LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Eglė Adomavičiūtė
Kalių kiaušidžių histomorfologiniai tyrimai
Histomorphological analysis of the ovaries in bitches
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: asist. Jolanta Ingrida Alionienė
2
DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „KALIŲ KIAUŠIDŽIŲ HISTOMORFOLOGINIAI TYRIMAI“:
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Eglė Adomavičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui. Jolanta Ingrida Alionienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
Rasa Želvytė
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
Alius Pockevičius
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8 1.1. Kiaušidžių anatomija ... 8 1.2. Lytinis ciklas ... 9 1.3. Kiaušidės sandara ... 131.4. Ovogenezė ir folikulo susidarymas ... 14
1.5. Folikulai ... 14
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 19
2.1. Darbo metodika ... 19
2.2. Histologinė technika ... 20
2.3. Mikroskopas ir programinė įranga ... 20
2.4. Histologinių preparatų analizė ... 21
3. TYRIMO REZULTATAI ... 23
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 29
5. IŠVADOS... 31
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 32
4 KALIŲ KIAUŠIDŽIŲ HISTOMORFOLOGINIAI TYRIMAI
Eglė Adomavičiūtė Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Darbo tikslas: įvertinti amžiaus įtaką kalių kiaušidžių įvairių folikulų ir ovocitų morfologiniams parametrams.
Tyrimui surinktos trylikos fiziologiškai sveikų, įvairaus amžiaus kalių kiaušidės. Iš viso surinktos 26 kiaušidės. Kalės pagal amžių suskirstytos į tris grupes: 6 – 12 mėnesių, 13 – 33 mėn., 39 – 85 mėn. Ovariohisterektomijų metu surinktos kiaušidės fiksuotos 10 proc. formalino tirpale, vėliau paruošti histologiniai preparatai. Preparatai analizuoti mikroskopu, atlikti matavimai, atlikta statistinė analizė.
Statistinės analizės metu gauti rezultatai rodo, kad didėjant amžiui, kartu turi tendenciją didėti ir dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo skersmuo, koreliacijos ryšys stiprus (r = 0,673), koreliacija statistiškai reikšminga, p<0,05. Didėjant amžiui, turi tendenciją didėti ir dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo plotas, (r = 0,715), p<0,01. Didėjant amžiui turi tendenciją didėti ir dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo ovocito skersmuo, ryšys vidutinis (r = 0,583), p<0,05.
Didžiausias užuomazginio folikulo skersmuo yra trečioje amžiaus grupėje, kairiojoje kiaušidėje – 49,00 ± 9,50 µm, didžiausias pirminio folikulo skersmuo trečioje amžiaus grupėje, dešiniojoje kiaušidėje – 83,00 ± 12,1 µm, didžiausias antrinio folikulo skersmuo yra antroje amžiaus grupėje, dešiniojoje kiaušidėje – 135,5 ± 9,2 µm.
Didžiausias užuomazginio folikulo plotas yra trečios amžiaus grupės kairiojoje kiaušidėje – 0,21 ± 0,09 mm2. Didžiausias pirminio folikulo plotas yra trečios amžiaus grupės dešiniojoje kiaušidėje – 0,57 ± 0,16 mm2, didžiausias antrinio folikulo plotas yra trečios amžiaus grupės dešiniojoje kiaušidėje – 1,48 ± 0,9 mm2.
Didžiausias užuomazginio folikulo ovocito skersmuo yra trečioje amžiaus grupėje kairiojoje kiaušidėje – 41,33 ± 9,35 µm, didžiausias pirminio folikulo ovocito skersmuo yra trečios amžiaus grupės dešiniojoje kiaušidėje – 51,00 ± 16,82 µm, didžiausias antrinio folikulo ovocito skersmuo yra antroje amžiaus grupėje kairiojoje kiaušidėje – 68,83 ± 10,53 µm.
5 HISTOMORPHOLOGICAL ANALYSIS OF THE OVARIES IN BITCHES
Eglė Adomavičiūtė Master‘s Thesis
SUMMARY
Aim of the study: to evaluate age influence on the diameter and area of various stages follicles and oocytes in the ovaries in bitches. Thirteen ovaries of physiologically healthy bitches of all ages were collected for the study. A total of 26 ovaries were collected. Bitches were divided into three groups according to their age: 6 – 12 months, 13 – 33 m, 39 – 85 m. Ovaries collected during ovariohysterectomies were fixed using 10% formalin solution, later, the histological slides were made. Histological preparations were analyzed using microscope, measurements were taken, statistical analysis was performed.
The results of the statistical analysis show that as the age increases, there is a tendency for the diameter of the right ovary primordial follicle to increase, the correlation is strong (r = 0.673), the correlation is statistically significant, p <0.05. As the age increases, the area of the right ovary primordial follicle also tends to increase, (r = 0.715), p <0.01. As the age increases, the diameter of the oocyte of primordial follicle in right ovary has a tendency to increase, (r = 0.583), p <0.05.
The largest diameter of the primordial follicle is in the third age group, 49.00 ± 9.50 µm in the left ovary. The largest diameter of the primary follicle is in the third age group, in left ovary, 83.00 ± 12.1 µm. The largest diameter of secondary follicle is in the second age group, 135.5 ± 9.2 µm, in the right ovary.
The largest area of the primordial follicle is in the left ovary of the third age group – 0.21 ± 0.09 mm2. The largest area of the primary follicle is in the right ovary of the third age group, 0.57 ± 0.16 mm2. The largest area of the secondary follicle is in the right ovary of the third age group, 1.48 ± 0.9 mm2.
The largest oocyte diameter of the primordial follicle is in the third age group, 41.33 ± 9.35 µm. The largest oocyte diameter of the primary follicle is in the third age group in right ovary, 51.00 ± 16.82 µm. The largest oocyte diameter of the secondary follicle is in the second age group in the left ovary, 68.83 ± 10.53 µm.
6
SANTRUMPOS
HE – hematoksilinas – eozinas UF – užuomazginis folikulas PF – pirminis folikulas AF – antrinis folikulas ang. – angliškai fol. – folikulas7
ĮVADAS
Kalės fiziologinę brandą pasiekia būdamos 6 – 14 mėnesių amžiaus, tačiau optimaliausią laiką kokybiškam dauginimuisi pasiekia būdamos 2 – 4 ar net 6 metų amžiaus. Gyvūnų patelėms senstant, jų organizme kiaušidės folikulų skaičius palaipsniui mažėja. Tai vyksta ir kalių organizme. Kalių kiaušidžių fiziologinis aktyvumas pradeda mažėti 6 – 8 metais ir gali visai išnykti pasiekus 10 metų ribą. Vyresnių kalių lytinis ciklas sutrinka, tampa nereguliarus, vaisingumas visiškai sumažėja ar net išnyksta, padidėja išsimetimų rizika [1].
Nemažai tyrimų atlikta nagrinėjant hormonų įtaką kalės kiaušidėms ir folikulų vystymuisi, tačiau galima rasti labai nedaug tyrimų, kurių tikslas būtų išsiaiškinti kalės amžiaus įtaką folikulų formavimuisi, folikulų parametrų kitimui. Kokybiniai tyrimai, kurių metu analizuojami folikulų parametrai, yra labai svarbūs, nes tokie rodikliainusako kalės reprodukcijos potencialą [2].
Darbo tikslas: įvertinti amžiaus įtaką įvairios stadijos kalių kiaušidžių folikulų ir ovocitų
morfologiniams parametrams.
