LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS ANATOMIJOS INSTITUTAS
Ieva Navickaitė
Širdies nitrerginiai neuronai: lokalizacija, morfologija ir funkcinė reikšmė
BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS Medicinos vientisųjų studijų programa
Darbo vadovas: prof. dr. Dainius H. Pauža
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 4 2. SUMMARY ... 5 3. PADĖKA ... 6 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 65. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6
6. SANTRUMPOS ... 7
7. SĄVOKOS ... 8
8. ĮVADAS ... 9
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
10.1. Azoto oksido funkcija ir veikimo mechanizmas nervų sistemoje ... 11
10.2. Intrakardinės ir ekstrakardinės nervų sistemos struktūra ... 12
10.3. Nitrerginių neuronų paplitimas ir galima funkcija intrakardinėje nervų sistemoje ... 15
10.4. Ekstrakardinių nitrerginių nervinių skaidulų kilmės tyrimai ... 17
10.5. Azoto oksido vaidmuo širdies ir kraujagyslių sistemos aferentinės informacijos integracijoje centrinėje nervų sistemoje ... 18
10.6. Azoto oksido reikšmė širdies ir kraujagyslių ligų patogenezei ir jo panaudojimo terapinės galimybės ... 19
11. TYRIMO METODIKA ... 22
11.1. Tiriamosios medžiaga preparavimas ir paruošimas ... 22
11.2. Smegenų kamieno preparatų paruošimas ... 23
11.3. Totalių preparatų paruošimas ... 23
11.4. Šaldomųjų pjūvių paruošimas ... 24
11.5. Imunohistocheminių reakcijų atlikimas ... 24
11.6. Preparatų mikroskopavimas, morfometriniai matavimai ir statistinė duomenų analizė ... 26
12. REZULTATAI ... 27
12.1. Nitrerginių neuronų paplitimas dvejiniame branduolyje ... 27
12.2. Nitrerginiai neuronai nugariniame nervo klajoklio branduolyje, atskirojo laido branduoliuose ir nervo klajoklio šaknelėse ... 29
12.3. Nitrerginiai neuronai nervo klajoklio apatiniame juntamajame ir nugariniuose mazguose .... 32
4
1. SANTRAUKA
Ieva Navickaitė. Širdies nitrerginiai neuronai: lokalizacija, morfologija ir funkcinė reikšmė. Medicinos studijų baigiamasis magistro darbas / mokslinis vadovas prof. dr. Dainius H. Pauža, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Anatomijos institutas, Kaunas, 2020.
Tyrimo tikslas. Ištirti nitrerginių neuronų kūnų ir nervinių skaidulų paplitimą bei morfologines ypatybes širdies inervacijos šaltiniuose.
Uždaviniai. 1. Nustatyti nitrerginių neuronų kūnų lokalizaciją, morfologines ypatybes ir nervinių skaidulų paplitimą nervo klajoklio branduoliuose bei šaknelėse; 2. Nustatyti nitrerginių neuronų kūnų paplitimą nervo klajoklio apatiniame juntamajame mazge bei C8-Th5 segmentų nugariniuose mazguose; 3. Nustatyti nitrerginių neuronų kūnų bei nervinių skaidulų paplitimą nugaros smegenų Th1-5 segmentų tarpiniame šoniniame branduolyje ir žvaigždiniame mazge; 4. Nustatyti nitrerginių nervinių skaidulų paplitimą nervo klajoklio kaklinėje dalyje ir širdinėse šakose.
Metodika. Šiam tyrimui buvo panaudotos 28 žiurkės. Paruošti pailgųjų smegenų, nugaros smegenų Th1-5 segmentų, nervo klajoklio apatinio juntamojo mazgo, nervo klajoklio šaknelių, nervo kaklinės dalies ir krūtininių širdinių šakų, C8-Th5 segmentų nugarinių mazgų ir žvaigždinių mazgų preparatai. Panaudojant pirminius antikūnus prieš neuroninę azoto oksido sintazę (nNOS), cholino acetiltransferazę (ChAT), periferiną, pagrindinį mielino baltymą (MBP), substanciją P (SP), su kalcitonino genu susijusį peptidą (CGRP) ir tirozino hidroksilazę (TH), buvo atliktos imunohistocheminės reakcijos su tiriamaisiais audiniais, o gauti preparatai ištirti lazeriniu konfokaliniu mikroskopu.
Tyrimo rezultatai. Dvejiniame branduolyje nitrerginių neuronų kūnai (NK) buvo bifenotipiniai su ChAT. Tankiajame pobranduolyje bifenotipiniai nNOS/ChAT imunoreaktyvūs (IR) NK sudarė 12,4 ± 1,6 %, pusiau tankiajame – 4,7 ± 1,2 %, o laisvajame nebuvo nustatyti. Nugariniame nervo klajoklio branduolyje bifenotipiniai nNOS/ChAT IR NK sudarė 7,0 ± 1,0 %, o išimtinai nNOS IR – tik 2,6 ± 0,4 %. Maži nitrerginiai NK buvo gausiai paplitę atskirojo laido branduoliuose. Nitrerginės nervinės skaidulos (NS) buvo gausios nervo klajoklio šaknelėse. Kaklinėje nervo klajoklio dalyje nitrerginės NS sudarė 31,4 ± 0,5 % ir dominuojanti jų dalis buvo nervo klajoklio širdinėse šakose. Apatiniame nervo klajoklio mazge 37,4 ± 1,3 % NK buvo nNOS IR, o nugariniuose mazguose rasti tik pavieniai nitrerginiai NK. Tarpiniame šoniniame branduolyje dauguma NK buvo nNOS/ChAT IR. Žvaigždiniame mazge nustatyti tik pavieniai nNOS IR NK.
5
2. SUMMARY
Ieva Navickaitė. Cardiac Nitrergic Neurons: Location, Morphology and Functional Role. Master‘s thesis / scientific supervisor prof. dr. Dainius H. Pauža, Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Institute of Anatomy, Kaunas, 2020.
Aim of the study. To study the distribution and morphological pattern of nitrergic neuronal somata and nerve fibres within the potential extrinsic sources of cardiac innervation.
Objectives. 1. To explore the distribution of nitrergic neuronal somata and nerve fibres within the vagal nuclei and vagal nerve rootlets; 2. To examine the distribution of nitrergic neuronal somata within the inferior vagal sensory ganglia and C8-Th5 dorsal root ganglia; 3. To inspect the distribution of nitrergic neuronal somata and nerve fibres within the Th1-5 intermediolateral nuclei and stellate ganglia; 4. To inspect the distribution of nitrergic nerve fibres within the cervical vagal nerve and vagal cardiac branches.
Methods. This study includes 28 rats examined. Section of the medulla oblongata, Th1-5 segments of the spinal cord, inferior vagal sensory ganglia, vagal rootlets, cervical vagal nerve, thoracic cardiac branches, C8-Th5 dorsal root ganglia and stellate ganglia were prepared. Immunohistochemical staining for neuronal nitric oxide synthase (nNOS), choline acetyltransferase (ChAT), peripherin, myelin basic protein (MBP), substantia P (SP), calcitonin gene-related peptide (CGRP) and tyrosine hydroxylase (TH) was performed. Preparations were analysed employing laser-scanning microscope.
Results. In the nucleus ambiguus, all nitrergic neuronal somata (NS) were biphenotypic with ChAT. They composed 12,4 ± 1,6 % in the compact subnucleus, 4,7 ± 1,2 % in the semicompact subnucleus and were absent in the loose part. In the dorsal nucleus of vagus nerve, biphenotypic nNOS/ChAT NS composed 7,0 ± 1,0 %, while purely nitrergic ones – 2,6 ± 0,4 % only. The small nitrergic NS were abundant in the nuclei of the solitary tract. Nitrergic NFs were plentiful in the rootlets of the vagal nerve. 31,4 ± 0,5 % of NFs in the cervical vagal nerve were nitrergic and an abundant population of them proceeded into cardiac branches. Inferior vagal sensory ganglia involved 37,4 ± 1,3 % of NS immunoreactive for nNOS. In the dorsal root ganglia, nitrergic NS were scarce. In the intermediolateral nuclei, the majority of NS were biphenotypic nNOS/ChAT. Only solitary nitrergic NS were revealed in the stellate ganglia.
6
3. PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui prof. dr. Dainiui H. Paužai už pasiūlytą įdomią tyrimo temą, pagalbą sprendžiant metodines problemas, interpretuojant gautus rezultatus bei šiltą bendravimą ir palaikymą.
Taip pat esu dėkinga visam Anatomijos instituto kolektyvui už draugišką priėmimą, palaikymą ir bendradarbiavimą.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autorei interesų konflikto nebuvo.Šis darbas buvo finansuotas iš Europos socialinio fondo lėšų (projektai Nr. 09.3.3.-LMT-K-712-09-0009, Nr. 09.3.3.-LMT-K-712-10-0195, Nr. 09.3.3.-LMT-K-712-15-0223) pagal dotacijos sutartis su Lietuvos mokslo taryba (LMT).
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
7
6. SANTRUMPOS
ACh – acetilcholinas
AKS – arterinis kraujo spaudimas
cAMP – ciklinis adenozino monofosfatas cGMP – ciklinis guanozino monofosfatas CGRP – su kalcitonino genu susijęs peptidas ChAT – cholino acetiltransferazė
CNS – centrinė nervų sistema
IR – imunoreaktyvumas, imunoreaktyvus
L-NAME – N(G)-nitro-L-arginino metilo esteris MBP – mielino pagrindinis baltymas
MIF ląstelės – mažos intensyviai fluorescuojančios ląstelės NK – neurono kūnas
NO – azoto oksidas
NOS – azoto oksido sintazė
nNOS – neuroninė azoto oksido sintazė eNOS – endotelinė azoto oksido sintazė iNOS – indukcinė azoto oksido sintazė NS – nervinės skaidulos
NTS – atskirojo laido branduoliai, nuclei tractus solitarii PDE – fosfodiesterazė
PKA – proteinkinazė A
PNS – periferinė nervų sistema sGC – tirpi guanilato ciklazė SP – substancija P
8
7. SĄVOKOS
Batmotropija – kardiomiocitų jaudrumas ir gebėjimas generuoti veikimo potencialą;
Bifenotipinis neuronas – neuronas, simultaniškai imunoreaktyvus dviem nerviniams žymenims, pvz., neuroninei azoto oksido sintazei ir cholino acetiltransferazei;
9
8. ĮVADAS
Azoto oksidas (NO) – svarbi dujinė signalinė molekulė, dalyvaujanti įvairiuose biologiniuose procesuose. Nervinėse ląstelėse NO sintetina neuroninė azoto oksido sintazė (nNOS), kuri oksiduoja aminorūgštį L-argininą ir šios reakcijos metu susidaro L-citrulinas bei išsiskiria NO [1]. Neuroninei NOS imunoreaktyvūs (IR), t. y. nitrerginiai, neuronai yra randami tiek centrinėje (CNS), tiek periferinėje nervų sistemoje (PNS) [2].
