LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Justina Šiupinienė
Dihidrokvercetino kiekio ir antioksidacinio aktyvumo
tyrimai funkcionaliosiose vytintose ir šaltai rūkytose dešrose
Dihydroquercetin quantity and antioxidant activity research
in functional cured and cold-smoked sausages
Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: Prof. dr. Gintarė Zaborskienė Maisto saugos ir kokybės katedra
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Dihidrokvercetino kiekio ir antioksidacinio aktyvumo tyrimai funkcionaliosiose vytintose ir šaltai rūkytose dešrose“. 1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Justina Šiupinienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Justina Šiupinienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Prof. dr. Gintarė Zaborskienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (INSTITUTE)
Prof. dr.Mindaugas Malakauskas
(aprobacijos data) (katedros (instito) vedėjo vardas,
pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1) Prof. dr. G. Januškevičienė
2) Lekt. dr. S. Ramonaitė
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Flavonoidų savybės ... 91.2 Spektrinė flavonoidų charakteristika ... 11
1.3 Flavonoidų metabolizmas ... 12
1.4 Dihidrokvercetino chemija ir farmakokinetika ... 13
1.5 Dihidrokvercetinas ir vėžys ... 14
1.6 Oksidacinis stresas ... 15
1.7 Funkcionalus maistas ir jo nauda žmogaus sveikatai ... 16
1.8 Antioksidacinių dihidrokvercetino savybių panaudojimas mėsos pramonėje ... 17
2 TYRIMŲ METODAI IR ORGANIZAVIMAS ... 18
2.1 Tyrimo atlikimo vieta ir laikas ... 18
2.2 Tyrimo objektas ir metodai ... 18
2.2.1 DPPH antioksidacinio aktyvumo tyrimas ... 19
2.2.2 Dihidrokvercetino kiekybinė analizė ... 20
2.2.3 Juslinis vertinimas ... 21
2.2.4 Statistinė analizė ... 22
3 TYRIMŲ REZULTATAI ... 23
3.1 Dihidrokvercetino antiradikalinio (antioksidacinio) aktyvumo DPPH nustatymas ... 23
3.2 Juslinis savybių ir priimtinumo vertinimas ... 24
3.2 Dihidrokvercetino kiekybinė analizė ... 25
4 REZULTATŲ APTARIMAS ... 27
IŠVADOS ... 29
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 30
4
SANTRAUKA
Dihidrokvercetino kiekio ir antioksidacinio aktyvumo tyrimai funkcionaliosiose vytintose ir šaltai rūkytose dešrose
Justina Šiupinienė Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: prof. dr. Gintarė Zaborskienė.
Tyrimas atliktas 2014 m. – 2018 m. Lietuvos Sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Veterinarijos fakultete, Maisto saugos ir kokybės katedroje ir UAB „Rokiškio pragiedruliai“ įkurtame biocheminių tyrimų centre.
Darbo apimtis 58 psl., darbe pateikta 12 lentelių, 3 pav., cituoti 63 literatūros šaltiniai. Darbo tikslas: atlikti dihidrokvercetino kiekybinę analizę ir antioksidacinį aktyvumą vytintose ir šaltai rūkytose dešrose.
Darbo uždaviniai: atlikti dihidrokvercetino antioksidacinio aktyvumo tyrimus vytintose ir šaltai rūkytose dešrose, atlikti kiekybinę dihidrokvercetino analizę dešrų pusgaminiuose, vytintose bei šaltai rūkytose dešrose, nustatyti šaltai rūkytų ir vytintų dešrų priimtinumą, statistikai išanalizuoti dešrų su dihidrokvercetino priedu tyrimų duomenis, apibendrinti rezultatus ir pateikti išvadas.
Rezultatai. Lyginant vytintų dešrų DPPH aktyvųjį radikalinį (antioksidacinį) aktyvumą dešrose su DHQ priedu ir be priedo, mėginyje su DHQ žymiai didesnis antioksidacinis aktyvumas, kai p ≤ 0,05. Vytintose dešrose tarp DHQ kiekio ir DPPH radikalinio (antioksidacinio) aktyvumo nustatyta stipri teigiama priklausomybė r=0,754. Lyginant šaltai rūkytų dešrų DHQ kiekį mažiausias nustatytas mėginyje tik su DHQ priedu. Vidutinė neigiama priklausomybė nustatyta šaltai rūkytų dešrų mėginiuose tarp DPPH antioksidacinio aktyvumo ir DHQ kiekio, r=-0,557. Vytintų dešrų bendras priimtinumas aukščiausiai įvertintas mėginyje su DHQ priedu (5 balai iš 6). Vytintose dešrose tarp bendro priimtinumo ir DHQ kiekio nustatyta vidutinė teigiama priklausomybė r=0,510. Rūkytų dešrų su DHQ priedu bendras priimtinumas įvertintas 6 balais iš 6.
Išvados. Kiekybinė dihidrokvercetino analizė dešrų pusgaminiuose, vytintose ir šaltai rūkytose dešrose parodė, kad nepaisai to, jog buvo naudotas vienodas DHQ 0,03 proc. pusgaminyje rezultatai gauti skirtingi, todėl galima daryti išvadą, kad bakterijų kultūros ir technologiniai procesai, bei jų veikimas kartu turi įtakos DHQ kiekiui. Atliktas šaltai rūkytų ir vytintų dešrų bendras priimtinumo vertinimas parodė, kad dihidrokvercertinas teigiamai veikia juslines gaminių savybes ir bendrą priimtinumą.
Raktiniai žodžiai: dihidrokvercetinas, vytinta dešra, šaltai rūkyta dešra, antioksidacinis aktyvumas
5
SUMMARY
Dihydroquercetin quantity and antioxidant activity research in functional cured and cold-smoked sausages
Justina Šiupinienė Master’s thesis The supervisor of the work: prof. dr. Gintarė Zaborskienė.
Place and time of accomplishment: the master‘s thesis was prepared in Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Department of Food Safety and JSC “Rokiskio pragiedruliai” Industrial Biochemistry Research Center during the period of the year 2014 – 2018.
Scope of the work: 58 pages, 3 pictures, 12 tables, 63 references, 12 appendixes.
Thesis tasks: to analyse dihydroquercetin antioxidant activity research in functional cured and cold-smoked sausages, to analyse dihydroquercetin quantity in semi-finished sausages products, functional cured and cold-smoked sausages, to evaluate the sausages’ acceptability and to analyse dihydroquercetin supplement research in functional cured and cold-smoked sausages.
Results. Comparing DPPH radical (antioxidant) activity in cured sausages with and without the addition of DHQ, the sample with DHQ has significantly higher antioxidant activity (p ≤ 0.05). Strong positive affinity was found in the cured sausages between DHQ and DPPH radical (antioxidant) activity (r=0,754). Comparing DHQ content of cold smoked sausages with DHQ, the minimum sample was found in cold smoked only with the DHQ supplement. The average negative dependency was found in the cold smoked sausages between DHQ and DPPH radical (antioxidant) activity (r=-0,557). The total acceptability of cured sausages is highest in the sample with a DHQ supplement (5 out of 6). The average positive affinity was found in the cured sausages between total acceptability and DHQ content (r=0,510). Total acceptability of smoked sausages was rated 6 points out of 6.
Conclusions. The quantitative analysis of dihydroquercetin in semi-finished sausages products, cured sausages and smoked sausages has shown that despite the fact that the same was used 0.03 percent of dihydroquercetin in semi-finished sausages the results are different. So we can concluded, that bacterial culture and technological processes and their operation together, affects the amount of DHQ. Assessment of cold-smoked and cured sausages has shown that DHQ has a beneficial effect on the sensory properties and overall acceptability of the products.
6
SANTRUMPOS
DHQ – dihidrokvercetinas, natūralus flavanoidas, pasižymintis aukštu biologiniu aktyvumu. DPPH - antioksidacinis aktyvumas
K – kontrolė
Kultūra 1 – probiotinė kultūra, kurią sudaro Leuconostoc carnosum
Kultūra 2
–
probiotinė kultūra, kurią sudaro Staphylococcus xylosus, Pediococcus pentosaceus/AKultūra 2 – probiotinė kultūra, kurią sudaro Staphylococcus xylosus, Pediococcus pentosaceus ROS – reaktyvios deguonies formos
RNS – aktyvios azoto formos
FM – funkcionalus maistas, plataus vartojimo kasdien valgomas maistas, kuris be mitybinės vertės, daro papildomą fiziologinį poveikį žmogaus organizmui.
7
ĮVADAS
Viena didžiausių žmonijos problemų – nepakankama maisto produktų apsauga. Kasmet visame pasaulyje prarandama maždaug 30 procentų maisto produktų ir kalti ne vien tik mikroorganizmai. Didelę žalą daro nesustabdomi oksidacijos procesai. Vykstantys riebalų oksidacijos procesai ne tik keičia produktų juslines savybes, bet gali daryti žalingą poveikį žmogaus organizmui. Todėl į šią problemą negalima žiūrėti atsainiai, tai turi būti vienas svarbiausių klausimų ne tik mūsų šalyje, bet ir visame pasaulyje.
Flavonoidai yra hidroksilinti fenolių dariniai, kurių gamybą augaluose paskatina mikrobinės infekcijos. Jų aktyvumas priklauso nuo struktūrų. Cheminė prigimtis priklauso nuo struktūrinės klasės, hidroksacijos laipsnio, kitų kitimų ir polimerizacijos laipsnio [1]. Didžiausią susidomėjimą kelia nauda sveikatai, kurią stimuliuoja šių polifenolinių junginių antioksidacinės savybės. Šios savybės prikalauso nuo hidroksilo grupių, laisvųjų radikalų ir metalų jonų kompleksinimo. [2, 3] Flavonoidų būvimas maiste ir nauda sveikatai siejama su antioksidaciniu aktyvumu, kuris yra įrodytas ir in vivo ir in vitro [1]. Flavonoidai turi savybę aktyvinti žmogaus organizmo fermentų sistemą. Daugelis atliktų tyrimų parodė, kad flovavoidai geba apsaugoti nuo daugelio infekcinių (bakterinių ir virusinių) susirgimų, degeneracinių ligų, širdies ir kraujągyslių , vėžinių susirgimų, taip pat nuo daugelio su amžiumi susijusių ligų [4, 1]. Flavonoidai taip pat pasižymi antioksidacinėmis savybėmis antrinėj augalų audinių gynybinėj sistemoj prieš abijotinius ir bijotinius stresus [1].