Uždaviniai:
1. Išmatuoti kalių kiaušidžių užuomazginių, pirminių, antrinių folikulų ir jų ovocitų parametrus ir atlikti statistinę analizę.
2. Palyginti gautus parametrus tarp amžiaus grupių. 3. Įvertinti amžiaus įtaką folikulų parametrams.
8
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Kiaušidžių anatomija
Kalių lytinę sistemą sudaro kiaušidės, kiaušintakiai, gimda, sudaryta iš kūno ir ragų, gimdos kaklelis, makštis, prieangis ir išoriniai lytiniai organai [3]. Kiaušidės – poriniai organai, atliekantys endokrininę ir egzokrininę funkcijas. Kaip endokrininė liauka ji sintetina hormonus – progesteroną ir estrogenus. Egzokrininė funkcija – kiaušialąsčių gamyba ir išskyrimas [3]. Anatomiškai kiaušidės randamos dorsalinėje pilvo ertmės dalyje, visai šalia ar net prisiglaudusios prie inkstų kaudalinių galų (1 pav.). Dėl asimetrinio inkstų išsidėstymo, kairioji kiaušidė randama šiek tiek kaudaliau dešiniosios kiaušidės. Kiaušidės pilvo ertmėje pritvirtintos kiaušidės pasaitu (mesovarium), kuris atsišakoja nuo visceralinės pilvaplėvės dalies. Kiaušidės pasaitas taip pat yra plačiojo gimdos raiščio dalis (ligamentum
latum uteri) [4].
9 Kalių kiaušidė yra stangrios konsistencijos elipsoidinis organas, daugiau ar mažiau nelygaus paviršiaus dėl joje besiformuojančių įvairios stadijos folikulų ir geltonųjų kūnų (corpus luteum) (2 pav.). Kiaušidės forma gali minimaliai kisti, priklausomai nuo lytinio ciklo fazės, pvz. anoestrus fazės arba ramybės periodo metu kiaušidės paviršius bus sąlyginai lygus [6]. Vidutinio dydžio kalės, sveriančios 11 – 25 kg, kiaušidės anoestrus fazės metu yra apie 1,4 cm ilgio, matuojant tarp kiaušintakinio ir gimdinio galų, ir 0,8 cm pločio, matuojant tarp pasaitinio ir laisvojo kraštų [6].
2 pav. Kalės kiaušidė [4]
1.2. Lytinis ciklas
Kalių lytiniam ciklui, skirtingai nei daugeliui policiklinių gyvūnų, būdingas monocikliškumas – ruja pasikartoja vieną kartą metuose, vidutiniškai kas 7 mėnesius, tačiau gali būti kas 6 – 10 mėnesių [6] ar 5 – 12 mėnesių [7]. Manoma, kad veislės dydis gali turėti įtakos lytinio ciklo pasikartojimo dažniui. Sezoniškumas kalių lytiniam ciklui įtakos neturi, išskyrus kelias veisles.Basenji veislės kalėms būdinga ruja rudens laikotarpiu. Lytinis ciklas skirstomas į penkias fazes. Visų fazių metu morfologiniai pokyčiai vyksta abejose kiaušidėse vienodai [8].
Prooestrus arba priešrujo fazės metu dažniausiai pastebima išorinių lytinių organų edema,
serozinės kraujingos išskyros iš makšties. Dažnai išskyros šios fazės metu gali būti nepastebimos, nes kai kurios patelės laižydamosis jas išsivalo. Patele domisi patinai, nes su išskyromis išskiriami feromonai, tokie kaip metil p – hidroksibenzoatas, kuris skatina patinų seksualinį susijaudinimą [7]. Tačiau, šios fazės metu patelė jų neprisileidžia. Priešrujo ir rujos metu prieš ovuliaciją, pūslinio folikulo vidinio apvalkalėlio (theca interna) endokrinocitai sintetina ir į folikulinę ertmę (antrum folliculare) išskiria estradiolį E2 ir jo kitimo produktus – estroną ir estriolį [9]. Estrogenai lemia patelės fiziologinius
10 ir lytinio elgesio pokyčius [3]. Kiaušidžių išorinis paviršius sąlyginai lygus, po balzganuoju dangalu (tunica albuginea) matomos mažos pūslelių pavidalo struktūros (3 pav.). Priešrujo fazėje abiejų kiaušidžių sagitaliniuose pjūviuose galima matyti po 2 – 4 didelius pūslinius folikulus (> 4 mm), nes patelių kiaušidėse susiformuoja tiek pūslinių folikulų, kiek patelė veda jauniklių [9]. Vėliau šioje fazėje, pūslinių folikulų sienelė pradeda raukšlėtis ir linkti į folikulinės ertmės vidų [8]. Priešrujo fazės trukmė gali būti 5 – 10 dienų, vidutiniškai 9 dienos [7].
3 pav. Kiaušidės prooestrus fazės metu [10]
Oestrus fazėje arba tikrosios rujos metu mažėja išorinių lytinių organų patinimas, išskyrų kiekis,
jos tampa mažiau kraujingos ir daugiau skaidrios. Patelė prisileidžia patinus, leidžiasi poravimuisi arba kergimui. Šios fazės metu estradiolio E2 kiekis kraujyje mažėja ir pradeda didėti progesterono P4 kiekis [7]. Oestrus fazės trukmė gali kisti nuo 5 iki 10 ar 16 dienų, tačiau vidutiniškai užtrunka apie 9 dienas [8]. Išoriškai kiaušidės paviršius nelygus, matomi dideli antriniai folikulai (4 pav.). Pūslinių folikulų sienelė toliau vis labiau linksta į folikulinės ertmės vidų, kol galiausiai plyšta ploniausioje folikulinio gumburėlio (stigma folliculare) vietoje ir ovocitas, apsuptas spindulinio vainiko (corona radiata), išsilaisvina iš folikulinės ertmės [8]. Ovuliacija dažniausiai įvyksta praėjus 1 – 2 dienoms nuo oestrus fazės pradžios. Ovuliuoti gali nuo 4 iki 15 kiaušialąsčių.
11 4 pav. Kiaušidė oestrus fazės metu [10]
Metoestrus arba ankstyvojo porujo fazės metu kalė nebeprisileidžia patino. Išorinių lytinių organų
edema ir patinimas beveik nepastebimas, išskyrų nėra. Organizme dominuoja geltonojo kūno sintetinamas ir išskiriamas progesteronas P4. Ankstyvajame porujo laikotarpyje kiaušidėse didžiąją dalį užima geltonieji kūnai, kurie vėlesniame porujo laikotarpyje pradeda regresuoti, o geltonojo kūno ląstelių – liuteocitų citoplazmoje atsiranda įvairaus dydžio vakuolių [8]. Šios fazės metu, kiaušidės paviršiuje dar galima matyti ir hemoraginių kūnų (corpus hemorrhagicum) ir geltonųjų kūnų (5 pav.). Ankstyvoji porujo fazė trunka 4 – 6 dienas.