Daug dėmesio skiriama autonominės nervų sistemos nitrerginių neuronų paplitimo bei funkcijos tyrimams, nes NO yra svarbus širdies ir kraujagyslių [3–5], virškinamojo trakto [6, 7] bei urogenitalinės sistemos [8] ligų patogenezei. Ypač aktyviai tiriami įvairių širdies ir kraujagyslių ligų modeliai, nes yra sukaupta duomenų, įrodančių nNOS susintetinto azoto oksido galimybes apsaugoti miokardą nuo žalingo išemijos poveikio [9], prieširdžius [10] ir skilvelius nuo virpėjimo [11, 12], be to, nustatyta, jog NO yra svarbus arterinio kraujo spaudimo (AKS) reguliacijoje [13, 14]. Nors nitrerginiai neuronų kūnai (NK) yra randami įvairių gyvūnų bei žmogaus vidusieniniame širdies nerviniame rezginyje [15], didelės dalies širdyje randamų nitrerginių nervinių skaidulų (NS) kilmė yra ekstrakardinė, t. y. šios nervinės skaidulos yra atkeliavusios į širdį iš išorinių nitrerginių neuronų telkinių, kitaip dar vadinamų šaltiniais [16, 17]. Kadangi didelė dalis nitrerginių intrakardinių neuronų yra bifenotipiniai su cholino acetiltransferaze (ChAT), įsivyravo nuomonė, jog jie dalyvauja parasimpatinėje širdies reguliacijoje [18–21]. Tačiau taip pat keliama hipotezė, jog širdį inervuojančios nitrerginės nervinės skaidulos gali būti kilusios iš nervo klajoklio juntamųjų mazgų arba nugarinių mazgų ir dalyvauti širdies aferentinėje inervacijoje [17, 22].
10
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas
Ištirti nitrerginių neuronų kūnų ir nervinių skaidulų paplitimą bei morfologines ypatybes širdies inervacijos šaltiniuose
Uždaviniai:
1. Nustatyti nitrerginių neuronų kūnų lokalizaciją, morfologines ypatybes ir nervinių skaidulų paplitimą nervo klajoklio branduoliuose bei šaknelėse;
2. Nustatyti nitrerginių neuronų kūnų paplitimą nervo klajoklio apatiniame juntamajame mazge bei C8-Th5 segmentų nugariniuose mazguose;
3. Nustatyti nitrerginių neuronų kūnų bei nervinių skaidulų paplitimą nugaros smegenų Th1-5 segmentų tarpiniame šoniniame branduolyje ir žvaigždiniame mazge;
11
10. LITERATŪROS APŽVALGA
10.1. Azoto oksido funkcija ir veikimo mechanizmas nervų sistemoje
Azoto monoksidas (NO) – dujinė signalinė molekulė, dalyvaujanti įvairiuose biologiniuose procesuose. NO sintetina trys azoto oksido sintazės (NOS) izoformos: neuroninė (nNOS, NOS1), indukcinė (iNOS, NOS2) ir endotelinė (eNOS, NOS3) [5]. Neuroninė NOS ekspresuojama centrinės (CNS) ir periferinės nervų sistemos (PNS) neuronuose [2], tačiau taip pat nustatoma ir inkstų tankiosios dėmės, kasos salelių ląstelėse, kardiomiocituose bei kraujagyslių lygiuosiuose raumenyse [5]. Endotelinė NOS nustatoma ne tik endoteliocituose, bet taip pat ir trombocituose, kardiomiocituose, placentos sincitiotrofoblastuose bei kai kuriose kitose ląstelėse [5]. Indukcinė NOS organizme sintetinama tik prasidėjus imuniniam atsakui, kadangi jos sintezę aktyvina bakterijų lipopolisacharidai, citokinai ir kitos biologiškai aktyvios medžiagos, išsiskiriančios uždegimo metu [5]. Pastaroji NOS forma gausiausiai nustatoma makrofaguose, tačiau uždegimo metu gali būti aptinkama ir daugelyje įvairių audinių ląstelių [5]. Visos žinomos NOS izoformos argininą, kaip substratą, paverčia L-citrulinu ir NO, dalyvaujant molekuliniam deguoniui, NADPH (nikotinamido adenino dinukleotido fosfatui) bei įvairiems kitiems kofaktoriams [1].
12 vivo šis atstumas gali būti dar mažesnis [29]. Be to, in vivo NO išlieka stabilus apie 1-2 sekundes [1], o jo veikimo pusperiodis yra apie 5 ms [30].
Nervų sistemoje nitrerginiai neuronai paplitę netolygiai: skiriasi ne tik jų gausa skirtingose struktūrose, bet ir neuronų morfologiniai tipai. Daugiausiai nitrerginių neuronų nustatoma smegenėlėse, viršutiniuose kalneliuose, centrinėje pilkojoje medžiagoje, vidutiniškai – smegenų žievėje, hipokampe, nugaros smegenyse, mažiausiai – didžiojoje smegenų jungtyje, skliaute bei blyškiajame kūne [31, 32]. Neuroninės NOS imunoreaktyvumas gausiai nustatomas įvairių struktūrų įterptiniuose neuronuose [1, 33], tačiau taip pat randamas ir specializuotuose juntamuosiuose, visceraliniuose eferentiniuose neuronuose [34, 35]. Kadangi azoto oksidas yra plačiai paplitęs nervų sistemoje, jo poveikis širdies nervinei reguliacijai taip pat gali pasireikšti įvairiuose širdies nervinės reguliacijos lygiuose (1 pav.): pailgųjų smegenų branduoliuose, moduliuojančiuose širdies ir kraujagyslių refleksus, simpatiniuose bei juntamuosiuose neuronuose, taip pat ir vidusieniniuose širdies nerviniuose mazguose [36].
10.2. Intrakardinės ir ekstrakardinės nervų sistemos struktūra
Manoma, kad širdį kontroliuojančių pirmųjų nervo klajoklio neuronų kūnai, kurių ikimazginiai aksonai sudaro sinapses su antraisiais neuronais vidusieniniuose širdies nerviniuose mazguose, lokalizuojasi dviejuose pailgųjų smegenų branduoliuose: dvejiniame, nucleus ambiguus, ir nugariniame nervo klajoklio branduolyje, nucleus dorsalis n. vagi [38]. Pavieniai pirmieji nervo klajoklio neuronai
13 taip pat gali būti nustatomi ir tarpinėje zonoje tarp šių branduolių, kadangi evoliucijos eigoje, gyvybei keliantis iš vandens į sausumą ir vykstant anatominiams bei fiziologiniams pokyčiams siekiant prisitaikyti prie kvėpavimo atmosferos oru, dalis evoliuciškai senesnio nugarinio nervo klajoklio branduolio neuronų migravo į ventralinę pailgųjų smegenų dalį, kur yra kvėpavimo centras [38].
Literatūroje teigiama, kad didžioji dalis (apie 80%) ikimazginių parasimpatinių širdinių nervinių skaidulų yra kilusios iš dvejinio branduolio [39]. Dvejinis branduolys yra skirstomas į tris pagrindinius pobranduolius: tankųjį, pars compacta, pusiau tankųjį, pars semicompacta, ir laisvąjį (angl. loose part), bei išorinį darinį (angl. external formation), esantį ventrolateralinėje pailgųjų smegenų dalyje, ventraliau pagrindinių pobranduolių [40]. Retrogradinio neuronų žymėjimo metodika gauti duomenys parodo, kad daugiausiai pirmųjų širdinių nervo klajoklio neuronų kūnų yra išoriniame dvejinio branduolio darinyje, mažiau – tankiajame pobranduolyje [40, 41]. Elektrofiziologiškai dvejinio branduolio širdiniai neuronai pasižymi ritmišku aktyvumu, kuris priklauso nuo: 2) arterinio pulso ir jutiminių signalų, perduodamų iš baroreceptorių per atskirojo laido branduolius, nuclei tractus solitarii (NTS), į nucleus ambiguus, ir 2) kvėpavimo centro aktyvumo [38]. Spėjama, kad iš minėtų struktūrų gauti signalai padeda efektyviai reguliuoti širdies veiklą pakitus aplinkos sąlygoms, kadangi iš dvejinio branduolio kilusios B tipo mielininės skaidulos inervuoja širdies laidžiosios sistemos mazgus ir kontroliuoja širdies susitraukimų dažnį, prieširdinį skilvelių laidumą ir slopina miokardo inotropiją [38, 39].
Pirmieji parasimpatiniai širdiniai neuronai, esantys nugariniame nervo klajoklio branduolyje inervuoja širdį nemielininėmis C tipo skaidulomis [38]. Teigiama, kad šių neuronų aktyvumas yra pastovus, reguliarus ir nepriklauso nuo aferentinių signalų, perduodamų periferinių chemo- bei baroreceptorių [39]. Nors anksčiau buvo manoma, kad nucleus dorsalis n. vagi turi mažą įtaką širdies nervinei reguliacijai, naujesni tyrimai parodė, kad šio branduolio neuronų aktyvumas apsaugo kairiojo skilvelio miokardą nuo išeminio pažeidimo [42]. Be to, galvojama, kad nugarinio nervo klajoklio branduolio neuronai, reguliuojantys skilvelių jaudrumą, gali veikti per intrakardinius nitrerginius neuronus [43]. Literatūroje teigiama, kad pagrindinė nugarinio nervo klajoklio branduolio širdinių neuronų funkcija – reguliuoti skilvelių inotropiją [44] ir batmotropiją [43].
14 (ACh), kuris jungiasi prie vidusieninių neuronų nikotininių NN receptorių ir ląstelių-taikinių muskarininių M2 (dominuoja širdyje) ir M3 receptorių [48]. Širdyje išsiskyręs acetilcholinas sukelia neigiamą inotropinį, chronotropinį bei batmotropinį poveikį [48].
