LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Miglė Giedrikaitė

Niziną gaminančių pienarūgščių bakterijų poveikis rūgštinės-fermentinės

varškės kokybei

The impact of nisin producing lactic acid bacteria on fresh cheese quality

Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: Prof. dr. Loreta Šernienė Maisto saugos ir kokybės katedra

2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Niziną gaminančių pienarūgščių bakterijų poveikis rūgštinės-fermentinės varškės kokybei“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

2019-04-29 Miglė Giedrikaitė

(data) (autoriaus vardas,

pavardė)

(parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2019-04-29 Miglė Giedrikaitė

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Prof. dr. Loreta Šernienė

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE

Prof. Mindaugas Malakauskas

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1) Lekt. dr. Vytautė Šakienė

2) Prof. dr. Elena Bartkienė

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas Milda Bulevičienė

(data) (autorės vardas,

pavardė) (parašas)

(data) (darbo vadovė vardas,

pavardė) (parašas)

(aprobacijos data) (katedros vedėjo vardas,

pavardė) (parašas)

(data) (gynimo komisijos sekretorės

vardas, pavardė)

3

TURINYS

1.1 Varškė ir jos pagrindiniai kokybės reikalavimai ... 9

1.2 Rūgštinės-fermentinės varškės gamyba ... 11

1.3 Bakteriocinus gaminančios pieno rūgšties bakterijos ... 13

1.4 Nizino savybės ir veikimas ... 15

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 17

2.1 Tyrimo metodai ... 17

2.2 Tyrimui naudotos medžiagos ... 17

2.3 Rūgštinės-fermentinės varškės gamyba ... 17

2.4 Rūgštinės-fermentinės varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo nustatymo tyrimo metodika ... 18

2.5 Rūgštinės-fermentinės varškės juslinės analizės metodika... 18

2.6 Statistinis duomenų įvertinimas ... 19

3. TYRIMO REZULTATAI ... 20

3.1 Bendras rūgštinės-fermentinės varškės juslinis priimtinumas ... 20

3.2 Priimtiniausių rūgštinės-fermentinės varškės mėginių juslinė profilinė analizė ... 22

3.3 Priimtiniausių rūgštinės-fermentinės varškės gaminių juslinio priimtinumo dinamika ... 23

3.4 Rūgštinės-fermentinės varškės titruojamojo rūgštingumo analizė ... 24

3.5 Kontrolinės ir bandomųjų rūgštinių-fermentinių varškių bendrojo titruojamojo rūgštingumo dinamika ... 27

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 29

IŠVADOS ... 31

4

SANTRUMPOS

BTR – bendras titruojamasis rūgštingumas; kg – kilogramai;

LAB – lactic acid bacteria; ml – mililitrai;

MRS – de Mann Rogosa Sharpe; Na OH – natrio hidroksidas; o

T – Ternerio laipsnis;

P – skirtumo tarp rezultatų reikšmių patikimumas, P patikimas, kai P < 0,05; pH – vandenilio jonų (H+_{) koncentracijos tirpale matas;}

PRB – pieno rūgšties bakterijos; proc. – procentai;

5

SANTRAUKA

Niziną gaminančių pienarūgščių bakterijų poveikis rūgštinės-fermentinės varškės kokybei Miglė Giedrikaitė

Magistro baigiamasis darbas

Pastaraisiais metais labai daug dėmesio skiriama pieno rūgšties bakterijų (PRB) gaminamų bakteriocinų panaudojimui. Bakteriocinus gaminančios PRB gali padėti prailginti kai kurių produktų vartojimui tinkamą laiką bei kontroliuoti patogeninių bakterijų augimą maisto produktuose.

Šio darbo tikslas buvo įvertinti bakteriocinus gaminančių vietinių L. lactis įtaką kai kuriems rūgštinės-fermentinės varškės kokybės rodikliams. Eksperimento metu buvo pagaminta rūgštinė fermentinė varškė iš žalio ir pasterizuoto pieno, pridedant tris Lactoccocus lactis padermes (56, 59 ir 63) gaminančias niziną, kurios buvo išskirtos iš ožkos pieno. Palyginimui, kaip kontrolinis mėginys, naudota L. lactis ATCC11454 bakterija gaminanti niziną. Sudarius varškės juslinius profilius buvo nustatytas bendras gaminių priimtinumas. Atrinkus tris priimtiniausius rūgštinės-fermentinės varškės mėginius įvertintos jų savybės: konsistencija (kruopėta, nesurišta (puri), sprangi, grubi, sausa), skonis (rūgštus, kartus, pašalinis), kvapas (būdingas, pašalinis), spalvos intensyvumas (nuo baltos iki gelsvos). Norint išsiaiškinti kiek laiko mėginiai gali būti priimtini vartoti su natūraliais konservantais, vertintas jų priimtinumas bei titruojamasis rūgštingumas po 0, 24, 48, 72 ir 96 valandų.

Atlikus bendrą rūgštinės-fermentinės varškės juslinį priimtinumą, priimtiniausi buvo pasterizuoto pieno rūgštinės-fermentinės varškės mėginiai. Tyrimo metu išsiaiškinta, kad bandomieji raugai PS56 ir PS63 statistiškai patikimai geriau raugino pieną, nei kontrolinis raugas.

Raktažodžiai: rūgštinė-fermentinė varškė, bakteriocinai, pieno rūgšties bakterijos, nizinas, kokybė, sauga

6

SUMMARY

The impact of nisin producing lactic acid bacteria on fresh cheese quality Miglė Giedrikaitė

Master‘s Thesis

Nowadays bacteriocins producing lactic acid bacteria (LAB) are receiving increasing attention. Bacteriocins producing LAB may help to prolong the shelf-life of some products and control the food-borne pathogens.

The aim of this Thesis was to evaluate the effect of bacteriocins producing LAB on some fresh cheese quality parameters. Fresh cheese was prepared from raw and pasteurized cow milk by adding three Lactococcus lactis strains (56, 59 and 63) producing nisin, which were isolated from raw goat milk. For comparison, the nisin-producing standard L. lactis ATCC1454 bacteria was used. The general acceptability of samples was estimated by sensory evaluation profile parameters. Three samples were selected and texture (graininess, crumbliness, grittiness, roughness, dryness), flavor intensity (sour, bitter, extraneous), smell intensity (typical, extraneous), color intensity (from white to yellow) was evaluated. The titratable acidity and acceptability of produced cheese was analyzed after 0, 24, 48, 72 and 96 h to estimate for how long the samples with natural preservatives could be acceptable for consumption.

The samples of fresh cheese prepared from pasteurized cow milk showed best general acceptability in sensory analysis. Study revealed that tested L. lactis strains PS56 and PS63 are statistically significant better in all parameters tested than reference L. lactis strain.

7

ĮVADAS

Varškė – baltymingas rauginto karvių ar kitų gyvulių pieno produktas, kuris gaunamas surauginus pieną grynomis pieno rūgšties bakterijų kultūromis arba kartu su grynųjų kultūrų raugu pridėjus pieną sutraukiančių fermentų ir kalcio chlorido, pašalinus dalį išrūgų, skirtas tiesiogiai vartoti arba varškės gaminiams gaminti. Gamybos būdai gali būti skirtingi, varškė gaunama gaminant rūgštiniu, rūgštiniu-fermentiniu ar termorūgštinės koaguliacijos būdais (29).

Šiomis dienomis vartotojams ypač svarbu gauti kuo natūralesnį bei sveikesnį maisto produktą. Pastaraisiais metais labai daug dėmesio skiriama pieno rūgšties bakterijų (PRB) gaminamų bakteriocinų, kaip natūralių konservantų, panaudojimui, kurie gali padėti prailginti kai kurių produktų vartojimo laiką bei kontroliuoti patogeninių bakterijų augimą maisto produktuose (2). Be to, bakteriocinas nizinas ne tik pasižymi slopinančiu poveikiu prieš patogenines bakterijas ir veikia kaip konservantas, bet gali būti naudojamas kaip vaistas nuo vėžio (18). Taip pat, nuo pieno rūgšties bakterijų, naudojamų fermentacijos procese, daugiausia priklauso sūrio ir varškės skonis bei kvapas – vienos iš svarbiausių savybių vartotojams (21).

Žinoma, kad Lietuvoje pieno sektorius turi gilias tradicijas. Pirminė pieno gamyba yra viena pagrindinių žemės ūkio šakų, o pieno perdirbimas – svarbiausia maisto perdirbimo sritis. Tarp ES šalių, ypač perdirbimo lygyje, viena labiausiai besispecializuojančių pieno gamyboje yra Lietuva (25). Remiantis Lietuvos žemės ir maisto ūkio 2017 m. duomenimis nuo 2013-2015 m. pagal sūrio ir varškės suvartojimą, matoma mažėjanti tendencija nuo 20,4 iki 18,9 kg vienam gyventojui per metus, tačiau 2016 m. sūrio ir varškės suvartojimas išaugo iki 20,2 kg, o 2017 m. pasiekė aukščiausią per tiriamąjį laikotarpį skaičių – 20,7 kg (20).

