LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS NEUROCHIRURGIJOS KLINIKA

VIENTISŲJŲ MEDICINOS STUDIJŲ BAIGIAMASIS MAGISTRINIS DARBAS

GALVOS SMEGENŲ GLIOBLASTOMŲ MOLEKULINIŲ ŽYMENŲ IR RADIOLOGINIŲ CHARAKTERISTIKŲ SĄSAJŲ ANALIZĖ

Darbo autorius Justinas Drūteika

Darbo vadovas doc. dr. Kęstutis Skauminas

Darbo konsultantai: asist. E. Keleras, lekt. Robertas Petrolis

Kaunas 2017 - 2019 m.

2

TURINYS

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ...5

6. SANTRUMPOS ...6

7. SĄVOKOS ...8

8. ĮVADAS ...9

9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

10.1 Galvos smegenų glioblastomų klinikiniai ypatumai ...11

10.1 Biologinės glioblastomų ypatybės ...14

10.3 Radiologinės glioblastomų ypatybės ...16

11. TYRIMO METODIKA ... 19

12. REZULTATAI ... 23

12.1 Molekulinių genetinių žymenų ir radiologinių požymių paieška ...23

12.2 Tiriamosios imties pacientų demografinės bei klinikinės ypatybės ...23

12.3 Tiriamosios imties pacientų MRT vaizduose matomų pakitimų kiekybiniai tūrio matavimai ...25

12.4 Sąsajos tarp tiriamosios imties pacientų glioblastomas charakterizuojančių MRT požymių ir išgyvenimo trukmės ...26

12.5 GFAP bei AREG genų raiškos dažnis ištirtų glioblastomų navikiniame audinyje ...29

12.6 Sąsajos tarp tiriamosios imties pacientų išgyvenimo trukmės ir GFAP bei AREG genų raiškos. ...31

12.7 Sąsajos tarp tiriamosios imties pacientų glioblastomų radiologinių kiekybinių MRT pakitimų tūrio kriterijų ir GFAP bei AREG genų raiškos ...32

12.8 Tirtų genų raiškos sąsajos su pacientų išgyvenimo trukme ...35

13. REZULTATŲ APTARIMAS IR DISKUSIJA ... 37

14. IŠVADOS ... 41

15. REKOMENDACIJOS ... 42

16. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43

3

1. TYRIMO SANTRAUKA

Autorius: Justinas Drūteika

Tema:„Galvos smegenų glioblastomų molekulinių žymenų ir radiologinių charakteristikų sąsajų analizė“. Tikslas: Nustatyti galvos smegenų glioblastomų molekulinių žymenų ir radiologinių požymių sąsajas. Uždaviniai: 1. Remiantis literatūros duomenimis įvertinti ir atrinkti galvos smegenų glioblastomas charakterizuojančius molekulinius žymenis ir radiologinius požymius. 2. Ištirti galvos smegenų glioblastomų pasirinktus radiologinius požymius bei jų prognozinę vertę tiriamųjų pacientų imtyje. 3. Nustatyti galvos smegenų glioblastomų ištirtų radiologinių požymių sąsajas su pasirinktais tyrimui glioblastomų molekuliniais žymenimis.

Metodika: Retrospektyvi užkoduotų klinikinių duomenų analizė pacientų, kurie 2015-2016 m. buvo tirti ir gydyti LSMU KK Neurochirurgijos klinikoje. Į tolesnį tyrimą įtraukti pacientai, kuriems Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje buvo ištirti navikų GFAP ir AREG molekuliniai genetiniai žymenys. Vaizdai apdoroti taikant standartizuotą paruošimą. Vaizdų segmentacija, trimačiai navikų modeliai, tūrių skaičiavimai atlikti ITK-SNAP 3.8.0-beta versija. Statistinė analizė atlikta SPSS 25.0 programa. Statistiškai reikšmingi rezultatai nurodyti, kai p<0,05.

Rezultatai: Centrinės naviko nekrozės, kontrastą kaupiančios naviko dalies (KKND), naviko sukeltos edemos tūriai tarp lyties, amžiaus grupių statistiškai nesiskyrė (p>0,05). Mažėjant KKND tūriui, išgyvenimo trukmė ilgėjo (p=0,003), o KKND/bendro pažeidimo (BP) ir KKND/edemos (p=0,024, p=0,015, atitinkamai) statistiškai reikšmingai skyrėsi. GFAP geno grupėje statistiškai reikšmingų sąsajų tarp molekulinių žymenų ir glioblastomos radiologinių požymių nenustatyta (p>0,05 visais atvejais). Silpnėjant AREG geno raiškai, BP tūris didėjo (Rs=-0,543, p=0,037). Esant sustiprintai geno raiškai šansų santykis išgyventi >12 mėn. lygus 2,800, o tikimybė 1,6 karto didesnė nei nustačius prislopintą AREG geno raišką.

Išvados: 1. Glioblastomą, kurios onkogenezėje dalyvauja GFAP ir AREG genai, charakterizuoja centrinė naviko nekrozė, kontrastą kaupianti naviko dalis, naviko sukelta edema. 2. Mažėjant kontrasto kaupiančios naviko dalies (KKND) tūriui išgyvenimo trukmė ilgėjo (p=0,003). 3. Didėjant bendram pažeidimo (BP) tūriui, AREG geno raiškos lygiai mažėjo (Rs=-0,543, p=0,037).

Rekomendacijos: Pritaikyti standartizuotą pacientų galvos smegenų MRT tyrimo algoritmą, nustatant vienodą pjūvių, sekų skaičių ir vokselio dydį.

4

2. SUMMARY

Author: Justinas Drūteika

Title: „Analysis of molecular markers and radiological characteristics of cerebral gliomas “.

Aim: To identify the correlations between molecular markers and radiological characteristics of cerebral glioblastomas.

Objectives: 1. To identify and select molecular markers and radiological characteristics of cerebral glioblastomas based on literature data. 2. To investigate and assess prognostic value of selected radiological features of cerebral glioblastomas in a selected group of patients. 3. To determine the correlations between investigated radiological characteristics of cerebral glioblastomas and selected molecular markers of cerebral glioblastomas in a selected group of patients.

Methods: Retrospective analysis of encoded clinical data of patients which were examined and treated in 2015 and 2016 in LSMUL KK Neurosurgery Department. GFAP, AREG genes were investigated in tumors samples in The Laboratory of Molecular Neuro-Oncology. MRI images were processed using standardized processing. Segmentation, 3D tumor models, volumes were computed with ITK-SNAP 3.8.0 beta version. Statistical analysis with SPSS 25.0 program. Results are statistically significant – p<0,05. Results: Statistical significance of central necrosis, contrast enhancement and edema was not determined in age and sex (p>0,05). Decreased volume of contrast enhancement positively correlated with survival time (p=0,003), ratio of contrast enhancement and total lesion, contrast enhancement and edema also had a significant impact on survival time in the subject group (p=0,024, p=0,015 accordingly). No statistically significant correlation of GFAP gene and radiological characteristics was found (p>0,05). Expression of AREG gene negatively correlated with the volume of total lesion (Rs=-0,543, p=0,037). Increased AREG gene expression increased the positive outcome of surviving more than 12 months and odds ratio was 2,8 and chances of survival was 1,6 times greater compared to decreased expression of this gene.