Pirmieji simpatiniai širdiniai neuronai lokalizuojasi nugaros smegenų Th1-5 segmentų tarpiniuose šoniniuose branduoliuose, nuclei intermediolaterales [49]. Šių neuronų mielininės cholinerginės nervinės skaidulos įeina į ventralinių šaknelių sudėtį ir per baltąsias jungiančiąsias šakas, rami communicantes albi, pasiekia simpatinio kamieno mazgus, kur sudaro sinapsinius ryšius su antraisiais simpatiniais neuronais [49]. Pirmųjų simpatinių neuronų neurotransmiteris yra acetilcholinas, kuris veikia per nikotininius NN receptorius ir taip perduoda nervinį impulsą adrenerginiams simpatinių mazgų neuronams [48]. Simpatinių mazgų neuronų užmazginiai aksonai formuoja širdinius simpatinius nervus ir vadinami atitinkamai pagal mazgą, iš kurio yra kilę: viršutinis, vidurinis ir apatinis (dažniausiai – iš žvaigždinio mazgo, ganglion stellatum) kakliniai ir krūtininis širdiniai nervai [45]. Pasiekusios širdį, adrenerginės nervinės skaidulos išplinta abiejų prieširdžių ir abiejų širdies skilvelių sienų epikarde, miokarde bei endokarde ir sąveikauja su vidusieninio širdies nervinio rezginio neuronais, be to, tiesiogiai veikia ritmo vedlio ląsteles, laidžiąją sistemą bei kardiomiocitus [49]. Širdyje išsiskyręs adrenalinas veikia ląsteles-taikinius per β1 (dominuoja) ir β2 receptorius ir sukelia teigiamą inotropinį, chronotropinį bei batmotropinį poveikį [48].
15 10.3. Nitrerginių neuronų paplitimas ir galima funkcija intrakardinėje nervų sistemoje
Nitrerginiai neuronų kūnai nustatyti žiurkės [18, 34], jūrų kiaulytės [16, 17], triušio [20, 23, 24], kiaulės [21] ir žmogaus [19] intrakardiniuose nerviniuose mazguose. Skirtingose epikardinio nervinio rezginio vietose nitrerginių NK kiekis svyruoja nuo 7% iki 67% [15]. Dauguma nNOS-IR neuronų taip pat imunoreaktyvūs ir cholino acetiltransferazei [18, 20–22]. Sinusiniame mazge taip pat nustatyta bifenotipinių nNOS/ChAT IR neuronų kūnų bei nervinių skaidulų, pavieniai neuronai buvo išimtinai nNOS IR [23]. Prieširdžių miokarde buvo nustatytos pavienės bifenotipinės nNOS/TH IR nervinės skaidulos [55]. Skilvelių miokarde nitrerginės NS yra antros pagal gausumą po adrenerginių ir net aštuonis kartus viršija cholinerginių skaidulų kiekį [20].
Vidusieniniame širdies nerviniame rezginyje taip pat pastebėti morfologiniai nitrerginių neuronų kūnų skirtumai. Nors dauguma išimtinai nitrerginių ar bifenotipinių su ChAT neuronų kūnų žymiai nesiskiria nuo gausiausiai širdyje paplitusių cholinerginių neuronų [21], kai kurie nNOS IR neuronų kūnai savo morfologija primena įterptinius neuronus dėl mažesnio neurono kūno dydžio bei ląstelės daugiapoliškumo [56]. Reikšmingai mažesni nNOS IR neuronų kūnai buvo nustatyti ir triušio širdies skilveliuose [20]. Be to, pastebėta, kad dalis vidusieninių nitrerginių neuronų aksonų prisijungia prie greta besitęsiančių epikardinių nervų, o dalis neišeina iš mazgo ribų [18]. Kai kurios nNOS IR nervinės skaidulos sujungia greta esančius nervinius mazgus [57]. Tai kelia hipotezę, kad dalis nitrerginių neuronų gali veikti kaip įterptiniai neuronai, jungiantys kelis to paties mazgo arba gretimų mazgų neuronus [19].
Dažna nNOS ir ChAT koegzistencija širdiniuose neuronuose kelia hipotezę, jog nNOS susintetintas azoto oksidas dalyvauja širdies veiklos parasimpatinėje reguliacijoje ar jos moduliacijoje. Fiziologinių tyrimų duomenimis, bifenotipinių nNOS/ChAT IR parasimpatinių aksonų terminalėse NO gali presinapsiškai moduliuoti acetilcholino išskyrimą: NO aktyvina sGC, sintetinamas cGMP, kuris slopina fosfodiesterazę PDE3 ir tai lemia padidėjusią ciklinio adenozino monofosfato (cAMP) sintezę, kuri sukelia nuo proteinkinazės A (PKA) priklausomą N-tipo Ca2+ jonų kanalų fosforilinimą, tuomet pro šiuos kanalus į aksono terminalę plūsta kalcio jonai ir tai lemia acetilcholino išsiskyrimą iš sinapsinių pūslelių į sinapsinį plyšį [36, 58] (2 pav.). Tačiau Brack ir kiti [59] teigia, jog skilveliuose iš postganglinių nervinių skaidulų išsiskyrusio NO poveikis nepriklauso nuo muskarininių receptorių ir kelia hipotezę, jog nitrerginės nervo klajoklio NS gali sudaryti atskirą parasimpatinių nervinių skaidulų tipą.
16 neuronuose: vietoje cholinerginėse terminalėse randamos PDE3, simpatinėse nustatoma PDE2 ir tolimesnių reakcijų kaskada lemia nuo proteinkinazės A priklausomo N-tipo Ca2+ kanalų fosforilinimo slopinimą [3, 36, 58] (2 pav.). Tačiau simpatiniuose mazguose nitrerginiai neuronai paplitę negausiai: žiurkės ganglion stellatum jų nebuvo aptikta [34], jūrų kiaulytės – rasti pavieniai [17], o katės mazguose nitrerginiai neuronai sudarė iki 8,3% [60].
2 pav. NO veikimo mechanizmas reguliuojant parasimpatinės ir simpatinės inervacijos balansą širdyje (adaptuota pagal Paton ir kiti [36]). Sutrumpinimai: nNOS, neuroninė azoto oksido sintazė;
sGC, tirpi guanilato ciklazė; GTP, guanilato trifosfatas; cGMP, ciklinis guanilato monofosfatas; PDE2, fosfodiesterazė 2; PDE3, fosfodiesterazė 3; cAMP, ciklinis adenozino monofosfatas; PKA,
proteinkinazė A; ACh, acetilcholinas; ICaN, N-tipo Ca2+ kanalai;ICaP, P-tipo Ca2+ kanalai; Gi,
17 10.4. Ekstrakardinių nitrerginių nervinių skaidulų kilmės tyrimai
Nepaisant gana gausaus nitrerginių neuronų kūnų paplitimo intrakardiniuose nerviniuose mazguose, yra žinoma, jog dalis širdinių nitrerginių nervinių skaidulų yra kilusios iš išorinių šaltinių [16, 17]. Pastebėta, jog po vagotomijos jūrų kiaulytės kairiajame prieširdyje bei tarpprieširdinėje pertvaroje esantys neuronų kūnai netenka juos inervuojančių nitrerginių nervinių terminalių, kurios galimai yra iš nervo klajoklio branduolių kilusios ikimazginės parasimpatinės skaidulos [16]. Atlikę retrogradinį žiurkės sinusinį mazgą inervuojančių nervo klajoklio branduolių neuronų ženklinimą, Takanaga ir kiti [61] nustatė, jog nepaisant gausaus nNOS imunoreaktyvių neuronų paplitimo nugariniame nervo klajoklio branduolyje, tik pavieniai neuronų kūnai buvo pozityvūs ir nNOS, ir retrogradiniam žymeniui. Dvejiniame branduolyje ir tarpinėje zonoje nitrerginių NK nebuvo rasta, nors juose buvo nustatyta atitinkamai 63,6% ir 7,6% visų sinusinį mazgą inervuojančių neuronų [61]. Pažymėtina, kad aprašytame tyrime naudotas retrogradinis žymėjimas choleros toksino B subvienetu nėra patikima metodika, nes buvo įrodyta, jog mažos injekuojamo choleros toksino B subvieneto molekulės geba prasiskverbti pro perikardo fenestracijas ir tai galėjo nulemti širdies aplinkoje esančius organus, ypač stemplę ir trachėją, inervuojančių neuronų pažymėjimą Takanaga su bendradarbiais atliktame tyrime [41, 61, 62].
18 apibendrinti, kad duomenys apie nitrerginių skaidulų kilmę ir funkciją širdyje yra prieštaringi, o duomenų interpretaciją apsunkina galimi atliktų tyrimų metodiniai trūkumai bei tarprūšiniai tirtų laboratorinių gyvūnų skirtumai.
10.5. Azoto oksido vaidmuo širdies ir kraujagyslių sistemos aferentinės informacijos integracijoje centrinėje nervų sistemoje
Neuroninės NOS susintetintas azoto oksidas taip pat gali dalyvauti perduodant juntamąją informaciją iš nervo klajoklio mazgų į atskirojo laido branduolius, nuclei tractus solitarii. Gausus nitrerginių neuronų paplitimas nustatytas pelės [64], žiurkės [34], jūrų kiaulytės [17], kiaulės [65] bei žmogaus vaisiaus [66] nervo klajoklio juntamuosiuose mazguose. Be to, nNOS IR nervinių terminalių kiekis NTS reikšmingai sumažėja atlikus apatinio nervo klajoklio mazgo rezekciją [67]. Teigiama, jog net 67% nervo klajoklio juntamųjų mazgų neuronų įcentrinių aksonų terminalių atskirajame branduolyje yra nNOS imunoreaktyvios [67]. Tačiau Atkinson ir kitų [63] tyrimo rezultatai priešingi: retrogradiškai pažymėjus nervo klajoklio ganglion inferius neuronus, NTS retrogradiniam žymeniui pozityvios nervinės terminalės nebuvo nNOS IR. Kontroversiški tyrimų duomenys kelia kelias galimos NO funkcijos nervo klajoklio juntamuosiuose mazguose hipotezes: 1) azoto oksidas veikia kaip įcentrinių aksonų neurotransmiteris [67]; 2) NO gali veikti kaip tarpneuroninis neurotransmiteris nervo klajoklio juntamųjų mazgų ribose, tačiau nepernešamas į šių neuronų įcentrinių aksonų terminales [63]. Nors daugumos neuroanatominių tyrimų rezultatai labiau remia pirmąją hipotezę [67], fiziologiniai eksperimentai rodo, jog NO taip pat gali veikti vietiškai, moduliuodamas neuronų aktyvumą [28]. Pavyzdžiui, apatiniame nervo klajoklio mazge nustatyti nitrerginiai barorecepciniai neuronai, iš kurių išsiskyręs NO autokrininiu būdu slopina šių neuronų natrio jonų kanalus ir taip prailgina jų refrakterinį periodą [68].