Matant vartotojo poreikį saugesniam ir natūralesniam maisto gaminiui bei augantį sūrio bei didėjantį varškės vartojimą, nuspręsta gaminti rūgštinę-fermentinę varškę, su vietinėmis Lactococcus lactis padermėmis, gaminančiomis bakteriocinus ir išanalizuoti kaip jos įtakoja gaminio kokybę.

Darbo tikslas: įvertinti bakteriocinus gaminančių vietinių L. lactis įtaką kai kuriems rūgštinės-fermentinės varškės kokybės rodikliams.

Darbo uždaviniai:

1. Pagaminti rūgštinę fermentinę varškę iš žalio ir pasterizuoto pieno su bakteriocinus gaminančiomis vietinėmis L. lactis padermėmis bei kontroliniu raugu, adaptuojant pramoninę gamybos technologiją laboratorijos sąlygoms.

2. Įvertinti bakteriocinus gaminančių vietinių L. lactis padermių įtaką rūgštinės-fermentinės varškės jusliniams rodikliams.

8 3. Įvertinti bakteriocinus gaminančių vietinių L. lactis padermių įtaką rūgštinės-fermentinės varškės fizikiniams-cheminiams rodikliams.

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Varškė ir jos pagrindiniai kokybės reikalavimai

Varškė – baltymingas karvių ar kitų gyvulių pieno gaminys, kuris gaunamas surauginus pieną grynų pieno rūgšties bakterijų kultūromis arba kartu su šių kultūrų raugu pridėjus pieną sutraukiančių fermentų ir kalcio chlorido bei pašalinus dalį išrūgų, kuris skirtas tiesiogiai vartoti arba varškės gaminiams gaminti. Varškė gali būti gaminama keliais skirtingais būdais:

1. Rūgštiniu būdu gaminant varškę, surauginti pieną naudojamas tik grynų pieno rūgšties bakterijų kultūrų raugas.

2. Rūgštiniu-fermentiniu būdu gaminamai varškei naudojamas pieną rauginantis grynų pieno rūgšties bakterijų kultūrų raugas, rauginama iki pH 4,6 bei dedami fermentai, tokie kaip šliužo fermentas, pepsinas, ar kitas pieno fermentinio traukinimo preparatas. Išrūgos atskiriamos mechaniniu būdu – gravitaciniu ar centrifuguojant, gaunama minkšta, gelio pavidalo masė. Galutinio produkto išeiga priklauso nuo žalio pieno sausųjų medžiagų kiekio, terminio apdorojimo, mechaninio atskyrimo būdų taikymo. Rūgštinės-fermentinės varškės skonį lemia fermentacijos sąlygos bei kokie raugai buvo naudoti (mezofiliniai ar termofiliniai) (9).

3. Termorūgštiniu būdu pagaminta varškė gaminama aukštoje temperatūroje rauginant pieną grynų pieno rūgšties bakterijų kultūrų raugu (7).

Varškė gali būti gaminama su skirtingu riebalų kiekiu. Riebioje varškėje riebalų yra ne mažiau kaip 13 proc., pusriebėje varškėje riebalų yra mažiau kaip 13 proc., bet ne mažiau kaip 5 proc., mažo riebumo varškėje riebalų yra mažiau kaip 5 proc., bet ne mažiau kaip 1 proc., o liesoje varškėje riebalų yra mažiau kaip 1 proc. 1 lentelėje pateikti pagrindiniai skirtingo riebumo varškės sudėties reikalavimai (7).

1 lentelė. Pagrindiniai varškės sudėties reikalavimai

Rodiklio pavadinimas Varškės klasifikacinis pavadinimas

Riebi Pusriebė Mažo

riebumo

Liesa

Riebalų kiekis, proc. Ne mažiau

kaip 13proc. Mažiau kaip 13 proc., bet ne mažiau kaip 5 proc. Mažiau nei 5 proc., bet ne mažiau kaip 1proc. Mažiau kaip 1proc.

Bendras sausųjų medžiagų kiekis proc., ne mažiau kaip: -rūgštiniu, rūgštiniu fermentiniu termorūgštinės koaguliacijos būdu pagamintai varškei;

- minėtais būdais srovine linija pagamintai varškei

30 26 22 18

26 24 22 18

Titruojamasis rūgštingumas, perskaičiuotas pieno rūgšties proc., ne daugiau kaip/arba aktyvusis rūgštingumas pH vienetais ne mažiau kaip:

- rūgštiniu būdu pagamintai varškei;

- rūgštiniu fermentiniu ir termokoaguliacijos būdu pagamintai varškei

1,9/4,3 2,0/4,3 2,1/4,3 2,2/4,3

10 Varškė gali būti gaminama iš žalio karvių pieno, kuris privalo atitikti Reikalavimus žalio pieno, termiškai apdoroto geriamojo pieno ir pieno produktų gamybai, patvirtintus Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2004 m. kovo 17 d. įsakymu Nr. B1-217. Be to, gali būti naudojamas ir kitų gyvulių pienas, kuris atitinka jo kokybei keliamus reikalavimus. Gaminant varškę leidžiami naudoti ingredientai:

 pieno rūgšties ir (arba) aromatinių bakterijų kultūrų raugai, kitos tinkamos raugo mikroorganizmų kultūros;

 šliužo fermentas ir kiti tinkami pienui traukinti fermentai;

 geriamasis vanduo, kuris atitinka Lietuvos higienos normą HN 24:2003 „Geriamojo vandens saugos ir kokybės reikalavimai“;

 natrio chloridas (valgomoji druska);

 uogos, vaisiai, daržovės, grūdai ir jų produktai, aguonos, šokoladas, kava, kakava, riešutai, medus, sacharidai, prieskoniai ir kiti natūralūs nekenksmingi gaminiai, vitaminai, mineralinės medžiagos, natūralios ir natūralioms identiškos kvapiosios medžiagos;

 krakmolas, želatina.

Priklausomai nuo varškės gamybos būdo, jos konsistencija gali būti vienalytė arba kruopėta. Be to, laikant varškę iš jos gali išsiskirti šiek tiek išrūgų. Kvapas – pienarūgštis. Žiemą ir pavasarį varškėje gali būti jaučiamas silpnas pašarų prieskonis. Neriebi (5-2 proc.) varškė gali būti šiek tiek karstelėjusi. Varškės spalva balta ar kreminio atspalvio, o visa masė vienoda.

Varškė turi būti laikomi 0-8 °C temperatūroje. 6 °C temperatūroje varškė laikoma 36 valandas, o – 8 °C temperatūroje – gali būti laikoma iki 6 mėnesių. Jeigu varškė sufasuota į pergamentą, tai jos vartojimo trukmė – 3 paros, o varškė sufasuota hermetiškuose polimeriniuose indeliuose galioja – 5 paras. Vartojimo trukmė skaičiuojama nuo technologinio proceso pabaigos.

11

1.2 Rūgštinės-fermentinės varškės gamyba

Rūgštinės-fermentinės varškės gamyba – sudėtingas technologinis procesas. 1 paveiksle pateikiama rūgštinės-fermentinės varškės gamybos proceso pakopos.

Raugas CaCl2

Šliužo fermentas

1 pav. Rūgštinės-fermentinės varškės technologinio proceso schema 2. Filtravimas, atšaldymas, sukaupimas ir

laikymas (2-6 ºC temp., ne > 36 h) 1. Žalio pieno priėmimas

(6-10 ºC temp.)

3. Šildymas, separavimas/valymas (34-40 °C temp.)

4. Normalizavimas (37±2 °C temp.)

5. Pasterizavimas (78±2 °C temp., išlaikant 15-20 s) ir atšaldymas ( iki 6 °C temp.)

6. Rauginimas (I) (23-30 °C temp., 2-3 val., 32-35 °T) ir maišymas (kas 30-40 min.) 7. Rauginimas (II) ir sutraukinimas (23-30 °C temp., 6-8 val., 58-60 °T) ir maišymas (5-6min.)

8. Pašildymas (iki 60 °C temp., 20-25 min.), išrūgų atskyrimas, varškės išleidimas 9. Galutinis išrūgų atskyrimas (ne žemesnė kaip

16 °C temp., 40-60 min.)

10. Varškės atšaldymas (ne > 12 °C temp., trukmė ne > 24 h)

11. Varškės fasavimas, pakavimas ir ženklinimas

12. Varškės galutinis atšaldymas (6 °C temp.)

13. Laikymas (ne > 48 val. įmonėje)

12 1. Pieno priėmimas

Pienas priimamas 6-10 °C temperatūros, kurio kokybė įvertinama pagal nustatytus reikalavimus. Iš priėmimo punkto atvežtas pienovežiu į gamyklą, pienas patikrinamas gamyklos laboratorijoje. Nustatomi pieno sudėties ir kokybės rodikliai, kurie užtikrinami pamatiniais fizikiniais, cheminiais ir mikrobiologiniais metodais, paskelbtais tarptautiniuose standartuose.

