitybos ar medžiagų apykaitos sutrikimų CRB koncentracija kraujyje sumažėjo, lyginant su sveikais šunimis (17). Nutukusių žmonių CRB koncentracija yra padidėjusi, o tuo tarpu šunų sumažėjusi. Manoma, kad CRB koncentarcijos sumažėjimui įtakos turėjo nutukusiems šunims padidėjęs trigliceridų kiekis kraujyje ir hepatocitų disfunkcija (22).
1.4.2 Sergantys šunys
Šunims CRB yra pagrindinis ūmios fazės proteinas, kuris naudojamas kaip rodiklis identifikuoti sisteminį uždegimą ar infekcijas (4). Pasireiškus patologiniam procesui šių baltymų lygis padidėja nuo 10 iki 100 ar net 1000 kartų per keletą valandų. Šių baltymų didžiausia koncentracija pasiekiama po 24–48 valandų (2).
Šunų CRB padidėja esant infekcinėms ligoms, tokioms kaip babeziozė, leišmaniozė, leptospirozė, parvovirusinis enteritas, tripanosomozė, patekus Bordetella bronchiseptica, Ehrlichia canis, ir Escherichia coli mikroorganizmams, išsivysčius sepsiui. Taip pat padidėja pasireiškus uždegiminėms žarnyno ligoms, ir hematologinių ir navikinių ligų metu (13).
M. Nakamura (6). atlikęs tyrimą, ligas suskirtė į dvi grupes: ligos be CRB pokyčių kraujyje ir ligos su padidėjusia CRB koncentracija.
18 • Neurologinės ligos: epilepsija, Atlanto-ašinio slankstelio išnirimas, smegenų vandenė,
nekrozinis meningoencefalitas, smegenų navikas (3,6);
• Endokrininės ligos: hipotiroidizmas, hiperadrenokorticizmas, hipoadrenokoticizmas, diabetas (3,6);
• Respiracinės ligos: rinitas, alerginis rinitas, alerginis bronchitas, bronchitas (6,23);
• Kitos ligos: akmenligė, mitralinio vožtuvo nepakankamumas, trachėjos kolapsas, lejomiosarkoma (6).
Ligos, kurių metu CRB koncentracija ženkliai padidėja, yra skirstomos į: uždegimines, bakterines, virusines, parazitines, navikines ir autoimunines (3). Taip pat CRB koncentracija kraujyje padėta stebėti pooperacinio laikotarpio metu atsiradus komplikacijoms ir žaizdos gyjimui (4).
Uždegiminiai procesai. Šiems procesams priskiriamos, tokios ligos kaip: ūminis
pankreatitas, poliartritas, piometra, uždegiminės virškinimo trakto ligos, sisteminio uždegiminio atsako sindromas (sepsis) (6,24,25).
Bakterinės kilmės ligos. Pagrindiniai patogeniniai mokroorganizmai, kurie turėjo ryšį su
CRB ir buvo išskirti iš sergančių gyvūnų organizmo: Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Leptospira interrogans (6,26).
Virusinės kilmės susirgimai. CRB koreliavimas su virusinės kilmės ligomis, yra
nepakankamai ištirtas. Didžiausio dėmesio susilaukė parvovirusinis enteritas (6,27).
Parazitinės ligos. Vis didesnio dėmesio susilaukia parazitinės kilmės ligos. Daugiausiai
tyrimų buvo atlikta babeziozė atžvilgiu. Šunų babeziozės atveju serumo CRB yra žymiai padidėję, o serumo HP koncentracija yra žymiai sumažėjusi, lyginant su sveikų šunų krauju (4,19). Taip pat nustatyta CRB koncentracijos pokyčiai oraganizme sergant: tripanosomozė, anaplazmozė, užsikrėtus Erlichia canis, Leishmania infantum (28).
Navikiniai procesai. Kai kurios neoplazijos sukelia uždegimines reakcijas dėl audinių
pažeidimo arba priešuždegiminių citokinų gamybos (29). Padidėjusi CRB koncentracija buvo užfiksuota keliuose neoplazijos tipuose, kurios paveikia sisteminius organus. Didžiausia padidėjimas tarp leukemijos, limfomos, hemangiosarkomos (6,17,29). Taip pat buvo nustatyta, kad CRB padidėja prie putliųjų lastelių naviko (mastocitomos), sarkomos (30). CRB koncentracijos padidėjimas kalėms su pieno liaukos naviku buvo užfiksuotas tik tų šunų, kuriems pasireiškė karcinoma, metastazės, naviko skersmuo buvo didesnis negu 5cm. ir pasireiškęs opėjimas (31,32).
Chirurginės intervencijos. Baltymo tyrimas gali būti naudojamas ir ligų atsekamumui. Be to
CRB gali būti stebimas ir pooperaciniu laikotarpiu. Po operacijos, CRB koncentracija didžiausią lygį pasiekia antroje ar trečioje dienoje ir, jei baltymas pradeda normalizuotis, galima teigti, kad procedūra praėjo sklandžiai ir papildomo gydymo antibiotikais neprireiks (17). Mokslininkai atlikto
19 tyrimą, kurio metu buvo tiriami šunys po atliktų chirurginių procedūrų ir kuriems nepasireiškė pooperacinės komplikacijos. Nustatyta, kad CRB koncentracija kraujyje buvo padidėjusi nuo vienos iki dviejų dienų po operacijos, bet koncentracija žymiai sumažėjo praėjus dešimt dienų po operacijos (5).