19 Nitrerginiai neuronai ir nervinės skaidulos yra nustatomos visuose atskirojo laido branduoliuose [67]. Gausiausia populiacija nNOS IR NK randama centriniame pobranduolyje, į kurį projektuojasi visceralinės aferentinės nervinės skaidulos iš burnos, stemplės ir skrandžio. Vidutiniškai gausiai nitrerginiai neuronai bei nervinės skaidulos yra paplitę užpakaliniame šoniniame atskirajame, nucleus solitarius posterolateralis, jungties, nucleus comissuralis, vidiniame atskirajame, nucleus medialis solitarius, ir intersticiniame, nucleus interstitialis solitarius, branduoliuose, kurie gauna juntamąją informaciją iš baro- bei chemoreceptorių [67]. Be to, NTS nitrerginiai neuronai dažnai yra bifenotipiniai su glutamatu: tokių neuronų skaičius svyruoja nuo 83 ± 13% centriniame NTS pobranduolyje iki 9 ± 8% komisūriniame, kituose – 20-64% [72].
Atskirojo laido branduolių neuronai integruoja iš baro- bei chemoreceptorių, širdies ir plaučių aferentinių NS gautą informaciją ir jų aksonai projektuojasi į branduolius, reguliuojančius parasimpatinių bei simpatinių širdį inervuojančių neuronų aktyvumą [69]. Širdies veiklą slopinantis poveikis sukeliamas per dvejinį branduolį: jį pasiekiantys nerviniai impulsai iš NTS aktyvina pirmuosius parasimpatinius, šie – vidusieninius širdinius neuronus ir sukeliama bradikardija [68, 69]. Simpatinės nervų sistemos aktyvumas moduliuojamas per NTS nervinių skaidulų projekcijas į kaudalinės ventrolateralinės pailgųjų smegenų srities neuronus, tuomet šie slopina rostralinėje ventrolateralinėje pailgųjų smegenų srityje esančius tinklinio darinio C1 srities adrenerginius neuronus, kurie projektuojasi į tarpinius šoninius branduolius nugaros smegenyse, ir taip sumažėja simpatinės širdies inervacijos tonusas [68]. Kadangi nitrerginiai neuronai gausiai paplitę NTS, jie gali dalyvauti aprašytuose refleksuose kaip interneuronai. Tokia nitrerginių NTS neuronų funkcija aprašyta stemplės pailgųjų smegenų reflekso lanke: nNOS IR centrinio atskirojo branduolio NS perduoda informaciją dvejinio branduolio neuronams [73]. Eksperimentinių tyrimų rezultatai kelia hipotezę, jog toks kelias gali dalyvauti ir širdies refleksiniuose lankuose, kadangi į dvejinį branduolį suleidus NO substrato L-arginino arba NO donoro natrio nitroprusido sukeliama bradikardija, o inhibitoriaus L-NAME injekcija sukelia tachikardiją [74]. Fiziologinėmis sąlygomis tokį efektą galėtų sukelti NO, išskirtas kardiovaskuliniuose refleksuose dalyvaujančių nitrerginių NTS neuronų.
10.6. Azoto oksido reikšmė širdies ir kraujagyslių ligų patogenezei ir jo panaudojimo terapinės galimybės
20 Tačiau naujesni moksliniai tyrimai įrodė, jog nervo klajoklio stimuliacijos metu išsiskiria NO, kuris padidina skilvelių virpėjimo slenkstį [59], o farmakologiškai slopinant NO išsiskyrimą arba inaktyvavus nNOS koduojantį geną (angl. knock-out) šis poveikis išnyksta [12]. Brack ir kiti [59] taip pat nustatė, jog antiaritminis nervo klajoklio stimuliacijos poveikis yra nepriklausomas nuo acetilcholino ir gali būti moduliuojamas skilvelius inervuojančių nitrerginių nervinių skaidulų arba išimtinai nNOS IR neuronų. Tačiau kitų tyrimų duomenimis, atropinas, muskarininių receptorių antagonistas, užblokuoja antiaritminį NO poveikį [76]. Be to, šis preparatas jau daugelį metų yra naudojamas klasikinėse in vivo studijose, siekiant užblokuoti nervo klajoklio stimuliacijos antiaritminį poveikį [12], todėl kiti autoriai laikosi nuomonės, jog nNOS susintetintas NO, veikdamas NO-cGMP-PDE3 signaliniu keliu, padidina acetilcholino išskyrimą iš parasimpatinių nervinių skaidulų [76]. Nervo klajoklio antiaritminis poveikis gali būti moduliuojamas ir pailgųjų smegenų lygmenyje, nes nustatyta, jog selektyviais farmakogenetiniais metodais inaktyvavus nugarinio nervo klajoklio branduolio neuronus sutrumpėja efektyvus skilvelių refrakterinis periodas ir sumažėja skilvelių virpėjimo slenkstis, o šių neuronų antiaritminis poveikis gali būti nulemtas antrųjų (vidusieninių) parasimpatinių nitrerginių neuronų aktyvavimo [43]. Taigi, nors neabejojama neuroninio azoto oksido antiaritminiu poveikiu, tikslus jo veikimo mechanizmas vis dar nežinomas.
22
11. TYRIMO METODIKA
11.1. Tiriamosios medžiaga preparavimas ir paruošimas
Tyrimui buvo panaudotos 28 Wistar veislės suaugusios (2-5 mėn.) abiejų lyčių žiurkės, užaugintos Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos vivariume. Gyvūnams buvo atlikta eutanazija, naudojant anglies dioksido dujas. Atlikus torakotomiją, širdis in situ buvo gausiai perfuzuota per kairįjį skilvelį fiziologiniu natrio chlorido tirpalu 0,01 M fosfatiniame buferyje (PBS; pH 7,4). Išplovus iš kraujotakos sistemos kraują, gyvūno audiniai buvo trumpai chemiškai fiksuoti perfuzuojant 4% paraformaldehido (PFA; pH 7,4) tirpalu. PBS sudėtis (mM): 137 NaCl; 2,7 KCl; 10 Na2HPO4; 2 KH2PO4.
Žirklėmis nukirpus žiurkės galvą ir viršutinę kaklinę stuburo dalį, buvo pašalintas apatinis žandikaulis. Po šios procedūros tiriamoji medžiaga toliau buvo preparuota naudojant Stemi 2000CS stereomikroskopą (Zeiss, Gottingen, Vokietija) ir KL 2500 LCD šviesolaidžius (Schot AG, Mainz, Vokietija). Pradedant nuo rostralinės kaukolės dalies, paeiliui rezekuoti kaukolės kaulai (nosikaulis, kaktikaulis, momenkauliai, tarpiniai momenkauliai ir pakauškaulis). Atidengus galvos smegenis, buvo pašalintos smegenėlės, galinės smegenys ir išimtas smegenų kamienas, nuo kurio atidalinta pailgųjų smegenų dalis, esanti tarp sulcus pontomedullaris ir poliežuvinio nervo šaknelių. Po šių procedūrų buvo disekuoti kaklo raumenys ir identifikuota vidinė miego arterija, a. carotis interna, bei greta jos sienos besitęsiantis nervas klajoklis, nervus vagus. Nervas preparuotas rostraline kryptimi iki pat įėjimo į kaukolę vietos – jungo angos, foramen jugulare. Nervo klajoklio šaknelės buvo perkirptos ties įėjimo į pailgąsias smegenis vieta, kaklinė nervo dalis perkirpta ties apatiniais kaklo slanksteliais ir išimtas visas nervo klajoklio šaknelių, juntamųjų mazgų ir nervo klajoklio kaklinės dalies kompleksas. Tuomet medžiaga buvo perkelta į Petri lėkštelę su PBS, pašalinti aplinkiniai audiniai ir nervo klajoklio struktūros buvo sukarpytos į atskirus preparatus: 1) nervo klajoklio šakneles su viršutiniu nervo klajoklio mazgu;
3 pav. Žiurkės nervo klajoklio šaknelių, juntamųjų mazgų ir kaklinės nervo dalies kompleksas.
23 2) apatinį nervo klajoklio mazgą, kuris buvo identifikuotas kaip kaudaliau esantis nervo klajoklio sustorėjimas, ir 3) kaklinės nervo klajoklio dalies segmentus (3 pav.).
Atvėrus krūtinės ląstą, buvo išpreparuotos nervo klajoklio krūtininės širdinės šakos, tuomet pašalinti krūtinės ląstoje esantys vidaus organai, identifikuotas simpatinis kamienas ir išpreparuotas žvaigždinis mazgas, ganglion stellatum. Disekavus nugaros raumenis, atlikta stuburo slankstelių lankų laminektomija, ekstirpuoti nugaros smegenų Th1-5 segmentai ir C8-Th5 segmentų nugariniai mazgai.
Išpreparuota tiriamoji medžiaga buvo 1 val. fiksuota 4% PFA tirpale, iš kurio išimti audiniai buvo plauti 3 kartus po 10 min. PBS.
11.2. Smegenų kamieno preparatų paruošimas
Atidalinta smegenų kamieno dalis specialiais cianakrilato klijais buvo priklijuojama ant vibrotomo (Comprestome VF-700, Precisionary Instruments Inc., JAV) stalelio ir užliejama ex tempore paruoštu 1,5% agarozės tirpalu, atvėsintu iki 40-42°C. Agarozei sustigus, smegenų kamienas buvo supjaustytas 150 µm storio koronariniais arba sagitaliniais pjūviais. Mikrožirklutėmis pašalinus aplinkinę sustingusią agarozę, vibrotomu padaryti pjūviai buvo pernešami į šulinėlius, pripildytus 0,05% natrio azido PBS tirpalu, kur buvo laikomi iki imunohistocheminių reakcijų atlikimo.