Conclusions: 1. GFAP, AREG genes are involved in the oncogenesis process of glioblastoma, which is characterized by central tumor necrosis, contrast enhancement and edema surrounding the tumor. 2. Survival time of the patients decreased if contrast enhancement volume increased (p=0,003 in the subject group) 3. Decreased expression of AREG gene correlated with increased volume of total lesion (Rs=-0,543, p=0,037).

Recommendation: To apply standardized algorithm for patients brain MRI scans, determining the number of sections, sequences and voxel size.

5

3. PADĖKA

Dėkoju mokslinio darbo vadovui, LSMU NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos darbuotojams bei konsultantams už pagalbą rašant „Galvos smegenų glioblastomų molekulinių žymenų ir radiologinių charakteristikų sąsajų analizė“ vientisųjų medicinos studijų baigiamąjį darbą.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

Mokslinis darbas nebuvo finansuojamas ar remiamas trečiųjų asmenų, todėl autoriui interesų konflikto nebuvo.

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Etikos leidimą (žr. Priedas 1) šiam moksliniam darbui atlikti išdavė LSMU Bioetikos centras. Leidimo nr. BEC-MF-265, išdavimo data 2018.02.23.

6

6. SANTRUMPOS

AREG – amfiregulinas (angl. Amphiregulin) BP – bendras pažeidimas

CaPTK – vėžio vaizdavimo fenomenų įrankių komplektas (angl. Cancer Imaging Phenomics Toolkit) CDK – nuo ciklinų priklausoma kinazė (angl. Cyclin-dependent kinases)

CNS – centrinė nervų sistema

CT – ribinis ciklas (angl. Cycle treshold)

DICOM – skaitmeninis vaizdavimas ir komunikacijos medicinoje (angl. Digital Imaging and Communications in Medicine)

DNR – deoksiribonukleorūgštis

EGF – epidermio augimo faktorius (angl. Epidermal growth factor)

EGFR – epidermio augimo faktoriaus receptorius (angl. Epidermal growth factor receptor) ERBB2 - erb-b2 receptoriaus tirozino kinazė 2 (angl. erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)

ESMO – Europos medicininės onkologijos draugija (angl. European Society for Medical Oncology) FLAIR – MRT pulsinės bangos T2 režimo seka su skysčių supresija (angl. Fluid-attenuated inversion recovery)

GBM – glioblastoma

GFAP – glialinis fibrilinis rūgštinis baltymas (angl. Glial fibrillary acidic protein) IDH – Izocitrato dehidrogenazė (angl. Isocitrate dehydrogenase)

KKND – kontrastą kaupianti naviko dalis

KPS – Karnovskio indeksas (angl. Karnofsky Performance Scale) LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno klinikos LSMU NI – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų institutas

MGMT – O6-metilguanino-metiltransferazė (angl. O-6-methylguanine-DNA methyltransferase) MRT – magnetinio rezonanso tyrimas

mRNA – matricinė ribonukleorūgštis (angl. Messenger ribonucleic acids)

NCCN – Nacionalinis vėžio centro tinkas (angl. National Comprehensive Cancer Network) NEF1 – neigiamas reguliavimo faktorius 1 (angl. Negative regulatory factor 1)

7 NIfTI – neuro-vaizdavimo informacinių technologijų iniciatyva (angl. Neuroimaging Informatics Technology Initiative )

Rs –Spirmeno koreliacijos koeficinetas p – reikšmingumo lygmuo

PCR – polimerazės grandininė reakcija (angl. Polymerase chain reaction)

PDGFRA – trombocitų augimo faktoriaus receptorius A (angl. Platelet-derived growth factor receptor A) PDW – protonų tankio svoris (angl. Proton density wheight)

PSO - Pasaulio sveikatos organizacija (PSO, angl. WHO – World Health Organization) p53 – baltymas p53

TMZ – temozolomidas

8

7. SĄVOKOS

Alkilinimas – cheminė reakcija, kurios metu vietoje vandenilio atomo į molekulę yra įterpiama alkilo grupė.

Angiogenezė – procesas, kurio metu formuojasi naujos kraujagyslės. Amplifikacija – geno arba DNR sekos pagausinimas.

Anaplazija – sutrikusi ląstelių diferenciacija. Apoptozė – užprogramuota ląstelių žūtis. De novo – pirminis.

Chemoterapija – gydymas cheminėmis medžiagomis. Edema – padidėjęs skysčio kaupimasis tarp audinių ląstelių.

Genomas – genų visuma viengubame ląstelės branduolio chromosomų rinkinyje.

Nekrozė – vietinės kraujotakos sutrikimo sukelta gyvo organizmo audinių ar organo ląstelių žūtis.

Metilinimas – cheminė reakcija, kurios metu vietoje vandenilio ar metalo atomo į molekulę yra įterpiama metilo grupė (-CH3).

Mitogenas – medžiaga, galinti sukelti ląstelių dalijimąsi (mitozę). Monoterapija – gydymas vienu vaistu.

Neuroglija – astrocitai, oligodendrocitai, mikroglija. Onkogenezė – navikų susidarymas ir vystymasis. Polimerazė – DNR sintezėje dalyvaujantis fermentas.

Pseudopalisadai –zona su padidėjusiu ląstelių kiekiu, kuri supa nekrozės sritį.

Radiogenominis – nurodo sąsajas tarp vėžio vaizdavimo funkcijų ir genų ekspresijos. Retinoblastoma – piktybinis tinklainės navikas.

Sekvenacija - procesas, kurio metu nustatoma nukleotidų seka gene. Transkripcija – RNR biosintezė, kurios metu nurašoma DNR grandinė. Vokselis – tūrinis elementas trimatėje erdvėje.

9

8. ĮVADAS

Pastaruoju dešimtmečiu radiogenominė analizė, ieškant sąsajų tarp radiologinių ir histopatologinių audinių savybių, padarė didžiulę pažangą. Mokslininkai neuroonkologijoje pasitelkdami įvairius radiogenomikos metodus siekia identifikuoti molekulinių žymenų ryšius, leidžiančius suprasti konkretaus naviko molekulinį patogeniškumą. Mūsų tiriamasis darbas skirtas glioblastomos, labiausiai paplitusio, greitai augančio centrinės nervų sistemos naviko [1], kai kurių molekulinių žymenų ir radiologinių charakteristikų sąsajų tyrimui. Glioblastoma, kaip ir visi neuroepiteliniai navikai, kitaip gliomos, formuojasi iš netaisyklingai proliferuojančių smegenų neuroglijos ląstelių [2]. Remiantis PSO nervų sistemos navikų klasifikacija, glioblastoma dėl ją sudarančių ląstelių atipijos, mitotinio aktyvumo, polinkio formuoti įvairaus dydžio nekrozės plotus, yra priskiriama aukšto piktybiškumo navikų grupei (PSO IV laipsnis) [3]. Šios savybės lemia, kad glioblastoma sergančių pacientų vidutinė išgyvenimo trukmė siekia 15 mėn. [4].

Nuolatinis technikos bei mokslo progresas tyrėjams leidžia giliau išsiaiškinti glioblastomos patogenezę lemiančius veiksnius. Mokslininkams pavyko tiksliau nustatyti sudėtingą glioblastomos genetinį profilį ir pagrindinius signalinius kelius, kurie dažniausiai yra „įjungiami“ šio naviko patogenezėje [5]. Nepaisant šių naujų duomenų ir įdiegtų pacientų diagnostikos bei gydymo metodų, šia liga sergančių pacientų vidutinė išgyvenimo trukmė lieka nedidelė [4,6]. Mokslininkai vieningai sutaria, kad siekiant nustatyti patikimus radiologinių požymių ir genetinių žymenų derinius, bei tinkamai pritaikyti mokslinių tyrimų rezultatus klinikinėje praktikoje, būtina atsižvelgti į heterogenišką šio naviko prigimtį, nulemtą genetinių ir epigenetinių veiksnių bei jų sąveikos [6].