5 pav. Kiaušidė metoestrus fazės metu, matomas hemoraginis kūnas ir geltonkūnis [10]
Diestrus, kitaip metoestrus II, fazė yra vėlyvasis porujo laikotarpis. Kitaip tariant, tai yra geltonojo
kūno gyvavimo laikotarpis, kurio metu geltonasis kūnas pasiekia aukščiausią funkcionavimo lygį. Praėjus maždaug trims savaitėms nuo tikrosios rujos požymių pabaigos, kiekvienoje kiaušidėje galima
12 matyti vidutiniškai 5,1 ± 0,7 geltonųjų kūnų, kurių skerspjūvio plotas siekia vidutiniškai 25,2 ± 13,9 mm2
[11]. Išoriškai kiaušidės paviršius tampa vis mažiau grublėtas, po balzganuoju dangalu matomi susiformavę geltonieji kūnai (6 pav.). Vyksta intensyvi gimdos liaukų hiperplazija ir hipertrofija, keičiasi išskyrų iš makšties konsistencija, gimdos gleivinės spalva [6]. Diestrus fazė trunka 45 – 70 dienų [7].
6 pav. Kiaušidė vėlyvo porujo metu, matomi trys geltonieji kūnai [10]
Anoestrus arba ramybės fazės metu vyksta visiška geltonojo kūno regresija, gimdos involiucija,
endometriumo atsistatymas. Šiuo laikotarpiu patelės nedomina patinai, nėra jokių išskyrų iš makšties.
Anoestrus fazės metu kiaušidės paviršius beveik lygus, kiaušidė įgauna elipsoidinę formą (7 pav.).
Praėjus maždaug 120 – 140 dienų nuo fazės pradžios stebimas menkas pirminių ar antrinių (1 – 3 mm) folikulų skaičius, tačiau 160 – 170 dienomis folikulų kiekis sparčiai didėja iki maždaug 2,2 ± 0,4 folikulo kiekvienoje kiaušidėje. Fazės pabaigoje, likus maždaug 5 dienoms iki prooestrus pradžios, antrinių folikulų skaičius padidėja iki 7,6 ± 0,5 folikulo kiekvienoje kiaušidėje [11]. Anoestrus fazė trunka vidutiniškai 80 – 240 dienų [8].
13 7 pav. Kalės kiaušidės tarprujo metu [10]
1.3. Kiaušidės sandara
Kalių kiaušidės, kaip ir daugelio kitų žinduolių, sudarytos iš dviejų pagrindinių zonų – žievės (cortex ovarii) ir šerdies (medulla ovarii). Žievinį sluoksnį iš išorės dengia paviršinis epitelis (epithelium
superficiale), dar vadinamas gemaliniu epiteliu, sudarytas iš vieno sluoksnio mikrogaurelinių kubiškųjų
arba stulpiškųjų epiteliocitų, bei balzganasis dangalas, sudarytas iš tankaus glaudžiojo netaisyklingojo kolageninio jungiamojo audinio [12]. Embrioniniame laikotarpyje gemalinis epitelis gamina tūkstančius užuomazginių folikulų [13]. Balzganojo dangalo storis gali siekti 100 µm, šiame dangale folikulų nėra [9]. Kiaušidės vartuose paviršinis epitelis pereina į kiaušidės raiščio paviršinį epitelį. Kiaušidės žievės stromą sudaro purus kolageninis jungiamasis audinys. Žievės parenchiminiai elementai – įvairių vystymosi ir regresijos stadijų folikulai, geltonieji kūnai, bei endokrinocitų eilės ir sankaupos. Folikulai žievėje dažniausiai išsidėsto netolygiai [14]. Vidutinis folikulų skaičius 1 mm2 žievės gali svyruoti nuo
3,24 iki 28,34 folikulų [15]. Žievėje taip pat yra tankus kapiliarų tinklas svarbus folikulų mitybai, bei ypatingai svarbus pūslinio folikulo transformacijai į geltonąjį kūną [9].
Kiaušidės šerdies stromą sudaro purus kolageninis jungiamasis audinys, lygieji miocitai, elastinės ir retikulinės skaidulos, kraujagyslės, limfagyslės, nervai [12]. Šerdyje taip pat yra kiaušidės tinklo (rete
ovarii), kuris yra sėklidės tinklo analogas, liekana. Kiaušidės vartuose šerdies jungiamasis audinys
14
1.4. Ovogenezė ir folikulo susidarymas
Embriono formavimosi metu, pirmykštės užuomazginės ląstelės arba ovogonijos migruoja ištrynio maišo endodermos į lytinių liaukų užuomazgas. Čia, joms proliferuojant, susidaro ląstelių salelės, kurių centre yra ovogonijos. Ovogonijos dauginasi mitoziškai iki tam tikro, rūšiai būdingo skaičiaus. Maksimalus ovogonijų skaičius pasiekiamas dar prieš gimimą, tačiau dalis jų sunyksta apoptozės būdu dar iki atvedimo [16]. Mitozė dažniausiai trunka iki atvedimo, tačiau pas kales mitozė trunka dar 17 – 54 dienų po atvedimo [17]. Ovogonijoms nustojus daugintis mitoziškai, prasideda pirmasis mejozės dalijimasis (I mejozė). Pirmosios ovogonijos, pradedančios mejozinį dalijimąsi, yra giliausiose kiaušidės žievės vietose ir mejozinės raidos banga sklinda nuo žievės vidinės dalies link išorės [16]. Ovogonijos diferencijuojasi į pirminius ovocitus (ovocytus primarius), branduoliai lieka pirmojo mejozinio dalijimosi vėlyvojoje profazės fazėje iki ovuliacijos. Pirminį ovocitą apgaubia vienas sluoksnis nediferencijuotų folikulinių ląstelių, tada folikulas vadinamas užuomazginiu folikulu (folliculus ovaricus
primordialis) [18]. Pas kales pirmasis mejozinis dalijimasis baigiasi po ovuliacijos [9]. Augdami
užuomazginiai folikulai diferencijuojasi į pirminius, antrinius, pūslinius folikulus.
1.5. Folikulai
Dėl tikslaus folikulų grupavimo nesutariama. Folikulai pagal morfologiją, dydį, folikulinių ląstelių skaičių ir folikulinės ertmės buvimą gali būti skirstomi į tris arba penkias grupes. Skiriami užuomazginiai, pirminiai (folliculus ovaricus primarius), antriniai (folliculus ovaricus secundarius) arba priešertminiai (priešpūsliniai), ankstyvieji pūsliniai folikulai ir vėlyvieji pūsliniai folikulai. [19].
Užuomazginiai folikulai (8 pav.) susiformuoja, kai pirminis ovocitas yra apgaubiamas vienu sluoksniu nediferencijuotų folikulinių ląstelių. Ovocito vystymasis sustojęs pirmojo mejozinio dalijimosi vėlyvojoje profazės fazėje. Folikulinės ląstelės, išsidėsčiusios ant ovocito pamatinės membranos, formuoja vienasluoksnį plokščiąjį epitelį [16]. Ovocitas yra ovalo arba rutulio formos, citoplazma homogeniška. Branduolys išsidėstęs centre, tačiau daugelio gyvūnų rūšių ovocito branduolys išsidėstęs šiek tiek toliau nuo centro [20]. Dažniausiai chromatinas nekondensuotas, taip pat gali būti matomi vienas ar du branduolėliai [21]. Užuomazginiuose folikuluose dar nėra susiformavusios skaidriosios zonos (zona pellucida).