11.3. Totalių preparatų paruošimas
24 11.4. Šaldomųjų pjūvių paruošimas
Šiame tyrime buvo paruošti nervo klajoklio apatinio mazgo, nervo klajoklio kaklinės dalies, tirtų nugaros smegenų segmentų ir nugarinių mazgų bei žvaigždinio mazgo šaldomieji pjūviai. Po cheminės fiksacijos audiniai buvo perkelti į 25% sacharozės ir 0,05% natrio azido PBS tirpalą ir inkubuoti jame dėl krioprotekcijos 24 val. 4 °C temperatūroje. Po šios procedūros tiriamoji medžiaga buvo užšaldyta skystame azote, panaudojant šaldomąją audinių terpę (Triangle Biomedical Sciences, JAV). Užšaldyti audiniai buvo supjaustyti 30 µm storio išilginiais arba skersiniais pjūviais, naudojant kriomikrotomą CryoStar NX70 (Thermo Fisher Scientific, JAV). Gauti pjūviai buvo perkeliami ant Superfrost Plus objektinių stikliukų (Menzel Glaser, Vokietija) ir 1 val. džiovinami kambario temperatūroje.
11.5. Imunohistocheminių reakcijų atlikimas
Ruošiant smegenų kamieno pjūvių bei totalius nervo klajoklio, jo šaknelių, apatinio juntamojo mazgo ir širdinių šakų preparatus, iš pradžių tiriamoji medžiaga buvo inkubuojama 1,68% KOH tirpale 20 min. kambario temperatūroje. Po to šie preparatai buvo išplauti 0,5% Triton X-100 tirpale PBS pagrindu (3 x 10 min.). Šaldomųjų pjūvių preparatai prieš imunohistocheminių reakcijų atlikimą buvo tik išplauti PBS 3 kartus po 10 min.
Vėliau visi preparatai buvo 1 val. inkubuojami 5% normalaus asilo serumo PBS tirpale kambario temperatūroje, siekiant išvengti nespecifinio antikūnų jungimosi. Po to pjūviai buvo išplauti PBS (3 x 10 min.) ir inkubuojami dviejų pirminių antikūnų (1 lentelė) mišinyje 24 val. 4 °C temperatūroje drėgnoje tamsioje aplinkoje. Po šios procedūros pjūviai vėl išplauti PBS (3 x 10 min.) ir inkubuoti dviejų antrinių antikūnų (1 lentelė) tirpale 2 val. kambario temperatūroje. Atliekant trigubo imunohistocheminio žymėjimo reakcijas, iš pradžių pjūviai buvo inkubuoti dviejų pirminių antikūnų tirpale (24 val., 4 °C), tuomet išplauti PBS (3 x 10 min.) ir inkubuojami trečiojo pirminio antikūno tirpale (24 val., 4 °C), po to vėl plaunami PBS (3 x 10 min.) ir inkubuojami visų trijų antrinių antikūnų mišinyje (2 val., 20 °C). Visi antikūnai buvo skiedžiami antikūnų skiedikliu ab64211 (Abcam, Cambridge, Jungtinė Karalystė). Galiausiai pjūviai buvo vėl išplauti PBS 3 kartus po 10 min. ir uždengti dengiamaisiais stikliukais, naudojant „Vectashield“ dengiamąją terpę (Vector Laboratories, JAV). Dengiamasis stikliukas buvo pritvirtinamas užlakuojant jo kraštus skaidriu nagu laku.
25 antikūnas, vietoj to inkubuojant kontrolinius pjūvius tik antikūnų skiediklyje. Siekiant įsitikinti, jog nėra kryžminės reakcijos tarp pirminių antikūnų, buvo atliktos imunohistocheminės reakcijos, naudojant tik vieną pirminį ir vieną antrinį antikūną. Šiais būdais gauti preparatai buvo palyginti su dvigubo imunohistocheminio žymėjimo reakcijomis.
Pirminiai antikūnai prieš nNOS buvo naudoti identifikuoti nitrerginius neuronus, cholinacetiltransferazę (ChAT) – cholinerginius, periferiną – visus periferinės nervų sistemos neuronus, su kalcitonino genu susijusį peptidą (CGRP) ir substanciją P (SP) – peptiderginius sensorinius neuronus, pagrindinį mielino baltymą (MBP) – mielino dangalą (1 lentelė).
1 lentelė. Tyrimui panaudoti pirminiai ir antriniai antikūnai
Antigenas Šeimininkas Tipas Skiedimas Gamintojas Katalogo nr. Pirminiai
nNOS Pelė Monokloninis 1:300 Santa Cruz
Biotechnologya
sc-5302
Periferinas Triušis Polikloninis 1:1000 Abcamb ab4666
ChAT Ožka Polikloninis 1:100 Chemiconc AB144P
CGRP Triušis Polikloninis 1:4000 Chemiconc AB5920
SP Jūrų kiaulytė Polikloninis 1:1000 Abcamb ab10353
MBP Triušis Polikloninis 1:1000 Abcamb ab40390
TH Avis Polikloninis 1:1000 Abcamb ab113
Antriniai
Pelė AF488 Asilas Polikloninis 1:300 Invitrogend A-21202
Pelė Cy3 Asilas Polikloninis 1:400 Milliporee AP192C
Ožka Cy3 Asilas Polikloninis 1:400 Chemiconc AP180C
Ožka Cy5 Asilas Poliklininis 1:400 Milliporee AP180S
Triušis FITC Asilas Polikloninis 1:100 Chemiconc AP182F
Jūrų kiaulytė Cy3
Asilas Polikloninis 1:500 Chemiconc AP193C
AvisAF488 Asilas Polikloninis 1:300 Invitrogend A-11015
a Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Teksasas, JAV b Abcam, Cambridge, Jungtinė Karalystė
c Chemicon International, Temecula, Kalifornija, JAV d Invitrogen, Ltd., Paisley, Jungtinė Karalystė
26 11.6. Preparatų mikroskopavimas, morfometriniai matavimai ir statistinė duomenų analizė
Paruošti preparatai buvo analizuoti ir fotografuoti lazeriniu konfokaliniu mikroskopu LSM 700 su ZEN Black SP1 2010 programine įranga (Carl Zeiss, Jena, Vokietija), naudojant 20×/0.8 Plan Apochromat, 40×/1.4 Plan Apochromat and 60×/1.46 αPlan Apochromat objektyvus (Carl Zeiss, Jena, Vokietija) su aliejine imersija.
Iliustracijos parengtos Adobe Photoshop CC 2018 programa (Adobe Systems, San Jose, JAV), koreguojant nuotraukos dydį, ryškumą ir kontrastą. Nervo klajoklio branduoliai bei kitos pailgųjų smegenų struktūros preparatuose buvo atpažintos remiantis stereotaksiniu žiurkės galvos smegenų atlasu [86].
Kiekybiniam vertinimui buvo panaudota 5 gyvūnų medžiaga. Morfometriniai matavimai atlikti ImageJ programa. Vaizdų analizei buvo naudotos dviejų spalvinių kanalų Z ašies optinių pjūvių serijos (angl. Z-stack) nesuprojektuotos tirtų struktūrų nuotraukos. Analizuojant dvigubo imunohistocheminio žymėjimo preparatus ir siekiant kiekybiškai įvertinti mono- ir bifenotipinių neuronų paplitimą, buvo naudotas ImageJ „Cell Counter“ įskiepis. Neuronų skerspjūvio plotai buvo matuoti rankiniu būdu apribojant neurono kūną pasirinktoje Z ašies pjūvių serijos nuotraukoje, kurioje matomas ląstelės branduolys ir branduolėlis. Imunoreaktyvių nervinių skaidulų procentinė dalis tirtuose nervo klajoklio kaklinės dalies skerspjūviuose buvo nustatyta rankiniu būdu apribojant nervo skerspjūvio plotą ir išsegmentuojant jame esančias tiriamiesiems žymenims imunoreaktyvias skaidulas.
27
12. REZULTATAI
12.1. Nitrerginių neuronų paplitimas dvejiniame branduolyje
Koronariniuose ir sagitaliniuose pailgųjų smegenų pjūviuose dvejinis branduolys, nucleus ambiguus, buvo identifikuotas kaip ChAT IR neuronų kūnų sankaupa ventrolateralinėje pailgųjų smegenų dalyje, kaudaliau veidinio nervo branduolio (4 pav., a-b). Koronariniuose pjūviuose pagal neuronų išsidėstymą išskyrėme tris dvejinio branduolio pobranduolius: tankųjį, pars compacta (4 pav., c), pusiau tankųjį, pars semicompacta (4 pav., d) ir laisvąjį (angl. loose part) (4 pav., e). Be to, pavieniai retai išsidėstę ChAT bei nNOS IR neuronai buvo stebimi ir ventraliau pagrindinio dvejinio branduolio, kur yra išorinis šio branduolio darinys (angl. external formation).
Išimtinai nNOS imunoreaktyvių neuronų kūnų dvejiniame branduolyje nebuvo nustatyta. Visi nNOS IR NK buvo bifenotipiniai su ChAT ir jų paplitimas reikšmingai skyrėsi tarp pobranduolių (2 lentelė). Gausiausia bifenotipinių nNOS ir ChAT IR neuronų kūnų populiacija buvo nustatyta tankiajame pobranduolyje, pars compacta, kur nNOS/ChAT IR NK sudarė 12,4 ± 1,6 % (4 pav., f-h). Bifenotipinių neuronų reikšmingai sumažėjo pusiau tankiajame pobranduolyje (4,7 ± 1,2 %), o laisvajame pobranduolyje jų išvis nebuvo rasta. Išorinio darinio NK kiekybiniai matavimai nebuvo atlikti, negalint jų patikimai atskirti nuo toje pačioje vietoje esančių ventrolateralinių tinklinio darinio branduolių neuronų [86].