Vienas „naujausių“ natūralių junginių ir labai daug mokslininkų dėmesio susilaukiantis - dihidrokvercetinas (DHQ), kuris išgaunamas iš Sibiro maumedžio (Larix occidentalis). Jo medienoje ir žievėje randama apie 3,5 proc. DHQ – vienas stipriausių antioksidantų randamas gamtoje. Jo aptinkama svogūnuose, Prancūzijos paprastosios pušies žievėje, pieniname ūsny, tamarindų sėklose, taip pat komerciškai prieinamas pusiau sintetinis parduodamas kaip vaistinis preaparatas. Šiuo metu labai didelis dėmesys skiriamas DHQ naudai įvairių ligų prevencijai, pavyzdžiui, vėžio, širdies ir kraujągyslių ligoms, kepenų susirgimams. Iki šiol DHQ retai naudojamas kaip vienetas, dažniausiai aptinkamas kompleksiniuose preparatuose. Atlikus aukšto slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) analizę įrodyta, kad fenoliniuose junginiuose buvęs ir tik vienu iš sudėtinių komponentų laikytas DHQ, „groja“ pagrindiniu smuiku ir pasižymi aukštu antioksidaciniu aktyvumu [26].
Jau atlikti tyrimai su lašiniais įrodė, kad DHQ pasižymi veiksmingumu ir produkto galiojimo laikas pailgėjo. Taip pat produkto tyrimai įrodė, kad DHQ yra visiškai saugus ir nekeičia pageidautinų produkto savybių. Dešros pagamintos su DHQ rekomenduojama doze
8 neturi toksinio poveikio nei gyvūnams, nei žmonėms [59]. DHQ dozė parenkama atsižvelgiant į kiekvieno produkto drėgmės ir riebalų kiekį. Pakeitus rozmarino ekstraktą į DHQ kiaulienos produktuose pasiekta finansinė nauda [60].
Mūsų tikslas, įvertinti dihidrokvercetino, kaip natūralaus antioksidanto, panaudojimo galimybes gaminant funkcionaliąsias vytintas ir šaltai rūkytas dešras.
Darbo tikslas: nustatyti dihidrokvercetino antioksidacinį aktyvumą ir jo kiekius vytintų ir šaltai rūkytų dešrų pusgaminiuose ir galutiniuose gaminiuose.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti dihidrokvercetino antioksidacinio aktyvumo tyrimus vytintose bei šaltai rūkytose dešrose po pagaminimo su dihidrokvercetino priedu.
2. Atlikti dihidrokvercetino kiekybinę analizę pusgaminiuose ir vytintose bei šaltai rūkytose dešrose po pagaminimo.
3. Nustatyti šaltai rūkytų bei vytintų dešrų priimtinumą.
4. Statistiškai išanalizuoti dešrų su dihidrokvercetino priedu tyrimų duomenis, apibendrinti rezultatus ir pateikti išvadas.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Flavonoidų savybės
Flavonoidai pagal cheminę struktūrą priskiriami fenoliniams junginiams [5]. Flovanoidai atsirado iš aglukonų, gliukozidų ir jų metilintų darinų. Pagrindinė flovanoidų struktūra – aglikoninė. Du benzeno žiedai A ir B tarpusavyje sujungti α-pironu arba dehidrintais jo dariniais C 1 pav. [7]. Flavonoidai skirstomi į šešis pogrūpius: flavonus (apigeninas, luteolinas, flavopiridolinas), flavononus (hesperetinas, narigeninas), flavanolius (epikatechinas, apigalokatechinas, katechinas), flavanonolius (taksifolinas, pinobaksinas), izoflavonus (daidzeinas, genisteinas) ir flavonolius (kvercetinas, miricetinas, rutinas). Tai įtakoja C žiede dviguba jungtis tarp 2 ir 3 anglies atomų, taip pat nuo funkcinių grupių, tokių kaip metoksi, hidroksi padėčių [6]. Flavonolių dažniausiai yra hidroksilo grupė ties 3-čiuoju anglies atomu ir antrą bei trečią anglies atomus jungia dviguva jungtis. Flovanoidų džniausiai hidroksilintos grupės yra 3, 5, 7, 2, 3`, 4`, arba 5`. Kai susidaro glikozidai, glikozidinė jungtis įprastai yra 3-čioje arba 7-oje padetyse ir angliavandeniai gali būti L-ramnozės, D-gliukozės, galaktozės arba arabinozės [1].
1 pav. Flavonoidų aglikono struktūra[7]
Flavonoidai yra labiausiai paplitusi ir daugiausia susidomėjimo kelianti fenolinių junginių grupė tiriama visose augalo dalyse, bet ypač fotosintetinami augalų ląstelėse. Jų būvimas lemia žydinčių augalų spalvą. Flavonoidai yra neatskiriami žmonių ir gyvūnų mityboje. Būdami fitochemikalais jie negali būti natūraliai sintetinami žmonių ir gyvūnų[8]. Gyvūnų organizmuose randami flavonoidai yra organinės kilmės iš augalų, kurie yra biosintetinami „in situ“. Iš flavonoidų augaluose dažniausiai aptinkami flavonoliai. Flavonoidai maiste paprastai atsakingi už spalvą, skonį, riebalų oksidaciją, ir apsaugo vitaminus bei fermentus. [9] Daugiausia flavonoidų grupių žmogaus mityboje randama sojos izoflavonų, flavonolių ir flavonų. Daugiausia vaisiuose ir ankštiniuose randama ketechinų, kiekis svyruoja nuo 4,5 iki 610 mg/kg
10 [1]. Priklausomai nuo maisto apdorojimo būdo ir lygio flavonoidų kiekis gali sumažėti. Pavyzdžiui, apelsinų sultyse tyrimų metu buvo nustatyta 81 – 200 mg/l tirpių flavanonų, tačiau didžiausia jų koncentracija nustatyta žievėje 206 – 644 mg/l, tai rodo, kad flavanonai susitelkę žievėje nepaisant saugojimo ir apdirbimo sąlygų. [10, 32] Sunku įvertinti kiek žmogus pasisavina flavonoidų su maistu, dėl skirtingo ir ekstensyvaus jų pasiskirtymo skirtingose augalinio maisto dalyse ir neapibrėžto suvartojimo [1].
Flavonoidai žmonių vartojami nuo tada kaip jie atsirado žemėje, jau maždaug 4 milijonai metai. Jie turi daug biologinių savybių, kurios skatina žmonių sveikatingumą ir mažina ligų riziką. Oksidacinis blogojo cholesterolio modifikavimas turi didelės įtakos aterosklerozei. Polifenoliniai junginiai randami pupinių šeimos augaluose slopina mažo tankio lipoproteinų oksidaciją naudojant laisvųjų radikalų plovimo mechanizmą[11]. Keletas epidemiologinių tyrimų įrodo, kad žalioji ir juodoji arbatos gali sumažinti cholesterolio koncentraciją kraujyje ir kraujo spaudimą, tai savotiškai apsaugo nuo širdies ir kraujągyslių ligų. Neseniai dėmesį patraukė vaistinių augalų terapinis potencialas ir gauti labai reikšmingi rezultatai, ypač tų, kurių didžiąją dalį fenolinių junginių sudaro flavonoidai [11, 12].
Flavonoidai randami uogose daro teigiamą poveikį senyvo amžiaus žmonėms, kurie serga Parkinsono liga. Antihipertenzinis poveikis buvo pastebėtas tyriamų žiurkių sergančių hipertenzija [13]. Flavonoidų antioksidacinis poveikis pastebėtas tiriant riziką susirgti smegenų dimensijos. [1] Flavonoidai taip pat žinomi kaip maisto produktų savybių saugotojai veikdami kaip antioksidantai, dažikliai ar aromatizatoriai [1, 14].
11
1.2.
Spektrinė flovanoidų charakteristika
Spektroskopiniai UV tyrimai parodė, kad dauguma flavonų ir flavonolių sudaryti iš kelių aromatinių žiedų, eksponuojami keliuose sugerties diapazonuose: pirmas diapazonas (240 - 285 nm) matomi B žiedo sugertis, antru diapazonu A žiedo sugertis, o trečiame C žiedo (300 - 550 nm) [15, 16]. Prijungtos funkcinės grupės prie flavonoidų pagrindinės cheminės sudėties diapazoną gali keisti, pavyzdžiui nuo 367 nm kamferolio (3, 5, 7, 4` - hidroksilo grupės) iki 371 nm kvercetino (3, 5, 7, 3`, 4` - hidroksilo grupės) ir miricetinas 3, 5, 7, 3`, 4`, 5` - hidroksilo grupės) [17].
12
1.3. Flavonoidų metabolizmas
Vienas iš veiksnių, kuris gali įtakoti gydomajį flavonoidų poveikį – jų tirpumas. Mažas tirpumas vandenyje įtakoja trumpą buvimą žarnyne taip pat mažą įsisavinamumą, o tai apsaugo vartotojus nuo ūmaus toksiško efekto, kurį gali sukelti flavonoidai, išskyrus retai pasitaikančias alergijas. Mažas tirpumas dažnai įtakoja tai, kad flavonoidai neįtraukiami į gydymo procesą. [1]
Flavonoidų išsiskyrimas juos kramtant priklauso nuo jų fizinių ir cheminių savybių, tokių kaip molekulių dydis, konfiguracijos, lipofiliškumas, tirpumas ir pKa. Flavonoidai gali būti absorbuojami plonojoje žarnoje arba prieš absorbciją keliauja į gaubtinę žarną. Tai gali įtakoti jų struktūra, ar ji yra glikozidinė ar aglikoninė. Dauguma flavonoidų, išskyrus katechinus, augaluose egzistuoja kaip cukrai arba B – glikozidai. Aglikonai lengvai absorbuojami plonojoje žarnoje, tuo tarpu glikozidiniai flavonoidai turi būti pakeisti į aglikoninę formą [18].