2. Pieno filtravimas, atšaldymas, sukaupimas ir laikymas

Pienas perleidžiamas per filtrus, kad būtų surinktos įvairios nuosėdos, tuomet nedelsiant atšaldomas iki 2-6 ºC temperatūros ir gali būti laikomas iki 36 h. Atšaldymo temperatūra priklauso nuo priimto pieno kokybės (bendrojo bakterijų kiekio), pradinės pieno temperatūros ir laikymo trukmės (14).

3. Šildymas, separavimas/valymas

Priimtas pienas, po laikymo pašildomas iki 34-40 °C temperatūros ir separuojamas. 4. Normalizavimas

Po separavimo pienas normalizuojamas pagal riebalus ir pagal baltymus, esant 37±2 °C temperatūrai.

5. Pasterizavimas

Po normalizavimo, pienas pasterizuojamas 78±2 °C temperatūroje, išlaikant 15-20 s, bet ne aukštesnėje nei 88 °C temperatūroje ir atšaldomas iki mezofilinio rauginimo temperatūros. Pasterizacijos tikslas – sunaikinti piene esančių kai kurių mikroorganizmų (ypač patogeninių) vegetatyvines ląsteles. Po pasterizacijos piene išlieka bakterijų sporos ir termofiliniai mikroorganizmai.

6. Rauginimas (I)

Į pasterizuotą ir atvėsintą pieną dedamas raugas, pienas išmaišomas ir rauginamas 2-3 valandas, 23-30 °C temperatūroje, kol jo rūgštingumas pasiekia 32-35 °T. Kad į paviršių neiškiltų laisvi riebalai, mišinys atsargiai pamaišomas kas 30-40 min. Norint koreguoti pieno sudėtį, į jį dedamas kalcio chloridas.

7. Rauginimas (II) ir sutraukinimas

Mišiniui pasiekus 32-35 °T rūgštingumą, į jį dedama 1 proc. šliužo fermento, tuomet rūpestingai maišoma 5-6 min. ir ramiai rauginama 6-8 val., kol jo rūgštingumas pasiekia 58-60 °T.

8. Mišinio pašildymas, išrūgų atskyrimas, varškės išleidimas

Nustačius rauginimo pabaigą ir susidarius pakankamai tankiai varškės sutraukai, ji susmulkinama ir atsargiai sumaišoma. Išmaišius, ji paliekama apie 30 min., kad išsiskirtų išrūgos, o kad tai įvyktų greičiau, sutrauka pašildoma iki 60 °C temperatūros ir šioje temperatūroje išlaikoma 20-25 min. Pabaigus šildyti varškę, atskiriamos išrūgos.

13 9. Galutinis išrūgų atskyrimas

Atskyrus dalį išrūgų, atliekamas sutraukos savaiminis susislėgimas. Jis tęsiasi tol, kol gaunami standarte numatyti varškės fizikiniai ir cheminiai rodikliai. Kad neužsitęstų išrūgų išsiskyrimas ir sutrauka neatvėstų, patalpos temperatūra turi būti ne žemesnė kaip 16 °C.

10. Varškės atšaldymas

Po savaiminio susislėgimo varškė atšaldoma iki 12 °C temperatūros ir laikoma ne ilgiau kaip 24 valandas, po to nukreipiama fasuoti.

11. Varškės fasavimas, pakavimas ir ženklinimas

Rūgštinė fermentinė varškė fasuojama į polimerinių medžiagų indelius, kurie atitinka nustatyta tvarka leistų naudoti medžiagų reikalavimus. Varškės indeliai pakuojami į polimerines dėžes (14). Ženklinama pagal Europos parlamento ir Tarybos reglamentą (ES) Nr.1169/2011 dėl informacijos apie maistą teikimo vartotojams.

12. Varškės galutinis atšaldymas

Fasuota varškė galutinai atšaldoma iki 6 C temperatūros šaldymo kameroje. 13. Laikymas

Varškė laikoma ne ilgiau kaip 48 valandas įmonėje.

1.3 Bakteriocinus gaminančios pieno rūgšties bakterijos

Pirmą kartą PRB buvo išskirtos iš pieno, o tada buvo rastos ir daugybėje fermentuotų maisto produktų, tokių kaip pieno produktai, mėsa, daržovės, gėrimai ir duona. PRB randamos ir natūraliai fermentuotame maiste, taip pat jų galima rasti ir druskoje, vandenyje, mėšle, nuotekose ir gyvūnuose. PRB praktinis pritaikymas žinomas nuo senų laikų. Buvo gydomos įvairios ligos su produktais, kuriuose yra PRB. Žinoma, kad daugelis tautų nuo seno vartoja PRB fermentuotus produktus nudegimams ir žaizdoms gydyti bei skrandžio – žarnyno ligų gydimui ir profilaktikai (16). Šios bakterijos yra gram – teigiamos, forma gali būti nuo kokų iki lazdelių, anaerobinės, bet toleruoja deguonį bei iš angliavandenių gamina energiją ir pieno rūgštį. Jos nesudaro sporų, pasižymi neigiama katalazės reakcija, sukelia rūgimą (10). Pieno rūgšties bakterijoms priklauso nemažai bakterijų rūšių, kurios yra priskiriamos Firmicutes tipui. Jų pagrindinės gentys: Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus,Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella (24), Aerococcus, Bifidobacterium, Microbacterium, Propionibacterium (8). Šios bakterijos yra jungiamos į atskirą mikroorganizmų grupę, nes pasižymi viena pagrindine savybe – kaip fermentacijos produktą pagamina pieno rūgštį. Pieno rūgštį gamina visos gram – teigiamos bakterijos, išskyrus kelis Actinobacteria tipo atstovus: Microbacterium, Aerococcus, Propionibacterium, Bifidobacterium (2). Pieno rūgštį gamina tokios rūšys, kaip Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus, L. delbrueckii bulgaricus, L. fermentum, L.

14 reuteri, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis cremoris, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. adolecentis, B. breve, Enterococcus feacalis, Enterococcus feacium, Streptococcus cricetus, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus

thermophilus ir kitas (10).

Pieno rūgšties bakterijos maisto pramonėje gali būti panaudotos kaip skoninės, tekstūrinės medžiagos ar konservantai. PRB, tokios kaip Lactobacillus lactis ir Streptococcus thermophilus stabdo patogeninių bakterijų veiklą ir taip ilgiau išsaugo neapdorotų maisto produktų kokybę. Išsaugomasis poveikis labiausiai susijęs su gaminamomis organinėmis rūgštimis, tokiomis kaip pieno ir acto rūgštis bei kai kurių padermių išskiriamais bakteriocinais. 2 paveiksle pateiktas PRB panaudojimas (30).

2 pav. Pieno rūgšties bakterijų panaudojimo įvairovė

Pieno rūgšties bakterijų (PRB), gaminančių antimikrobinius junginius, kaip natūralius konservantus, skirtus sūrio kokybei ir saugai pagerinti pritaikymas susilaukia vis didesnio mokslininkų dėmesio. Listeria monocytogenes bakterijų kontrolė minkštų sūrių gamyboje vis dar yra iššūkis, nes ji geba augti šaldytuvo temperatūroje ir pasižymi druskos atsparumu.

Bakteriocinai tai didelė ir įvairialypė, baltyminės kilmės, ribosomų pagalba sintetinamų medžiagų grupė, kuri pasižymi antimikrobiniu veikimu. Jų veikimo spektras yra gana siauras – inhibuoja filogenetiškai artimas mikroorganizmų rūšis.

Bakteriocinai skirstomi į keletą grupių, priklausomai nuo organizmo, kuris gamina ir klasifikavimo kriterijų. Pirmajai klasei priskiriama lantibiotikai, kuriuos sudaro grupė mažų peptidų, kurie termiškai stabilūs ir turi lantioniną. Antrosios klasės bakteriocinai yra maži, nekintami, atsparūs karščiui peptidai ir lantionino jie neturi. Trečiajai klasei priklauso dideli ir karščiui neatsparūs proteinai. Ketvirtoji bakteriocinų klasė sudaryta iš įvairaus baltymų, lipidų, angliavandenių mišinio (1,13).