Taip pat buvo nustatyti neuronų kūnų dydžio skirtumai tarp NK neurocheminių tipų ir pobranduolių (2 lentelė). Tankiajame pobranduolyje bifenotipinių ir išimtinai cholinerginių neuronų
2 lentelė. Neurocheminiai neuronų kūnų tipai ir jų dydžiai dvejinio branduolio pobranduoliuose
nNOS IR/ChAT IR ChAT IR
% Plotas, µm2 % Plotas, µm2 Tankusis pobranduolis 12,4 ± 1,6 ^ 349,1 ± 13,4 87,6 ± 1,6 ^ 355,5 ± 6,3 ^ Pusiau tankusis pobranduolis 4,7 ± 1,2 ^ 383,2 ± 29,1 * 95,3 ± 1,2 ^ 549,9 ± 13,1 ^* Laisvasis pobranduolis 0 − 100 ^ 686,1 ± 15,3 ^
28
4 pav. Nitrerginių neuronų kūnų ir nervinių skaidulų paplitimas dvejiniame branduolyje. (a) –
koronarinis, (b) – sagitalinis pailgųjų smegenų pjūviai. (c-e), koronariniai dvejinio branduolio pjūviai, iliustruojantys tankųjį (c), pusiau tankųjį (d) ir laisvąjį (e) pobranduolius. (f-h), tankusis pobranduolis ir bifenotipiniai neuronai jame (rodyklės); punktyrine linija apibrėžta vieta padidinta
(i-k) iliustracijose. (i-k) nuotraukos iliustruoja nNOS IR nervines skaidulas greta cholinerginio neurono kūno (rodyklės) ir ChAT IR nervines terminales (trikampiai). Sutrumpinimai: V n., trišakis
29 kūnų dydis reikšmingai nesiskyrė (349,1 ± 13,4 µm2 ir 355,5 ± 6,3 µm2 atitinkamai, p>0,05). Pusiau tankiajame pobranduolyje ChAT IR neuronų kūnai, lyginant su pars compacta, buvo didesni, o bifenotipinių NK dydis reikšmingai nesiskyrė. Didžiausi cholinerginiai neuronai rasti laisvajame pobranduolyje (686,1 ± 15,3 µm2). Taigi, cholinerginiai neuronai didėjo nuo rostralinės link kaudalinės branduolio dalies, o bifenotipinių nNOS/ChAT IR neuronų kūnų dydžiai pobranduoliuose buvo vienodi. Dvejiniame branduolyje buvo nustatytas tankus nitrerginių nervinių skaidulų tinklas. Gausiausios jos buvo tankiajame pobranduolyje (4 pav., g, i-j), retesnės – pusiau tankiajame. Neuroninei NOS IR nervinės skaidulos dažnai buvo stebimos betarpiškai prie cholinerginių neuronų kūnų ir galimai sudarė sinapses su jais (4 pav., i-j). Kadangi dvejiniame branduolyje nNOS IR buvo nustatytas tik bifenotipiniuose neuronuose, o nervinės terminalės buvo išimtinai nNOS imunoreaktyvios, galima teigti, jog pastarosios yra kitų branduolių neuronų skaidulos. Pažymėtina, kad ant nucleus ambiguus neuronų taip pat buvo stebimos ir išimtinai cholinerginės nervinės terminalės (4 pav., i, k).
12.2. Nitrerginiai neuronai nugariniame nervo klajoklio branduolyje, atskirojo laido branduoliuose ir nervo klajoklio šaknelėse
Nugarinis nervo klajoklio branduolys, nucleus dorsalis n. vagi, buvo identifikuojamas dorsalinėje medialinėje pailgųjų smegenų dalyje, dorsaliau poliežuvinio nervo branduolio (4 pav., a). Jį sudarė tankiai išsidėstę cholinerginiai neuronai, tarp kurių buvo rasti ir nNOS imunoreaktyvūs NK. Dauguma jų buvo bifenotipiniai su ChAT ir tokie NK sudarė 7,0 ± 1,0 % visų šio branduolio neuronų. Šie bifenotipiniai neuronų kūnai savo morfologija bei dydžiu nesiskyrė nuo kitų cholinerginių branduolio neuronų (5 pav., d-f). Išimtinai nNOS imunoreaktyvūs neuronų kūnai pagal morfologiją buvo suskirstyti į dvi grupes: 1) maži NK, turintys didelį branduolį ir siaurą aplinkbranduolinę neuroplazmą, kurie sudarė 2,6 ± 0,5 % visų branduolio neuronų ir morfologiškai priminė tipinius CNS įterptinius neuronus; 2) nNOS IR NK, dydžiu nesiskiriantys nuo cholinerginių visceralinių eferentinių NK, sudarė vos 0,3 ± 0,2 % (5 pav., e). Abiejų tipų nitrerginiai ir bifenotipiniai šio branduolio NK buvo gausesni lateralinėje branduolio dalyje (3 lentelė). Kaip ir dvejiniame branduolyje, visame šio branduolio plote buvo stebėtos nitrerginės NS, kurios galimai kontaktavo su cholinerginių neuronų kūnais.
30
5 pav. Nitrerginiai neuronai nugariniame nervo klajoklio branduolyje, atskirojo laido branduoliuose ir nervo klajoklio intramedulinėje šaknelių dalyje. (a-c), dorsalinės medialinės
pailgųjų smegenų dalies panoraminis vaizdas. (d-f), nugarinio nervo klajoklio branduolio segmentas; rodyklės žymi bifenotipinius nNOS/ChAT IR tipinius visceralinius eferentinius neuronų
kūnus, žvaigždutė – išimtinai nNOS IR visceralinį eferentinį NK, trikampis – išimtinai nNOS IR mažą, morfologiškai interneuroną primenantį NK (padidinta iškarpoje kairėje (e)). (g-i) iliustruoja
intramedulinių nervo klajoklio šaknelių segmentą ties dvejinio branduolio nervinių skaidulų (rodyklės) prisijungimo vieta; (h) iliustracijoje iškarpoje kairiajame viršutiniame kampe padidintos
nNOS IR nervinės skaidulos. Sutrumpinimai: X, nugarinis nervo klajoklio branduolys; XII, poliežuvinio nervo branduolys; cNTS, centrinis atskirasis branduolys; mNTS, vidinis atskirasis
31
3 lentelė. Nitrerginių, cholinerginių ir bifenotipinių neuronų kūnų paplitimas ir dydis nugariniame nervo klajoklio branduolyje
nNOS IR/ChAT IR nNOS IR
maži NK
nNOS IR vidutinio dydžio NK
ChAT IR
% Plotas, µm2 % Plotas, µm2 % Plotas, µm2 % Plotas, µm2
Medialinė pusė 5,0 ± 1,2 ^ 287,4 ± 12,5 ^ 0,7 ± 0,3 ^ 113,5 ± 8,4 * 0 − 94,3 ± 1,2 ^ 258,8 ± 2,7 ^ Lateralinė pusė 8,9 ± 1,4 ^ 246,7 ± 6,5 ^ 4,5 ± 0,9 ^ 116,6 ± 4,7 * 0,6 ± 0,3 253,1 ± 11,8 85,9 ± 2,1 ^ 241,6 ± 3,1 ^ Visas branduolys 7,0 ± 1,0 260,0 ± 6,2 2,6 ± 0,5 116,2 ± 4,2 * 0,3 ± 0,2 253,1 ± 11,8 90,1 ± 1,3 250,4 ± 2,1
32 turintys neuronų kūnai. Gausiausia ir tankiausia nitrerginių neuronų kūnų sankaupa sudarė apskritą centrinį atskirąjį branduolį (5 pav., a-c). Rečiau išsidėstę nitrerginiai neuronai taip pat buvo rasti ir kituose NTS branduoliuose (5 pav., a-c). Be to, visame atskirojo laido branduolių plote buvo stebimos gausios nitrerginės terminalės.
Koronariniuose pailgųjų smegenų pjūviuose buvo stebėta intramedulinė nervo klajoklio šaknelių eiga (4 pav., a). Didžiąją šaknelių dalį sudarė cholinerginiai nugarinio nervo klajoklio branduolio neuronų aksonai. Tarp jų buvo nustatyta ir plonų nitrerginių NS (5 pav., g-i). Koronariniuose pailgųjų smegenų pjūviuose buvo stebėta, kaip dvejinio branduolio NS plito dorsolateraliai nuo branduolio, o ties intramedulinių šaknelių viduriu prisijungė prie jų. Nepaisant gana gausaus bifenotipinių ChAT/nNOS IR neuronų kūno paplitimo dvejiniame branduolyje, nuo jo besitęsiančių intramedulinių šaknelių dalyje buvo stebėtos tik cholinerginės nervinės skaidulos (5 pav., g-i). Gausios nitrerginės NS taip pat nustatytos ekstramedulinėse nervo klajoklio šaknelėse (9 pav., a-b).
12.3. Nitrerginiai neuronai nervo klajoklio apatiniame juntamajame ir nugariniuose mazguose
Nitrerginiai neuronų kūnai sudarė 37,4 ± 1,3 % visų apatinio nervo klajoklio juntamojo mazgo, ganglion inferius, neuronų kūnų (8 pav., a-c). Nitrerginiai NK buvo tolygiai pasiskirstę kairiajame ir dešiniajame mazge (37,2 ± 1,8 % ir 37,5 ± 1,8 % atitinkamai, p>0,05). Šiuose mazguose buvo nustatyti du morfologiniai nitrerginių neuronų tipai: 1) didžiąją dalį sudarė tipiški pseudounipoliniai, atpažįstami pagal spirale susisukusį (angl. coiled) proksimalinį aksoną (8 pav., d-e); 2) retesni buvo neuronų kūnai, kurie turėjo ilgą tiesų aksoną (8 pav., f).
Svarbu pažymėti, jog nNOS imunoreaktyvumas buvo būdingas tiek itin mažiems (<400 µm2), tiek ir stambiems (>1300 µm2) NK (6 pav.). Lyginant su tik periferinui IR NK, nitrerginių NK ploto vidurkis visgi buvo reikšmingai didesnis (721,5 ± 7,6 µm2 ir 656,9 ± 7,3 µm2, atitinkamai, p<0,001).
33 Siekiant nustatyti nNOS koegzistenciją su specifiniais aferentinių neuronų žymenimis, buvo ištirtas šių juntamųjų mazgų neuronų imunoreaktyvumas CGRP ir SP neurožymenims. Apatiniame nervo klajoklio mazge buvo nustatyti tik pavieniai SP arba CGRP imunoreaktyvūs neuronų kūnai, tačiau jie nebuvo bifenotipiniai su nNOS. Nepaisant negausaus SP ir CGRP IR neuronų kūnų paplitimo, buvo stebimi tiek SP, tiek ir CGRP IR nervinių skaidulų pluoštai, tranzitu kertantys šį mazgą (8 pav., g-i).
Tirtuose Th1-Th5 segmentų nugariniuose mazguose buvo rasti tik pavieniai nitrerginiai neuronai. Žymiai gausesni šiuose mazguose buvo peptiderginiai SP arba CGRP imunoreaktyvūs neuronų kūnai. Nugariniuose mazguose SP arba CGRP imunoreaktyvumas taip pat buvo patvirtintas ir daugeliui nitrerginių neuronų kūnų (7 pav.).