Pasirinktos pacientų imties magnetinio rezonanso vaizdai buvo išanalizuoti pagal šio tyrimo literatūros apžvalgoje aprašomus kriterijus. Šiame tyrime analizuotos sąsajos tarp LSMU KK Neurochirurgijos klinikoje gydytų pacientų magnetinio rezonanso tyrimo metu nustatytų glioblastomas charakterizuojančių radiologinių požymių ir LSMU NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje tiriamų glioblastomų molekulinių žymenų.

Atrastos sąsajos leistų geriau suprasti glioblastomos onkogenezės procesus, padėtų tiksliau diagnozuoti šio naviko subtipus, paskirti individualų gydymą, vertinti gydymo atsaką bei prognozuoti pacientų išgyvenimo trukmę.

10

9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

DARBO TIKSLAS

Nustatyti galvos smegenų glioblastomų molekulinių žymenų ir radiologinių požymių sąsajas.

DARBO UŽDAVINIAI

1. Remiantis literatūros duomenimis įvertinti ir atrinkti galvos smegenų glioblastomas charakterizuojančius molekulinius žymenis ir radiologinius požymius.

2. Ištirti galvos smegenų glioblastomų pasirinktus radiologinius požymius bei jų prognozinę vertę tiriamųjų pacientų imtyje.

3. Nustatyti galvos smegenų glioblastomų ištirtų radiologinių požymių sąsajas su pasirinktais tyrimui glioblastomų molekuliniais žymenimis.

11

10. LITERATŪROS APŽVALGA

10.1 GALVOS SMEGENŲ GLIOBLASTOMŲ KLINIKINIAI YPATUMAI

Glioblastoma (GBM) yra dažniausias centrinės nervų sistemos (CNS) piktybinis navikas, sudarantis 45,2 proc. piktybinių pirminių smegenų ir CNS auglių, 54 proc. visų gliomų [1]. Lyginant skirtingus naviko histologinius tipus, pacientų amžių diagnozės metu, lytis, rases bei šalis gliomų paplitimo dažniai reikšmingai skiriasi [7]. Pirminių CNS navikų paplitimo dažnis Europoje nurodomas tarp 4,5-11,2 atvejų/100 000 vyrų ir 1,6-8,5 atvejų/100 000 moterų [8]. Išsivysčiusiose Europos ir Šiaurės Amerikos šalyse sergamumas glioblastomomis yra didesnis nei likusiose šalyse [4]. Glioblastomų paplitimo dažnis yra didesnis tarp vyrų nei tarp moterų [1,4]. Deja, nėra surinkta daug informacijos apie pastarųjų metų Lietuvos populiacijos situaciją. Ankstesniuose, Lietuvoje atliktuose, tyrimuose aprašytas 1,5 karto didesnis sergamumas moterų tarpe [6]. Gyd. V. Ašmonienė savo daktaro laipsnio disertacijoje iškėlė prielaidą, jog tokį sergamumo skirtumą tarp vyrų ir moterų lemia dabartinė demografinė situacija Lietuvoje [9]. Glioblastoma gali pasireikšti bet kurio amžiaus pacientui, tačiau dažniausiai nustatoma vyresniame amžiuje, o amžiaus pikas diagnozės nustatymo metu yra 55 – 65 metai [4,10,11]. Kai kurie autoriai glioblastoma sergančiųjų populiacijoje išskiria du amžiaus pikus: kuomet GBM pasireiškia apie 65 gyvenimo metus arba iki 45 metų amžiaus [12].

Klinikinė eiga

Simptomai, sergant piktybiniais CNS navikais, skirstomi į bendruosius (generalizuotus) ir specifinius (su lokalizacija susijusius). Bendriesiems simptomams priskiriami galvos skausmai, pykinimas, vėmimas, bendras silpnumas ir kt. Su lokalizacija susiję simptomai gali pasireikšti traukuliais, pusiausvyros sutrikimais, asmenybės ar elgesio pokyčiais, apsunkinta kalbos funkcija ir kt. Ligos atvejai, kuomet nėra aiškių ligos simptomų - ypač reti [13]. Remiantis A. Omuro ir bendraautorių tyrimų duomenimis, pacientams, sergantiems GBM, skirtingus ligos požymius ir simptomus nulemia trys mechanizmai: a) tiesioginio naviko poveikio sukelta nekrozė smegenų audinyje: 40-60 proc. tokių atvejų pacientams nustatomi židininiai neurologiniai simptomai [14]; b) padidėjęs vidinis galvospūdis, kuris yra tiesioginė naviko dydžio padidėjimo ir padidėjusios edemos aplink naviką pasekmė: dėl šios priežasties atsiradęs galvos skausmas, būdingas 30-50 proc. GBM pacientų [15]; c) priklausomai nuo naviko vietos

12 20-40 proc. atvejų gali pasireikšti traukuliai [14,15]. Dažniausiai galvos skausmas yra vienpusis, laipsniškai stiprėjantis ligai progresuojant [14]. Galvos skausmas yra lydimas pykinimo ir /ar vėmimo beveik 40 proc. ligos atvejų.

Glioblastomų klasifikacija ir potipiai

Skirtingi navikų išsivystymo patogenetiniai mechanizmai bei ligos eiga leidžia išskirti du skirtingus GBM potipius [16]. Apie 90-95 proc. atvejų GBM yra pirminės (išsivysčiusios de novo) [3,17,18], dažniausiai diagnozuojamos vyresnio amžiaus pacientams. Tuo tarpu jaunesnių nei 45 metų [12] pacientų grupėse labiau vyrauja antrinės GBM, kurios išsivysto iš žemo laipsnio (PSO I-III laipsnio) difuzinių ar anaplastinių astrocitomų [16]. Teigiama, kad per 5-10 metų nuo diagnozės nustatymo 70 proc. PSO II-III laipsnio astrocitomų progresuoja iki glioblastomos [12].

PSO 2016 metais pristatė naują centrinės nervų sistemos navikų klasifikacijos sistemą [3]. Šioje klasifikacijoje glioblastoma yra priskiriama naujai išskirtai difuzinių gliomų kategorijai. Tai vienas esminių skirtumų, lyginant naująją klasifikacijos sistemą su senąja jos versija. Be to, PSO ekspertai rekomenduoja atsižvelgti į navikų genotipą bei fenotipą, o glioblastomas skirstyti pagal geno IDH1 ar IDH2, koduojančio fermentą izocitrato dehidrogenazę, mutacijos buvimą (IDH-mutant) ir mutacijos nebuvimą (IDH-wildtype). Pagal PSO, IDH genų mutacijos neturintys pacientai dažniausiai priskiriami kliniškai apibūdintam de novo potipiui dėl panašių charakteristikų, pavyzdžíui: 90 proc. pacientų, sergančių šia glioblastoma, yra vyresnio amžiaus (>55 metai), vyriškos lyties [3]. IDH geno mutaciją turintys pacientai priskiriami antrinėms GBM. Šiai grupei būdingas jaunesnis pacientų amžius, o GBM vystosi iš anksčiau minėtų PSO I-III laipsnio astrocitomų.