15 8 pav. Užuomazginiai folikulai (rodyklės) kalės kiaušidėje (100x padidinimas, HE) [autoriaus
nuotrauka]
Užuomazginio folikulo folikulinėms ląstelėms pradėjus proliferuoti ir diferencijuotis, pradeda formuotis pirminis folikulas (9 pav.). Taip pat pradeda augti ir ovocitas. Ne tik padidėja folikulinių ląstelių skaičius, tačiau keisdamos formą pradeda formuoti vienasluoksnį kubiškąjį epitelį, susiformuoja skaidrioji zona [22]. Skaidriąją zoną sintetina folikuliniai epiteliocitai. Vėliau, susiformuoja dar keli sluoksniai folikulinių ląstelių.
16 9 pav. Pirminiai folikulai (rodyklės) kalės kiaušidėje (100x padidinimas, HE) [autoriaus
nuotrauka]
Toliau augant ovocitui, didėjant folikulinių ląstelių skaičiui susiformuoja antrinis arba priešpūslinis folikulas (10 pav.). Nors pas daugelį gyvūnų rūšių patelių, skaidrioji zona pilnai susiformuoja dar pirminiame folikule, pas kales ji galutinai suformuojama antriniame folikule. Kalių skaidrioji zona dažniausiai būna nepastebima arba matomos tik šios zonos dėmės. Per visą gyvenimą kalės kiaušidėje susiformuoja apie 47 900 antrinių folikulų [16]. Tiesiogiai ovocitą dengiančios folikulinės ląstelės sudaro vienasluoksnį stulpiškąjį epitelį ir pradedamas formuoti spindulinis vainikas (corona radiata).
17 10 pav. Antrinis folikulas (rodyklė) kalės kiaušidėje (100x padidinimas, HE) [autoriaus
nuotrauka]
Pūsliniai folikulai gali būti skirstomi į ankstyvuosius pūslinius (11 pav.) ir vėlyvuosius pūslinius folikulus (12 pav.). Vėlyvieji pūsliniai folikulai dar kitaip vadinami Grafo folikulais. Antriniam folikului toliau bręstant, tarp folikulinių ląstelių pradeda formuotis nedidelės ertmės – antrinis folikulas pereina į ankstyvojo pūslinio folikulo stadiją. Ertmės pripildytos folikulinio skysčio (liquor folliculi). Didėjant folikulinio skysčio kiekiui, ertmės plečiasi, kol galiausiai susilieja į vieną bendrą folikulinę ertmę (antrum folliculare) – folikulas tampa vėlyvuoju pūsliniu folikulu [23]. Folikulo sienelė sudaryta iš vidinio folikulinių ląstelių sluoksnio ir išorinio žievės jungiamojo audinio apvalkalo. Apvalkalas sudarytas iš išorinio apvalkalėlio (theca externa) ir vidinio apvalkalėlio (theca interna). Ovocitas, jį gaubianti skaidrioji zona ir spindulinis vainikas kartu formuoja ovocito - spindulinio vainiko kompleksą (ang. Cumulus – oocyte complex, COC) (13 pav.). Visišką pūslinio folikulo susiformavimą charakterizuoja pilnas apvalkalėlių susiformavimas, folikulinės ertmės buvimas, spindulinio vainiko susiformavimas, bei kiaušialąstės iškylos (cumulus oophorus) susiformavimas [22].
18 11 pav. Ankstyvasis pūslinis folikulas kalės kiaušidėje (200x padidinimas, HE) [1]
12 pav. Vėlyvasis pūslinis folikulas katės kiaušidėje (100x padidinimas, HE) [24]
19
2.
TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Darbo metodika
Nuo 2019 metų sausio mėnesio buvo pradėti rinkti mėginiai X veterinarijos gydykloje. Mėginiai buvo imami ovariohisterektomijos metu, atidalintos kiaušidės dedamos į atskirus vienkartinius indelius su jau paruoštu 10 proc. formalino tirpalu. Kiaušidės buvo atrenkamos atsižvelgiant į kalės amžių, fiziologinę būklę, nebuvo imamos kiaušidės su matomomis patologijomis, pvz. cistomis. Visos kalės, kurių kiaušidės buvo naudojamos tyrimui, buvo fiziologiškai sveikos. Iš viso surinktos 26 trylikos kalių kiaušidės.
Surinkus visus mėginius ir išanalizavus duomenis apie kales, jos buvo suskirstytos pagal amžių mėnesiais į amžiaus grupes (1 lentelė). Pirmąją amžiaus grupę sudaro 6 – 12 mėnesių, antrąją grupę 13 – 33 mėnesių, trečiąją 39 – 85 mėnesių amžiaus kalės. Išmatuoti užuomazginių, pirminių, antrinių folikulų skersmenys, plotai ir šių folikulų ovocitų skersmenys. Ovocitų skersmenys buvo matuojami be skaidriosios zonos. Paruošti surinktų mėginių histologiniai preparatai buvo tirti šviesos mikroskopu
OLYMPUS BX43. Mėginių morfometrinė analizė atlikta naudojant OLYMPUS Stream image analysis software programą. Duomenų statistinė analizė atlikta naudojantis SPSS programa. Atliekant Pirsono
koreliacijos analizę nustatytas ryšys tarp analizuotų parametrų, o Post Hoc metodu nustatytas parametrų pasiskirstymas tarp amžiaus grupių.
1 lentelė. Amžiaus grupės ir kalių, kurių kiaušidės buvo naudotos tyrimui, skaičius Amžius (mėn.) Kalių skaičius (vnt.)
1 amžiaus grupė 6 2 10 1 12 2 2 amžiaus grupė 13 1 14 1 15 1 21 1 33 1 3 amžiaus grupė 39 1 54 1 85 1
20
2.2. Histologinė technika
Histologinių preparatų gamyba susidėjo iš tokių etapų: fiksavimas, plovimas, dehidratacija, skaidrinimas, impregnavimas, blokų formavimas, pjaustymas ir preparatų dažymas. Mėginiai fiksuoti 10 proc. formalino tirpale. Formalino tirpalo buvo 15-20 kartų daugiau nei fiksuojamosios medžiagos. Prieš pradedant kitą etapą, mėginiai formaline fiksuoti mažiausiai 24 val.
Mėginiai patalpinti į biopsines kasetes ir 24 valandas plauti po tenkančiu vandentiekio vandeniu. Atlikus plovimą, pradėtas dehidratacijos etapas, kurio metu mėginiai dehidratuoti palaipsniui keliant dehidratanto koncentraciją – 60, 80, 96 proc. etilo alkoholis, izopropanolis. Kiekvienos koncentracijos dehidratante mėginiai mirkyti 2 val.
Kitame etape, jau dehidratuoti mėginiai, skaidrinti naudojant chloroformą, taip pašalintas dehidratantas. Vėliau mėginiai impregnuoti tvirtinamąja – standinamąja medžiaga parafinu, naudojantis audinių įliejimo įrangą Sakura Tissue- Tek® TEC® 5, suformuoti parafininiai blokai. Parafininiuose
blokuose paruošti mėginiai pjaustyti rotaciniu mikrotomu, atlikti 5 µm mikropjūviai. Gauti mikropjūviai panardinti į termostatinę vandens vonelę, kurioje mėginys išsilygina. Iš vonelės mėginys paimtas naudojant objektinį stiklelį.
Dažymas taip pat susideda iš kelių etapų. Pirmiausia, mėginiai deparafinuoti ksilenu, vėliau hidratuoti izopropilo ir 96 proc. etilo alkoholiais. Prieš pradedant dažymą, mėginiai skalauti po tekančiu vandeniu minutę laiko. Hematoksilino dažuose mėginys laikytas 5 min., pjūvis melsvintas 0,1 proc. amonio vandeniu ir skalautas po tekančiu vandeniu. Eozino dažuose mėginys laikytas 1 min.