Ūminės fazės proteinai yra daug labiau jautresni negu tradiciniai metodai (leukocitų nustatymas kraujyje, somatinių ląstelių skaičiaus nustatymas piene ir kt.) norint nustatyti uždegimines reakcijas. Todėl CRB nustatymas šunų ligos atveju galėtų būti greitas ir informatyvus metodas klinikinėje praktikoje vertinant uždegimo procesą ir ligas, atliekant monitoringą, stebint paskirto gydymo efektyvumą, antibiotikų veiksmingumą, uždegiminių ligų atsaką į steroidų terapiją ir komplikacijų atsiradimą pooperacinio periodo metu.
20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tyrimas atliktas 2015 m. liepos mėn. – 2015 m. gruodžio mėn. Veterinarijos klinikoje UAB “Veterinarai”, kuri yra įsikūrusi Šiauliuose. Veterinarijos klinika UAB “Veterinarai” yra privati veterinarijos gydykla, įkurta laikantis Lietuvos Respublikos įstatymų. Veterinarijos klinikoje dirba direktorius, kuris taip pat eina veterinarijos gydytojo pareigas, trys privatūs veterinarijos gydytojai, vienas veterinarijos felčeris bei jiems asistuoja praktiką atliekantys II – VI kurso studentai. Klinikos patalpos susideda iš laukiamojo, procedūrinio ar apžiūros patalpos ir operacinės. Klinikoje atliekamos šios paslaugos: gyvūnų apžiūra ir konsultacija; ligų diagnostika ir gydymas; chirurginės procedūros; laboratoriniai tyrimai (morfologinis ir biocheminis kraujo tyrimai ir kt.) ir kitos paslaugos.
Visi tyrimai buvo atliekami vadovaujantis Lietuvos Respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymu (Žin., 1997, Nr. 108-2728; 2001, Nr. 99-3521; 2003, Nr. 74-3418; 2012, Nr. 122 – 6126).
Į kliniką pristatyti šunys dėl konsultacijos, gydymo ar tyrimų atlikimo buvo registruojami pacientų registracijos žurnale. Padedant gydytojui, iš šeimininkų buvo surinkta išsami anamnezė apie gyvūną. Vėliau atliktas klinikinis tyrimas: gyvūnas apžiūrėtas, pamatuota temperatūra, atlikta auskultacija, apžiūrėtos gleivinės, suskaičiuoti širdies ir kvėpavimo dažniai ir įvertinta gyvūno būklė.
Tiriami gyvūnai buvo atrinkti atsižvelgiant į jų anamnezės duomenys, klinikinio tyrimo rezultatus, didesnį dėmesį skiriant temperatūros rodikliui. Kraujas imamas laikantis aseptikos ir antiseptikos reikalavimų. Gyvūnas buvo atitinkamai fiksuojamas. Galūnė kraujo paėmimo vietoje nuskutama ir tuomet dezinfekuojama spiritiniu tirpalu. Šunims kraujas buvo imamas iš priekinės kojos poodinės venos (V. cephalica) ir iš užpakalinės kojos šoninės poodinės venos (V. saphena). Galūnė aukščiau kraujo paėmimo vietos buvo suveržiama žgutu. Kraujo buvo imama 3–5 ml. Naudojantis sterilia adata, kraujagyslė buvo pradurta ir kraujas surinktas į atitinkamus mėgintuvėlius su EDTA antikoaguliantu arba be antikoagulianto. Adata ištraukiama ir dūrio vieta prispaudžiama vata, suvilgyta spiritiniame tirpale, kol nustos kraujuoti. Mėgintuvėliai su antikoaguliantais paėmus kraują buvo vartomi rankoje, kad antikoaguliantas susimaišytų su krauju.
Morfologinis kraujo tyrimas. Šiam kraujo tyrimui atlikti buvo naudojamas kraujas surinktas
į mėgintuvėlius su EDTA. Kraujo tyrimas buvo atliktas su klinikoje esančiu švedų gamybos hematologiniu analizatorius “EXIGO”, kuris pritaikytas veterinarinei diagnostikai. Šis aparatas yra skirtas tik klinikinei veterinarijai ir atitinka gyvūnų kraujo komponentus. Šis aparatas nustato: WBC, neutrofilų, eozinofilų, monocitų, limfocitų kiekį kraujyje, taip pat eritrocitus, hemoglobiną, hematokritą, trombocitus ir kitus kraujo parametrus. Tačiau pagrindinis dėmesys buvo skiriamas WBC kiekiui kraujyje. Pagal“EXIGO” hematologinio analizatoriaų WBC norma yra 6–17 (x109/l).