Gydymo taktika

Naujai diagnozuotų glioblastomų gydymui reikalingas daugiadisciplininis požiūris [19], todėl šiuo metu pagrindiniu GBM gydymo būdu laikoma naviko chirurginio šalinimo derinimas su pooperaciniu spinduliniu gydymu bei chemoterapija [20]. Remiantis JAV Nacionalinio vėžio centro tinklo (angl. National Comprehensive Cancer Network (NCCN), 2016) GBM gydymo gairėmis dabartinę standartinę terapiją sudaro maksimalios apimties saugi chirurginė rezekcija, pooperacinis spindulinis gydymas derinyje su alkilinančiu preparatu temozolomidu (vadinamasis chemospindulinis gydymas) arba spindulinis gydymas ir po jo skiriama papildoma chemoterapija su temozolomidu [21]. Chirurginės rezekcijos tikslas yra kiek įmanoma radikalesnis saugus naviko pašalinimas. Dėl naviko polinkio

13 infiltratyviai augti į aplinkinius sveikus smegenų audinius visiška naviko rezekcija negalima [17]. Aplinkiniuose sveikai atrodančiuose smegenų audiniuose likusios infiltracinės naviko ląstelės lemia ligos progresavimą ir pasikartojimą [22].

Spindulinis gydymas, dėl savo teigiamo poveikio pacientų išgyvenimo trukmei, yra aukšto piktybiškumo laipsnio gliomų neatsiejama gydymo dalis [23,24]. Taikant “involved-field” metodą, spinduliuotė paveikia tik navikinį audinį ir 2-3 centimetrus aplink esančių audinių, todėl neurotoksinis spindulių poveikis nėra didelis [25]. Guler Yavas ir kiti. autoriai apžvelgė keletą klinikinių tyrimų ir nustatė, kad „optimalus“ spindulinio gydymo tūris išlieka diskutuotinas ir varijuoja tarp skirtingų bendradarbiaujančių institucijų” [23]. Šiuolaikinės standartinės spindulinės terapijos, taikomos sergantiems aukšto piktybiškumo laipsnio gliomomis, suminė dozė yra 60 Gy, išdalinta į 30-33 frakcijas [14,26]. Klinikiniais tyrimais įrodyta, kad dozė didesnė nei 60 Gy neparodė jokio teigiamo poveikio pacientų išgyvenimui [23].

Papildomas pooperacinis gydymas temozolomidu derinyje su spinduliniu gydymu, kaip jau minėta anksčiau, yra viena iš gliomų standartinio gydymo dalių [21]. ESMO (angl. European Society for Medical Oncology) 2014 m. gairėse šis chemoterapijos ir spindulinio gydymo derinys laikomas „auksiniu standartu“ (I, A lygio rekomendacija) [27]. Temozolomidas (TMZ) - XX a. pab. sukurtas peroraliai vartojamas alkilinantis preparatas, kuris, veikdamas navikinių ląstelių DNR, sukelia jų apoptozę ir navikinio audinio žūtį. TMZ skiriamas derinio fazės metu kombinacijoje su radioaktyviais spinduliais ir monoterapijos fazės metu, kuomet gydoma tik šiuo chemopreparatu [17,28]. Stupp ir kiti autoriai keletą metų tyrė kombinuoto gydymo naudą pacientų išgyvenimo trukmei ir nustatė, kad pacientų, jaunesnių nei 70 metų, grupėje ženkliai padidėjo 2 ir 5 metų išgyvenimo tikimybė [29,30]. Duomenų analizė atskleidė, kad pacientų, kuriems buvo taikytas tik spindulinis gydymas, vidutinė išgyvenimo trukmė siekė 12,1 mėn., o tiems, kurie gavo spinduliuotės ir chemoterapijos kombinaciją – 14,6 mėn. Atitinkamai padidėjo ir 2 metų išgyvenimo tikimybė (10,4 proc. 26,5 proc.) [29]. Be to, įrodyta, kad MGMT geno mutaciją, metilintą MGMT geną, turintys pacientai, kuriems taikytas kombinuotas gydymas, turi geresnę 2 m. išgyvenimo prognozę (48,9 proc.) lyginant su pacientais, kurie šios mutacijos neturėjo (14,8 proc.) [30].

Veiksniai, lemiantys išgyvenimo prognozę

Dėl vienų iš nepalankiausių išeičių tarp visų CNS navikų, mokslininkai jau kelis dešimtmečius tyrinėja pacientų, sergančių gliomomis, išgyvenimo prognozę lemiančius veiksnius. Nepaisant gydymo, glioblastoma sergančių pacientų prognozė bloga – vidutinė išgyvenimo trukmė siekia 15 mėn. [4].

14 Skiriutės ir bendraautorių atliktame tyrime tirtos populiacijos vidutinė išgyvenimo trukmė siekė 14,6 mėn. [6]. Pastaruoju dešimtmečiu atlikta nemažai tyrimų, kuriose statistiškai patikimai įrodyti veiksniai, galintys nulemti palankesnę prognozę. Daugelis autorių sutinka, kad reikšmingą įtaką daro jaunesnis amžius, aukštas Karnovskio skalės indeksas (angl. Karnofsky Performance Scale (KPS)), operacijos apimtis (visas navikas pašalintas ar dalis), spindulinio gydymo suminė dozė, spindulinės ir chemoterapijos derinys [31–34]. Kumar ir kiti autoriai [31] nustatė, kad pacientų, jaunesnių nei 50 m. (KPS 90-100) vidutinė išgyvenimo trukmė siekė 8,87 mėn., o vyresnių nei 50 m. grupėje – 7,17 mėn. (KPS < 90) (P=0.028). Tyrimai įrodė, kad didinant radioaktyvių spindulių dozes iki 60 Gy, ilgėja pacientų išgyvenimo trukmė [31,32,35], o viršijančios 60 Gy dozės, kaip jau minėta anksčiau, jokio papildomo efekto nesuteikė [23].

10.1 BIOLOGINĖS YAPATYBĖS

Glioblastoma pagal savo onkogenezę, kaip jau minėta anksčiau, skirstoma į pirminę, de novo, sudarančią apie 95 proc. visų GBM atvejų, ir antrinę, išsivystančią iš mažesnio diferenciacijos laipsnio astrocitomų [12,16]. Pirmuoju atveju GBM dažniau pasireiškia vyresniame amžiuje, antruoju – jaunesniame nei 45 metų amžiuje [3,12]. Nors 2016 m. PSO išleista naujoji CNS klasifikacija buvo papildyta genetiniais navikų genezės ar molekuliniais žymenimis, histologinis diagnostinių kriterijų pagrindas išliko toks pat [3]. Histopatologinis ištyrimas laikomas „auksiniu standartu“ nustatant gliomos tipą ir laipsnį [36]. Tai ypač svarbu antrinės glioblastomos diagnozei nustatyti bei vertinant mažiau piktybinės astrocitomos (PSO II-III laipsnis) progresavimą iki glioblastomos [37]. Šio naviko, kaip ir daugelio CNS navikų, diagnozei nustatyti iš esmės reikalingi keturi pagrindiniai griežtai apibrėžti patologiniai histologiniai kriterijai: ląstelių branduolių atipija, mitotinis aktyvumas, kraujagyslių endotelio proliferacija, įvairios formos ir dydžio nekrozės plotai [36,38,39]. Rong ir kiti [40] apžvelgė pseudopalisadų (vieno iš patognominių GBM požymių) mechanizmus, susijusius su kraujagyslių patologija, hipoksija ir angiogeneze. Šie grupėmis išsidėstę prailgėję ląstelių branduoliai, susiformuojantys dėl išorinių veiksnių, pavyzdžiui, intravaskulinės trombozės ir nekrozės, leidžia naviką priskirti prie aukšto piktybiškumo navikų grupės (PSO IV laipsnis) ir atskirti jį nuo žemesnio laipsnio astrocitomų [41].