34 12.4. Nitrerginių nervinių skaidulų paplitimas nervo klajoklio kaklinėje dalyje ir širdinėse
šakose
Kaklinėje nervo klajoklio dalyje nitrerginės nervinės skaidulos sudarė 31,7 ± 0,5% visų, t. y. periferinui imunoreaktyvių, NS. Jų kiekis statistiškai nesiskyrė tarp dešiniojo ir kairiojo nervo klajoklio nervų (32,3 ± 0,6 % ir 30,4 ± 0,8 % atitinkamai, p>0,05). Dauguma nitrerginių nervinių skaidulų buvo nemielininės, ženkliai retesnės buvo plonu mielino dangalu padengtos nNOS IR skaidulos (9 pav., d-e). Taip pat buvo nustatytos pavienės stambios nitrerginių aksonų varikozės (9 pav., c). Be to, nervo klajoklio kaklinėje dalyje, distaliau juntamųjų mazgų, buvo rasti pavieniai nNOS IR neuronai.
Siekiant įsitikinti, kad nervo klajoklio nitrerginės nervinės skaidulos pasiekia širdį, buvo ištirtos nervo krūtininės širdinės šakos. Nustatyta, jog jose yra gausi populiacija nitrerginių NS (9 pav., j-l).
12.5. Nitrerginių neuronų paplitimas simpatinės širdies inervacijos šaltiniuose
Th1-Th5 nugaros smegenų segmentų tarpiniame šoniniame branduolyje dauguma simpatinių cholinerginių neuronų buvo bifenotipiniai su nNOS (10 pav., a-c). Bifenotipinės mielininės nNOS/ChAT IR nervinės skaidulos buvo nustatytos priekinėse nugaros smegenų šaknelėse (10 pav., d-f). Jos buvo pasiskirstę nedidelėmis grupelėmis, įsiterpdamos tarp stambių somatinių motorinių cholinerginių NS.
35
8 pav. Nitrerginiai neuronai apatiniame nervo klajoklio mazge. (a-c), nitrerginių neuronų
paplitimas mazge. (d-f) trimatės neuronų rekonstrukcijos iliustruoja du skirtingus nitrerginių neuronų tipus: (d, e) – pseudounipoliniai neuronai, atpažįstami pagal spirale susisukusį proksimalinį aksoną, (f) – neuronas, turintis ilgą tiesų aksoną. (g-i), nuotraukos iliustruoja SP IR
36
9 pav. Nitrerginių nervinių skaidulų paplitimas nervo klajoklio šaknelėse, kaklinėje dalyje ir širdinėse šakose. (a-b) iliustruoja gausų nitrerginių nervinių skaidulų paplitimą nervo klajoklio
šaknelėse; rodyklė žymi silpnai ChAT IR neuronų kūnus. (c), stambi nNOS IR varikozė kaklinėje nervo klajoklio dalyje. (d-f), iliustruoja nNOS ir ChAT IR NS mielinizaciją kaklinėje nervo klajoklio dalyje; rodyklė žymi plonu mielino dangalu padengtas nNOS IR NS. (g-f), iliustruoja išimtinai nNOS
37
10 pav. Nitrerginių neuronų paplitimas simpatinės širdies inervacijos šaltiniuose. (a-c), tarpinis
šoninis branduolys, rodyklės žymi tik ChAT imunoreaktyvius neuronus. (d-f), nugaros smegenų priekinių šaknelių fragmentas, iliustruojantis tarp stambių mielininių cholinerginių skaidulų įsiterpusias plonas mielinines bifenotipines nNOS/ChAT IR nervines skaidulas (centre). (g-i), į žvaigždinį mazgą įsiskverbiančių tik nNOS IR nervinių skaidulų pluoštai (rodyklės). (j-l), žvaigždinio
38
13. REZULTATŲ APTARIMAS
Šio tyrimo tikslas buvo ištirti nitrerginių neuronų paplitimą bei morfologiją širdies inervacijos šaltiniuose ir nustatyti galimą nitrerginių skaidulų kilmę širdyje bei neuroninio azoto oksido vaidmenį širdies veiklos reguliacijai. Pagrindiniai šio tyrimo rezultatai yra:
1) gausiausia nitrerginių neuronų populiacija nustatyta apatiniame nervo klajoklio mazge. Todėl tikėtina, jog didelė dalis išorinės kilmės širdies nitrerginių nervinių skaidulos yra kilusios iš minėtojo mazgo ir galimai dalyvauja širdies aferentinėje inervacijoje;
2) mažesnė dalis nitrerginių neuronų kūnų rasta dvejiniame bei nugariniame nervo klajoklio branduoliuose ir jie buvo bifenotipiniai su ChAT. Todėl NO taip pat gali dalyvauti ir perduodant parasimpatinius nervinius impulsus ikimazginėmis skaidulomis;
3) nitrerginiai neuronai buvo ypač gausūs atskirojo laido branduoliuose ir tarpiniame šoniniame branduolyje. Todėl galima daryti prielaidą, kad azoto oksidas gali būti svarbus integruojant juntamąją informaciją pailgosiose smegenyse ir reguliuojant simpatinės nervų sistemos aktyvumą;
4) pavieniai nitrerginiai neuronai nugariniuose mazguose ir žvaigždiniame mazge įrodo, kad šių struktūrų įtaka nitrerginei širdies inervacijai yra minimali (11 pav.).
Iki šio darbo atliktų nitrerginių neuronų paplitimo nervo klajoklio branduoliuose tyrimų rezultatai prieštaringi. Calupca ir kiti [17], tyrę galimą jūrų kiaulytės širdį inervuojančių nitrerginių nervinių skaidulų kilmę, nei dvejiniame, nei nugariniame nervo klajoklio branduoliuose nitrerginių neuronų kūnų nenustatė. Takanaga ir kiti [61], retrogradinio aksonų transporto žymėjimo metodika tyrę žiurkės sinusinį mazgą kontroliuojančius parasimpatinius neuronus, nustatė, kad pastarieji yra paplitę abiejuose nervo klajoklio branduoliuose, bet nitrerginiai NK yra tik nugariniame nervo klajoklio branduolyje. Mūsų tyrime bifenotipiniai nNOS ir ChAT IR neuronai buvo nustatyti ir dvejiniame, ir nugariniame nervo klajoklio branduoliuose. Be to, mes identifikavome tris skirtingus neuronų kūnų tipus: bifenotipiniai nNOS/ChAT IR ir išimtinai nNOS IR visceraliniai eferentiniai bei išimtinai nNOS smulkūs, galimai įterptiniai neuronai. Kontroversiškus rezultatus galėjo lemti panaudotų metodų skirtumai: mūsų bei Calupca ir kitų [17] tyrimai pateikia netiesioginius įrodymus apie galimą nNOS IR širdinių nervinių skaidulų kilmę, remiantis lyginamosios anatomijos principais, o retrogradiniu aksonų transportu paremta neuronų kūnų žymėjimo metodika gali būti nepakankamai selektyvi dėl netiksliai atliktos injekcijos bei injekuojamos medžiagos patekimo ant gretimų anatominių struktūrų injekcijos metu [62].
39
11 pav. Schematinis nitrerginių neuronų kūnų ir nervinių skaidulų paplitimas širdies inervacijos šaltiniuose. Širdies vidusieninių nervinių mazgų sudėtis pavaizduota remiantis LSMU Anatomijos
instituto mokslininkų imunohistocheminių širdies inervacijos tyrimų rezultatais [20, 21, 47]. Sutrumpinimai: X, nugarinis nervo klajoklio branduolys; XII, poliežuvinio nervo branduolys; NAm,
40 dvejiniame ir nugariniame nervo klajoklio branduoliuose esančios nNOS IR skaidulos gali būti kilusios iš atskirojo laido branduolių ir gali dalyvauti pailgųjų smegenų refleksų lankuose. Panaši nitrerginių NTS neuronų funkcija aprašyta triušio stemplės inervacijos reguliacijoje [73]. Be to, NO donorų injekcija į dvejinį branduolį sukelia bradikardiją [74]. Tai patvirtina NO reikšmę centrinei širdies veiklos reguliacijai. Kadangi nebuvo rasta nitrerginių nervinių skaidulų, išeinančių iš dvejinio branduolio ir prisijungiančių prie nervo klajoklio šaknelių, NO gali veikti šio branduolio ribose, darydamas įtaką jo neuronų aktyvumui ir/ar moduliuodamas kitų neurotransmiterių išskyrimą. Pavyzdžiui, nustatyta, kad azoto oksidas dvejiniame branduolyje slopina glutamaterginių ir glicinerginių parasimpatinius širdinius neuronus inervuojančių terminalių aktyvumą ir padidina γ-amino sviesto rūgšties (GABA) išsiskyrimą [87]. Taigi, kitų neurotransmiterių išskyrimo reguliacija galimai yra vienas mechanizmų, kaip azoto oksidas gali reguliuoti pirmųjų širdinių nervo klajoklio neuronų aktyvumą.
Gausiausia nitrerginių neuronų populiacija buvo nustatyta apatiniame juntamajame nervo klajoklio mazge. Analogiški rezultatai gauti ir Calupca ir kt. [17] tyrime. Atkinson ir kt. [63] nitrerginius juntamuosius širdinius neuronus ganglion inferius nustatė retrogradiniu aksonų transportu paremta neuronų kūnų žymėjimo metodika, nors Hoover ir kt. [22] retrogradiškai nei nNOS, nei SP ar CGRP imunoreaktyvių širdį inervuojančių neuronų ganglion inferius nerado. Visgi pažymėtina, kad pastarajame tyrime buvo tirta tik skilvelių inervacija, todėl jo rezultatai nepaneigia galimybės, jog nitrerginiai ganglion inferius neuronai gali inervuoti prieširdžius. Apibendrinant galima daryti prielaidą, jog neuroninis NO dalyvauja širdies aferentinėje inervacijoje.
Kadangi kai kurie autoriai teigia, jog neuroninis azoto oksidas gali veikti tik branduolių bei nervinių mazgų ribose, moduliuodamas gretimų neuronų aktyvumą [63, 88, 89], mes ištyrėme nitrerginių nervinių skaidulų paplitimą nervo klajoklio šaknelėse, jo kaklinėje dalyje ir širdinėse šakose. Visose išvardintose struktūrose buvo rastos gausios nNOS IR skaidulos, kurių kiekis akivaizdžiai neatitiko santykinai nedidelio nitrerginių neuronų kūnų paplitimo nervo klajoklio branduoliuose. Be to, daugumos tyrimų duomenimis, net iki 67% nitrerginių nervinių terminalių atskirojo laido branduoliuose yra kilusios iš ganglion inferius [67], o nNOS IR skaidulos širdyje sunyksta atlikus vagotomiją [16]. Taigi mūsų bei kitų autorių rezultatai patvirtina, jog azoto oksidas gali perduoti nervinius impulsus ir įcentriniais, ir periferiniais ganglion inferius neuronų aksonais.