Dauguma bakteriocinų išskiriami iš pieno rūgšties bakterijų. Svarbiausi iš jų yra nizinas, diplokokinas, acidofilinas, bulgarikanas, helveticinai, laktacinai, plantaricinai. Lantabiotikai yra

Pradinė arba natūraliai esanti kultūra

Probiotikai

Išgryninimas Žmogaus virškinimo traktas

Bakteriocinai Medicina

Maisto sauga ir kokybė Maistas

15 labiausiai ištirti ir dažnai naudojami pramonėje dėl savo siauro veikimo spektro ir netoksiškumo. Lantabiotikas nizinas natūraliai gaminamas Lactococcus lactis ssp. lactis ir pramonėje naudojamas kaip maisto priedas E234. Nizinas turi A ir Z formas, kurios skiriasi tik viena aminorūgštimi. Abi šios formos yra patvirtintos įstatymais ir leidžiamos naudoti kaip maisto priedai JAV ir Europos sąjungoje. Jos pasižymi slopinamu poveikiu maiste esančioms patogeninėms bakterijoms. Nizino formos antimikrobiškai aktyvios prieš gram – teigiamas bakterijas, tokias kaip PRB, Listeria sp., Micrococcus sp. bei sporas formuojančias bakterijas, tokias kaip Bacillus sp. ir Clostridium sp. Nizino inhibicinis poveikis pasireiškia veikiant keletą ląstelių augimo fazių. Jis kaupiasi ląstelių membranose ir galiausiai įsiterpia į jas. Susijungus su membrana įgaunama vandens prisipildžiusių porų forma (1,13).

1.4 Nizino savybės ir veikimas

2014 m. Sonia Garde ir kiti mokslininkai (12) nustatė, kad niziną ir reuteriną gaminančios pieno rūgšties bakterijos pasižymi antimikrobinėmis savybėmis prieš Clostridium perfringens tipo bakterijas. Nizino poveikis C. perfringens buvo analizuotas lyginant jį su lizocimu ir natrio nitritu. Tyrimų rezultatai parodė, kad reuterinas ir nizinas stabdo C. perfringens vegetatyvinių ląstelių augimą ir net sporų susidarymą, lizocimas nedaro jokio poveikio tirtoms bakterijoms, o natrio nitratas silpnai slopina C. perfringens bakterijų veiklą. Galima teigti, kad reuterinas ir nizinas yra potencialūs inhibitoriai prieš C. perfringens ir gali padėti kovoti prieš bakterijas, patekusias į maisto grandinę.

Nizino antibakterinis veikimas gali būti dar stipresnis veikiant kartu su leukocinu C. Leukociną C gamina Leuconostoc carnosum 4010, kuri priklauso II a bakteriocinų klasei ir taip pat pasižymi antimikrobiniu poveikiu. Kadangi abu bakteriocinai turi skirtingus veikimo spektrus, bendras jų panaudojimas gali būti puikus būdas kontroliuoti patogeninių bakterijų augimą maisto produktuose. Xu H ir kitų mokslininkų 2018 m. atlikti tyrimai parodė, kad rekombinantinis kamienas yra aktyvus prieš Listeria monocytogenes ir Staphylococcus aureus ir vidutiniškai aktyvus prieš Salmonella enterica serovarą Enteritidis bei Escherichia coli. L. lactis N8-r-lecCI padermės, išskiriančios niziną, ir leukociną C, poveikis buvo patikrintas praktiškai, atliekant „time-kill“ testą pasterizuotame piene, kuris parodė, kad ši padermė gali būti perspektyvi pieno perdirbime ir jo išsaugojime dėl savo stipraus antibakterinio poveikio (31).

Šviežias minkštas sūris yra puiki terpė vystytis daugeliui mikroorganizmų, tarp kurių dažnai pasitaiko ir patogenų. Antônio F. de Carvalho ir kitų mokslininkų (26) 2013 m. atliktas tyrimas, kurio tikslas ištirti bakteriocinų (bovicino HC5 ir nizino) poveikį Listeria monocytogenes ir Staphylococcus aureus bakterijoms, esančios šviežiame Brazilijos sūryje „Minas“. Sūrio mėginiai su bakteriocinais buvo užsėti patogeninėmis bakterijomis ir laikomi 9 paras 4 °C temperatūroje. Eksperimento pabaigoje juose Listeria monocytogenes bakterijų nerasta. Taip pat nizinas ir

16 bovicinas HC5 sulėtino S. aureus ATCC 6538 populiacijos augimą. Gauti rezultatai rodo, kad naudojant niziną kartu su biovicinu HC5 galima kontroliuoti patogeninių bakterijų augimą šviežiame sūryje.

Nizinas buvo žinomas tik kaip maisto produktų konservantas, bet 2016 m. Yvonne Kapila ir kiti mokslininkai (11) išsiaiškino, kad jis gali gydyti vienas sudėtingiausių šio laikmečio ligų. Nizinas gali būti naudojamas kaip vaistas nuo vėžio ar paveikti tokias bakterijas, kurių neveikia antibiotikai, pvz.: auksinį stafilokoką. Mičigano universitete žiurkės buvo girdomos „nizino pieno kokteiliu“, kuris sunaikino 70-80 proc. galvos ir kaklo auglio ląstelių per 9 savaites.

17

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

2.1 Tyrimo metodai

Tyrimai atlikti 2017 – 2018 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, juslinių tyrimų laboratorijoje. Tyrimo objektas – laboratorinėmis sąlygomis pagaminta rūgštinė-fermentinė varškė.

2.2 Tyrimui naudotos medžiagos

Bandymuose naudotos niziną gaminančio Lactococcus lactis padermės (56, 59, 63). Jos buvo išskirtos iš ožkų pieno Maisto saugos ir kokybės katedroje, mikrobiologijos laboratorijoje. Iki eksperimento, PRB buvo laikomos -80 °C temperatūroje, M17 sultinyje (Merck, Vokietija), 30 proc. glicerolio tirpale iki tolimesnių analizių (19). Prieš atliekant eksperimentus, padermės buvo atšildytos ir pagausintos de Mann Rogosa Sharpe sultinyje (MRS) (Biolife, Milanas, Italija), 30 °C temperatūroje išlaikant 18 valandų termostate. Rauginimui minėtos bakterijos buvo pagausintos pasterizuotame piene (pagamintas gamybinis raugas) ir po 2 proc. šio raugo panaudoti rūgštinės-fermentinės varškės gamybai.

Žalias pienas gautas iš Audriaus Banionio ūkio, esančio Kauno rajone Margininkų kaime. Pieno sudėtis: baltymų – 3,2 proc., angliavandenių – 4,7 proc., riebalų – 3,8 proc.

2.3 Rūgštinės-fermentinės varškės gamyba

Analizei buvo pagaminti 8 varškės mėginiai, iš kurių 4 mėginiai pagaminti iš žalio pieno, o kiti 4 – iš pasterizuoto pieno. Prieš pradedant varškės gamybą atitinkamai pažymėtos talpos, kuriose buvo rauginamas pienas (žalio pieno – ŽSK (kontrolinis mėginys), ŽS56, ŽS59, ŽS63 ir pasterizuoto pieno – PSK (kontrolinis mėginys), PS56, PS59, PS63). Norint gauti pasterizuotą pieną, žalias pienas buvo supiltas į talpą, kurioje kaitinamas iki 90 °C temperatūros išlaikant 20 s. Tuomet pienasatvėsintas iki 30 °C temperatūros ir įdėtas kalcio chloridas (CaCl2)(0,2 g/l, Merck). Žalias pienaspašildytas iki 30 °C temperatūros. Žalias ir pasterizuotas pienas išpilstytas į 8 talpas po 3 l. Į kontrolinius mėginius įdėtas komercinis raugas su L. lactis ATCC 11454, o į likusius – po 2 proc. tiriamojo raugo. Mėginiai buvo rauginami 2 valandas, 30 °C temperatūroje, po to į visus mėginius įdėtas šliužo fermentas ir dar išlaikyta 6 valandas. Susidarius pakankamai tankiai varškės sutraukai, ji susmulkinta į 1-2 cm kubelius ir atsargiai sumaišyta. Išmaišius, ji palikta apie 30 min., 21 °C temperatūroje, kad išsiskirtų išrūgos. Po to varškė supilta į sūrmaišius, kuriuose palikta 1 valandą, 21 °C temperatūroje nusivarvėti.

18

2.4 Rūgštinės-fermentinės varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo

nustatymo tyrimo metodika

Rūgštinės-fermentinės varškės titruojamojo rūgštingumo tyrimas paremtas produkte esančių rūgščių neutralizavimu (LST ISO/TS 11869:2013), naudojant 0,1 mol/l NaOH koncentracijos tirpalą, dalyvaujant indikatoriui fenolftaleinui (28).

Rūgštingumas įvertintas Ternerio laipsniais (°T) (10). Mėginių bendras titruojamasis rūgštingumas matuotas 5 g mėginio rūgštinės-fermentinės varškės užpilant 50 ml 40-50°C temperatūros distiliuoto vandens, indelyje grūstuvėliu sutrinta iki vienalytės masės ir įlašinta 4-5 lašai indikatoriaus fenolftaleino ir titruota. Mėginių titruojamasis rūgštingumas buvo nustatinėjamas tol, kol jie buvo priimtini vartoti.