15 Glioblastomos onkogenezė

Glioblastomos heterogeniška prigimtis yra nulemta įvairių genetinių pokyčių, kurie paveikia genus, atsakingus už ląstelių augimą, apoptozę, invaziją ar angiogenezę [6]. Kitaip tariant, genetiniai ir epigenetiniai veiksniai ar jų bendra sąveika gali nulemti ligos progresavimą. Įgyvendinant „Cancer Genome Atlas“ projektą sekvenuojant kelis šimtus įvairiausių genų, buvo nustatytas sudėtingas GBM genetinis profilis ir trys pagrindiniai signaliniai keliai, kurie dažniausiai yra „įjungiami“ GBM patogenezėje (naviko baltymo p53 (p53) kelias, receptoriaus tirozinkinazės / Ras / fosfoinositido 3-kinzės signalizavimo kelias ir retinoblastomos kelias) [5]. Yra pateikta klasifikacija, kurioje išskiriami keturi skirtingi GBM subtipai [42]:

- Klasikinis subtipas susijęs su išreikšta epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) amplifikacija ir EGFRvIII ekspresija.

- Proneuralinis – jam būdinga iš trombocitų gauto augimo faktoriaus amplifikacija ir šis tipas yra susijęs su p53, izocitrato dehidrogenazės (IDH) 1 ir 2 bei nuo ciklinų priklausomos kinazės (CDK) 6 ir 4, taip pat PDGFRA geno mutacijomis.

- Neuralinis – susijęs su tokiais žymenimis, kaip NEF1 ar padidėjusiais ERBB2 lygiais. - Mezenchiminis - susijęs su PTEN ir CDK inhibitoriaus 2a praradimu.

Verhaak ir bendraautoriai nustatė, kad įprastų smegenų ląstelių tipų genų parašai rodo stiprų ryšį tarp potipių ir skirtingų nervinių ląstelių linijų. Be to, autoriai suformulavo potencialius kriterijus, vienijančius transkriptinius ir genominius žymenis, tinkamus GBM molekulių skirstymui į grupes.

Kasmet aprašoma vis daugiau tyrimų, kuriuose tyrėjai tiria ir nustato pacientų, sergančių glioblastomomis, MR vaizduose nustatomų žymenų sąsajas su molekuliniais genetiniais mechanizmais. MGMT ir IDH yra labiausiai ištirti genai, dalyvaujantys glioblastomos patogenezėje [6,9,42,43]. Siekiant paaiškinti įvairius mechanizmus, nesusijusius su minėtais genais, tyrėjai ieško naujų molekulinių žymenų, galinčių turėti įtakos glioblastomų onkogenezei. Vieni tokių yra GFAP bei AREG genai:

GFAP. Vienas dažniausiai naudojamų diagnostinių žymenų neuroonkologijoje [44,45]. Tai 50 kDa skaidulinis intracitoplazminis baltymas, labiausiai specifiškas CNS astrocitinės kilmės ląstelių žymuo, įeinantis į glijos ląstelių skeleto sudėtį. GFAP genas gali būti išreikštas įvairiomis izoformomis, kurios skiriasi savo struktūra ir funkcijomis. GFAP ekspresija atspindi astrocitų brandumą, o jos aktyvumas turi didelį poveikį įvairioms šių ląstelių savybėms, pvz., morfologijai, augimui ir ląstelių dalijimuisi [46]. Julia Tichy ir bendraautorių [47] 2016 m. atliktas prospektyvinis tyrimas atskleidė, kad serumo GFAP raiškos lygiai labiausiai koreliuoja su GBM tūriu ir histopatologinėmis šio naviko

16 charakteristikomis. Manoma, kad mažėjantis baltymo kiekis gali būti nulemtas navikinio audinio ląstelių diferenciacijos [48]. Sereika ir kiti [49] 2018 m. tirdami skirtingo piktybiškumo laipsnio astrocitinių navikų, tarp jų ir IV laipsnio astrocitomų (glioblastomų), biopsinės medžiagos mėginius, nustatė, kad GFAP mRNR ir baltymų ekspresija mažėja didėjant astrocitomos laipsniui (p <0,05). Tuo tarpu Jung CS. ir kolegos [50], remdamiesi daugumos glijos ląstelių navikų, įskaitant ir glioblastomų, savybe produkuoti GFAP, nustatė, jog šio baltymo lygio kitimas serume gali atspindėti naviko susidarymo ar išplitimo procesus, todėl serumo GFAP gali būti kaip vienas iš GBM diagnostinių biologinių žymenų.

AREG. Šio geno koduojamas membranos baltymas, priklausantis epidermio augimo faktoriaus (angl. EGF) baltymų šeimai, veikia kaip mitogenas, skatinantis ląstelių augimą ir slopinantis tam tikrų agresyvių karcinomos ląstelių linijų vystymąsi [51,52]. Vėžio atveju šis baltymas apibūdinamas kaip onkogenas ir remiantis klinikiniais duomenimis, gali būti prognostinis veiksnys ne smulkių ląstelių plaučio vėžio atveju [53]. Moksliniais tyrimais atskleista, kad AREG metilinimas yra stipriai susijęs su paciento amžiumi ir blogesnėmis išeitimis tarp glioblastoma sergančių pacientų [54], tačiau išsamesnės informacijos apie AREG vaidmenį šio tipo navikų patogenezei nėra daug. Steponaitis savo disertacijoje nurodo, kad AREG baltymo ekspresijos lygiai pacientų su GBM diagnoze populiacijoje yra statistiškai reikšmingai mažesni, lyginant pacientus su II ir III laipsnio astrocitomos diagnoze, o išgyvenimo analizė parodė ilgesnę bendrą pacientų išgyvenimo trukmę tarp pacientų su aukštesniais AREG baltymo lygiais (Log-Rank test, χ2= 7.898, df=1, p=0.005) [55].

2^-ddCT metodas, kitaip dar delta-delta-Ct ar ddCt, – matematinis metodas, skirtas analizuoti kiekybinių realaus laiko polimerazės grandininių reakcijų duomenis (angl. quantitative real time PCR) [56]. Šiuo metodu galima nustatyti santykinius kiekybinius genų ekspresijos pokyčius [57]. Taikant ribinių ciklų (CT – ribinis fluorescencijos lygis) informaciją, programinės įrangos apskaičiuoja genų ekspresijos pokyčius tiriamajame mėginyje – taikinyje ir mėginyje - etalone, naudojant etaloninį geną kaip “standartą“ [58]. Rezultatai išreiškiami skaitinėmis reikšmėmis, kurių teigiama išraiška nurodo sustiprintą (angl. Up-regulated) geno raišką, o neigiama – prislopintą (angl. Down-regulated) geno raišką.