41 8,6% buvo bifenotipiniai nNOS ir SP IR [22]. Todėl tikėtina, jog ir ganglion inferius nitrerginiai neuronai dalyvauja širdies jutimuose, tačiau reikalingi išsamesni tyrimai šiai hipotezei pavirtinti.
Žvaigždiniuose mazguose rasti tik pavieniai nitrerginiai neuronai ir jie buvo bifenotipiniai su TH. Kitų autorių duomenimis, žiurkės ganglion stellatum nNOS IR neuronų kūnai nenustatyti [34], jūrų kiaulytės – rasti pavieniai [17], o katės žvaigždiniuose mazguose nitrerginiai neuronai sudarė iki 8,3% [60]. Tokie duomenys rodo, jog galimi tarprūšiniai skirtumai, tačiau esant mažai duomenų apie nNOS ir TH koegzistenciją vidusieniniame širdies nerviniame rezginyje [55], todėl simpatiniai mazgai nėra tikėtinas širdinių nitrerginių nervinių skaidulų šaltinis. Tačiau tiek šio, tiek kitų autorių [35, 90] duomenimis, dauguma nugaros smegenų simpatinių neuronų kūnų tarpiniame šoniniame branduolyje yra bifenotipiniai nNOS/ChAT IR. Be to, žvaigždiniame mazge yra gausu nitrerginių nervinių skaidulų, kurios kontaktuoja su mazgo adrenerginiais neuronais. Todėl tikėtina, jog neuroninis azoto oksidas gali reguliuoti simpatinės nervų sistemos aktyvumą ikimazginiame lygmenyje. Šią hipotezę patvirtina ir fiziologinių tyrimų duomenys, nes intratekaliai suleidus nNOS inhibitoriaus L-NAME, vidurinis arterinis kraujo spaudimas padidėja, o nNOS substrato L-arginino – sumažėja [80].
42
14. IŠVADOS
1. Dvejiniame branduolyje visi nitrerginiai neuronų kūnai yra taip pat ir cholinerginiai, o jų paplitimas skiriasi tarp pobranduolių. Tankiajame pobranduolyje jų vidutiniškai būna apie 12%, pusiau tankiajame – apie 5%, o laisvajam pobranduoliui jie visiškai nebūdingi. Nitrerginių nervinių skaidulų, paliekančių dvejinį branduolį ir prisijungiančių prie bendros nervo klajoklio intramedulinės šaknelės, rasta nebuvo, todėl tikėtina, kad NO veikia tik šio branduolio ribose. 2. Nugariniam nervo klajoklio branduoliui yra būdingi trijų tipų nitrerginiai neuronų kūnai: 1) tipiški
visceraliniai eferentiniai bifenotipiniai nNOS/ChAT IR (apie 7%), 2) išimtinai nNOS IR visceraliniai eferentiniai (apie 0,3%), 3) maži, morfologiškai į įterptinius neuronus panašūs nNOS IR neuronų kūnai (virš 2%). Iš šio branduolio nitrerginės nervinės skaidulos driekiasi į nervo klajoklio šakneles, todėl jos gali dalyvauti širdies parasimpatinėje inervacijoje.
3. Maži nitrerginiai neuronų kūnai buvo gausūs atskirojo laido branduoliuose, o dvejiniame ir nugariniame nervo klajoklio branduoliuose yra apstu nitrerginių nervinių terminalių. Todėl tikėtina, jog nitrerginiai neuronai gali veikti pailgųjų smegenų autonominių refleksų lankuose kaip įterptiniai neuronai.
4. Apatiniame nervo klajoklio mazge pseudounipoliniai nitrerginiai neuronai sudaro beveik 40% visų mazgo neuronų kūnų, todėl tikėtina, jog nervo klajoklio nitrerginės nervinės skaidulos dalyvauja širdies aferentinėje inervacijoje. C8-Th5 nugariniuose mazguose randami tik pavieniai nNOS imunoreaktyvūs neuronų kūnai.
5. Nugaros smegenų Th1-5 segmentų tarpiniame šoniniame branduolyje dauguma neuronų kūnų yra bifenotipiniai nNOS/ChAT IR. Žvaigždiniame mazge yra apstu nitrerginių nervinių skaidulų, bet nustatomi tik pavieniai nitrerginiai neuronų kūnai, kurie būna bifenotipiniai su TH. Tai rodo, kad NO yra svarbus ikimazginėje simpatinėje širdies reguliacijoje.
43
15. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Tricoire L, Vitalis T. Neuronal nitric oxide synthase expressing neurons: A journey from birth to neuronal circuits. Front Neural Circuits [Internetas]. 2012;6(82):1–16. Prieiga per internetą: https://doi.org/10.3389/fncir.2012.00082
2. Vincent SR. Nitric oxide neurons and neurotransmission. Prog Neurobiol. 2010;90(2):246–55. 3. Farah C, Michel LYM, Balligand JL. Nitric oxide signalling in cardiovascular health and disease.
Nat Rev Cardiol. 2018;15(5):292–316.
4. Carnicer R, Crabtree MJ, Sivakumaran V, Casadei B, Kass DA. Nitric Oxide Synthases in Heart Failure. Antioxid Redox Signal. 2013;18(9):1078–99.
5. Förstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: Regulation and function. Eur Heart J. 2012;33(7):829–37.
6. Rivera LR, Poole DP, Thacker M, Furness JB. The involvement of nitric oxide synthase neurons in enteric neuropathies. Neurogastroenterol Motil. 2011;23(11):980–8.
7. Bódi N, Szalai Z, Bagyánszki M. Nitrergic enteric neurons in health and disease-focus on animal models. Int J Mol Sci. 2019;20(8):1–10.
8. Davies KP. Development and therapeutic applications of nitric oxide-releasing materials to treat erectile dysfunction. Futur Sci OA [Internetas]. 2015;1(1):FSO53. Prieiga per internetą: https://doi.org/10.4155/fso.15.53
9. Hardwick JC, Ryan SE, Beaumont E, Ardell JL, Southerland EM. Dynamic remodeling of the guinea pig intrinsic cardiac plexus induced by chronic myocardial infarction. Auton Neurosci Basic Clin. 2014;181(1):4–12.
10. Stavrakis S, Scherlag BJ, Fan Y, Liu Y, Mao J, Varma V, et al. Inhibition of atrial fibrillation by low-level vagus nerve stimulation: The role of the nitric oxide signaling pathway. J Interv Card Electrophysiol. 2013;36(3):199–208.
11. Ng GA. Neuro-cardiac interaction in malignant ventricular arrhythmia and sudden cardiac death. Auton Neurosci Basic Clin. 2016;199:66–79.
12. Herring N, Kalla M, Paterson DJ. The autonomic nervous system and cardiac arrhythmias: current concepts and emerging therapies. Nat Rev Cardiol. 2019;16(12):707–26.
13. Zhang YH. Neuronal nitric oxide synthase in hypertension – an update. Clin Hypertens [Internetas]. 2016;22:20. Prieiga per internetą: https://doi.org/10.1186/s40885-016-0055-8 14. Shabeeh H, Khan S, Jiang B, Brett S, Melikian N, Casadei B, et al. Blood Pressure in Healthy
Humans is Regulated by Neuronal NO Synthase. Hypertension. 2017;69(5):970–6.
44 16. Tanaka K, Chiba T. The vagal origin of preganglionic fibers containing nitric oxide synthase in
the guinea-pig heart. 1998;252:135–8.
17. Calupca MA, Vizzard MA, Parsons RL. Origin of neuronal nitric oxide synthase (NOS)-immunoreactive fibers in guinea pig parasympathetic cardiac ganglia. J Comp Neurol. 2000;426(3):493–504.
18. Richardson RJ, Grkovic I, Anderson CR. Immunohistochemical analysis of intracardiac ganglia of the rat heart. Cell Tissue Res. 2003;314(3):337–50.
19. Hoover DB, Isaacs ER, Jacques F, Hoard JL, Pagé P, Armour JA. Localization of multiple neurotransmitters in surgically derived specimens of human atrial ganglia. Neuroscience. 2009;164(3):1170–9.
20. Pauziene N, Alaburda P, Rysevaite-Kyguoliene K, Pauza AG, Inokaitis H, Masaityte A, et al. Innervation of the rabbit cardiac ventricles. J Anat. 2016;228(1):26–46.
21. Pauziene N, Rysevaite-Kyguoliene K, Alaburda P, Pauza AG, Skukauskaite M, Masaityte A, et al. Neuroanatomy of the Pig Cardiac Ventricles. A Stereomicroscopic, Confocal and Electron Microscope Study. Anat Rec. 2017;300(10):1756–80.
22. Hoover DB, Shepherd A V, Southerland EM, Armour JA, Ardell JL. Neurochemical diversity of afferent neurons that transduce sensory signals from dog ventricular myocardium. 2009;141:38– 45.
23. Inokaitis H, Pauziene N, Rysevaite-Kyguoliene K, Pauza DH. Innervation of sinoatrial nodal cells in the rabbit. Ann Anat. 2016;205:113–21.
24. Brack KE. The heart’s “little brain” controlling cardiac function in the rabbit. Exp Physiol. 2015;100(4):348–53.
25. Garthwaite J. NO as a multimodal transmitter in the brain: discovery and current status. Br J Pharmacol. 2019;176(2):197–211.
26. Hardingham N, Dachtler J, Fox K. The role of nitric oxide in pre-synaptic plasticity and homeostasis. Front Cell Neurosci [Internetas]. 2013;7:190. Prieiga per internetą: https://doi.org/10.3389/fncel.2013.00190
27. Costa ED, Rezende BA, Cortes SF, Lemos VS. Neuronal Nitric Oxide Synthase in Vascular Physiology and Diseases. Front Physiol [Internetas]. 2016;7:206. Prieiga per internetą: https://doi.org/10.3389/fphys.2016.00206
28. Santos RM, Lourenço CF, Ledo A, Barbosa RM, Laranjinha J. Nitric oxide inactivation mechanisms in the brain: Role in bioenergetics and neurodegeneration. Int J Cell Biol [Internetas]. 2012;2012:391914. Prieiga per internetą: https://doi.org/10.1155/2012/391914