2.5 Rūgštinės-fermentinės varškės juslinės analizės metodika

Juslinė analizė atlikta Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje, juslinės analizės laboratorijoje. Juslinių savybių vertinime dalyvavo 6 asmenų vertintojų grupė. Jiems buvo pateikti aštuoni skirtingų receptūrų rūgštinės-fermentinės varškės mėginiai, kurie preliminariai vienodais kiekiais sudėti į plastikines lėkštelės, o ant jų užrašyti gaminių kodai (3 pav.). Sudarius pagamintos varškės juslinius profilius buvo nustatytas bendras gaminių priimtinumas, kuris įvertintas 10 balų sistemoje. Atrinkus tris priimtiniausius rūgštinės-fermentinės varškės mėginius, įvertintos jų savybės: konsistencija (kruopėta, nesurišta (puri), sprangi, grubi, sausa), skonis (rūgštus, kartus, pašalinis), kvapas (būdingas, pašalinis), spalvos intensyvumas (nuo baltos iki gelsvos). Tyrimas atliktas vadovaujantis LST ISO 6658, 2006 Juslinė analizė. Metodika (17). Bendrieji nurodymai (tapatus ISO 6658:2005).

19

2.6 Statistinis duomenų įvertinimas

Gauti duomenys buvo sisteminami aprašomosios ir statistinės analizės metodais statistiniu SPSS paketu (SPSS Inc., 20 versija). Analizuojant buvo nustatytas kintamųjų rodiklių duomenų skaičius (N), aritmetiniai vidurkiai ir vidurkių nuokrypiai. Veiksnių (varškių su skirtingais raugais) įtakos kintamiesiems (fizikiniams-cheminiams bei jusliniams varškių rodikliams) analizė atlikta pavienių veiksnių įtakos (ANOVA) metodu. Aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas (p) nustatytas pagal Bonferonni kriterijų. Skirtumas laikomas patikimu, kai p<0,05.

20

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1 Bendras rūgštinės-fermentinės varškės juslinis priimtinumas

Rūgštinės-fermentinės iš žalio ir pasterizuoto pieno, kontrolinių ir bandomųjų varškių priimtinumas buvo tirtas 4 paras. Bendras rūgštinės-fermentinės varškės priimtinumas tirtas po 24 val. Iš pateiktų rezultatų 4 paveiksle galime matyti, kad iš žalio pieno pagamintų varškių priimtinumas kito nuo 2,98 iki 4,48 balų, o iš pasterizuoto – nuo 4,73 iki 7,18 balų. Pasterizuotos varškės mėginiai išrinkti labiausiai priimtini – PSK – 7,15, PS56 – 7,18 ir PS63 – 6,70. Nustačius priimtiniausius varškių mėginius, su jais buvo atlikta juslinė profilinė analizė.

4 pav. Bendras rūgštinės-fermentinės varškės priimtinumas

Rūgštinės-fermentinės iš žalio ir pasterizuoto pieno, kontrolinių ir bandomųjų varškių priimtinumas po 48 val. pateiktas 5 paveiksle. Didžiausią priimtinumą, kaip ir po pirmos paros turėjo PSK – 5,17, PS56 – 6,93 ir PS63 – 6,40 mėginiai. Statistiškai patikimo skirtumo tarp kontrolinės PSK ir bandomųjų varškių PS56, PS63 po 48 val. nėra.

5 pav. Rūgštinės-fermentinės varškės priimtinumas po 48 val.

2,98 3,08 3,53 4,48 7,15 7,18 4,73 6,70 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 ŽSK ŽS56 ŽS59 ŽS63 PSK PS56 PS59 PS63 Priim tin im o v id u rk is, b a la is Mėginiai 3,00 1,70 3,20 3,37 5,17 6,93 5,97 6,40 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 ŽSK ŽS56 ŽS59 ŽS63 PSK PS56 PS59 PS63 P riim tinu m o v idu rk is , ba la is Mėginiai

21 6 paveiksle pateiktas rūgštinių-fermentinių varškių priimtinumas po 72 val. Daugiausia priimtinumo balų surinko PS63 mėginys – 6,13, po to sekė PS59 – 5,87 ir PS56 – 4,90. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės pasterizuotos, žalio pieno varškės ir bandomųjų varškių nebuvo rasta.

6 pav. Rūgštinės-fermentinės varškės priimtinumas po 72 val.

7 paveiksle pateiktas rūgštinės-fermentinės varškės juslinis priimtinumas po 96 val. Nuo pagaminimo visų varškių priimtinumas ženkliai sumažėjo, o ypač iš žalio pieno pagamintų varškių. Didžiausią priimtinumą turėjo mėginiai – PS63 – 4,40, PS56 – 3,55 ir PS59 – 2,70.

7 pav. Rūgštinės-fermentinės varškės priimtinumas po 96 val. 2,03 1,53 2,53 1,93 4,13 4,90 5,87 6,13 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 ŽSK ŽS56 ŽS59 ŽS63 PSK PS56 PS59 PS63 P riim tinu m o v idu rk is , ba la is Mėginiai 0,50 1,25 1,95 1,80 2,60 3,55 2,70 4,40 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 ŽSK ŽS56 ŽS59 ŽS63 PSK PS56 PS59 PS63 P riim tinu m o v idu rk is , ba la is Mėginiai

22

3.2 Priimtiniausių rūgštinės-fermentinės varškės mėginių juslinė profilinė

analizė

Atlikus profilinę analizę su didžiausią priimtinumą turėjusiomis varškėmis, pagamintomis su skirtingais raugais – PSK, PS56, PS63 paaiškėjo, kad bandomosios varškės jusliškai nesiskyrė tarpusavyje nuo kontrolinio mėginio (p<0,05). Tirtas skonis (rūgštus, kartus, pašalinis), konsistencija (sprangi, nesurišta (puri), grubi, sausa, kruopėta), kvapas (pašalinis, būdingas) ir spalvos intensyvumas (nuo baltos iki gelsvos). 2 lentelėje pateiktos rūgštinės-fermentinės varškės juslinių savybių vertinimo vidutinės reikšmės.

2 lentelė. Rūgštinės-fermentinės varškės juslinių savybių vertinimo vidutinės reikšmės, p<0,05

Eil. nr. Juslinės savybės Mėginiai

PSK PS56 PS63 Konsistencija 1. Sprangi 0,78±0,84 0,93±0,74 1,07±0,99 2. Nesurišta 7,88±1,18 8,18±0,94 6,97±2,03 3. Grubi 1,02±0,85 0,98±1,30 2,08±2,45 4. Sausa 0,40±0,49 0,47±0,56 0,95±0,75 5. Kruopėta 1,88±1,77 1,68±1,39 3,05±1,91 Skonis 6. Rūgštus 1,2±1,38 0,57±0,61 0,55±0,54 7. Pašalinis 1,02±1,26 1,38±1,90 0,98±1,23 8. Kartus 0,42±0,48 0,47±0,66 0,47±0,58 Kvapas 9. Būdingas 8,93±0,52 8,53±1,11 8,87±1,25 10. Pašalinis 1,40±1,30 0,80±0,69 0,83±0,79 Spalvos intensyvumas

11. Nuo baltos iki

gelsvos

6,10±1,84 3,98±3,42 4,97±2,30

Atlikus priimtiniausių varškių PSK, PS56 ir PS63 konsistencijos vertinimą iš 8 paveikslo galima teigti, kad mėginiai mažai skyrėsi vienas nuo kito. Visi tirtieji mėginiai pasižymėjo mažu sprangumu. Nesurišta konsistencija labiausiai išsiskyrė PSK ir PS63 varškės. PS63 varškė išsiskyrė didesniu sausumu ir kruopėta konsistencija lyginant su PSK ir PS56, kurių gauti rezultatai labai panašūs.

8 pav. Profilinė rūgštinės-fermentinės varškės konsistencijos analizė 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00Sprangi Nesurišta Grubi Sausa Kruopėta _PSK PS56 PS63

23 Atlikus priimtiniausių mėginių PSK, PS56, PS63 skonio vertinimą, galima matyti 9 paveiksle, kad labiausiai rūgščiu skoniu išsiskyrė kontrolinė PSK varškė, o mėginių PS56 ir PS63 gauti rezultatai panašūs – abu pasižymėjo mažesniu rūgštingumu. Visuose mėginiuose buvo panašiai silpnai jaučiamas kartus skonis. PS56 varškėje labiausiai jautėsi pašalinis kvapas, be to ir pašalinis skonis buvo labiausiai jaučiamas šioje varškėje.

9 pav. Profilinė rūgštinės-fermentinės varškės skonio analizė

3.3 Priimtiniausių rūgštinės-fermentinės varškės gaminių juslinio priimtinumo

dinamika

Pasterizuotos kontrolinės varškės PSK priimtinumo kitimas per 4 paras pateiktas 10 paveiksle. Per visą tiriamąjį laikotarpį jis kito tolygiai, nuo 7,15 iki 2,60 balo ir nuo pagaminimo pradžios sumažėjo 63,63 proc.