Hidrofilinis glikozidinis flavonoidas, toks kaip kvercetinas keliauja plonąja žarna padedant Na + jonams ir blokuoja gliukozės įsisavinamumą. Alternatyvus mechanizmas rodo, kad gliukozidiniai flavonoidai hidrolizuojami padedant laktozės floridino hidrolazės (LFH) ir β – gliukozidazės, tai įtakoja žarnos gaureliai esantys sienelių išorėje. Taip išlaisvinama aglikoninė struktūra ir gali būti pasisavinama plonojoje žarnoje[19]. LFH fermentas specifiškas glikozidiniams flavonoidams (gliukozidams, galaktozidams, arabinozidams, ksilozidams ir ramnozidams) [21]. Gliukozidai, kuriems fermentas poveikio neturi keliauja į gaubtąją žarną kur yra hidrolizuojami specifinių bakterijų, tuo pat metu pablogėja aglikoninių flavonoidų išlaisvinimas [20]. Gaubtinės žarnos absorbcija daug mažesnė nei plonosios žornos, todėl ir įsisavinamumas gali būti minimaliai tikėtinas.
Po absorbcijos flavonoidai yra paruošti kepenų gliukuronidinimui, sulfatinimui, metilinimui arba metabolizavimui į mažesnius fenolinius junginius [20]. Dėl šių pakitimų laisvų aglikoninių flavonoidų galima rasti plazmoje arba šlapime, išskyrus katechinus [25]. Priklausomai nuo maisto, iš kurio gaunami flavonoidai, jų prieinamumas labai skiriasi, pavyzdžiui, kvercetino įsisavinamumas iš svogūnų keturis kartus didesnis nei iš obuolių ar arbatos [22, 29]. Flavonoidai, kurie išskiriami į žarnyną su tulžimi ir tie, kurie negali būti absorbuojami plonojoje ar gaubtinėje žarnose, paveikiami žarnyno mikrofluoros ir suardoma jų žiedinė struktūra. Oligomeriniai flavonoidai gali būti hidrolizuoti į monomerus ar dimerus skrandžio rūgštčių pagalba. Didesnės molekulės pasiekia gaubtinę žarną ir yra veikiamos bakterijų. Cukrinis glikozidinių flavonoidų fragmentas yra svarbus veiksnys, kuris įtakoja jų prieinamumą. Yra įrodita, kad dimerizacija mažina biologinį prieinamumą. Lyginant visus flavonoidų poklasius izoflavonai pasižymi aukščiausiu biologiniu prieinamumu [23]. Išgėrus žalios arbatos, flavonoidų kiekis, kuris yra absorbuojamas, matomas plazmoje ir šlapime. Jie
13 patenka į sisteminę kraujotaką netrukus po pavartojimo ir gali reikšmingai padidinti organizmo plazmos antioksidacinį statusą [24].
1.4. Dihidrokvercetino chemija ir farmakokinetika
Dihidrokvercetinas (2R, 3R) – 2 – (3,4 – dihidroksifenil) – 3,5,7 – trihidroksi – 2,3 – dihidrochromen – 4 – onas) yra flavonoidas pirmą kart išskirtas iš Douglas eglės žievės (Pseudotsuga taxifolia), o vėliau iš Daūrinio ir Sibirinio maumedžių ( Larix sibirica Leder ir Rupr. Sin Larix dahurica Tuzor) [26]. HPLC analizė parodė, kad jis gali egzistuoti tiek trans, tiek cis izomerais ir, kad jis ląstelėje kristalizuojasi kaip du nepriklausomi monoklininiai kristalai 3 pav., kurių struktūrą yra C15H12O7 · 2.5H2O. DHQ lydymosi temperatūra svyruoja nuo 218 °C iki 253 °C [26]. Tiek trans, tiek cis izomerai yra tirpūs vandenyje, etanolyje ir kituose poliniuose tirpikliuose. (+)trans – dihidrokvercetinas oksidacija yra stipresnė, lengviau atiduoda vandenilio atomus, todėl oksiduojasi iki kvercetino (2 – (3,4 – dihidroksifenil) – 3,5,7 – trihidroksi – 4H – chromen – 4 vianą) [27]. Dihidrokvercetinas ir kvercetinas skiriasi tuo, kad viename jų C žiede yra dviguba C2, C3 jungtis. Tai daro didelę įtaką jų aktyvumo ir struktūros santykiui (SAR), bei antioksidaciniam stiprumui. [28]
2 pav. Dihidrokvercetino struktūra [26]
3 pav. Dihidrokvercetino kristalinė struktūra (99.97 proc. grynumas)
14 DHQ yra stiprus antioksidantas, kurio kaip flovanoidų sudedamosios dalies poveikis stipriausias gydant sunkius susirgimus, tokius kaip vėžys, kepenų ar širdies ir kraujagyslių. Stereocheminiai ir prooksidacijos tyrimai molekuliniame lygmeny puikiai įrodo DHQ potencialą.
DHQ antioksidacinis aktyvumas viršija rutino, kvarvitino ir beta-karotino aktyvumą. Tiesioginis DHQ antiradikalinis aktyvumas pasireiškia pirmiausia dėl sąveikos su lipidų radikalais ir superoksidiniais anijonais. Vykdant daugiaplanius tyrimus naudojant įvairių sistemų modelius nustatyta, kad DHQ inhibituoja laisvųjų radikalų rūgštėjimą kaip vandenyje tirpių (liuminolas) taip ir riebaluose tirpių substratų (liposamalinių ir mikrosamalinių lipidų membranos). Čia DHQ gali būti kaip aktyvių deguonies formų gaudyklė, kintamų valentingumo metalų chelatorius arba lipidų aktyvių deguonies formų grandinės ardytojas. Daugybė eksperimentų duomenys liūdyje, kad DHQ yra efektyvi priemonė organizmo antioksidacinės būsenos korekcijos [30, 31].
1.5. Dihidrokvarcetinas ir vėžys
Iki šiol labai daug publikacijų randama apie DHQ naudą kovojant su vėžiniais susirgimais, poveikį piktybinėms ląstelėms ir sukeliamo vaistų toksiškumo sumažinimui. DHQ skatina gerųjų ląstelių proliferacija, diferenciacija, apoptozė taip pat pakeista transkripcijos faktoriaus ekspresija esminių ląstelės baltymų ciklo reguliavimo rezultai ir viso tai įtakoja blogųjų ląstelių ir vėžinių audinių plėtrą. Todėl jau buvo nusistovėjusi kai kurių vėžinių susirgimų ir širdies bei kraujągyslių ligų kontrolė tam tikrais maisto produktais [33] turinčiais flavonoidų ir matoma anti-uždėgiminio atsako nauda [34]. Šalia jau įrodyto antioksidacinio teigiamo poveikio laisvųjų radikalų apytakoje, taip pat atrastam kad flavonoidais praturtinta dieta, turi didelės įtakos daugumai kancerogeninių mechanizmų [26]. DHQ aktyvuoja tam tikrus fermentus, kurie skatina ląstelių išlykimą, signalo perdavimą, imunologines gynybos reakcijas [35]. DHQ cis izomeras aktyvina vadinamą antioksidacinio reagavimo elementą (ARE) dar kitaip vadinamą elektrofilo reagavimo elementu (EpRE). Manoma, kad dėl šių teigiamų reakcijų atsakinga dviguba jungtis esanti tarp C2 ir C3 anglies atomų benzeno žiede [26].
Taip pat yra įrodyta, kad DHQ slopina benzidino sukeltas lipidų peroksidacojos reakcijas, jis veikia kaip stiprus geležies chelatų ir kraujo geležies pernešėjas [36].
15
1.6. Oksidacinis stresas
Oksidacinis stresas – tai biologinė žala organizmui, kurią sukelia dizbalansas atsiradęs tarp antioksidantų ir laisvųjų radikalų tokių kaip ROS (reaktyvios deguonies formos) ar RNS (aktyvios azoto formos) [37, 39]. Laisvieji radikalai – turintys neporinį elektronų skaičių atomai ar jų grupės. Jie susidaro deguonies ir kitų medžiagų molekulių reakcijos metu [40].