21
Biocheminis kraujo tyrimas. Šiam kraujo tyrimui atlikti buvo naudojamas kraujas surinktas
į mėgintuvėlius su EDTA ir mėgintuvėliai be antikoagulianto. Kraujo tyrimas buvo atliktas diagnostinėje laboratorijoje UAB “Rezus‘‘, kuri yra įsikūrusi Šiauliuose. Su šia laboratorija veterinarijos gydykla turi pasirašius sutartį dėl biocheminių kraujo parametrų nustatymo. Laboratorijoje biocheminiams rodikliams nustatyti naudojamas “Olympus‘‘ analizatorius. Šis aparatas matuoja biocheminius ir imunologinius parametrus.
Tyrimo metu CRB buvo nustatomas naudojantis šio analizatoriaus pagalba. CRB nustatymas “Olympus‘‘ analizatoriumi yra paremtas imunoturbidimetrijos metodu ir naudojamas identifikuoti žmonių CRB. Tačiau buvo atlikti moksliniai tyrimai, kurių metu šunų kraujas buvo tiriamas šio metodo pagalba ir nustatyta, teigiama kryžminė reakcija tarp šunų serumo CRB ir žmonių CRB. Padaryta išvada teigė, kad šunų CRB galima matuoti ir nustatyti jo koncentracijos padidėjimą kraujyje naudojantis žmonių CRB nustatymui pritaikytus metodus. (33,34,35,36). Tad kaip M. Kjelgaard-Hansen teigė, šunų CRB struktūrą, savybės ir funkcijas galima laikyti labai panašiomis į žmogaus CRB ir jų nustatymui tinka vienodi diagnostiniai metodai (16).
Tyrimo metu buvo paimta ir ištirta 14 šunų kraujo rodikliai. Gyvūnai buvo atrenkami pagal jiems pasireiškusius klinikinius požymius. Pirmiausia buvo atliekamas kraujo morfologinis tyrimas ir įvertinami gauti rodikliai, paskelbiama preliminari diagnozė ir vėliau kraujo mėginys siunčiamas į diagnostikos laboratorija UAB “Rezus‘‘ nustatyti CRB ir reikalui esant kitus kraujo biocheminius parametrus. Detalesni duomenys apie šunų lytį, veislę, amžių ir diagnozę pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Bendri duomenys apie šunis
Šunys Diagnozė Veislė Lytis Amžius (metais)
Nr. 1 Apsinuodijimas Mišrūnas kalė 9
Nr. 2 Pankreatitas Vokečių aviganis šuo 10
Nr. 3 Pankreatitas Mišrūnas kalė 5
Nr. 4 Piometra Pekinas kalė 8
Nr. 5 Piometra Mišrūnas kalė 3
Nr. 6 Akmenligė Prancūzų buldogas šuo 3
Nr. 7 Demodekozė Vokečių aviganis šuo 3
Nr. 8 Navikinis procesas Mišrūnas kalė 4
Nr. 9 Babeziozė Labradoro retriveris kalė 9
Nr. 10 Babezioze Mišrūnas kalė 4
Nr. 11 Trauma Taksas šuo 1
Nr. 12 Kliniškai sveikas Vokečių aviganis šuo 5
Nr. 13 Kliniškai sveikas Mišrūnas šuo 2
22 Atsižvelgus į gautus rezultatus ir gyvūnams nustatytas diagnozes suskirstyti į keturias grupes: parazitinės ligos (n=3), piometros (n=2), pankreatitai (n=2), kitos ligos (n=4) ir gauti rezultatai buvo lyginami su kliniškai sveikais šunimis (n=3). Parazitinėms ligoms priskiriami šunys, kuriems nustatytos babeziozės atvejai (n=2) ir demodekozė (n=1). Prie kitų ligų buvo priskirtos apsinuodijimas (n=1), šlapimo takų akmenligė (n=1), pieno liaukos navikas (n=1), trauma (n=1). Kliniškai sveikiems arba kontrolinei grupei priskirti tie gyvūnai kurių kraujo rodikliai nebuvo nukrypę nuo normos ribų ir nepasireiškė didesni temperatūros šuoliai.
Gautų rezultatų apdorojimui lentelėms, diagramoms ir visiems apskaičiavimai buvo pasirinkta Microsoft EXCEL 2010 programa. Buvo apskaičiuojamas koreliacijos koeficientas naudojantis ,,CORREL‘‘ funkcija, taip pat apskaičiuojami kai kurių reikšmių vidurkių santykinė paklaida ir patikimumai.
23
3. TYRIMO REZULTATAI
Tyrimo metu į kliniką atvesti šunys buvo atrinkti atsižvelgiant į jų anamnezės duomenys, klinikinio tyrimo rezultatus, didesnį dėmesį skiriant temperatūros rodikliui. Kadangi esant padidėjusiam temperatūros rodikliui galima įtarti, kad organizme prasidėjo uždegiminiai procesai. Buvo paimta ir ištirta 14 šunų kraujo mėginiai. Kraujas buvo imamas neatsižvelgiant į šuns lytį, amžių, svorį, veislę ar kitus fiziologinius rodiklius.