Atlikus dažymą, pjūviai vėl dehidratuoti ir skaidrinti, užlieti sintetine derva ir uždengti dengiamaisiais stikleliais [26].
2.3. Mikroskopas ir programinė įranga
Histologinių preparatų analizei buvo naudojamas OLYMPUS BX43 šviesos mikroskopas ir kompiuteris. OLYMPUS Stream image analysis software programa susieja mikroskopą su kompiuteriu ir tokiu būdu preparatus galima analizuoti kompiuterio ekrane. Programa leidžia pro skirtingus objektyvus matomus vaizdus užfiksuoti, daryti nuotraukas, priartinti vaizdus, atlikti įvairius matavimus ir gautus rezultatus susisteminti Excel programoje.
21
2.4. Histologinių preparatų analizė
Iš viso išanalizuoti 26 histologiniai kalių kiaušidžių preparatai. Viename preparate matomas visas vienos kiaušidės mikropjūvis. Pirmiausia, mikroskopo 40x padidinimo objektyvu nustatomas kiaušidės žievės plotas, kuriame matomas didžiausias reikiamų folikulų skaičius. Matavimai atlikti nustačius 100x arba 200x padidinimo vaizdą. Naudojantis OLYMPUS Stream image analysis software programa užfiksuotos kiaušidės vaizdo nuotraukos (14 pav.) ir išmatuoti reikiami folikulų parametrai (15 pav.), rezultatai automatiškai susisteminti Excel programoje. Kiekvienoje kiaušidėje išmatuota po 10 užuomazginių, pirminių ir antrinių folikulų. Matuoti kiekvieno iš folikulų skersmenys, plotai bei ovocitų skersmenys.
14 pav. OLYMPUS Stream image analysis software programa užfiksuojama kiaušidės vaizdo
22 15 pav. OLYMPUS Stream image analysis software programa išmatuoti kiaušidės folikulų
23
3.
TYRIMO REZULTATAI
Atlikus matavimus ir statistiškai apdorojus duomenis, gauti rezultatai parodė, jog kiekvienoje amžiaus grupėje tarpusavyje skirtingų folikulų skersmenys, plotai ir ovocitų skersmenys labai panašūs. Lyginant kairės ir dešinės kiaušidės folikulų skersmenų vidurkius tarp trijų amžiaus grupių, didžiausias užuomazginio folikulo skersmuo yra trečioje amžiaus grupėje, kairiojoje kiaušidėje – 49,00 ± 9,50 µm, mažiausias - pirmoje amžiaus grupėje, dešiniojoje kiaušidėje – 37,00 ± 4,73 µm. Didžiausias pirminio folikulo skersmuo yra trečioje amžiaus grupėje, dešiniojoje kiaušidėje – 83,00 ± 12,1 µm, mažiausias - pirmoje amžiaus grupėje, kairiojoje kiaušidėje – 36,33 ± 1,45 µm. Didžiausias antrinio folikulo skersmuo yra antroje amžiaus grupėje, dešiniojoje kiaušidėje – 135,5 ± 9,2 µm, mažiausias - trečioje amžiaus grupėje, kairiojoje kiaušidėje – 111,67 ± 28,26 µm (16, 17 pav.).
16 pav. Kairės kiaušidės užuomazginio, pirminio ir antrinio folikulų skersmens vidurkių
pasiskirstymas tarp amžiaus grupių
46.67 38 49 36.33 56.33 52.33 114 122.83 111.67 0 20 40 60 80 100 120 140
1 amžiaus grupė 2 amžiaus grupė 3 amžiaus grupė
Foliku lo skers m u o , µ m Amžiaus grupės
24 17 pav. Dešinės kiaušidės užuomazginio, pirminio ir antrinio folikulų skersmens vidurkių
pasiskirstymas tarp amžiaus grupių
Lyginant kairės ir dešinės kiaušidžių folikulų plotų vidurkius tarp amžiaus grupių, didžiausias užuomazginio folikulo plotas yra trečios amžiaus grupės kairiojoje kiaušidėje – 0,21 ± 0,09 mm2,
mažiausias – pirmos amžiaus grupės dešiniojoje kiaušidėje – 0,11 ± 0,03 mm2. Didžiausias pirminio
folikulo plotas yra trečios amžiaus grupės dešiniojoje kiaušidėje – 0,57 ± 0,16 mm2, mažiausias – pirmos
amžiaus grupės kairiojoje kiaušidėje – 0,11 ± 0,01 mm2. Didžiausias antrinio folikulo plotas yra trečios
amžiaus grupės dešiniojoje kiaušidėje – 1,48 ± 0,9 mm2, mažiausias yra trečios amžiaus grupės kairiojoje
kiaušidėje – 1,04 ± 0,5 mm2 (18, 19 pav.). 37 42 38.17 46 55.5 83 115 135.5 124.67 0 20 40 60 80 100 120 140 160
1 amžiaus grupė 2 amžiaus grupė 3 amžiaus grupė
Foliku lo skers m u o , µm Amžiaus grupės
25 18 pav. Kairės kiaušidės užuomazginių, pirminių ir antrinių folikulų plotų vidurkių
pasiskirstymas tarp amžiaus grupių
19 pav. Dešinės kiaušidės užuomazginių, pirminių ir antrinių folikulų plotų vidurkių
pasiskirstymas tarp amžiaus grupių
0.19 0.12 0.21 0.11 0.26 0.22 1.13 1.33 1.04 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
1 amžiaus grupė 2 amžiaus grupė 3 amžiaus grupė
Foliku lo p lot as, mm 2 Amžiaus grupės
Užuomazginio fol. plotas Pirminio fol. plotas Antrinio fol. plotas
0.11 0.14 0.12 0.17 0.29 0.57 1.08 1.44 1.48 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
1 amžiaus grupė 2 amžiaus grupė 3 amžiaus grupė
Foliku lo p lot as, m m 2 Amžiaus grupės
26 Lyginant kairės ir dešinės kiaušidžių folikulų ovocitų skersmenų vidurkius tarp amžiaus grupių, didžiausias užuomazginio folikulo ovocito skersmuo yra trečioje amžiaus grupėje kairiojoje kiaušidėje – 41,33 ± 9,35 µm, mažiausias - antroje amžiaus grupėje kairiojoje kiaušidėje – 29,67 ± 2,45 µm. Didžiausias pirminio folikulo ovocito skersmuo yra trečios amžiaus grupės dešiniojoje kiaušidėje – 51,00 ± 16,82 µm, mažiausias - pirmoje amžiaus grupėje kairiojoje kiaušidėje – 11,67 ± 0,88 µm. Didžiausias antrinio folikulo ovocito skersmuo yra antroje amžiaus grupėje kairiojoje kiaušidėje – 68,83 ± 10,53 µm, mažiausias - pirmoje amžiaus grupėje dešiniojoje kiaušidėje – 47,67 ± 4,41 µm (20, 21 pav.).