Pats stresas pasireiškia padidėjus ROS ir RNS gamybai, arba kai jaučiamas trūkumas fermentinių ir nefermentinių antioksidantų. Sudėtinis oksidacinio proceso mechanizmas smarkiai įtakoja organizmą ir priklauso nuo tokių veiksnių kaip: oksidantų tipo, kur jie gaminasi ir kaip intensyviai, tai pat nuo juos veikiančių antioksidandų ir nuo jų gebėjimo niautralizuoti bei atstatyti padarytą žalą organizmo sistemoms [18, 58]. ROS ir RNS gali sukelti DNR (deoksiribonukleorūšties), RNR (ribonukleorūgšties), fermentų, baltymų, angliavandenių ar lipidų oksidacinius pakitimus. Išvardintų procesų pasėkmės gali būti tokios kaip piktybinių navikų atsiradimas, uždegiminiai sąnarių procesai, katarakta, sutrikę virškinamojo trakto funkcijos, Parkinsono ir Alzhaimerio ligos, širdies ir kraujągyslių ligos, diabetas [43,39]. Ląstelėse vykstant metobolizmo procesams arba ląsteles veikiant išorinių nekontroliuojamų veiksnių (herbicidų, pesticidų, jonizuojančios spinduliuotės, UV spinduliai) metu susidaro ROS ir silpnėja imuninė sistema, to pasekoje organizmas patiria žalojantį poveikį [40, 39].Susidarant laisviesiams radikalams jie prisijungia arba atiduoda elektroną kitam ir vyksta grandininė reakcija, kurią gali nutraukti prisijungusi antioksidanto molekulė. Žmogaus organizmo ląstelės fermentų ir su jais nesusijusių antioksidacinių sistemų pagalba bando apsisaugoti. Tačiau kartais to nepakanka ir žmogus turi vartoti antioksidantus papildomai [42, 41]. Literatūroje aprašomi sintetinių antioksidantų, kurie yra sudedamoji žmonių vartojamų papildų dalis, kancerogeniniai ir hepatotoksiniai poveikiai skatina natūralių, augalinės kilmės antioksidantų paiešką [38]. Daug epidemiologinių tyrimų atlikta siekiant įrodyti natūralių, gamtoje randamų flavanoidų naudą žmonių sveikatai. Įvedant flavanoidus į mitybą, daug dėmesio skiriama vertinant jų struktūros ir funkcijos santikį. Biologinis prieinamumas, metabolizmas, biologinis flavonoidų aktyvūmas priklauso nuo konfigūracijos, hidroksilo grupių skaičiumi, branduolinės struktūros funkcinių grupių. Žmogui pagrindiniai flavonoidų šaltiniai yra vaisiai, daržovės, arbata ir vynas. Jau įrodyta, kad flavonoidai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu, gebėjimu sujungti laisvuosius radikalus, koronarinės širdies ligos prevencijai, priešuždegiminėmis ir priešvėžinėmis savybėmis, tai pat antivirusine veikla [44].
16
1.7. Funkcionalus maistas ir jo nauda žmogaus sveikatai
Funkcionalus maistas (FM) – tai plataus vartojimo kasdien valgomas maistas, kuris be mitybinės vertės, daro papildomą fiziologinį poveikį žmogaus organizmui. Tokie produktai gali stiprinti žmogaus organizmą, veikti profilaktiškai, mažinti susirgimų riziką. FM produktai papildyti fiziologiškai aktyviomis veikliosiomis dalimis, arba produktai, pagaminti pašalinus iš maisto žaliavos nepageidaujamas medžiagas [45]. Pastarąjį dešimtmetį smarkiai išaugo funkcionaliojo maisto gamyba ir pardavimas. Didelis vartotojų susidomėjimas ir pritarimas tokio maisto įdęjai kuria pagrindus naujos ateities rinkos atsiradimui.Tai paskatino kurti funkcionaliuosius mėsos produktus [46]. Mėsa – produktas su aukšta maistine verte. Ji nepakeičiamas baltymų, aminorūgščių, vitaminų ir mineralų šaltinis. Funkcionaliaisiais produktais galima vadinti mėsos produktus, kurių sudėtyje yra vitaminų C, A, E, mineralų K, Ca, Mg, maistinės skaidulos, nepakeičiamos riebalų rūgštys omega – 3, omega – 6, konjuguota linolo rūgštis, aktyvūs peptidai, probiotinės kultūros, prebiotikai [47]. Dar vienas svarbus reikalavimas keliamas funkcionaliems ingridientams, kad jie minimaliai įtakotų produktų skonį ir aromatą [48].
Naujai susiformavęs požiūris, kad maistas gali būti vaistas, ženkliai sumažino cheminių preparatų naudojimą, o tai veda prie natūraliasnio gyvenimo būdo [49].
Maisto produktų gamybos metu svarbu įvertinti veikliųjų medžiagų stabilumą. Flavonoidų (kvercetino ir jo glikozidų), taninų, eterinių aliejų, kantonų, rutino ir kitų medžiagų kiekis, jų stabilumas gali būti vertinami didelio skysčių chromatografijos metodu [45]. Flavonoidų poveikis sveikatai intensyviai tyrinėjamas jau du dešimtmečius. Manoma, kad jie gali apsaugoti nuo pažeidimo, kurį kraujo kūneliuose sukelia cholesterolis. Flavonoidų gausu daugelyje daržovių, vaisių, uogų ir gėrimų (arbata, vynas, vaisių sultys) [45].
Probiotikai – tai mikroorganizmai, kurie papildo ir padeda išlaikyti natūralų mikroorganizmų kiekį žmogaus virškinamajame trakte [46]. Įrodyta, kad naudojant juos yra stiprinama sveikata. Tai puiki profilaktinė priemonė, kuri stiprina imunitetą, mažina riziką susirgti vėžiu, ateroskleroze ar koronarine širdies liga [50, 51]. Pagrindinis probiotinėms kultūroms, kurios naudojamos mėsos pramonėje, keliamas reikalavimas yra išgyventi fermentacijos ir džiovinimo procesus, kurie yra neatsiejami gamybinio proceso metu [52]. Produktai praturtinti probiotikais yra plačiai prieinami rinkoje [49].
FM produktai, kurie praturtinti probiotikais sumažina įvairių virusinių ir bakterinių diarėjų, gastroenterito, uždegiminės žarnyno ligos, laktozės netoleravimo, kūdikių alergijų, dirgliosios žarnos sindromo ir kt. susirgimų riziką [53].
17
1.8. Antioksidacinių dihidrokvercetino savybių panaudojimas mėsos
pramonėje
Analizuojant šiandieninę rinką pastebimas didėjantis mėsos pusgaminių suvartojimas. Pusgaminių gamyba leidžia efektyviau panaudoti žaliavas ir patenkinti įvairių socialinių sluoksnių vartotojų poreikius. Kadangi pusgaminiams gaminti naudojama ne pigi žaliava, atsiranda tikslas prailginti gaminių galiojimo laiką ir išsaugoti kitas būdingas savybes pusgaminius laikant ilgesnį laiką [55].
Kadangi kiauliena yra riebi mėsa, didžiausia problema – kaip sustabdyti riebalų oksidacijos procesus. Kokybės pablogėjimo ir mėsos produktų broko visiškai išvengti nepavyks, tačiau galima sulėtinti gedimo procesus pasitelkiant reikiamas receptūras, apdirbimo metodus, teisingą laikymą ir naudojant natūralius antioksidantus[54].
Daug mokslininkų yra parašę svarbių darbų skirtų riebalų oksidacijos problemai. Aprašyta šimtai cheminių junginių galinčių turėti įtakos šiai reakcijai, siūloma įvairių problemos sprendimo būdų. Riebalų oksidacija daro didelę įtaką visisems maisto produktams, bet mėsos pramonėje tai ypač opi problema. Lipidų oksidaciją nagrinėjo daugybė autorių. Dėmesys krypsta į reakcijos metu susidarančių šalutinių produktų daromą žalą žmogaus sveikatai, turima omeny kancerogeninį ir mutageninį poveikį. Dar devintajame dešimtmetyje dėmesį patraukė sintetiniai antioksidantai. Nors jie pasižymėjo dideliu veiksmingumu, bet įtarta, kad turi neigiamą poveikį žmonių sveikatai. Būtent todėl sinteninių antioksidantų naudojimą riboja įstatymai. Sintetinius antioksidantus įstatymai leidžia naudoti tik džiovintoje mėsoje, todėl imta ieškoni jiems natūralių atmainų [59]. Šiuo atveju atliekant antioksidacinio aktyvumo tyrimus ir lyginant skirtingus junginius, turinčius antioksidacinių savybių ryškiausiai pasižymėjo dihidrokvercetinas išgautas iš Sibiro maumedžio [57].
Atliktas oksidacinio aktyvumo mėsos produktuose tyrimas parodė, kad atsižvelgiant į mėsos produktų riebalų kiekį, prieita prie išvados, kad produktų, kurių riebalų kiekis didesnis nei 15 proc. patartina į sudėtį įtraukti antioksidantus. Nustatyta, kad vos 0,01 proc. DHQ priedas stabdo lipidų oksidaciją marinuotuose mėsos pusgaminiuose. Eksperimentu įrodyta, kad mėsą supjauščius optimalaus dydžio gabalėliais, užtenka juos įtrinti antioksidaciniu tirpalu 60 minučių ir gaunamas toks pat rezultatas kaip su adatos injekcijomis. Naudojant DHQ kaip antioksidantą mėsos gaminių galiojimo laikas pratestas iki 60 dienų [59].
18
2. TYRIMŲ METODAI IR ORGANIZAVIMAS
2.1.Tyrimo atlikimo vieta ir laikas
Tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje ir UAB „Rokiškio pragiedruliai“ įkurtame pramoninių biocheminių tyrimų centre. Tyrimai buvo atlikti nuo 2014 metų gruodžio mėnesio iki 2015 metų birželio mėnesio pabaigos.
2.2. Tyrimo objektas ir metodai
Gamykloje „X“ buvo pagamintos aukščiausios rūšies vytintos ir šaltai rūkytos dešros naudotos atliekant eksperimentus. Dešros bei jų pusgaminiai pagaminti naudojant bakterijų kultūras ir 0,03 proc. 99,4 proc. švarumo dihidrokvercetino priedu. Atliktų eksperimentų metu buvo įvertintas antioksidacinis DHQ aktyvumas ir jo kiekis.
Dešros pagamintos naudonat tą pačią receptūrą. Po brandinimo panaudoti du skirtingi baigiamieji procesai: rūkimo šaltais medienos dūmais ir vytinimo.
Naudota receptūra pateikta 1 lentelėje.
1 lentelė. Vytintų ir šaltai rūkytų dešrų bei jų pusgaminių receptūra:
Sudėtinės dalys g/kg Kiaulienos nuopjovos 11,52 Kiaulienos kumpis 2,88 Skonio stipriklis „Salami wegierska“ 0,22 Nitritinė druska 0,37
„Salami wegierska“ skonio stipriklis
Sudėtis: Druska, natūralūs prieskoniai (pipirai), aromatas (patobulintas aromatas, natūralus aromatas, natūralūs aromatų preparatai, maltodekstrinai, druska, gliukozė, E – 621), gliukozė. Aprašymas: aromatingo kvapo, birūs milteliai, saldaus skonio, kreminės spalvos.