10.3 RADIOLOGINĖS GLIOBLASTOMŲ YPATYBĖS

Kadangi smegenų auglių klinikiniai simptomai dažniausiai nėra specifiniai, smegenų naviko diagnozavimas remiasi radiologiniais tyrimais. Neuroonkologijoje radiologiniai tyrimai užima ne tik

17 svarbų vaidmenį nustatant centrinės nervų sistemos auglio preliminarią diagnozę, bet ir vertinant prognozę ar gydymo efektyvumą [59]. Glioblastoma bei kiti CNS navikai iš pradžių gali būti aptikti atlikus kompiuterinės tomografijos tyrimą, tačiau magnetinio rezonanso tyrimas (MRT) suteikia daugiau informacijos [60]. Įprastiniai MRT režimai, įskaitant T1 režimo vaizdus prieš ir po kontrastinės medžiagos panaudojimo, rodo tikslią naviko vietą ir naviko sritis, nekaupiančias kontrasto, dažniausiai susijusias su naviko nekroze, kuri vėliau patvirtinama histologiškai [43].

Jau daugiau nei prieš du dešimtmečius buvo aprašyti radiologiniai požymiai, leidžiantys ne tik daryti prielaidas apie ligos piktybiškumą, bet ir vertinti jos prognozę [61,62]. Naviko nekrozės kiekis turėjo statistiškai stipriausią prognostinę vertę (p <0.001) lyginant su kontrasto kaupimo intensyvumu bei aplinkinių audinių edemos dydžiu [61]. Be to, mažesnis naviko nekrozės tūris (<35 proc. naviko masės) lėmė ilgesnę pacientų išgyvenimo trukmę [62]. Tačiau pastarojo dešimtmečio tyrimai privertė suabejoti naviko nekrozės tūrio reikšme prognozuojant pacientų išgyvenimo trukmę. Pope WB ir kiti autoriai nustatė, kad tik kontrasto nekaupianti naviko dalis, edema, daugiažidiniškumas yra statistiškai patikimi MRT vaizdų prognostiniai požymiai sergančiųjų GBM populiacijoje [63]. Be to, G. Hallaert ir bendraautorių retrospektyvinis tyrimas atskleidė, kad naudojant pusiau automatizuotą tūrinę analizę, tarp nekrozės tūrio ir glioblastomos diagnozės bei mirtingumo rizikos nėra jokios koreliacijos (p=0.484) [64].

Macyszyn savo tyrime 2015 m. [65] iškėlė hipotezę, kad bendra pacientų išgyvenimo trukmė ir molekuliniai GBM subtipai susiję su bendru MRT vaizdo fenotipu. Rezultatai atskleidė, kad tyrėjams pavyko nustatyti GBM subtipus 76 proc. tikslumu, o šiuos subtipus nulemiantys genominiai pokyčiai gali būti įvertinami naudojant MRT duomenis. Tyrėjai rėmėsi Itakura ir bendraautorių [66] aprašyta GBM kiekybinių radiologinių požymių klasifikacija, atspindinčia genetinius tipų mechanizmus bei tipų prognostinę vertę. Ši klasifikacija sudaryta iš trijų GBM radiolognių tipų (pre-multifokalinis, sferinis ir “žiedu” kaupiantis kontrastą), kurie tarpusavyje labiausiai skyrėsi navikinės masės tūriu.

MRT vaizdų paruošimas

Dabartinėje klinikinėje praktikoje medicininio vaizdavimo būdai atlieka labai svarbų vaidmenį vertinant pacientų, sergančių smegenų augliais, būklę ir turi reikšmingą įtaką priimant su gydymu susijusius sprendimus. Kaip jau minėta, skirtingų MRT sekų vaizdai yra naudojami diagnozuojant ir išskiriant navikų rūšis [60]. Šios sekos apima T1 svorio (T1w), T1 svorio su kontrastu (T1wc), T2 svoriu MRT (T2w), protonų tankio svorio (PDW), FLAIR ir kt. MRT vaizdus. Deja MRT vaizdai nėra paruošti iš karto tiesioginiam naudojimui, nes juose gali būti taip vadinamų triukšmų, ne smegenų audinio (akys,

18 raumenys, riebalai ir pan.) signalo intensyvumo pokyčių ir kt. [67]. MRT vaizdų išankstinis apdorojimas yra tiesiogiai susijęs su geresniais segmentacijos rezultatais. Toks vaizdų paruošimas yra skirtas minėtų priežasčių pašalinimui [68]. Pavyzdžiui, kaukolės kaulų kartu su skalpo ar smegenis dengiančių audinių sluoksnių vaizdo signalų nuėmimas (angl. Skull – stripping) sumažina klaidų tikimybę atskiriant sveikus ir pažeistus audinius [69]. Išankstinio apdorojimo metu multimodaliniai MRT vaizdai yra registruojami vienoje erdvėje dažniausiai naudojant linijinį transformacijos modelį, kurio abipusio informacijos panašumo metrika ir pakartotine atranka siekiama užtikrinti, kad visais būdais būtų laikomasi vokselio į vokselį atitikimo [70].

MRT vaizdų segmentacija:

Smegenų navikų segmentacija yra navikinių patologinių audinių, tokių kaip mitotiškai aktyvių ląstelių, nekrozės plotų, edemos signalų išskyrimas iš normalių smegenų audinių signalų (smegenų pilkosios bei baltosios medžiagos arba smegenų skysčio) [71]. Navikų segmentacijos metodai gali būti klasifikuojami į įvairias kategorijas pagal skirtingus principus, tačiau klinikinėje praktikoje atsižvelgiant į tyrėjo sąveikos su programa laipsnį išskiriamos trys pagrindinės vaizdų segmentacijos rūšys [72–74]: - Rankinė segmentacija – tyrėjas pats braižo navikinio audinio ribas ir pažymi anatominių struktūrų regionus skirtingomis etiketėmis [72]. Dėl patirties stokos, laiko sąnaudų šis metodas gali lemti ne vienodus rezultatus tarp skirtingų ekspertų, ar to paties eksperto.

- Pusiau automatinė segmentacija – tyrėjas privalo įvesti norimus parametrus ir yra atsakingas už vaizdinės informacijos analizę ir programos apskaičiavimų įvertinimą [73]. Programinės įrangos skaičiavimas yra skirtas smegenų auglių segmentavimo algoritmų realizavimui.

- Pilnai automatinė segmentacija – kompiuterinė programa atlieka naviko segmentaciją be tyrėjo įsikišimo.

Nors geresni rezultatai gaunami naudojant pusiau automatinę ir pilnai automatinę vaizdų segmentaciją, šie metodai kelia didelių iššūkių, nes dažniausiai sunku aiškiai apibrėžti naviko ribas. Tai susiję su netaisyklingomis smegenų auglio ribomis MRT vaizduose ir dalinio tūrio poveikiu (angl. partial volume effect) smegenų navikų vaizdams.

Įvertinus įvairius tyrimus, kuriuose aprašomos genetinių žymenų ir radiologinių vaizdų požymių koreliacijos, autoriai vieningai sutaria, kad patikimų radiologinių požymių ir genetinių žymenų derinių, kurie būtų 100 proc. pritaikomi klinikinėje praktikoje, šiuo metu nėra nustatyta. Todėl tolimesni tyrimai radiogenomikos srityje, siekiant rasti kuo reikšmingesnius požymius ar jų derinius, yra ypač svarbūs ir aktualūs.

19

11. TYRIMO METODIKA

Šis retrospektyvinis atvejo – kontrolės tyrimas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų (LSMUL KK) Neurochirurgijos klinikoje panaudojant kai kuriuos LSMU Neuromokslų instituto (NI) Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos bendradarbiavimo tikslais pateiktus duomenis.