20 pav. Kairės kiaušidės užuomazginio, pirminio ir antrinio folikulų ovocitų skersmens vidurkių
pasiskirstymas tarp amžiaus grupių
39.67 29.67 41.33 11.67 36.83 27.67 61.33 68.83 56 0 10 20 30 40 50 60 70 80
1 amžiaus grupė 2 amžiaus grupė 3 amžiaus grupė
Foliku lo o vo cito s kers m u o , µm Amžiaus grupės
27 21 pav. Dešinės kiaušidės užuomazginio, pirminio, antrinio folikulų ovocitų skersmens vidurkių
pasiskirstymas tarp amžiaus grupių
Koreliacinėje analizėje (1 priedas) nustatytas statistinio ryšio stiprumas tarp stebėtų kintamųjų, t.y. nustatytas ryšys tarp amžiaus (mėn.) ir dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo skersmens, ploto ir užuomazginio folikulo ovocito skersmens. Nustatyta, jog didėjant amžiui, kartu turi tendenciją didėti ir dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo skersmuo, koreliacijos ryšys stiprus (r = 0,673), koreliacija statistiškai reikšminga, p<0,05. Didėjant amžiui, turi tendenciją didėti ir dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo plotas, (r = 0,715), p<0,01. Didėjant amžiui turi tendenciją didėti ir dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo ovocito skersmuo, (r = 0,583), p<0,05.
Nustatytas statistiškai stiprus ryšys tarp užuomazginio folikulo skersmens ir užuomazginio folikulo ovocito skersmens kairėje ir dešinėje kiaušidėse, atitinkamai (r = 0,921) ir (r = 0,914), p<0,01. Tai rodo, kad didėjant užuomazginio folikulo skersmeniui, užuomazginio folikulo ovocito skersmuo turi tendenciją didėti. Taip pat, stiprus ryšys nustatytas tarp pirminio folikulo skersmens ir pirminio folikulo ovocito skersmens kairėje ir dešinėje kiaušidėse, atitinkamai (r = 0,874) ir (r = 0,903), p<0,01. Stiprus statistinis ryšys nustatytas ir tarp antrinio folikulo skersmens ir antrinio folikulo ovocito skersmens kairėje ir dešinėje kiaušidėse, atitinkamai (r = 0,844) ir (r = 0,678), p<0,01.
Atlikus statistinę analizę, tyrimo rezultatai rodo, jog pirmos amžiaus grupės kairės kiaušidės pirminio folikulo skersmuo, lyginant su antros amžiaus grupės kairės kiaušidės pirminio folikulo
30 31.33 36 17 34 51 47.67 68.67 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80
1 amžiaus grupė 2 amžiaus grupė 3 amžiaus grupė
Foliku lų o vo citų ske rs m u o , µm Amžiaus grupės
28 skersmeniu, yra 20,00 µm mažesnis (35,50 proc.), p<0,01. Antros amžiaus grupės kairės kiaušidės pirminio folikulo plotas yra 1,47 mm2 (56,90 proc.) didesnis, nei pirmos amžiaus grupės kairės kiaušidės pirminio folikulo plotas, p<0,01. Antros amžiaus grupės kairės kiaušidės pirminio folikulo ovocito skersmuo yra 25,15 µm (68,30 proc.) didesnis, nei pirmos amžiaus grupės kairės kiaušidės pirminio folikulo ovocito skersmuo, p<0,05.
Trečios amžiaus grupės dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo skersmuo yra 9,00 µm (19,60 proc.) didesnis, nei pirmos amžiaus grupės užuomazginio folikulo skersmuo, p<0,05. Pirmos amžiaus grupės dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo plotas yra 607,00 µm2 (34,95 proc.) mažesnis, nei trečios amžiaus grupės dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo plotas, p<0,05. Trečios amžiaus grupės dešinės kiaušidės užuomazginio folikulo plotas yra 550,34 µm2 (31,67 proc.) didesnis, nei antros amžiaus grupės
29
4.
REZULTATŲ APTARIMAS
Carvalho et al. [27] atliktame tyrime buvo vertinami kiaušidžių folikulų histomorfometriniai parametrai ir kiaušidėse vykstantys apoptoziniai procesai tarp skirtingų amžiaus grupių kačių. Katės suskirstytos į tris grupes: jaunos (5 – 12 mėn., vidutiniškai 7,8 ± 10 mėn.), suaugusios (13 – 72 mėn., vidutiniškai 2,8 ± 0,5 metų) ir vyresnės (> 72 mėn., vidutiniškai 8,0 ± 0,9 metų). Išmatavus užuomazginių, pirminių, turinčių vieną sluoksnį folikulinių ląstelių, pirminių, turinčių kelis ir daugiau folikulinių ląstelių sluoksnius, ir antrinių folikulų skersmenis, plotus ir perimetrus paaiškėjo, kad užuomazginių folikulų visi parametrai buvo didesni jaunų grupėje, lyginant su suaugusių grupe, o pirminių folikulų visi parametrai buvo didesni lyginant su vyresnių grupe, p<0,05. Ovocitų parametrai taip pat buvo didesni jaunų kačių grupėje. Lyginant pirminių folikulų, turinčių kelis ir daugiau folikulinių ląstelių sluoksnius, antrinių ir priešovuliacinių folikulų parametrus tarp amžiaus grupių, gauti duomenys nebuvo patikimi, p>0,05. Padaryta išvada, jog amžius turėjo įtakos ovocitų parametrams, katėms senstant kartu mažėja ir ovocitų parametrai. Mūsų atliktame tyrime, folikulų ovocitų parametrai buvo didžiausi trečioje amžiaus grupėje. Galima daryti prielaidą, kad didžiausi folikulų parametrai gauti vyriausių kalių grupėje dėl to, kad tokio amžiaus kalės buvo pilnai lytiškai subrendusios ir pasiekusios aukščiausią reproduktyvumo lygį.
Hewitt, England [28] atliko tyrimą, kuriame nagrinėjo kalių ovocito dydžio ir kalės amžiaus įtaką ovocito branduolio subrendimui in vitro. Kalės buvo suskirstytos į dvi grupes: 1 – 6 metų ir ≥7 metų. Atlikus tyrimą gauta išvada, kad ovocitai mažesni nei 100 µm skersmens savo branduoliuose turėjo mažiau branduolinės medžiagos ir mejozinio pajėgumo. Otoi et al. (2000) [31] tyrime taip pat nustatė, kad daugiau ovocitų ir jie lengviau pereina į metafazę II, jei jų skersmenys yra >100 µm ir kalės yra 1 – 6 metų amžiaus. Ovocitai jaunų kalių grupėje turi didesnį brendimo potencialą, nei vyresnių kalių. Reiktų nepamiršti, jog šiame tyrime ovocitų skersmenys buvo matuojami kartu su skaidriąja zona. Žinant, jog skaidriosios zonos plotis yra apie 12 µm [9], galima daryti prielaidą, kad ovocitai, mažesni nei 88 µm, turi mažiau reprodukcinio potencialo. Mūsų atliktame tyrime, tokio dydžio folikulai buvo aptikti visose amžiaus grupėse.
Lyginant išmatuotus parametrus su kitų rūšių parametrais, pastebėta, kad pirmos amžiaus grupės kalių užuomazginių folikulų skersmenys (37 – 46,67 µm) didesni, nei nesubrendusių kiaulaičių (33,8 µm) [29] ir mergaičių iki 13 metų amžiaus (39 µm) [30], tačiau kalių pirminių folikulų skersmenys (36,33 – 42 µm) yra mažesni, nei kiaulaičių (40,4 – 84,5 µm) ir mergaičių (44,1 µm). Pirmos amžiaus
30 grupės kalių užuomazginių folikulų ovocitų skersmenys (30 – 39,67 µm) didesni, nei nesubrendusių kiaulaičių (26 µm) ir mergaičių (34,3 µm), pirminių folikulų ovocitų skersmenys (11,67 – 17 µm) mažesni, nei nesubrendusių kiaulaičių (27,3 – 39,1 µm) ir mergaičių (41 µm).