Pagal lytį paimti kraujo mėginiai pasiskirstė: kalės sudarė 57 proc. (n=8), šunys sudarė 43 proc. (n=6). Amžius svyravo nuo 1–10 metų, paskaičiavus amžiaus vidurkis sudarė 5,2 ± 0,84. Iš veislių labiausiai dominavo mišrūnai (n=6), kitos veislės pasiskirstė apylygiai. Kiti parametrai nebuvo nustatinėjami, kadangi neturėjo įtakos atliekamiems tyrimams.
Remiantis gautais rezultatais ir nustatyta diagnoze šunys buvo suskirstyti į 4 grupes: parazitinės ligos (n=3) ; piometros (n=2); pankreatitai (n=2) ir visos kitos ligos (n=4). Visos grupės buvo lyginamos su kliniškai sveikų šunų (n=3) ištirtu krauju (2 lentelė). Kliniškai sveikų šunų buvo išvesti CRB (0,083 ± 0,005 mg/l) ir WBC (12,5 ± 1,2 x109
/l) vidurkiai ir gautas bendras vidurkis lyginamas su sergančiais šunimis. Pagrindinis dėmesys skiriamas CRB ir WBC pasireiškimui sergančių šunų kraujyje.
2 lentelė. CRB ir WBC pasiskirstymas tarp diagnozių (norma CRB <5mg/l; WBC 6–17 x109/l)
Šuo Įtariama diagnozė CRB (mg/l) WBC (x109/l)
Nr. 1 Apsinuodijimas 0,17 17,3 Nr. 2 Pankreatitas 18,56 25,6 Nr. 3 Pankreatitas 27,14 26,3 Nr. 4 Piometra 24,286 25,7 Nr. 5 Piometra 32,012 30,8 Nr. 6 Akmenligė 0,89 18 Nr. 7 Demodekozė 6,687 17,8 Nr. 8 Navikinis procesas 0,94 17,6 Nr. 9 Babeziozė 22,425 11,8 Nr. 10 Babeziozė 3,101 7,3 Nr. 11 Trauma 11,15 19 Nr. 12 Kliniškai sveikas 0,09 16,5 Nr. 13 Kliniškai sveikas 0,08 7,1 Nr. 14 Kliniškai sveikas 0,08 14,1
Tiek CRB, tiek WBC koncentracijos padidėjo šunims kurie sirgo piometra (šuo Nr. 5: CRB– 32,012 mg/l; WBC– 30,8 x109/l ir šuo Nr. 4: CRB– 24,286 mg/l; WBC– 25,7 x109/l), abiejų pankreatitų metu (šuo Nr. 2: CRB– 18,56 mg/l; WBC– 25,6 x109/l ir šuo Nr. 3: CRB– 27,14 mg/l; WBC– 26,3 x109/l) ir traumos metu (šuo Nr. 11: CRB– 11,15 mg/l; WBC– 19 x109/l).
24 CRB koncentracija išliko normos ribose, tačiau WBC kiekis kraujyje padidėjo kai šunims pasireiškė: apsinuodijimas (šuo Nr. 1: CRB– 0,17 mg/l; WBC– 17,3 x109
/l); sergant šlapimo takų akmenligę (šuo Nr. 6: CRB– 0,89 mg/l; WBC– 18 x109/l), demodekozė (šuo Nr. 7: CRB– 6,687
mg/l; 17,8 x109/l) ir navikinis procesas (šuo Nr. 8: CRB– 0,94 mg/l; 17,6 x109/l).
WBC kiekis kraujyje išliko normos ribose, o CRB koncentracija padidėjo: pasireiškus babeziozei (šuo Nr. 9: CRB– 22,425 mg/l; WBC– 11,8 x109/l).
CRB ir WBC normos ribose išliko šunims kurie buvo pripažinti kliniškai sveikais ir babeziozės atveju kuomet nei vienas iš rodiklių neviršijo normos (šuo Nr. 10: CRB– 3,101 mg/l; WBC– 7,3 x109/l).
3.1 C- reaktyviojo baltymo ir leukocitų pasiskirstymas tarp ligų
3.1.1. Parazitinės ligos (erkių platinamos ligos)Lyginant sergančius ir kliniškai sveikų šunų vidurkį pastebėta, kad CRB nustatymas babeziozės atveju yra daug aktualesnis negu WBC kiekio nustatymas, kadangi CRB yra daug jautresnis ir didesnio diapazono nei WBC (pav. Nr 1). Tuo tarpu demodekozės metu CRB neparodė didesnio koncentracijos pakitimo, lyginant su WBC.
CRB koncentracija ženkliai padidėjo šuns Nr. 9 kraujyje 22,425 mg/l, kuriam nustatytas babeziozės atvejis, tuo tarpu WBC išliko normos ribose 11,8 x109
/l, tuo tarpu Nr. 10 šuns babeziozės atveju CRB ir WBC koncentracija išliko normos ribose 3,101 mg/l; 7,3 x109
/l. Tai galėjo įtakoti, kad šuo į kliniką buvo atvestas jau ligai pažengus ir perėjus į lėtinę formą. Demodekozės atveju (šuo Nr. 7) CRB padidėjo iki 6,687 mg/l, o WBC padidėjo iki 17,8 x109
/l.