Kauno regioninio biomedicininių tyrimų Etikos komitetas suteikė leidimą (leidimo nr. BEC-MF-265) atlikti tyrimą. Atlikta mokslinės literatūros, pacientų medicininės dokumentacijos, radiologinių vaizdų bei užkoduotos navikų molekulinių genetinių žymenų informacijos analizė.

Glioblastomos molekulinių genetinių žymenų ir radiologinių charakteristikų atranka tolimesnei analizei

Siekiant atrinkti molekulinius genetinius žymenis tolimesnei analizei, vadovautasi dviem kriterijais: 1) literatūros duomenimis įrodytas žymens dalyvavimas glioblastomos onkogenezės procesuose; 2) yra duomenys, jog pacientų navikiniame audinyje žymuo mūsų tyrimo laikotarpiu (2015-2016 m.) ištirtas NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje. Pasirenkant šio tipo naviką charakterizuojančius radiologinius požymius, atlikta mokslinės literatūros, kuri yra publikuojama įvairiose LSMU prenumeruojamose duomenų bazėse, analizė.

Imtis

Analizuoti atvejai pacientų, operuotų 2015 – 2016 m. LSMUL KK Neurochirurgijos klinikoje, kuriems diagnozuota galvos smegenų glioma ir naviko audinys buvo tirtas LSMU NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje.

Į šio tyrimo imtį įtraukti pacientai, pagal nustatytus tyrimo protokole kriterijus:

a. Pacientai ≥ 18 m. amžiaus 2015 – 2016 m. tirti ir gydyti LSMUL KK Neurochirurgijos klinikoje.

b. LSMUL KK Patologinės anatomijos klinikoje histologiškai nustatyta glioblastomos diagnozė pagal PSO Centrinės nervų sistemos navikų gairėse pateiktus kriterijus; c. Prieinami tyrimui pasirinkti GFAP ir AREG molekulinių žymenų duomenys, gauti

20 d. LSMUL KK Radiologijos klinikos duomenų sistemoje yra išsaugoti daugiafunkciniai

priešoperaciniai MRT vaizdai;

Tiriamųjų pacientų amžius – pacientų amžius metais operacijos dieną. Išgyvenimo trukme laikoma pacientų išgyvenimo trukmė mėnesiais, apskaičiuota nuo operacijos datos iki paciento mirties datos.

Tiriamosios imties pacientų demografiniai ir klinikiniai duomenys surinkti atliekant retrospektyvinę LSMUL KK Neurochirurgijos klinikos archyve saugomų ligos istorijų analizę. Surinkti šie pacientų duomenys: lytis, gimimo data, glioblastomos lokalizacija, naviko židinių skaičius galvos smegenyse, nustatyti MRT vaizduose, operacijos data. Duomenys susieti su užkoduota molekuline genetine informacija bei pacientų mirties datomis, gautomis iš LSMU NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos duomenų bazės. Į imtį neįtraukti pacientai, kuriems buvo nustatytas naviko recidyvas.

Molekulinė genetinė informacija

Tyrime panaudota pacientų, sergančių glioblastoma ir operuotų 2015 – 2016 m.. LSMUL KK Neurochirurgijos klinikoje, navikų molekulinė genetinė informacija, kuri gauta ištyrus navikinio audinio mėginius, paimtus operacijų metu. LSMU NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos moksliniai darbuotojai buvo atlikę genetinės medžiagos išskyrimo ir indentifikavimo etapus bei pateikė visą šiam tyrimui reikalingą informaciją.

Magnetinis branduolių rezonanso tyrimas

Tiriamosios imties pacientų galvos smegenų magnetinio rezonanso vaizdai gauti iš LSMUL KK Radiologijos klinikos duomenų bazės ir susieti su demografiniais ir klinikiniais duomenimis bei užkoduota molekuline genetine informacija. Tyrimui naudoti prieš operaciją 1,5T galingumo Siemens MAGNETOM Aera MR aparatu atlikti vaizdai.

Naudojantis kompiuterine programa RadiAnt DICOM Viewer (versija 4.6.9, https://www.radiantviewer.com), skirtą medicininių vaizdų peržiūrai ir apdorojimui, analizuotos tiriamosios pacientų imties MRT vaizdų sekos, kokybiniai ir kiekybiniai požymiai. Įvertinti tyrimui svarbiausi parametrai: naviko anatominė lokalizacija, naviko židinių skaičius, centrinė naviko nekrozė, kontrastą kaupianti naviko dalis, aplink naviką esančios edemos buvimas, navikinis židinys, bendras pažeidimo tūris.

21 Į tyrimo imtį neįtraukti pacientai, kurių MRT vaizdų nebuvo LSMUL KK Radiologijos klinikos vaizdų archyve arba MRT vaizdų sekų kiekis buvo nepakankamas ir negalėjo būti naudojamas 3D modelių sukūrimui vokselinės morfometrijos principu.

MRT vaizdų paruošimas

Tiriamosios imties pacientų galvos smegenų magnetinio rezonanso vaizdai skyrėsi tūrinio elemento – vokselio – matmenimis (raiška) trimatėje erdvėje tarp atskirų to paties paciento MRT vaizdų sekų ir tarp skirtingų pacientų. Siekiant gauti kuo patikimesnius tyrimo rezultatus, visiems antrame priede. tiriamosios imties pacientų galvos smegenų MRT vaizdų režimams buvo pritaikytas standartizuotas paruošimas. Pirmiausia, naudojantis statistinės analizės programine įranga SMP12 (https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/) MRT DICOM formate esantys vaizdai buvo konvertuoti į NIfTI formatą. Toliau, pasitelkiant vėžio radiologinių vaizdų analizei skirtą programinę įrangą CaPTK (http://captk.projects.nitrc.org/), atliktas aukšto dažnio intensyvumo skirtumų (triukšmų) šalinimas (angl. denoise) taikant algoritmą „SUSAN“. Anksčiau minėtos programinės įrangos SMP12 pagalba tiriamiesiems vaizdams pritaikytas standartinis vokselio dydis (1.0 x 1.0 x 1.0 mm). MRT vaizdų paruošimo etapas užbaigtas suliejant (angl. coregistration ar image fusion) pasirinktų režimų vaizdus vienoje koordinačių plokštumoje.

Trimačiai modeliai – kūrimas ir analizė pusiau automatinės segmentacijos metodu

Tiriamosios pacientų imties magnetinio rezonanso vaizdai analizuoti naudojantis kompiuterine pusiau automatinės segmentacijos programa ITK-SNAP 3.8.0-beta versija (http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php). Vokselinės morfometrijos principu sukurti navikų centrinės nekrozės, kontrastą kaupiančios naviko dalies, aplink naviką esančios edemos trimačiai modeliai. Naviko zona T1 režime po kontrasto suleidimo buvo matoma kaip padidinto tankio sritis ir laikoma kontrastą kaupiančia naviko dalimi. Tame pačiame režime sumažinto tankio sritis, apribota kontrastinės medžiagos kaupimo, buvo laikoma centrine naviko nekroze. Aplink naviką esanti edema T2 FLAIR režime buvo matoma kaip hiperintensinė sveiko smegenų audinio atžvilgiu sritis.