31
5.
IŠVADOS
1. Atlikus matavimus nustatyta, kad didžioji dalis parametrų gauti didžiausi trečioje amžiaus grupėje. Tokie parametrai buvo: užuomazginių, pirminių folikulų skersmenys, užuomazginių, pirminių ir antrinių folikulų plotai ir pirminių, antrinių folikulų ovocitų skersmenys. Didžioji dalis mažiausių parametrų gauti pirmoje amžiaus grupėje. Tokie parametrai buvo: užuomazginių, pirminių folikulų skersmenys, užuomazginių, pirminių folikulų plotai ir užuomazginių, pirminių folikulų ovocitų skersmenys.
2. Trečios amžiaus grupės užuomazginio folikulo skersmuo ir plotas yra didesni, nei pirmos amžiaus grupės užuomazginio folikulo skersmuo ir plotas atitinkamai 19,60 proc. ir 34,95 proc., p<0.05. Trečios amžiaus grupės užuomazginio folikulo plotas yra 31,67 proc. didesnis, nei antros amžiaus grupės užuomazginio folikulo plotas, p<0,05. Antros amžiaus grupės pirminio folikulo skersmuo, pirminio folikulo plotas, pirminio folikulo ovocito skersmuo yra didesni, nei pirmos amžiaus grupės pirminio folikulo skersmuo, pirminio folikulo plotas, pirminio folikulo ovocito skersmuo atitinkamai 35,50 proc., 56,90 proc., p<0,01 ir 68,30 proc., p<0,05.
3. Didėjant amžiui, kartu turi tendenciją didėti ir užuomazginio folikulo skersmuo (p<0,05), užuomazginio folikulo plotas (p<0,01) ir užuomazginio folikulo ovocito skersmuo (p<0,05). Kitiems kintamiesiems amžius statistiškai patikimos įtakos neturėjo.
32
6.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Korkmaz Ö, Korkmaz D, Polat IM, Pir Jağci I, Peckan M, Emre B, et al. Differences in the follicular morphology of young and aged bitches and their correlation with the Anti-Müllerian hormone. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2016;22 (5): 733-739.
2. Doležel R, Kyliánková R, Kummer V, Mašková J, Stará P, Vitásek R. Follicular Population and Oestrogen Receptor Alpha in Ovary of the Bitch. Acta Veterinaria Brno. 2004;73(1):37-43. 3. Aspinall V, Cappello M, Aspinall V. Introduction to Veterinary Anatomy and Physiology. 3rd ed.
London: Elsevier Health Sciences UK; 2015. p. 123 – 142.
4. Dyce KM, Sack WO, Wensing CJG. A textbook of veterinary anatomy. 4th ed. St. Louis: Sounders/Elsevier. 2010. p. 167 – 215.
5. Pet-informed-veterinary-advice-online.com. (2019). Dog Spaying Surgery - Everything you need to know about spaying a dog. [elektroninis išteklius] Prieiga per internetą: http://www.pet-informed-veterinary-advice-online.com/dog-spaying.html [Žiūrėta 2019 m. spalio 10 d.].
6. Noakes DE, Parkinson TJ, England GCJ. Veterinary reproduction and obstetrics. 10th ed. Edinburg: Elsevier. 2019. p. 2 – 34.
7. Concannon PW. Reproductive cycles of domestic bitch. Anim Reprod Sci. 2011 Apr; 124 (3-4): 200-10.
8. Sato J, Nasu M, Tsuchitani M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. J Toxicol Pathol. 2016 Jul; 29(3): 155–162.
9. Padaiga A, Lasys V, Sederavičius A. Naminių gyvūnų mikroskopinė anatomija. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. 2006. p. 158 – 171.
10. Groppetti D, Aralla M, Bronzo V, Bosi G, Pecile A, Arrighi S. (2019). Periovulatory time in the bitch: what's new to know? Comparison between ovarian histology and clinical features. [elektroninis išteklius] Semanticscholar.org. Prieiga per internetą: https://www.semanticscholar.org/paper/Periovulatory-time-in-the-bitch%3A-what's-new-to-and-Groppetti-Aralla/b3cabd00ca8c144c2e277da82b7f1ee0b10c609c [Žiūrėta 2019 m. rugpjūčio 23 d.].
11. England GC, Russo M, Freeman SL. Follicular dynamics, ovulation and conception rates in bitches. Reprod Domest Anim. 2009 Jul; 44 Suppl 2:53-8.
33 12. Kuehnel W. Color atlas of cytology, histology and microscopic anatomy. 4th ed. Stuttgart/New
York: Thieme. 2003. p. 400 – 437.
13. Rastogi SC. Essentials of animal physiology. 4th ed. New Delhi: New age international (P) limited. 2007. p. 437 – 454.
14. Hayashi M, Hariya M, Kayano M, Suzuki H. Distribution of follicles in canine ovary. A simple and rapid method for counting follicles. Cryobiology. 2015 Dec;71(3):514-7.
15. Wakasa I, Hayashi M, Abe Y, Suzuki H. Distribution of follicles in canine ovarian tissue and xenotransplantation of cryopreserved ovarian tissues with even distribution of follicles. Reprod Domest Anim. 2017 Apr;52 Suppl 2:219-223.
16. Paulini F, Silva RC, Rôlo JL, Lucci CM. Ultrastructural changes in oocytes during folliculogenesis in domestic mammals. J Ovarian Res. 2014 Oct 30;7:102.
17. Songsasen N, Fickes A, Pukazhenthi BS, Wildt DE. Follicullar morphology, oocyte diameter and localization of fibroblast growth factors in the domestic dog ovary. Reprod Domest Anim. 2009 Jul; 44(Suppl 2): 65–70.
18. Sathananthan AH, Selvaraj K, Girijashankar ML, Ganesh V, Selvaraj P, Trounson AO. From oogonia to mature oocytes: inactivation of the maternal centrosome in humans. Microsc Res Tech. 2006 Jun;69(6):396-407.
19. Songsasen N, Wildt DE. Oocyte biology and challenges in developing in vitro maturation systems in the domestic dog. Anim Reprod Sci. 2007 Mar; 98(1-2): 2–22.
20. Yu SJ, Yong YH, Cui Y. Oocyte morphology from primordial to early tertiary follicles of yak. Reprod Domest Anim. 2010 Oct;45(5):779-85.
21. Kacinskis MA, Lucci C, Luque MCA, Bao SN. Morphometric and ultrastructural characterization of Bos indicus preantral follicles. Animal Reproduction Science 2005 Jul: 87(1-2):45-57. 22. Diagone KV, Vicente VR, Pacheco MR, Mateus O. Oocyte morphometry in female dogs (Canis
familiaris, Linnaeus, 1758). Anat Histol Embryol. 2008 Apr;37(2):81-5.
23. Lucci CM, Silva RV, Carvalho CA, Figueiredo R, Bao N. Light microscopical and ultrastructural characterization of goat preantral follicles. Small Rumin Res. 2001 Jul;41(1):61-69.