10 pav. Rūgštinės-fermentinės varškės PSK priimtinumo dinamika 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40Rūgštus Pašalinis Kartus PSK PS56 PS63 7,15 5,17 4,13 2,60 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 24 48 72 96 P riim tinu m o v idu rk is , ba la is

Eksperimento trukmė, valandomis

24 Pasterizuotos bandomosios rūgštinės-fermentinės varškės PS56 priimtinumo kitimą per 4 paras galime matyti 11 paveiksle. Ši varškė buvo priimtiniausia iš visų pateiktų mėginių. Pirmąją dieną priimtinumas siekė 7,18 balo, antrąją nežymiai krito iki 6,93, o trečiąją matomas žymus pakitimas, priimtinumas krito iki – 4,9 balo, o paskutinę – ketvirtą – 3,55, priimtinumo sumažėjimas sudarė 50,56 proc.

11 pav. Rūgštinės-fermentinės varškės PS56 priimtinumo dinamika

Pasterizuotos rūgštinės-fermentinės varškės PS63 priimtinumo dinamika pateikta 12 paveiksle. Po 24 val. varškės priimtinumas buvo 6,70 balo ir krito tolygiai iki trečios paros iki – 6,13, o ketvirtąją parą nukrito iki 4,40 balo, priimtinumo sumažėjimas sudarė 34,33 proc.

12 pav. Rūgštinės-fermentinės varškės PS63 priimtinumo dinamika

3.4 Rūgštinės-fermentinės varškės titruojamojo rūgštingumo analizė

7,18 _6,93 4,90 3,55 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 24 48 72 96 P riim tinu m o v idu rk is , ba la is

Eksperimento trukmė, valandomis

PS56 6,70 6,40 6,13 4,40 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 24 48 72 96 P riim tinu m o v idu rk is , ba la is

Eksperimento trukmė, valandomis

25

13 pav. Iš žalio pieno pagamintos rūgštinės-fermentinės varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo kitimas per 96 val.

Lyginant kontrolinį žalio pieno varškės mėginį ŽSK su kitais mėginiais pirmąją dieną, didžiausią rūgštingumą turėjo ŽS56 mėginys – 120 °T, o mažiausią – ŽS63 – 104 °T (p˂0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės ir bandomųjų varškių nebuvo rasta.

Lyginant kontrolinę varškę ŽSK, kurios rūgštingumas buvo didžiausias – 143 °T, su kitais varškių gaminiais po pirmos paros, mažiausią rūgštingumą turėjo – ŽS59 – 130 °T (p˂0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės varškės ir bandomųjų nebuvo rasta.

Lyginant kontrolinį mėginį ŽSK, kuris turėjo mažiausią titruojamąjį rūgštingumą – 146 °T su kitais mėginiais po dviejų parų, didžiausiu rūgštingumu pasižymėjo ŽS56 mėginys – 166 °T (p˂0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės varškės ir bandomųjų varškių nebuvo rasta.

Po trijų parų mažiausią titruojamąjį rūgštingumą turėjo kontrolinė varškė ŽSK – 157 °T, o didžiausią – ŽS56 – 169 °T. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp kontrolinės ŽSK ir ŽS56 varškės (p < 0,05).

Po keturių parų palyginus kontrolinės varškės mėginį ŽSK su kitais varškių mėginiais, didžiausiu rūgštingumu pasižymėjo ŽS56 mėginys – 204 °T, o mažiausiu – ŽS63 – 170°T. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp kontrolinės ŽSK ir ŽS59 varškės (p < 0,05).

Iš pasterizuoto pieno pagamintos rūgštinės-fermentinės varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo (BTR) kitimas per 96 val. matomas 14 paveiksle.

1 1 3 ,0 0 1 4 3 ,0 0 1 4 6 ,0 0 1 5 7 ,0 0 1 8 8 ,0 0 1 2 0 ,0 0 ₁40 ,0 0 16 6 ,0 0 1 6 9 ,0 0 1 8 5 ,5 0 1 1 5 ,0 0 1 3 0 ,0 0 15 6 ,0 0 1 5 8 ,0 0 2 0 4 ,0 0 1 0 4 ,0 0 1 3 4 ,0 0 ₁56 ,0 0 1 7 0 ,0 0 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 0 24 48 72 96 T it ruo ja m as is rūg št ing um as , ° T

Ekperimento trukmė, valandomis

ŽSK ŽS56 ŽS59 ŽS63

26

14 pav. Iš pasterizuoto pieno pagamintos rūgštinės-fermentinės varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo kitimas per 96 val.

Palyginus kontrolinį pasterizuoto pieno varškės mėginį PSK su kitais mėginiais pirmąją dieną, didžiausiu titruojamuoju rūgštingumu pasižymėjo PS59 mėginys – 75 °T, o mažiausiu – PS56 – 48 °T. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės varškės ir bandomųjų varškių nenustatyta (p < 0,05).

Lyginant kontrolinį varškės mėginį PSK su kitais varškių mėginiais po vienos paros, didžiausią rūgštingumą turėjo PS59 mėginys – 97 °T, o tuo tarpu mažiausią – mėginys PS56 – 62 °T. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp kontrolinės PSK ir PS59 varškės (p < 0,05).

Po dviejų parų palyginus kontrolinę varškę PSK, su kitomis varškėmis, didžiausią rūgštingumą turėjo PS59 varškė – 101 °T, o mažiausią PS56 – 70 °T. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės varškės ir bandomųjų varškių nebuvo nenustatyta (p < 0,05).

Atlikus palyginimą, po trijų parų tarp kontrolinio mėginio PSK ir kitų mėginių, nustatyta, kad didžiausiu rūgštingumu pasižymėjo PS63 varškė – 117 °T, o mažiausiu PS56 – 84 °T. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp pasterizuotos kontrolinės PSK ir PS59 ir PV63 varškių (p < 0,05).

Palyginus kontrolinį pasterizuoto pieno varškės mėginį PSK su kitais mėginiais po keturių parų nustatyta, kad didžiausiu titruojamuoju rūgštingumu pasižymėjo PS56 mėginys – 145 °T, o mažiausiu – PS59 – 134 °T. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės varškės ir bandomųjų varškių nerasta (p < 0,05). 5 8 ,0 0 6 5 ,0 0 8 8 ,0 0 99 ,0 0 1 3 6 ,0 0 4 8 ,0 0 62 ,0 0 7 0 ,0 0 84 ,0 0 1 4 5 ,0 0 7 5 ,0 0 9 7 ,0 0 1 0 1 ,0 0 1 1 1 ,0 0 1 3 4 ,0 0 7 4 ,0 0 8 1 ,0 0 9 9 ,0 0 1 1 7 ,0 0 1 4 4 ,0 0 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 0 24 48 72 96 T it ruo ja m as is rūg št ing um as , T °

Eksperimento trukmė, valandomis

PSK PS56 PS59 PS63

27

3.5 Kontrolinės ir bandomųjų rūgštinių-fermentinių varškių bendrojo

titruojamojo rūgštingumo dinamika

15 paveiksle pateiktas iš pasterizuoto pieno pagamintos kontrolinės rūgštinės-fermentinės varškės PSK bendras titruojamojo rūgštingumo kitimas per 96 val. Iš paveikslo matyti, kad rūgštingumas per 72 val. didėjo tolygiai nuo 58 iki 99 °T, o po 96 val. žymiai išaugo iki 136 °T.

15 pav. Pasterizuotos kontrolinės varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo pasiskirstymas per 96 val.

16 paveiksle matyti iš pasterizuoto pieno pagamintos bandomosios rūgštinės-fermentinės varškės PS56 bendras titruojamojo rūgštingumo kitimas per 96 val. Iš paveikslo matome, kad rūgštingumas per 72 val. didėjo tolygiai nuo 48 iki 84 °T, o po 96 val. žymiai išaugo iki 145 °T.

16 pav. Pasterizuotos PS56 varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo pasiskirstymas per 96 val.

17 paveiksle pateiktas bandomosios, iš pasterizuoto pieno pagamintos, rūgštinės-fermentinės varškės PS63 bendras titruojamojo rūgštingumo kitimas per 96 val. Galima matyti, kad rūgštingumas tolygiai kilo 48 val. nuo 74 iki 99 °T, o po 72 val. išaugo iki 117 °T, o po keturių parų rūgštingumas siekė 144 °T. 58,00 65,00 88,00 99,00 136,00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 24 48 72 96 T it ruo ja m as is rūg št ing um as , ° T

Eksperimento trukmė, valandomis

PSK 48,00 62,00 70,00 84,00 145,00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 24 48 72 96 T it ruo ja m as is rūg št ing um as , °T

Eksperimento trukmė, valandomis

28

17 pav. Pasterizuotos PS63 varškės bendrojo titruojamojo rūgštingumo pasiskirstymas per 96 val.