Paskirtis: išryškina ir sustiprina skonį.
Tyrimo metu buvo pasirinktos 3 probiotinės kultūros: KULTŪRA 1 – Leuconostoc carnosum, KULTŪRA 2 – Staphylococcus xylosus, Pediococcus pentosaceus/A, KULTŪRA 3 – Staphylococcus xylosus, Pediococcus pentosaceus. Jų naudota po 0,025 g.
19 Pagaminta buvo keturios mėginių grupės. Trys iš jų su probiotinių kultūrų (KULTŪRA 1, KULTŪRA 2 ir KULTŪRA 3) ir DHQ (0,03 proc.) priedu, ketvirtas mėginys – kontrolė, kuriame nėra papildomų priedų (2 lentelė).
2 lentelė. Vytintų ir šaltai rūkytų dešrų bei jų pusgaminių mėginių grupės
Mėginio Nr. Mėginių grupės
1 K + KULTŪRA 1 + DHQ
2 K + KULTŪRA 2 + DHQ
3 K + KULTŪRA 3 + DHQ
4 K + DHQ
5 K
Pagal pasirinktas ir patvirtintas metodikas buvo tiriami dešrų pusgaminių tik pagamintų (0 d.) ir dešrų po pagaminimo (1 d.) cheminiai, fizikiniai ir kiekybiniai rodikliai. Nustatomas dihidrokvercitino antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu, atliekama dihidrokvercetino kiekybinė analizė bei dešrų pusgaminių ir pagamintų dešrų priimtinumas. Tyrimų metu buvo paisoma temperatūrinių rėžimų reikalingų rezultatų tikslumui.
2.2.1.DPPH antioksidacinio aktyvumo tyrimas
Aparatūra
Tyrimas atliktas spektrofotometru UNVIKON 930 (Kontrol Instruments, Italija), buvo parinktas 517 nm bangos ilgis. Reakcija vykdyta kambario temperatūroje, tamsoje, purtant po 20 min periodiškai.
Meginių paruošimo procedūra
Eksperimentui buvo paimta 0,66 ml dešrų pusgaminių ir pagamintų dešrų ekstraktų (praskiestų su etanoliu), įpilta 3,6 ml 0,1 mM DPPH tirpalo.
Antioksidacinio aktyvumo apskaičiavimas pagal formulę:
Antiradikalinis aktyvumas (%)=(A kontrolė-A mėginys)/A kontrolė x 100%,
20
2.2.2. Dihidrokvercetino kiekybinė analizė
Aparatūra
DHQ analizė buvo atlikta aukšto slėgio skysčių chromatografu SHIMADZU ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPH NEXERA™ (SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, Japan) sukomplektuotu iš dviejų degazatorių, dviejų tirpiklių padavimo siurblių, gradiento sistemos, automatinės mėginių įleidimo sistemos, UV – VIS detektoriaus ir termostuojamų kolonėlių.
DHQ atskytimui naudota YMC – Pack ODS – AQ kolonėlė (250 x 4.0 mml.D. S – 5 μm 12 nm) sukomlektuota su YMC Guard Cartridge ODS – AQ prieškolonėlės (10 x 4.0 mml.D S – 5 μm 12 nm).
Reagentai ir tirpalai
Vanduo HPLC, gradientinės HPLC grynumo (UAB „EUROCHEMICALS“, LT) Acetonitrilas HPLC, gradientinės HPLC grynumo (UAB „EUROCHEMICALS“, LT) Heksanas, >99,0 % grynumo(UAB „EUROCHEMICALS“, LT)
Etanolis >96,3 % grynumo (AB „Vilniaus degtinė“)
Mėginių paruošimo procedūra
10 g susmulkinto mėsos mėginio užpilame 50 ml etanolio ir purtome 1 valandą 200 min-1
greičiu. Pirmą porciją etanolio nupilame ir užpilame naują 50 ml etanolio porciją ir vėl purtome 1 valandą 200 min-1
greičiu. Etanolio ekstraktai sujungiami. Sukoncentruojame mėginį iki 10 ml ir pridedame 10 ml distiliuoto vandens. Nufiltruojame susidariusias nuosėdas. Ekstrahuojame mėginį su 5 ml heksano. Vandeninė fazė atskiriama ir analizuojama.
Analizė trunka 25 min. Mobilę fazę sudaro 25 % acetonitrilo ir 75 % HPLC vandens (0.1 % koncentracijos ledinės acto rūgšties tirpalas su distiliuotu vandeniu). Srauto greitis – 0.8 ml/min. Kolonėlės temperatūra 35 0
21
2.2.3. Juslinis vertinimas
Buvo pasitelktas individualaus uždaro (kabinose) vertinimo principas. Aštuoni nepriklausomi vertintojai buvo supažindinti su mėsos produktų vertinimo kriterijais. Vertinimas buvo atliktas pagal tarptautinius reikalavimus įrengtoje juslinės analizės laboratorijoje, LSMU VA Maisto saugos ir kokybės katedroje, kuri atitinka LST ISO 8589 keliamus reikalavimus.
Vertintojų buvo paprašyta, vengiant skonio ir uoslės receptorių pakitimų, prieš vertinimą pusė valandos nieko nevalgytų, negertų (išskyrus vandenį), nerūkytų. Kiekvienas vertintojas gavo po 5 koduotus indelius su šaltai rūkytų ir vytintų dešrų gabalėliais. Po kiekvieno indelio vertinimo receptoriai buvo pasiūlyti neutralizuoti balta kvietine duona ir vandeniu. Juslinis vertinimas atliktas šviežių dešrų ( 1d. po gamybinio proceso).
Vertintojai juslines savybes vertino testo pagalba, kuris atitinka LST ISO 8589 keliamus reikalavimus. Vertinamos buvo šios savybės:
-bendras kvapo intensyvumas - pašalinio skonio intensyvumas - rūgštaus skonio intensyvumas - liekamojo skonio intensyvumas - bendras skonio intensyvumas - susikramtymas
- kartumas - sultingumas - pašalinis kvapas
Priimtinumo testo rezultatų analizei taikyti santykiniai balai, atitinkantys: labai priimtinas – 6; priimtinas – 5; truputį priimtinas – 4; nei priimtinas, nei nepriimtinas – 3; truputį nepriimtinas – 2; labai nepriimtinas – 1.
22
2.2.4. Statistinė analizė
Matematinė statistinė duomenų analizė atlikta MS Excel programą. Reikšmė p – skirtumo tarp rezultatų reikšmių patikimumas, p – patikimas, kai p<0,05. Kiekybinių kintamųjų ir tiesinių ryšių tamprumui įvertinti paskaičiuotas koreliacijos koeficientas Pearson. Statistinė duomenų analizė atlikta, naudojant Ms EXCEL programą. Darbe pateikta įvertinta rezultatų vidutinė vertė iš vienos receptūros mėginių grupės (3 vnt.), standartiniai nuokrypiai, skirtumų patikimumo lygmuo (p) koreliacijos koeficientas (r). Teigiame, kad statistiškai reikšmingi skirtumai yra kai p ≤ 0, 05.
Koreliacijos koeficiento r vertinimo reikšmės pateikiamos 3 lentelėje.
3 lentelė. Koreliacijos koeficiento r vertinimo skalė.
Neigiamos reikšmės Aprašymas Teigiamos reikšmės
0.00 “nėra” 0.00 0.19 - -0.01 “labai silpnas” 0.01 – 0.19 -0.39 - -0.20 “silpnas” 0.20 - 0.39 -0.69 – -0.40 “vidutinis” 0.40 – 0.69 -0.89 - -0.70 “stiprus” 0.70 – 0.89 -0.99 - -0.90 “labai stiprus” 0.90 – 0.99 -1.00 Visiškai tikslus” 1.00
23
3.TYRIMŲ REZULTATAI
Dihidrokvercetino (DHQ) antiradikalinio (antioksidacinio) aktyvumo
DPPH nustatymas šaltai rūkytose ir vytintose dešrose
Didžiausias DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas vytintose dešrose užfiksuotas ketvirtame mėginyje su K + DHQ priedu - 79,58±1,27 proc. Didžiausias DPPH laisavųjų radikalų surišimo aktyvumas mėginiuose su bakterinėmis kultūromis užfiksuotas mėginyje K + Kultūra 1 + DHQ - 78,63±0,59 proc., mažiausias – K + Kultūra 3 + DHQ 77,54±0,18 proc. (4 lentelė). Lyginant su K 75,02±1,96 proc. visi mėginiais su bakterinėmis kultūromis ir DHQ priedu pasižymėjo didesniu DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumu.
4 lentelė. DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas vytintose dešrose, proc.
Mėginiai Vytintos dešros po technologinio proceso 1 d.
1 K + KULTŪRA 1 + DHQ 78,63±0,59
2 K + KULTŪRA 1 + DHQ 78,19±0,28
3 K + KULTŪRA 1 + DHQ 77,54±0,18
4 K + DHQ 79,58±1,27
5 K 75,02±1,96
Didžiausia DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas šaltai rūkytose dešrose užfiksuotas antrame mėginyje K + Kultūra 2 + DHQ - 89,95±1,59 proc. Mažiausias DPPH laisvųjų radikalų ssurišimo aktyvumas su bakterijų kultūra užfiksuotas mėginyje K + Kultūra 1 + DHQ - 77,93±0,87 proc. Lyginant su K - 75,02±1,27 proc. visi mėginiai su bakterijų kultūromis ir DHQ priedu pasižymėjo didesniu DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumu (5 lentelė).
5 lentelė. DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas šaltai rūkytose dešrose, proc.