1 pav. CRB ir WBC kiekio pasiskirstymas kraujyje tarp parazitinių ligų ir kliniškai sveikų
šunų (norma CRB <5mg/l; WBC 6–17 x109 /l) 6,687 22,425 3,101 0,083 0 5 10 15 20 25 CR B m g/ l Šunų ligos 17,8 11,8 7,3 12,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 WBC x10 9/l Šunų ligos
25
3.1.2. Piometra
Lyginant kales, kurioms nustatyta piometra su kliniškai sveikų šunų vidurkiu galima teigti, kad tiek CRB, tiek ir WBC parodė didelį sisteminį organizmo uždegimą (P>0,05)(pav. Nr. 2).
Abiejų kalių, sirgusių piometra, kraujyje padidėjo tiek CRB koncentracija, tiek WBC kiekis. Abiem atvejais kraujo rodikliai ženkliai šoktelėjo: Nr. 4 šuns atveju CRB padidėjo 24,286 mg/l, o WBC 25,7 x109/l. Nr. 5 kalės kraujyje CRB koncentracija nustatyta 32,012 mg/l, o WBC 30,8 x109/l.
2 pav. CRB ir WBC kiekio pasiskirstymas kraujyje tarp kalių sergančių piometra (norma
CRB <5mg/l; WBC 6–17 x109/l)
3.1.3. Pankreatitas
Šunų sirgusių pankreatitu CRB ir WBC pokyčiai buvo panašūs į piometra sirgusių kalių (pav. Nr. 3): padidėjo ir CRB, ir WBC koncentracija kraujyje. CRB koncentracija kraujyje padidėjo net 300 kartų lyginant su kliniškai sveikų šunų vidurkiu, o WBC kiekis lyginant sergančius ir kliniškai sveikus šunis padidėjo ne taip ženkliai, tačiau viršijo normos ribas (P>0,05). Nr. 2 šuns CRB nustatytas 18,56 mg/l, WBC– 25,6 x109/l . Tuo tarpu Nr. 3 tiriamojo šuns kraujyje CRB buvo 27,14 mg/l, o WBC– 26,3 x109/l. Tad šios ligos atžvilgiu, abu rodikliai yra svarbūs nustatant organizme pasireiškusį sisteminį uždegimą.
24,286 32,012 0,083 0 5 10 15 20 25 30 35
Piometra Piometra Kliniškai sveikas CR B m g/ l 25,7 30,8 12,5 0 5 10 15 20 25 30 35
Piometra Piometra Kliniškai sveikas
WBC
x10
26 3 pav. CRB ir WBC kiekio pasiskirstymas kraujyje tarp šunų sergančių pankreatitu (norma
CRB <5mg/l; WBC 6–17 x109/l)
3.1.4. Visos kitos diagnozuotos ligos
Visų likusių ligų atveju (apsinuodijimas, šlapimo takų akmenligė, pieno liaukos navikas ir trauma) buvo pastebėta, kad CRB koncentracija padidėjo esant traumai (šuo Nr. 11: 11,15 mg/l), o kitų susirgimų metu CRB išliko normos ribose ir neparodė jokių pokyčių (pav. Nr. 4). Tuo tarpu WBC kiekis kraujyje lyginant su išvestu kliniškai sveikų šunų vidurkiu pasireiškusių ligų metu viršijo normos ribas: trauma (Nr. 11 šuo)– 19 x109
/l, šlapimo takų akmenligė (Nr. 6 šuo)– 18 x109/l, navikinis procesas (Nr. 8 šuo)– 17,6 x109/l, apsinuodijimas (Nr. 1 šuo)– 17,3 x109/l.
4 pav. CRB ir WBC kiekio pasiskirstymas kraujyje tarp skirtingų ligų (norma CRB <5mg/l;
WBC 6–17 x109/l) 18,56 27,14 0,083 0 5 10 15 20 25 30
Pankreatitas Pankreatitas Kliniškai sveikas CR B m g/ l 25,6 26,3 12,5 0 5 10 15 20 25 30
Pankreatitas Pankreatitas Kliniškai sveikas WBC x10 9/l 0,17 0,89 0,94 11,15 0,083 0 2 4 6 8 10 12 CR B m g/ l Šunų ligos 17,3 18 17,6 19 12,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 WBC x10 9/l Šunų ligos
27 Lyginant gautus rezultatus galima teigti, kad pasireiškus apsinuodijimui, šlapimo takų akmenligei ir pieno liaukos navikui CRB koncentracija kraujyje nepakito ir išliko normos ribose. Tuo tarpu WBC, visų ligų metu, viršijo normą ir buvo patikimesnis rodiklis identifikuojant susirgimus.
3.2. Temperatūros pokyčiais ir jos įtaka kraujo rodikliams
Atliekant tyrimą į kliniką atvestiems gyvūnams buvo matuojama temperatūra. Šis rodiklis buvo pasirinktas, kadangi temperatūros pokyčiai yra dažniausiai vienas iš pirmųjų klinikinių požymių pasireiškiančių prasidėjus sisteminiam uždegiminiam procesui. 5 pav. pavaizduoti temperatūros pokyčiai esant skirtingiems susirgimams.