74,00 81,00 99,00 117,00 144,00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 24 48 72 96 T it ruo ja m as is rūg št ng um as , °T

Eksperimento trukmė, valandomis

29

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šiomis dienomis vartotojams ypač svarbu gauti kuo natūralesnį bei sveikesnį maisto produktą. Žmonės stengiasi rinktis maistą, kuriame kuo mažiau sintetinių priedų, o taip pat ir su ilgu tinkamumo vartoti laiku. Todėl pastaraisiais metais labai daug dėmesio skiriama pieno rūgšties bakterijų (PRB) gaminamų bakteriocinų panaudojimui. Bakteriocinus gaminančios PRB gali padėti prailginti kai kurių produktų vartojimui tinkamą laiką, kontroliuoti patogeninių bakterijų augimą maisto produktuose (2).

Skonis ir kvapas yra vienos svarbiausių savybių vartotojams. Lakiųjų junginių susidarymas šviežiuose varškės sūriuose skiriasi dėl naudojamų fermentacijai bakterijų. Sūrio aromatas daugiausia priklauso nuo fermentacijos procese naudojamų pieno rūgšties bakterijų (4). Žinoma, kad vienos iš pieno rūgšties bakterijų L. lactis padermių daro didelę įtaką ne tik aromato gerinimui, bet ir naikina bakterijas, gaminančias toksinus (22).

Mūsų eksperimento metu pagaminus rūgštinę-fermentinę varškę ir ją laikius 4 paras buvo pastebėta, kad bakteriociną niziną Z gaminančios L. lactis padermės sumažino šviežios ir pasterizuotos rūgštinės-fermentinės varškės pH, nors daugelyje straipsnių teigiama, kad L. lactis silpnai rūgština ir negali sumažinti pH rodiklio žemiau 6 (2). Visi trys pagaminti rūgštinės-fermentinės varškės gaminiai su niziną Z gaminančiomis L. lactis padermėmis 56, 59 ir 63 mažino pH žemiau šios vertės, todėl galima teigti, kad buvo geri rūgštintojai ir išreiškė vieną iš svarbiausių sūrių gamybos savybių – gebėjimą greitai pagaminti rūgštį (6). Mūsų gautus rezultatus patvirtina ir kitų tyrėjų darbai. 2014 m. Skabeikytė E. ir kt. (27) išskyrė penkias bakteriocinus gaminančias L. lactis padermes iš kalninio dašio (Satureja montana L.) ir paprastojo rapontiko (Rhaponticum carthamoides (CD.) Iljin) augalų, kurios buvo panaudotos nebrandinto varškės sūrio gamyboje. Bendras L. lactis kiekis augalų bioproduktuose svyravo nuo 7,46 iki 9,42 log10 KSV/g priklausomai nuo L. lactis padermės ir augalo rūšies. Kalninio dašio ir paprastojo rapotniko augalų fermentacija su L. lactis žymiai sumažino mezofilinių bakterijų, enterobakterijų, mielių ir grybų sporų kiekį. Šių bioproduktų panaudojimas gaminant nebrandintą varškės sūrį sumažino pH ir padidino bendrąjį titruojamąjį rūgštingumą bei lakiųjų junginių (timolio, karvololo, p-cymeno) kiekį ir pagerino sūrio priimtinumą. Lactobacillus sakei fermentuoti bioproduktai, palyginti su rezultatais, gautais pridėjus nefermentuotą Satureja montana L., sumažino biogeninių aminų kiekį sūriuose.

Atlikus eksperimentinių gaminių su niziną gaminančiomis L. lactis juslinio priimtinumo tyrimą paaiškėjo, kad didžiausiu priimtinumu pasižymėjo 56 ir 63 padermės. Jų priimtinumas statistiškai nesiskyrė nuo kontrolinio mėginio, todėl šiems gaminiams buvo atlikta juslinė profilinė analizė. Atlikus priimtiniausių varškių profilinę analizę nustatėme, kad mėginiai savo jusliniu

30 profiliu – konsistencija, skoniu ir kvapu mažai skyrėsi vienas nuo kito. Stipriausiu rūgščiu kvapu ir skoniu pasižymėjo kontrolinė varškė. Nors mūsų tyrimų metu nustatėme, kad laukinės L. lactis gana gerai raugina pieną, tačiau kontrolinio produkto, sprendžiant iš kvapo-skonio profilio, visgi nepralenkia. Panašius rezultatus gauna ir kiti tyrėjai. 2018 m. Van Thi Thuy Ho ir kt. (15) atliko tyrimą su 897 PRB izoliatais, gautais iš žolelių, vaisių ir daržovių. Keturiolika izoliatų, kuriuose nustatyta Lactococcus lactis pasižymėjo ypač dideliu aktyvumu, visuose izoliatuose buvo rasta nizino genų. Laukinės L. lactis padermės lėtai utilizavo laktozę ir rūgštino pieną, nepaisant didelių augimo tempų. Laboratorijoje pagamintame sūryje, kuris fermentuotas su laukinėmis ir pramoninėmis L. lactis padermėmis nustatytas daugiau nei 300-400 kartų padidėjęs 3-metilbutalio kiekis, kuris yra labai svarbus faktorius sūrio kvapui ir skoniui.

Mūsų tyrimais nustatėme, kad varškė, pagaminta iš pasterizuoto pieno, buvo jusliškai statistiškai patikimai priimtinesnė. Spėjame, kad žaliame piene natūraliai esanti mikroflora ir pridedamas rauginimo metu L. lactis sąveikauja tarpusavyje, taip įtakodami varškės juslines savybes. Be to, remiantis ir daugelio tyrimų duomenimis nustatyta, kad pieno terminis apdorojimas turi didelę įtaką pieno produktų skoniui. Tačiau nėra žinoma, ar pasterizacija turi bendrą poveikį skoniui ar poveikis yra specifinis tam tikriems sūriams. Kanzas Sičio mokslininkai atliko tyrimą su septyniomis Prancūziško sūrio rūšimis (Bri, Kulomjeras, Kamamberas, Saint Nectare, Munster, Chevre, Bleu), kurioms buvo sudaryti priimtinumo profiliai tiek iš pasterizuoto, tiek ir iš žalio pieno pagamintiems sūriams. Žalio pieno sūriai pasižymėjo ryškesniu kvapu, nei pasterizuoto pieno sūriai. Minkštų, su pelėsio odele (Bri, Kulomjeras, Kamamberas, Saint Nectare) taip pat ir Chevre, Bleu sūrių pagamintų iš termiškai apdoroto pieno profiliai minimaliai skyrėsi nuo iš žalio pieno pagamintų sūrių, tačiau Munster sūrio juslinis įvertinimas visiškai neatitiko profilio. Rezultatai rodo, kad daugeliui, bet ne visų sūrių tipams, pieno pasterizacija turi įtakos juslinėms savybėms(3).

Kaip žinoma, švieži ir minkšti sūriai yra tinkama terpė daugelio mikroorganizmų dauginimuisi (4). PRB gali prisidėti ne tik prie pageidaujamo skonio ir fizikinių savybių sudarymo, bet ir prie pieno produktų išsaugojimo (23).

Mūsų gauti rezultatai suteikė žinių apie ne iš pieno gautų L. lactis padermių juslines ir technologines savybes. Galime teigti, kad šios laukinės L. lactis padermės gali būti ne tik panaudotos raugintų pieno produktų gamyboje, bet ir kaip natūralūs konservantai kontroliuojant žalingų bakterijų augimą sūriuose.

31

IŠVADOS

1. Ištyrus bendrą rūgštinės-fermentinės varškės juslinį priimtinumą, priimtiniausi buvo pasterizuoto pieno rūgštinės-fermentinės varškės mėginiai. PSK surinko 7,15, PS56 – 7,18 ir PS63 – 6,70 balo. Po 4 dienų nustatytas mėginių priimtinumo mažėjimas. Kontrolinio mėginio priimtinumas nuo pagaminimo pradžios sumažėjo 63,63 proc., PS59 – 50,56 proc., PS63 - 34,33 proc.

1.1. Atlikus varškių, pagamintų su kontroliniu, PS56 ir PS63 raugais konsistencijos profilinę analizę nustatyta, kad tarp visų mėginių sprangumu labiausiai pasižymėjo PS63. Nesurišta konsistencija labiausiai išsiskyrė kontrolinė ir PS56 varškės. PS63 varškė išsiskyrė didžiausiu sausumu ir kruopėta konsistencija.

1.2. Atlikus priimtiniausių mėginių (PSK, PS56, PS63) skonio vertinimą, labiausiai rūgščiu skoniu išsiskyrė kontrolinė PSK varškė. Nustatyta, kad visuose tirtuose mėginiuose tarp kartaus skonio statistiškai patikimo skirtumo nėra. Pašaliniu skoniu ir spalvos intensyvumu labiausiai pasižymėjo kontrolinė varškė.

2. Bandomieji raugai PS56 ir PS63 statistiškai patikimai geriau raugino pieną, nei kontrolinis raugas.

32

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Aly S, Cheik QAT, Imael BHN, Alfred T. Bacteriocins and lactic acid bacteria - a minireview. African Journal of Biotechnology.2006; 678-683.