24. Bacha WJ, Bacha LM. Color atlas of veterinary histology. 3rd ed. Oxford: Wiley – Blackwell. 2012. p. 243 – 265.
25. Demiray SB, Yilmaz Ö, Goker ET, Tvmergen E, Calimlioglu N, Sezerman OU et al. Expression of the bone morphogenetic protein-2 (BMP2) in the human cumulus cells as a biomarker of oocytes and embryo quality. Journal of Human Reproductive Sciences. 2017 Jul: 10(3):194.
34 26. Laurinavičienė A, Smaliukienė R. Histologinių technologijų vadovas. Vilnius: Eugrimas. 2007.
p. 29-64.
27. Carvalho I, Denadai D, Trevisan J, Mendes H, Perri S, Monteiro C et al. Follicular histomorphometry and evaluation of ovarian apoptosis in queens of different age groups. Acta Scientiae Veterinariae, 2018;44 (1):8.
28. Hewitt DA, England DC. The effect of oocyte size and bitch age upon oocyte nuclear maturation
in vitro. Theriogenology. 1998 Apr 1;49(5):957-66.
29. Silva R, Bao S, Jivago J, Lucci C. Ultrastructural characterization of porcine oocytes and adjacent follicular cells during follicle development: Lipid component evolution. Theriogenology. 2011 Dec;76(9):1647-1657.
30. Westergaard C, Byskov A, Anderson C. Morphometric characteristics of the primordial to primary follicle transition in the human ovary in relation to age. Human reproduction. 2007;22(8): 2225 – 2231.
31. Otoi T, Fujii M, Tanaka M, Suzuki T. Canine oocyte diameter in relation to meiotic competence and sperm penetration. Theriogenology. 2000;54(4):535 – 542.
35
7.
PRIEDAI
1 priedas
22 pav. Analizuotų požymių tarpusavio ryšio koreliacinė lentelė
Amžiaus grupė Amžius (mėn.) UF skersmuo (kairė) UF plotas (kairė) UF ovocito skersmuo (kairė) PF skersmuo (kairė) PF plotas (kairė) PF ovocito skersmuo (kairė) AF skersmuo (kairė) AF plotas (kairė) AF ovocito skersmuo (kairė) UF skersmuo (dešinė) UF plotas (dešinė) UF ovocito skersmuo (dešinė) PF skersmuo (dešinė) PF plotas (dešinė) PF ovocito skersmuo (dešinė) AF skersmuo (dešinė) AF plotas (dešinė) AF ovocito skersmuo (dešinė) Amžiaus grupė 1.000 ,805** 0.104 0.108 0.069 0.520 0.483 0.408 -0.019 -0.034 -0.085 0,577* 0,582* 0.470 0.520 0.516 0.396 0.136 0.220 0.170 Amžius (mėn.) ,805 ** 1.000 0.531 0.553 0.497 0.212 0.171 -0.017 -0.128 -0.168 -0.225 0,673* 0,715** 0,583* 0.335 0.305 0.142 0.271 0.396 0.160 UF skersmuo (kairė) 0.104 0.531 1.000 0,984** 0,921** -0.033 -0.029 -0.100 -0.162 -0.163 -0.150 0.140 0.134 0.055 -0.091 -0.090 -0.130 0.030 0.041 0.012 UF plotas (kairė) 0.108 0.553 0,984** 1.000 0,907** -0.058 -0.055 -0.130 -0.160 -0.159 -0.134 0.107 0.106 0.031 -0.107 -0.105 -0.150 0.018 0.030 -0.009 UF ovocito skersmuo (kairė) 0.069 0.497 0,921** 0,907** 1.000 -0.088 -0.084 -0.127 -0.187 -0.178 -0.216 0.137 0.133 0.090 -0.101 -0.088 -0.135 0.095 0.097 0.050 PF skersmuo (kairė) 0.520 0.212 -0.033 -0.058 -0.088 1.000 0,980** 0,874** 0.118 0.105 0.117 0.126 0.108 0.078 0.060 0.042 0.044 -0.031 0.015 -0.071 PF plotas (kairė) 0.483 0.171 -0.029 -0.055 -0.084 0,980** 1.000 0,868** 0.121 0.110 0.133 0.088 0.074 0.056 0.053 0.040 0.031 0.004 0.037 -0.032 PF ovocito skersmuo (kairė) 0.408 -0.017 -0.100 -0.130 -0.127 0,874** 0,868** 1.000 0.098 0.079 0.162 0.149 0.137 0.105 0.097 0.082 0.101 -0.044 -0.011 -0.059 AF skersmuo (kairė) -0.019 -0.128 -0.162 -0.160 -0.187 0.118 0.121 0.098 1.000 0,980** 0,844** -0.146 -0.131 -0.165 0.106 0.096 0.118 -0.051 -0.056 -0.136 AF plotas (kairė) -0.034 -0.168 -0.163 -0.159 -0.178 0.105 0.110 0.079 0,980** 1.000 0,808** -0.134 -0.124 -0.136 0.103 0.101 0.118 -0.020 -0.025 -0.084 AF ovocito skersmuo (kairė) -0.085 -0.225 -0.150 -0.134 -0.216 0.117 0.133 0.162 0,844** 0,808** 1.000 -0.060 -0.050 -0.045 0.145 0.131 0.202 -0.024 -0.043 -0.124 UF skersmuo (dešinė) 0,577* 0,673* 0.140 0.107 0.137 0.126 0.088 0.149 -0.146 -0.134 -0.060 1.000 0,980** 0,914** 0.088 0.066 0.040 -0.131 -0.091 -0.186 UF plotas (dešinė) 0,582 * 0,715** 0.134 0.106 0.133 0.108 0.074 0.137 -0.131 -0.124 -0.050 0,980** 1.000 0,903** 0.075 0.052 0.018 -0.102 -0.068 -0.170 UF ovocito skersmuo (dešinė) 0.470 0,583* 0.055 0.031 0.090 0.078 0.056 0.105 -0.165 -0.136 -0.045 0,914** 0,903** 1.000 0.047 0.036 -0.011 0.028 0.045 -0.045 PF skersmuo (dešinė) 0.520 0.335 -0.091 -0.107 -0.101 0.060 0.053 0.097 0.106 0.103 0.145 0.088 0.075 0.047 1.000 ,979** ,903** -0.094 -0.077 -0.029 PF plotas (dešinė) 0.516 0.305 -0.090 -0.105 -0.088 0.042 0.040 0.082 0.096 0.101 0.131 0.066 0.052 0.036 ,979** 1.000 ,902** -0.110 -0.093 -0.036 PF ovocito skersmuo (dešinė) 0.396 0.142 -0.130 -0.150 -0.135 0.044 0.031 0.101 0.118 0.118 0.202 0.040 0.018 -0.011 ,903** ,902** 1.000 -0.125 -0.111 0.016 AF skersmuo (dešinė) 0.136 0.271 0.030 0.018 0.095 -0.031 0.004 -0.044 -0.051 -0.020 -0.024 -0.131 -0.102 0.028 -0.094 -0.110 -0.125 1.000 ,974** ,678** AF plotas (dešinė) 0.220 0.396 0.041 0.030 0.097 0.015 0.037 -0.011 -0.056 -0.025 -0.043 -0.091 -0.068 0.045 -0.077 -0.093 -0.111 ,974** 1.000 ,609** AF ovocito skersmuo (dešinė) 0.170 0.160 0.012 -0.009 0.050 -0.071 -0.032 -0.059 -0.136 -0.084 -0.124 -0.186 -0.170 -0.045 -0.029 -0.036 0.016 ,678** ,609** 1.000 *p<0,05 **p<0,01