Didžiausia temperatūra buvo užfiksuota babeziozės atvejais (šunys Nr. 9–10) 39,7–40 oC (normali šunų temp. 38–39 oC), taip pat temperatūros šuoliai užfiksuoti piometros atvejais 39,4–
39,9 oC (šunys Nr. 4–5), apsinuodijimo metu 39,6 oC (šuo Nr. 1), ūmaus pankreatito metu 39,5– 39,7 oC (šunys Nr. 2–3). Neženkliai temperatūra pakilo esant akmenligei 39,3 oC (šuo Nr. 6) ir navikui 39,1 oC (šuo Nr. 8). Tuo tarpu demodekozės, patirtos traumos metu ir kliniškai sveikų šunų kūno temperatūra išliko normos ribose.
5 pav. Temperatūros pasiskirstymas tarp sergančių šunų 39,6 39,5 39,7 39,4 39,9 39,3 38,7 39,1 39,7 40 38,8 38,3 38,1 38,8 37 37,5 38 38,5 39 39,5 40 40,5 Tem p e ratū ra Šunų ligos
28
3.3.1. C- reaktyviojo baltymo ir temperatūros koreliavimas
Atlikto tyrimo metu buvo vertinama temperatūros įtaka ir sąveika su CRB koncentracija sergančių šunų kraujyje. 6 pav. pavaizduota CRB ir temperatūros koreliacija tarp visų sergančių šunų (n= 13).
Buvo apskaičiuotas koreliacijos koeficientas r=0,521 ir remiantis koreliacijų skale nustatyta vidutinio stiprumo koreliacija tarp CRB ir temperatūros pokyčių. Iš grafiko galima matyti, kad kai kurių ligų metu pakilus temperatūrai padidėjo ir CRB koncentracija kraujyje, tačiau pastebėta atvejų kurių metu pakilus temperatūrai CRB koncentracija kraujyje nepakito.
6 pav. CRB ir temperatūros koreliacijos grafikas
3.3.2. Leukocitų kiekio ir temperatūros koreliavimas
Tyrimo metu taip pat buvo atsižvelgta į WBC ir temperatūros sąveiką pasireiškus tam tikriems susirgimams. WBC ir temperatūros koreliacijos grafikas pateiktas 7 pav.
Apskaičiavus koreliacijos koeficientą nustatyta, kad tarp WBC ir temperatūros yra silpna koreliacija r= 0,372. Iš grafiko galima matyti, kad kai kuriais atvejais pavyzdžiui, babeziozės temperatūra pakyla net iki 40 o
C, o tuo tarpu WBC kiekis išlieka normos ribose. Tad galima teigti, kad glaudaus ryšio tarp WBC ir temperatūros neužfiksuota.
0 5 10 15 20 25 30 35 38 38,5 39 39,5 40 CR B m g/ l Temperatūra oC
29 7 pav. WBC ir temperatūros koreliacijos grafikas
3.4. C-reaktyviojo baltymo ir leukocitų koreliacija
Atliekant tyrimą pagrindinis tikslas buvo įvertinti CRB ir WBC koreliavimą tarp ligų. Buvo vertinami visi sergantys ir kliniškai sveiki šunys.
Norint detaliau įvertinti CRB ir WBC sąveiką sergančių šunų kraujyje galima remtis 8 pav. pavaizduotu koreliacijos grafiku. Taip pat buvo apskaičiuotas CRB ir WBC koreliacijos koeficientas, kuris buvo vidutinio stiprumo r= 0,719. Iš grafiko galima spręsti, kad tarpusavio ryšį turėjo tik kai kurios ligos (pankreatitas, piometra) ir jų metu padidėjo tiek CRB koncentracija, tiek ir WBC kiekis.
8 pav. CRB ir WBC koreliacijos grafikas 0 5 10 15 20 25 30 35 38 38,5 39 39,5 40 40,5 WBC x10 9/l Temperatūra oC 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 CR B m g/ l WBC x109/l
30
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Tyrimo metu gauti rezultatai buvo lyginami su užsienio mokslininkų gautais tyrimo duomenimis apie CRB pasireiškimą sergant įvairiomis ligomis, CRB ir klinikinių simptomų sąveiką, CRB ir tradicinio uždegiminio rodiklio (leukocitų) koreliavima sergant įvairiomis ligomis ir palyginti CRB svarbą tarp sergančių šunų.
Nagrinėjant mokslininkų atliktus tyrimus, kuriuose buvo nustatyta, kad gyvūno amžius, lytis, veislė ir kiti fiziologiniai rodikliai CRB koncentracijai kraujyje neturi įtakos. (3,16,17). Atsižvelgiant į šiuos mokslinius tyrimus kiti parametrai nebuvo nustatinėjami, kadangi neturėjo didesnės sąsajos su atliekamu tyrimu. Tyrimo metu buvo ištirta 13 šunų su įvairiomis ligomis.
Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad didžiausias CRB koncentracijos padidėjimas pasireiškė kalėms, kurioms buvo diagnozuotos piometros (24,286 mg/l; 32,012 mg/l), taip pat užfiksuotas padidėjimas pankreatitų atveju (18,56 mg/l; 27,14 mg/l) Šie gauti rezultatai sutampa su mokslininkų atliktais tyrimais, kurių metu buvo nustatinėjama CRB koncentracija skirtingų ligų metu. Gauti rezultatai parodė, kad piometros ir ūmių pankreatitų metu CRB koncentracija šoktelėjo aukščiau normos ribų, kadangi pasireiškė sisteminis organizmo uždegimas (6,24,25).
Taip pat CRB koncentracijos padidėjimas buvo užfiksuotas babeziozės metu. Vieno iš šunų sirgusio babezioze CRB koncentracija pakilo aukščiau normos (22,425 mg/l), kito liko normos ribuose. Lyginat su mokslininkų atliktais darbais, kurie teigia, kad šunų babeziozės atveju serumo CRB yra žymiai padidėjęs negu sveikų šunų krauju (4,19). Mūsų gauti rezultatai sutapo su tyrėjų duomenimis ir galima teigti, kad babeziozės metu CRB yra išskiriamas iš hepatocitų.
Tuo tarpu kai kurie mokslininkai teigia, kad traumos (5,17), pieno liaukos naviko (31,32) ir demodekozės (37) metu padidėja CRB koncentracija kraujyje. Tačiau atlikto tyrimo metu gauti rezultatai nesutapo su autorių gautais tyrimo rezultatais ir CRB koncentracija šių susirgimų metu išliko normos ribose arba nežymiai pakito.
Analizuojant gautus kraujo morfologinis tyrimus didžiausias dėmesys buvo skiriamas WBC kiekiui kraujyje. Tyrimo duomenys parodė, kad didžiausias WBC koncentracija užfiksuota kalėms, kurioms buvo diagnozuotos piometros (30,8 x109/l; 25,7 x109/l), taip pat pankreatito atveju (26,3 x109/l), kitais atvejai užfiksuotas nežymus WBC padidėjimas kraujyje. Toks WBC šuolis kraujyje gali reikšti, kad organizme prasidėjo uždegiminiai procesai. Tačiau abiejų babeziozių metu WBC išliko normos ribose (11,8 x109
/l; 7,3 x109/l). Šunims kurie pripažinti kliniškai sveikais WBC pokyčių nepastebėta.
Analizuojant sergančių šunų temperatūros pokyčius pastebėta, kad didžiausia temperatūra nustatyta babeziozių metu 39,7–40 o
C, piometros atvejais 39,4–39,9 oC, taip pat pankreatito ir apsinuodijimo metu, kitų ligų atveju temperatūra padidėjo nežymiai arba visai nepakilo. Esant
31 temperatūros pokyčiams galima įtarti, kad prasidėjo sisteminis organizmo uždegimas ir galima daryti prielaidą, kad WBC ir CRB koncentracija padidėjo. Tam patvirtinti buvo lyginama temperatūros ir kraujo rodikliu koreliacija (tarpusavio ryšys).
Vertinant temperatūros ir WBC sąveiką, nustatyta silpna koreliacija, kurios koeficientas (r= 0,421), tai reiškia, kad vieno požymio pasireiškimas turi silpną reikšmę kito požymio atsiradimui. Tuo tarpu vertinant temperatūros ir CRB koreliacija buvo nustatytas vidutinio stiprumo koreliacijos koeficientas (r= 0,509). Tad galima teigti, kad temperatūros pakilimas turi didesnę reikšmę CRB gamybai nei WBC kiekiui kraujyje. Lyginant su užsienio literatūra, vienas tyrimas nustatė, kad temperatūra turėjo labai didelę įtaką CRB koncentracijos padidėjimui (r= 0.855) (26), tačiau tuo tarpu kito tyrimo metu buvo nustatyta labai silpna koreliacija tarp temperatūros ir uždegiminių rodiklių pasireiškimo (r= 0.213) (6).
Analizuojant CRB ir WBC tarpusavio koreliaciją buvo nustatytas vidutinio stiprumo koreliacijos koeficientas (r= 0,708). Tad galima teigti, kad yra teigiamas vidutinio stiprumo ryšys tarp CRB ir WBC koncentracijos padidėjimo pasireiškus tam tikriems susirgimams. Tuo tarpu mokslininkai atlikę tyrimus nustatė, kad tarp WBC ir CRB pasireiškia teigiamai silpna koreliacija (r= 0.44, P<0.001) (6,26). Tad tyrimo metu gauti rezultatai nesutapo su mokslininkų tyrimo rezultatais. Nustatyta, kad CRB koncentracija daug greičiau padidėja organizme negu WBC, uždegiminio proceso metu, dėl to galima teigti, kad CRB yra daug jautresnis rodiklis apsprendžiant uždegiminius procesus (11).