2. Beasley S. Isolation, identification and exploitation of lactic acid bacteria from human and animal microbiota. Helsinki: Department of Applied Chemistry and Microbiology [Internet]

2004.[cited 2018 Jan 15]. Available from:

https://pdfs.semanticscholar.org/641e/0c5082319d057e560dc659f6898c9955605f.pdf.

3. Chambers DH, Esteve E, Retiveau A. Effect of milk pasteurization on flavor properties of seven commercially available french cheese types [Internet].2010 Aug 1 [cited 2019 Jan 29]. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1745-459X.2010.00282.x DOI: 10.1111/j.1745-https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1745-459X.2010.00282.x.

4. Choi K-H, Lee K, Lee S, Kim S, Yoon Y. Cheese Microbial Risk Assessments — A Review [Internet].2016 Feb 24 [cited 2019 Jan 8]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4811779/ DOI: 10.5713/ajas.15.0332.

5. Coelho MC, Silva CCG, Ribeiro SC, Dapkevicius MLNE, Rosa HJD. Control of Listeria monocytogenes in fresh cheese using protective lactic acid bacteria [Internet]. 2014 Aug 23

[cited 2019 Feb 15]. Available from:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160514004334 DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.08.029.

6. Dal Bello B, Cocolin L, Zeppa G, Field D, Cotter PD, Hill C. Technological characterization of bacteriocin producing Lactococcus lactis strains employed to control Listeria monocytogenes in cottage cheese [Internet].2012 Feb 2 [cited 2019 Feb 20]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22104121 DOI 10.1016/j.ijfoodmicro.2011.10.016.

7. Dėl juslinės analizės metodikų patvirtinimo. Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro įsakymas [elektroninis išteklius] 2003. [žiūrėta 2018 kovo 6d.]. Prieiga per internetą: https://e-seimas.lrs.lt/portal/legalAct/lt/TAD/TAIS.213810?jfwid=q8i88lfti.

8. Djadouni F, Kihal M. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria and the spectrum of their biopeptides against spoiling germs in foods [Internet]. 2012 Mar 23 [cited 2012 Jun 21].

Available from:

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-89132012000300015&script=sci_arttext&tlng=pt DOI: 10.1590/S1516-89132012000300015. 9. Farkye NY. Quark, Quark-like Products, and Concentrated Yogurts. In: McSweeney PLH., Fox PF, Everett DW, editors. Cheese (Fourth edition):chemistry, physics and microbiology. California: San Luis Obispo; 2017. Chapter 43; p. 1103-1110.

33 10. Fermentuotas pienas. Titruojamojo rūgštingumo nustatymas. Potenciometrinis metodas (tapatus ISO/TS 11869:2012). LST ISO/TS 11869:2013. [elektroninis išteklius]. Lietuvos standartizacijos departamentas; 2013. [žiūrėta 2018 kovo 15 d.] Prieiga per internetą: http://www.lsd.lt/index.php?278151460.

11. Food preservative kills cancer cells, superbugs. [Internet] [cited 2018 Jan 03] Available from: https://www.rogelcancercenter.org/news/archive/food-preservative-kills-cancer-cells-superbugs.

12. Garde S, Gómez-Torres N, Hernández M, Ávila M. Susceptibility of Clostridium perfringensto antimicrobials produced by lactic acid bacteria: Reuterin and nisin [Iternet]. 2014 Apr

2 [cited 2018 Jan 15]. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713514001595 DOI:10.1016/j.foodcont.2014.03.034.

13. Grosu-Tudor S-S, Stancu M-M, Pelinescu D, Zamfir M. Characterization of some bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from fermented foods. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2014, 2459–2469-9.

14. Gudonis A. Pieno gaminių technologija. Utena: Utenos Indra; 2012 p. 158.

15. Ho VTHTH, Lo R, Bansal N, Turner MS. Characterisation of Lactococcus lactisisolates from herbs, fruits and vegetables for use as biopreservatives against Listeria monocytogenes in cheese [Internet].2018 Mar 29 [cited 2019 Jan 19]. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095671351730453X?via%3Dihub DOI: 10.1016/j.foodcont.2017.09.036.

16. Jankauskienė R. Lactoflora of carp (Cyprinus carpio L.) intestinal tract. Vilnius: Natural sciences: biology (ecology). 1996. p. 78-83.

17. Juslinė analizė. Metodika. Bendrieji nurodymai (tapatus ISO 6658:2017). LST ISO 6658:2017. [elektroninis išteklius]. Lietuvos standartizacijos departamentas; 2017. [žiūrėta 2018 kovo 15 d.] Prieiga per internetą: http://lsd.lt/index.php?1592523223.

18. Kamarajan P, Hayami T, Matte B, Liu Y, Danciu Th, Kapila Y et al. Nisin ZP, a Bacteriocin and Food Preservative, Inhibits Head and Neck Cancer Tumorigenesis and Prolongs Survival[Internet]. 2015 Jul 1 [cited 2017 Mar 04]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4489501/ DOI: 10.1371/journal.pone.0131008.

19. Kondrotiene K, Kasnauskyte K, Serniene L, Alter Th, Kaskoniene V, Malakauskas M et al. Characterization and application of newly isolated nisin producing Lactococcus lactisstrains for control of Listeria monocytogenes growth in fresh cheese [Internet]. 2018 Jan 18 [cited 2019 Jan 17]. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643817306965 DOI: 10.1016/j.lwt.2017.09.021.

34 20. Lietuvos žemės ir maisto ūkis 2017[elektroninis išteklius]. [žiūrėta 2019 kovo 12 d.]. Prieiga per internetą:https://www.laei.lt/?mt=leidiniai&straipsnis=1333&metai=2018.

21. Mozuriene E, Bartkiene E, Juodeikiene G, Zadeike D, Basinskiene L, Maruska A et al. The effect of savoury plants, fermented with lactic acid bacteria, on the microbiological contamination, quality, and acceptability of unripened curd cheese. LWT – Food Science and Technology. 2016; 69:161-168.

22. Nyberg J. Microorganisms influence on quality and flavor of cheese. Sweden: Swedish University of Agricultural Sciences [Internet] 2016. [cited 2018 Jan 20]. Available from: https://stud.epsilon.slu.se/9039/1/nyberg_j_160513.pdf.

23. Pacheco FP, Galindo AB. Microbial safety of raw milk cheeses traditionally made at a pH below 4.7 and with other hurdles limiting pathogens growth. Mexico: Colegio de Postgraduados

[Internet] 2004. [cited 2018 Jan 15]. Available from:

https://pdfs.semanticscholar.org/d978/d09f51f3044215b92fb235e28a559001e1bc.pdf.

24. Parada JL, Caron CR, Medeiros ABP, Soccol CR. Bacteriocins from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives [Internet]. 2007 Mar 9 [cited 2007 May 18]. Available from: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132007000300018&lng=en&tlng=en#top DOI: 10.1590/S1516-89132007000300018.

25. Pieno sektoriaus svarba Lietuvoje. [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2019 kovo 12 d.]. Prieiga per internetą:https://www.ekt.lt/wp-content/uploads/2017/03/Pieno-sektoriaus-svarba-Lietuvoje.pdf.

26. Pimentel Filho N De J, Mantovani H, Carvalho AF, Dias RS, Vanetti MCD. Efficacy of bovicin HC5 and nisin combination against Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in fresh cheese [Internet]. 2013 Aug 30 [cited 2018 Jan 8]. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/ijfs.12316 DOI:10.1111/ijfs.12316.

27. Skabeikytė E; Jocienė G; Bartkienė E; Juodeikienė G; Vidmantienė D; Maruška A ir kt. The influence of the fermented with certain lactobacilli Rhaponticum carthamoides on the quality and safety of curd cheese [elektroninis išteklius]. Kaunas: Vytauto Didžiojo universitetas; 2014. [žiūrėta 2019 vasario 15 d.]. Prieiga per internetą: VDU DSpace/CRIS.

28. Urbienė S. Pieno ir jo produktų cheminės analizės metodai. Kaunas: Lietuvos maisto institutas; 1999. p. 56.

29. Varškė [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2019 m. vasario 15 d.]. Prieiga per internetą:http://vmvt.lt/node/431.

30. Wessels S, Axelsson L, Hansen EB, De Vuyst L, Laulund S, Lähteenmäki L et al. The lactic acid bacteria, the food chain, and their regulation [Internet]. 2004 Mar 3 [cited 2018 Mar 15].

35 Available from: https://cris.vtt.fi/en/publications/the-lactic-acid-bacteria-the-food-chain-and-their-regulation DOI: 10.1016/j.tifs.2004.03.003

31. Xu H, Fu Y, Mu D, Qiao W, Zhu D, Liu F et al. Co-expression of Nisin Z and Leucocin C as a Basis for Effective Protection Against Listeria monocytogenes in Pasteurized Milk [Internet]. 2018 Mar 23 [cited 2019 Jan 8]. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.00547/fullDOI: 10.3389/fmicb.2018.00547