Mėginiai Šaltai rūkytos dešros po technologinio proceso 1 d. 1 K + KULTŪRA 1 + DHQ 77,93±2,77 2 K + KULTŪRA 1 + DHQ 89,95±5,73 3 K + KULTŪRA 1 + DHQ 78,03±2,70 4 K + DHQ 89,64±5,51 5 K 73,68±5,78
24
Juslinių savybių ir priimtinumo tyrimas
Vertinant bendrą skonio intensyvumą išsiskyrė mėginiai su K + Kultūra 1 + DHQ ir K + Kultūra 3 + DHQ, o mėginio su K + Kultūra 2 + DHQ skonis buvo mažiausiai intensyvus (6 lentelė). Liekamasis skonis aukščiausiai įvertintas mėginyje K + Kultūra 1 + DHQ. Pašalinis skonis labiausiai juntamas buvo K + Kultūra 1 + DHQ ir K + Kultūra 3 + DHQ mėginiuose, o visai nejuntamas K mėginyje. Rūgštaus skonio intensyvumas labiausiai juntamas buvo mėginiuose su bakterinėmis kultūromis, o K - mažiausiai juntamas. Bendras kvapas priimtiniausias buvo K + Kultūra 1 + DHQ ir K + Kultūra 3 + DHQ mėginiuose, o K – mažiausiai priimtinas. Sultingiausias K mėginys, mėginiai su bakterijų kultūromis ir DHQ - vienodai sultingi, o tik su DHQ priedu - sultingas mažiausiai. Kartumas nebuvo juntamas. Pašalinis kvapas nežymiai, bet buvo juntamas K + Kultūra 1 + DHQ ir K + Kultūra 2 + DHQ mėginiuose.
6 lentelė. Šaltai rūkytų dešrų juslinių savybių vertinimas
Mėginiai B endra s sko nio inte ns y v um a s L ieka mo jo s ko nio inte ns y v um a s P aš alin io s ko nio inte ns y v um a s Rūg št aus s ko n io inte ns y v um a s B endra s kv a po inte ns y v um a s Su lt ing u ma s K a rt um a s P aš alin is kv apa s 1 K + KULTŪRA 1 + DHQ 5±0.2 2,5±0.1 1,5±0.1 1,5±0.2 3,5±0.2 2±0.1 0±0.0 0,5±0.0 2 K + KULTŪRA 1 + DHQ 4±0.1 2±0.1 0,5±0.0 1,5±0.1 3±0.2 2±0.2 0±0.0 0,5±0.1 3 K + KULTŪRA 1 + DHQ 5±0.2 1,5±0.1 1,5±0.1 1,5±0.1 3,5±0.2 2±0.1 0±0.0 0±0.0 4 K + DHQ 4,5±0.2 1,5±0.1 0,5±0.1 1±0.1 3±0.2 0,5±0.1 0±0.0 0±0.0 5 K 4,5±0.1 1,5±0.1 0±0.0 0,5±0.1 2,5±0.1 2,5±0.2 0±0.0 0±0.0
7 lentelėje pateiktas bendras šaltai rūkytų dešrų priimtinumo vertinimas. Visi šaltai rūkytų dešrų mėginiai pasižymėjo geromis juslinėmis savybėbis. Labiausiai priimtina buvo dešra su DHQ priedu.
7 lentelė. Šaltai rūkytų dešrų priimtinumo vertinimas
Bendras įvertinimas K + KULTŪRA 1 + DHQ 5±0.3 K + KULTŪRA 1 + DHQ 5±0.2 K + KULTŪRA 1 + DHQ 5±0.3 K + DHQ 6±0.2 K 5±0.3
Bendras skonio intensyvumas vienodai įvertintas visuose mėginiuose (8 lentelė). Liekamuoju skoniu pasižymėjo mėginys su K + Kultūra 3 + DHQ. Pašalinis skonis buvo
25 juntamas visuose mėginiuose su bakterijų kultūromis ir DHQ. Rūgščiu skoniu labiausiai pasižymėjo K + Kultūra 3 + DHQ, K + DHQ ir K mėginiai. Bendras kvapas intensyviausiai buvo juntamas mėginyje K + Kultūra 3 + DHQ, mažiausiai juntamas – K + Kultūra 1 + DHQ. Sultingiausi mėginiai buvo K + Kultūra 1 + DHQ, K + DHQ ir K. Kartumas ir pašalinis kvapas nebuvo juntami nei viename mėginyje.
8 lentelė. Vytintų dešrų juslinių savybių vertinimas
Mėginiai B endra s sko nio inte ns y v um a s L ieka mo jo s ko nio inte ns y v um a s P aš alin io s ko nio inte ns y v um a s Rūg št aus s ko n io inte ns y v um a s B endra s kv a po inte ns y v um a s Su lt ing u ma s K a rt um a s P aš alin is kv apa s 1 K + KULTŪRA 1 + DHQ 4,5±0.2 2,5±0.1 0,5±0.1 1,5±0.1 2±0.1 1,5±0.2 0±0.0 0±0.0 2 K + KULTŪRA 1 + DHQ 4,5±0.3 2,5±0.1 0,5±0.2 1,5±0.2 3±0.2 0±0.0 0±0.0 0±0.0 3 K + KULTŪRA 1 + DHQ 4,5±0.3 3,5±0.3 0,5±0.3 2,5±0.1 4±0.3 0±0.0 0±0.0 0±0.0 4 K + DHQ 4,5±0.2 2,5±0.2 0±0.0 2,5±0.1 3,5±0.1 1,5±0.2 0±0.0 0±0.0 5 K 4,5±0.3 2,5±0.2 0±0.0 2,5±0.1 3,5±0.0 1,5±0.1 0±0.0 0±0.0
Bendras vytintų dešrų priimtinumas pateikiamas 9 lentelėje. Labiausiai priimtinos buvo dešra su DHQ priedu ir K. Dešros su bakterijų kultūromis ir DHQ įvertintos vienodai.
9 lentelė. Vytintų dešrų priimtinumo vertinimas
Bendras įvertinimas K + KULTŪRA 1 + DHQ 4±0.2 K + KULTŪRA 1 + DHQ 4±0.3 K + KULTŪRA 1 + DHQ 4±0.2 K + DHQ 5±0.1 K 5±0.1
Dihidrokvercetino kiekybinė analizė
Didžiausias DHQ kiekis 0.533±0,13 mg/kg užfiksuotas mėginyje K + Kultūra 2 + DHQ, o mažiausias - 0.180±0,12 mg/kg mėginyje K + Kultūra 3 + DHQ. Mėginiuose K + DHQ ir K + Kultūra 1 + DHQ kiekis skiriasi labai nedaug, atitinkamai 0.339±0,00 mg/kg ir 0.329±0,01 mg/kg.
10 lentelė. Dešrų pusgaminių DHQ kiekis
Mėginiai DHQ kiekis, mg/kg
26 K + KULTŪRA 1 + DHQ 0.533±0,13
K + KULTŪRA 1 + DHQ 0.180±0,12
K + DHQ 0.339±0,00
Didžiausias DHQ kiekis šaltai rūkytose dešrose užfiksuota mėginyje K + Kultūra 3 + DHQ - 0.452±0,12 mg/kg. Neženkliai mažesnis kiekis 0.438±0,11 mg/kg užfiksuotas mėginyje K + Kultūra 1 + DHQ (11 lentelė). Mažiausias DHQ kiekis mėginyje K + DHQ 0.111±0,12 mg/kg, o K + Kultūra 2 + DHQ neženkliai didesnis - 0.113±0,12 mg/kg.
11 lentelė. Šaltai rūkytų dešrų DHQ kiekis
Mėginiai DHQ kiekis, mg/kg
K + KULTŪRA 1 + DHQ 0.438±0,11 K + KULTŪRA 1 + DHQ 0.113±0,12 K + KULTŪRA 1 + DHQ 0.452±0,12
K + DHQ 0.111±0,12
Didžiausias DHQ kiekis vytintose dešrose užfiksuota mėginyje K + DHQ 0.534±0,12 mg/l. Mažiausias DHQ kiekis - mėginyje K + Kultūra 3 + DHQ 0.112±0,18 mg/kg ir ženkliai skiriasi nuo likusių mėginių. K + Kultūra 1 + DHQ DHQ kiekis 0,374±0,01 mg/kg, o K + Kultūra 1 + DHQ DHQ kiekis 0.425±0,05 mg/kg (12 lentelė).
12 lentelė. Vytintų dešrų DHQ kiekis
Mėginiai DHQ kiekis, mg/kg
K + KULTŪRA 1 + DHQ 0,374±0,01 K + KULTŪRA 1 + DHQ 0.425±0,05 K + KULTŪRA 1 + DHQ 0.112±0,18
27
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Atlikus tyrimus galime palyginti ir įvertinti pridėto DHQ įtaką vytintų, šaltai rūkytų dešrų mėginių DPPH radikaliniam (antioksidaciniam) aktyvumui ir dešrų pusgaminių, vytintų ir šaltai rūkytų dešrų priimtinumo vertinimui, bei jo kiekybinę analizę.
Lyginant vytintų dešrų DPPH aktyvųjį radikalinį (antioksidacinį) aktyvumą su DHQ priedu ir K, mėginyje su DHQ žymiai didesnis antioksidacinis aktyvumas, kai p ≤ 0,05. Mėginiuose su bakterijų kultūromis ir DHQ ženklaus antioksidacinio aktyvumo išsiskyrimo nepastebėta, taip pat nuo mėginio tik su DHQ priedu skirtumas nedidelis, o K mėginys išsiskyria mažesniu DPPH radikaliniu aktyvumu visais atvėjais kai p ≤ 0,05.
Didžiausia DHQ kiekis nustatytas mėginyje tik su DHQ, o mėginiuose su bakterijų kultūromis kiekis skiriasi nievienodai. Galima daryti prielaidą, kad bakterijų kultūros mažina DHQ kiekį. Didžiausias skirtumas nustatytas tarp mėginio su DHQ ir mėginio su K + Kultūra 3 ir DHQ priedais, kai ≤ 0,05.