Analizuojant gautus rezultatus pastebima, kad labiausiai CRB ir WBC kiekis padidėjo kalėms, kurioms diagnozuotos piometros (CRB- 32,012 mg/l; WBC- 30,8 x109
/l), taip pat pankreatitų atveju (CRB- 27,14 mg/l; WBC-26,3 x109/l). Nustatyta ir tokių atvejų, kurių metu CRB koncentracija nepakito, bet WBC padidėjo: apsinuodijimas, akmenligė, demodekozė ir naviko atveju. CRB padidėjo, o WBC nepakito kai šunims pasireiškė babeziozė. Atlikti moksliniai tyrimai teigia, kad uždegiminiai procesai tokie kaip: ūminis pankreatitas, piometra, uždegiminės virškinimo trakto ligos sukelia tiek CRB, tiek ir WBC kiekio padidėjimą kraujyje (6,24,25). Taip pat reikia pažymėti, kad šunų babeziozės atveju CRB žymiai padidėja, tačiau WBC išlieka normos ribose arba net sumažėja (4,19).
32
5. IŠVADOS
1. Mokslinės literatūros šaltiniai leidžia teigti, jog CRB nustatymas šunų ligos atveju galėtų būti greitas ir informatyvus metodas klinikinėje praktikoje vertinant uždegimo procesą ir ligas, atliekant monitoringą, stebint paskirto gydymo efektyvumą, antibiotikų veiksmingumą, uždegiminių ligų atsaką į steroidų terapiją ir komplikacijų atsiradimą pooperacinio periodo metu.
2. Sergančių šunų CRB svyravo nuo 0,17 iki 32,012 mg/l. Didžiausi C- reaktyviojo baltymo koncentracijos padidėjimas buvo nustatytas šunims, kuriems buvo diagnozuota piometra (32,012 mg/l; 24,286 mg/l), pankreatitas (27,14 mg/l; 18,56 mg/l) ir babeziozės (22,425 mg/l) metu, kitais atvejais CRB koncentracija pakilo nežymiai arba visai nepadidėjo lyginat su sveikų šunų CRB.
3. Sergančių šunų WBC svyravo nuo 7,3 iki 30,8 x109/l. Nustatyta, kad leukocitų kiekis kraujyje labiausiai padidėjo sergant: piometra (30,8 x109
/l; 25,7 x109/l), pankreatitu (26,3 x109/l), kitais atvejais WBC kiekis padidėjo nežymiai arba visai nepakito (babeziozės atveju). Didžiausi temperatūros šuoliai užfiksuoti sergant piometra (39,4–39,9 oC), babeziozės metu (39,7–40 o
C), pankreatitu (39,5–39,7 oC) kitos temperatūros kito nežymiai arba išliko normos ribose.
4. Įvertinus CRB ir temperatūros koreliaciją, nustatytas, kad tarp CRB ir temperatūros yra vidutinio stiprumo ryšys (r= 0,509), o tarp WBC ir temperatūros pasireiškė silpnas ryšys (r= 0,421). Tarp CRB ir WBC buvo nustatytas vidutinio stiprumo ryšys (r= 0,708) tarp tiriamų ligų.
33
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Khan F. A., Khan M. F. Inflammation and acute phase response. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology. 2010 Aug-Oct; 1(2):312–319.
2. Cray C., Zaias J., Altman N. H. Acute Phase Response in Animals: A Review. Comparative Medicine. 2009; 59(6):517–526.
3. Gómez-Laguna J., Salguero F. J., Pallarés F. J., Rodríguez-Gómez I. M., Barranco I., Carrasco L. Acute Phase Proteins as Biomarkers in Animal Health and Welfare. Acute Phase Proteins as Early Non-Specific Biomarkers of Human and Veterinary Diseases. 2011 October; 259–280.
4. Pradeep M. Application of acute phase proteins as biomarkers in modern veterinary practice. The Indian Journal of Animal Sciences. 2014 January – February; 43(1):1– 13.
5. Bell R., Wilson C. Acute phase proteins: how they are useful for practitioners. Veterinary times. 2014 December 8;21–23.
6. Nakamura M., Takahashi M., Ohno K., Koshino A., Nakashima K., Setoguchi A., et al. C-Reactive Protein Concentration in Dogs with Various Diseases. J. Vet. Med. Sci. 2008; 70(2):127–131.
7. Anziliero D., Bassi E., Pain K. M., Valle S. F., Kreutz L. C. Serum c-reactive protein (CRP) measurement in dogs with altered hematological parameters. Ci. Anim. Bras. 2013; 14(2):265-272.
8. Tîrziu E. Acute-phase proteins in immune response. Lucrări stiinłifice medicină veterinară. 2009; 8(1):329–338.
9. Gruys E., Toussaint M. J. M., Niewold T. A., Koopmans S. J. Acute phase reaction and acute phase proteins. Journal of Zhejiang University science. 2005; 6B(11): 1045–1056. 10. Eckersall P. D. Recent advances and future prospects for the use of acute phase proteins as
markers of disease in animals. Revue Méd. Vét. 2000; 151(7): 577-584.
11. Ceron J. J., Eckersall P. D., Martinez-Subiela S. Acute phase proteins in dogs and cats: current knowledge and future perspectives. Veterinary Clinical Pathology. 2005; 34(2):85– 96.
12. Tóthová C., Nagy O., Kováč G. The Use of Acute Phase Proteins as Biomarkers of Diseases in Cattle and Swine. Acute Phase Proteins. Intech. 2013.
13. Panicker V. P., Gopalakrishnan A., George S. Acute phase proteins of veterinary importance – review. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2014; 3(9):18–195 .