Vytintose dešrose tarp DHQ ir DPPH radikalinio (antioksidacinio) aktyvumo nustatyta stipri teigiama priklausomybė r=0,754. Galima teigti, kad didėjant DHQ kiekiui taip pat didėja antioksidacinis aktyvumas. Lyginant su literatūros šaltiniuose aprašytais rezultatais . R. A. Mustafa ir kt. nustatė stiprų koreliacijos ryšį tarp antioksidantinio aktyvumo ir flavonoidų kiekio (koreliacijos koeficientas 0,843) bei fenolinių junginių kiekio (koreliacijos koeficientas 0,861) [61]. Mūsų gauta kereliacija yra neženkliai silpnesnė, tai galėjo įtakoti skirtingos tyrimo metodikos, bei skirtingas koreliacijos ryšio apskaičiavimo.
Šaktai rūkytų dešrų kontroliniame mėginyje DPPH radikalinis (antioksidacinis) aktyvumas mažiausiais lyginant su mėginiais, kuriuose pridėta DHQ ir bakterijų kultūrų, kai p ≤ 0,05. Mažiausias skirtumas nustatytas tarp mėginio K + DHQ ir mėginio K + Kultūra 2 + DHQ. Šiuo atvėju mėginyje su bakterijų priedu DPPH antioksidacinis aktyvumas neženkliai, bet aukštesnis, kai p ≤ 0,05.
Lyginant šaltai rūkytų dešrų DHQ kiekį mažiausias nustatytas mėginyje K + DHQ. Mėginiuose su bakterijų kultūromis dižiausiaS DHQ kiekis mėginyje K + Kultūra 3 + DHQ, mažiausia – K + Kultūra 2 + DHQ, kai p ≤ 0,05. Lyginant gautus rezultatus šaltai rūkytose dešrose, galima daryti prielaidą, kad technologinis procesas ir bakterijų kultūrų priedas daro įtaką DHQ kiekiui. Būtent šaltai rūkytų dešrų kokybę lemia du pagrindiniai gamybos etapai – žaliavos paruošimas ir jos sūdymas bei brandinimas [62].
Vidutinė neigiama priklausomybė nustatyta šaltai rūkytų dešrų mėginiuose tarp DPPH antioksidacinio aktyvumo ir DHQ kiekio, r=-0,557. Darome išvadą, kad šaltai rūkytose dešrose antioksidacinis aktyvumas nuo DHQ kiekio nepriklauso.
28 Vertinant dešrų pusgaminių DHQ kiekį lyginant mėginius su bakterijų kultūromis ir DHQ ir mėginiu tik su DHQ priedu, mažiausias kiekis nustatytas mėginyje K + Kultūra 3 + DHQ, o didžiausia K + Kultūra 2 + DHQ priedu, kai p ≤ 0,05.
Vytintų dešrų bendras priimtinumas aukščiausiai įvertintas K ir mėginyje su DHQ priedu (5 balai iš 6). Dešros su bakretijų kultūromis ir DHQ priedu įvertinti 4 balais iš 6. Pašaliniu kvapu ir kartumu nepasižymėjo nei vienas mėginys. Bendras kvapas intensyviausiai juntamas buvo dešroje K + Kultūra 3 + DHQ.
Vytintose dešrose tarp bendro priimtinumo ir DHQ kiekio nustatyta vidutinė teigiama priklausomybė r=0,643. Galima teigti, kad didesnis DHQ kiekis vytintų dešrų bendrą priimtinumą įtakoja nežymiai.
Šaltai rūkytų dešrų su DHQ priedu bendras priimtinumas įvertintas 6 balais iš 6, nors išsiskyrė mažiausiu sultingumu. K buvo įvertintas 5 balais iš 6, nebuvo jaučiamas nei pašalinis skonis, nei kvapas. Dešros su bakterijų kultūrų ir DHQ priedu įvertintos 5 balais iš 6. Nei viena dešra nepasižymėjo kartumu. Micrococcus varians, Staphylococcus carnosus bei Staphylococcus xylosus , įtakoja skonio ir aromato formavimąsi, lėtina apkartimo procesą [63].
Vidutinė neigiama priklausomybė nustatyta tarp šaltai rūkytų dešrų bendro priimtinumo ir DHQ kiekio, r=-0,581. Darome išvadą, kad DHQ kiekis bendram šaltai rūkytų dešrų priimtinumui įtakos neturi.
29
IŠVADOS
1. Atlikti dihidrokvercetino DPPH radikalinio (antioksidacinio) aktyvumo tyrimai vytintose ir šaltai rūkytose dešrose su DHQ priedu:
1.1. Vytintose dešrose tarp DHQ ir DPPH radikalinio (antioksidacinio) aktyvumo nustatyta stipri teigiama priklausomybė r=0,754. Tai rodo, kad dihidrokvercetino priedas didina antioksidacinį aktyvumą nepaisant technologinio proceso.
1.2. Vidutinė neigiama priklausomybė nustatyta šaltai rūkytų dešrų mėginiuose tarp DPPH antioksidacinio aktyvumo ir DHQ kiekis, r=-0,557. Tai rodo, kad šalto rūkimo technologinis procesas gali stabdyti DHQ antioksidacinį aktyvumą.
2. Kiekybinė dihidrokvercetino analizė dešrų pusgaminiuose, vytintose ir šaltai rūkytose dešrose parodė, kad nepaisant to, kad buvo naudotas vienodas DHQ 0,03 proc. rezultatai gauti skirtingi, todėl galima daryti išvadą, kad bakterijų kultūros ir technologiniai procesai, bei jų veikimas kartu turi įtakos DHQ kiekiui.
3. Atliktas šaltai rūkytų ir vytintų dešrų bendras priimtinumo vertinimas parodė, kad dihidrokvercertinas teigiamai veikia juslines gaminių savybes ir bendrą priimtinumą.
30
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Kumar S., Abhay K., Pandey O. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview., The Scientific World Journal. 2013; Article ID 162750, 16 pages.
2. Kumar S., Mishra A., and Pandey A. K. “Antioxidant mediated protective effect of Parthenium hysterophorus against oxidative damage using in vitro models” . BMC Complementary and Alternative Medicine. 2013;13:120-118.
3. S. Kumar and A. K. Pandey, Phenolic content, reducing power and membrane protective activities of Solanum xanthocarpum root extracts,Vegetos, 2013; p. 307–301.
4. A. K. Pandey, Anti-staphylococcal activity of a pan-tropical aggressive and obnoxious weed Parihenium histerophorus: an in vitro study, National Academy Science Letters. 2007; 30(11):386–383.
5. Miwa, Y., Mitsuzumi, H., Sunayama, T., Yamada, M., Okada, K., Kubota, M., Chaen, H., Mishima, Y., Kibata, M. Glucosyl hesperidin lowers serum triglyceride level in hypertriglyceridemic subjects through the improvement of very low-density lipoprotein metabolic abnormality. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2005;51(6):470–460.
6. Huang, W., Cai, Y., and Zhang, Y., Natural Phenolic Compounds From Medicinal Herbs and Dietary Plants: Potential Use for Cancer Prevention, Nutrition and Cancer. 2009; 62(1):20-1.
7. Kavishankar D, Rajora AK, Greco F, Osborn HMI. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2013; Dec;45(12):2821–3.
8. R. Koes, W. Verweij, and F. Quattrocchio, Flavonoids: a colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways, Trends in Plant Sciences. 2005;10(5): 242–236. 9. G. Agati, E. Azzarello, S. Pollastri, and M. Tattini. Flavonoids as antioxidants in plants:
location and functional significance. Plant Science. 2012; 12:76–67.
10. Wright, J. S., Johnson, E. R. & DiLabio, G. A. Predicting the activity of phenolic antioxidants: Theoretical method, analysis of substituent effects, and application to major families of antioxidants. J. Am. Chem. Soc. 2011;123:1183–1173.
11. S. Kumar and A. K. Pandey, “Antioxidant, lipo-protective and antibacterial activities of phytoconstituents present in Solanum xanthocarpum root,” International Review of Biophysical Chemistry. 2012; 12:47–42.
12. F. Pourmorad, S. J. Hosseinimehr, and N. Shahabimajd, “Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants,” The African Journal of Biotechnolog. 2006;11:1145–1142.
13. J. X. Li, B. Xue, Q. Chai, Z. X. Liu, A. P. Zhao, and L. B. Chen, “Antihypertensive effect of total flavonoid fraction of Astragalus complanatus in hypertensive rats,” The Chinese Journal of Physiology. 2005;2:106–101.
14. S. Kumar, U. K. Sharma, A. K. Sharma, and A. K. Pandey, “Protective efficacy of Solanum xanthocarpumroot extracts against free radical damage: phytochemical analysis and antioxidant effect,” Cellular and Molecular Biology. 2012;1:171–178.
15. Flaig, T.W., Glodé, L.M., Gustafson, D., van Bokhoven, A., Tao, Y., Wilson, S., Su, L.J., Li, Y., Harrison, G., Agarwal, R., Crawford, E.D., Lucia, M.S., Pollak, M., A study of high-dose oral silybinin-phytosome followed by prostatectomy in patients with localized prostate cancer. 2010; 10:855–848.
16. Symonowicz M., Kolanek M. Flavonoids and their properties to form chelate complexes. Food Science and Biotechnology. 2012; 6(1):35-41.
17. Lambert, J.D., Elias, R.J., The antioxidant and pro-oxidant activities of green tea polyphenols: a role in cancer prevention. Arch. Biochem. Biophys. 2010; 501:65–72. 18. W. Zhu, Q. Jia, Y. Wang, Y. Zhang, and M. Xia, The anthocyanin
31 against reactive oxygen species during hyperglycemia: involvement of a cAMP-PKA-dependent signaling pathway, Free Radical Biology and Medicine. 2012;2:314–327. 19. A. Mishra, A. K. Sharma, S. Kumar, A. K. Saxena, and A. K. Pandey, “Bauhinia
variegata leaf extracts exhibit considerable antibacterial, antioxidant and anticancer activities,” BioMed Research International. 2013; Article ID 915436, 10 pages.
20. A. Mishra, S. Kumar, A. Bhargava, B. Sharma, and A. K. Pandey, “Studies on in vitro antioxidant and antistaphylococcal activities of some important medicinal plants,” Cellular and Molecular Biology.2011;1:16–25.
21. C. N. S. Santos, M. Koffas, and G. Stephanopoulos, Optimization of a heterologous pathway for the production of flavonoids from glucose, Metabolic Engineering. 2011;4:392–400.
22. A. Wang, F. Zhang, L. Huang et al., “New progress in biocatalysis and biotransformation of flavonoids,” Journal of Medicinal Plant Research. 2010; no. 10, pp. 847–856.
23. E. Leonard, Y. Yan, Z. L. Fowler et al., “Strain improvement of recombinant Escherichia coli for efficient production of plant flavonoids,” Molecular Pharmaceutics. 2008;2:257– 265.
24. A. K. Pandey, A. K. Mishra, and A. Mishra, “Antifungal and antioxidative potential of oil and extracts derived from leaves of Indian spice plant Cinnamomum tamala,” Cellular and Molecular Biology. 2012;10:142–147.
25. Y. Wang, S. Chen, and O. Yu, Metabolic engineering of flavonoids in plants and microorganisms, Applied Microbiology and Biotechnology. 2011; no. 4, pp. 949–956. 26. Robert Gordon, Dihydroquercetin: More than just an impurity?, European Journal of
Pharmacology. 2012; 684:19–26.
27. Rogozhin, V.V., Peretolchin, D.V., Kinetic regulation of dihydroquercetin oxidation with horseradish peroxide. Russ. J. Bioorg. Chem. 2009; 35:576–580.
28. Zherdev, V.P., Kolyvanov, G.B., Litvin, A.A., Sariev, A.K., Viglinskaia, A.O., Gekkiev, B.I., Grigor'ev, A.M., Gorlov, V.V., Comparative pharmacokinetics of dihydroquercetin in rats upon peroral administration of parent compound and liposomal flamen D. Exp. Clin. Pharmacol. (Eksperimentalnaya i klinicheskaya farmakoloogiya) 73, 23–25. In 26 A.E. Weidmann / European Journal of Pharmacology. 2010; 684,19–26.
29. Jeevitha, D., Sadasivam, K., Praveena, R. & Jayaprakasam, R. DFT study of glycosyl group reactivity in quercetin derivatives. J. Mol. Struct. 2016; 1120:15–24.
30. S. Kumar, A. Gupta, and A. K. Pandey, Calotropis procera root extract has capability to combat free radical mediated damage, ISRN Pharmacology. 2013; Article ID 691372, 8 pages.
31. Shikov, A.N., Pozharitskaya, O.N., Miroshnyk, I., Mirza, S., Urakova, I.N., Hirsjärvi, S., Makarov, V.G., heinämäki, J., Yliruusi, J., Hitunen, R., Nanodispersions of taxifolin: impact of solid state properties on dissolution behaviour. Pharm. Nanotechnol. 2009; 377:148–152.
32. Beatriz Abad-Garc. ´a, Sergio Garmo ´ n-Lobato, Luis A. Berrueta, Blanca Gallo and Francisca Vicente, A fragmentation study of dihydroquercetin using triple quadrupole mass spectrometry and its application for identification of dihydroflavonols in Citrus juices, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009;23:2785–2792.
33. Sutandyo, N,Nutritional carcinogenesis. Acta Med. Indones. 2010;42:36–42.
34. Garcia-Lafuente, A., Guillamón, E., Villares, A., Rostagno, M.A., Martínez, J.A., Flavonoids as anti-inflammatory agents: implications in cancer and cardiovascular disease. Inflamm. 2009;58:537–552.
35. Kaspar, J.W., Niture, S.K., Jaiswal, A.K., Nrf2:INrf2 (Kep1) signalling in oxidative stress. Free Radic. Biol. Med. 2009;47:1309–1304.
36. Flavin, R., Peluso, S., Nguyen, P.L., Loda, M., Fatty acid synthase as a potential therapeutic target in cancer. Future Oncol. 2010;6:562–551.
37. Shymala Gowri S, Pavitha S, Vasantha K. Free radical scavenging capacity and antioxidant activity of young leaves and barks of Acacia nilotica. International Journal of pharmacy and Pharmaceutical sciences. 2010;3(1):164-160.
32 38. Agrawal S, Kulkarni GT, Sharma VN. A comparative study on the antioxidant activity of methanolic extracts of Terminalia paniculata and Madhuca longifolia. Free Radic Antioxid. 2010;1(4):62–8.
39. Rahal, A., Kumar, A., Singh, V., Yadav, B., Tiwari, R., Chakraborty, S., and Dhama, K., Oxidative Stress, Prooxidants, and Antioxidants: The Interplay, BioMed Research International. 2014; Article ID 761264, 19 pages.
40. Ayala, A., Muñoz, M., and Argüelles, S., Lipid Peroxidation: Production, Metabolism, and Signaling Mechanisms of Malondialdehyde and 4-Hydroxy-2-Nonenal, Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2014; Article ID 360438, 31 pages.
41. Maizura M., Aminah A., Wan Aida W.M. Total Phenolic Content and Antioxidant Activity of Kesum (Polygonum minus), Ginger (Zingiber officinale) and Turmeric (Curcuma longa) Extract. International Food Research Journal.2011;18:534-529.
42. Mabberley D.J. Mabberley's Plant-Book third edition (2008). Cambridge University Press: UK. P 160-152.
43. Bhoyas M.S., Mishra G.P., Naik P.K., Srivastava R.B. Estimation of Antioxidant Activity and Total Phenolics Among Natural Populations of Caper (Capparis spinosa) Leaves Collected from Cold Arid Desert of Trans-Himalayas. 2011; AJCS.5. p. 912-919.
44. Sasikumar JM, Patharaj J, Adithya ES, Christabel PH, Shamna R. Antioxidant capacity and phenolic content of Elaeagnus kologa schlecht. an underexploited fruit from India. Free Radic Antioxid.2012;2(3):28–35.
45. Dalia Sekmokiene, Algirdas Liutkevicius, Mindaugas Malakauskas, Funkcionalusis maistas ir jo veikliosios dalys, ISSN 1392-2130. Veterinarija ir zootechnika. 2007;37 (59):85-81.
46. Menrad K. Market and marketing of functional food in Europe. Journal of Food Engineering. 2003;12:188 – 181.
47. Muhammad I.K., Muhammad S.A., Muhammad F.A., Ayesha S., Aneeq-ur-Rehman, Waqas T. G. Meat as a functional food with special reference to probiotic sausvages. Food Research International. 2011; 24:3133-3125.
48. Decker E. A., Park Y. Healthier meat products as functional foods. Meat Science. 2010; 12:55–49.
49. Arihara K. Strategies for designing novel functional meat products. Meat Science. 2006; 13:229–219.
50. Ruiz-Moyano S., Martin A., Benito M.J., Nevado F.P., Cordoba M.G. Screening of lactic acid bacteria and bifidobacteria for potential probiotic use in Iberian dry fermented sausages. Meat Science. 2008; 55:715–21.
51. Toldra F., Reig M. Innovations for healthier processed meats. Trends Food Science Technology. 2011; 24:517–22.
52. De Vuyst L., Falony G., Leroy F. Probiotics in fermented sausages. Meat Science 2008;44:8–75.
53. Deshpandea G., Rao S., Patolea S. Progress in the field of probiotics: year 2011. Current Opinion in Gastroenterology. 2011; 58:13–18.
54. FoglianO V, Vitaglione P. Functional foods: Planning and development, Mol. Nutr. Food Res. 2005; 49:256-262.
55. D.K. Balev, A.S. Staykov, G.Y. Ivanov, S.G. Dragoev, E.H. Filizov, K.P. Vassilev and T.G. Grozdeva, Effect of natural antioxidant treatment and modified atmosphere packaging on the quality and shelf-life of chilled beef, Agriculture and biology journal of north America.. 2010; ISSN Print: 2151-7517, ISSN Online: 2151-7525.
56. Bronnikov, G. E., Kulagina, T. P., Aripovsky, A. V. (2009). Dietary Supplementation of Old Mice with Flavonoid Dihydroquercetin Causes Recovery of Mitochondrial Enzyme Activities in Skeletal Muscles. ISSN 1990-7478, Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 2009, Vol. 3, No. 4, pp. 453-458. In Pleiades Publishing, Ltd.Russian language version. Original Russian Text G. E. Bronnikov, T. P. Kulagina, A. V. Aripovsky, 2009, published in Biologicheskie Membrany. No. 5, pp. 387-393. Russian language version.
33 57. Yifan Chen. Antioxidants quercetin and dihydroquereetin inhibit ex vivo homolysis but
not plasma lipid peroxidation.2009; FASEB J. 23: 966-3.
58. Xinyu JIANG. Xiaoqing CHEN and Yan WEI. Free Radical Scavenging Activity and Flavonoids Contents of Polygonum orientale Leaf, Stem and Seed Extracts. Lat. Am. J. Pharm. 2009;28(2):284-7.
59. Semenova A. A, Food Additives' Evaluation for an Adequate Application in Meat Industry, .Russian language version.Russian Institute of meat Industry. 2008.
60. Stavreva, M., et al. Protocol on Toxicological Investigations and Safety Evaluation of DHQ for application in food products, National Center of Public Health and Nutrition, Director Ivanov, L., Ministry of Health, Sofia, Bulgaria.Agreement. 2008;34:20-07. 61. Muth E.R, Laurent J, Jasper P. The effect of bilberry nutritional supplementation on night
visual acuity and contrast sensitivity. Altern Med Rev. 2000; 5:164-73.
62. Gečienė R., Baltuškienė V. Mėsos gaminių technnologija. Vilnius. 2007. P.187.
63. Mahoney M., Henriksson A. The effect of processed meat and meat starter cultures on gastrointestinal colonization and virulence of Listeria monocytogenes in mice. Food Microbiology. 2003;84:255–261.