Po vaizdų paruošimo etapo pacientų galvos smegenų MRT vaizdai įkelti į ITK-SNAP programą. Pasirinktą dominantį regioną sudarė trys sritys: navikinės nekrozės, kontrasto kaupimo ir aplink navikinį audinį esančios edemos užimami plotai. Kiekvienai sričiai buvo priskirta atitinkamas pavadinimas (angl. label) ir ją žyminti spalva. Segmentacija atlikta vadovaujantis mokslinėje literatūroje nurodytais

22 protokolais [75,76]. Rankiniu būdu buvo pažymėtos pasirinkto regiono sritys, kurios automatiškai programos pagalba pagal vokselių raišką buvo įtrauktos į trimačius kiekvienos srities modelius. Siekiant suformuoti galutinius aktyvius kontūrus, segmentacijos etapas baigtas specialių aktyvių analizei skirtų zonų (angl. bubbles) pažymėjimu ant dominančių sričių. Trečiame priede pateikiami ITK-SNAP programa sukurto naviko 3D modelio pavyzdys. Programos pagalba buvo automatiškai apskaičiuoti centrinės naviko nekrozės (nekrozė tūris), kontrastą kaupiančios naviko dalies (KKND) bei aplink naviką esančios edemos tūriai. Be to, panaudojant šiuos duomenis su Microsoft Office Excel (2013) programa apskaičiuoti papildomi dydžiai – navikinio židinio (židinio tūris) ir bendro pažeidimo (BP) tūris, nekrozės/kontrastą kaupiančios dalies, nekrozės/edemos, KKND/edemos, židinio/edemos, nekrozės/židinio, KKND/židinio, nekrozės/BP, KKND/BP, židinio/BP, edemos/BP tūrių santykiai.

Statistinė analizė

Duomenų rinkimas ir įvertinimas atliktas naudojant statistinės analizės IBM SPSS 25.0 programą (Armonakas, JAV). Tirtoje imtyje kiekybinių dydžių reikšmės nebuvo pasiskirsčiusios pagal Gauso skirstinį (angl. Gaussian distribution), todėl duomenys aprašyti pateikiant medianą, medianos minimalią bei maksimalią vertę. Neparametriniai testai buvo naudoti dydžių reikšmėms palyginti.

Demografinėms tirtos imties ypatybėms apibūdinti naudotas Fišerio tikslusis testas (angl. Fisher’s Exact test).

Skaitiniai kintamieji aprašyti nurodant medianas, medianų minimalią bei maksimalią vertes. Kadangi tirtų genų grupės buvo nedidelės, siekiant palyginti šiuos kriterijus tarp dviejų nepriklausomų kintamųjų grupių, pritaikytas neparametrinis Mano-Vitnio kriterijus (angl. Mann-Whitney U Test). Skirtumų analizei tarp naviko tūrių, naviko tūrių santykių skirtingose lyties, amžiaus grupėse taikyta Kruskal-Valio testas (angl. Kruskal-Wallis test) bei Mano-Vitnio kriterijus.

Analizuojant tirtų genų raiškos sąsajas su naviko tūriais bei naviko tūrių santykiais, taikytas Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas (angl. Spearman’s Rho coefficient).

Nagrinėjant pacientų išgyvenimo trukmę tirtų genų raiškos grupėse analizuoti šansų santykiai, bei tikimybės.

Šiame tyrime visais atvejais pasirinktas statistinio reikšmingumo lygmuo α=0,05. Kriterijų statistinis reikšmingumas stebėtų skirtumų ir priklausomybių atveju apskaičiuotas, kai p<0,05.

23

12. REZULTATAI

12.1 Molekulinių genetinių žymenų ir radiologinių požymių paieška

Siekiant įvykdyti pirmąjį tyrimo uždavinį, atlikome lietuvių bei užsienio autorių mokslinės literatūros analizę, kuri buvo prieinama LSMU prenumeruojamose duomenų bazėse. Pastebėjome, kad GFAP ir AREG genų pokyčių nulemta baltymų ekspresija gali būti susijusi su gliomose vykstančiais onkogenezės procesais bei būti vienais iš prognostinių žymenų glioblastoma sergančių pacientų populiacijoje. Yra įrodyta, kad glioblastomos fenotipas gali būti nulemtas genotipo pokyčių, todėl remdamiesi moksline literatūra identifikavome navikų žymenų kokybinius (naviko lokalizacija, augimo tipas – židiniškumas) ir kiekybinius parametrus (centrinė naviko nekrozė, kontrasto kaupimas, edema). Sąsajų paieška tarp radiologinių navikų savybių ir molekulinių genetinių žymenų atskleidė, kad centrinė naviko nekrozė, kontrastą kaupianti naviko dalis bei edema skirtingų genų atvejais gali būti laikomi statistiškai patikimais kriterijais, identifikuojant savitus glioblastomų subtipus. Šiuo tyrimu siekėme nustatyti sąsajas tarp minėtų genų raiškos lygių ir glioblastomų radiologinių požymių.

12.2 Tiriamosios imties pacientų demografinės bei klinikinės ypatybės

Išanalizavus 83 pacientų pasirinkto laikotarpio ligos istorijų duomenis, pagal tyrimo metodikoje nurodytus atrankos kriterijus tolimesnei analizei suformuota 18 pacientų tiriamoji imtis. Šios imties pacientų demografinės ypatybės pateikiamos pirmoje lentelėje. Joje nurodoma tiriamosios imties moterų ir vyrų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes operacijos dieną. Atsižvelgiant į skirtingus literatūros duomenis [4,7,8,9,16], tolimesniems skaičiavimams imties pacientai suskirstyti pagal amžių į dvi grupes: a) jaunesnei pacientų grupei priskirti pacientai, kurių amžius buvo ≤55 m. b) vyresnę grupę sudarė vyresni nei 55 m. pacientai.

Tiriamosios imties pacientų amžiaus mediana operacijos dieną buvo 59 (36 – 79) m. Šioje pacientų imtyje moterų grupė sudarė 44,4 proc. (n=8), o vyrų grupė – 55,6 proc. (n=10). Jaunesnė amžiaus grupė, kurioje buvo 55 m. ir jaunesni pacientai, sudarė 44,4 proc. (n=8), o vyresnių nei 55 m. amžiaus grupė – 55,6 proc. (n=10). Taikant Fišerio tikslųjį testą buvo palygintos pacientų amžiaus grupės vyrų ir moterų tarpe – statistiškai patikimų skirtumų negauta ( p>0,05).

24 1 lentelė. Į tyrimą įtrauktų pacientų imties demografinės ypatybės

Imtis

Moterys¹ n=8 (44,4)

Vyrai¹ n=10 (55,6)

Amžiaus ypatybės

Pacientų amžiaus mediana² 59

Minimali 36 Maksimali 79 Amžiaus grupė ≤ 55 m.¹ n=8 (44,4) Moterys¹ n=3 (37,5) Vyrai¹ n=5 (62,5) Amžiaus grupė >55 m.¹ n=10 (55,6) Moterys¹ n=5 (50) Vyrai¹ n=5 (50)

¹Nurodomas atvejų skaičius n ir išraiška proc. ²Nurodoma amžiaus mediana metais

Remiantis užkoduotais retrospektyviai surinktais tiriamosios pacientų imties duomenimis, analizuotas glioblastomų pasiskirstymas pagal naviko tipą. Didžiausią dalį tiriamojoje imtyje sudarė pacientai, kuriems buvo nustatytas solidinis naviko augimo tipas – 72,2 proc. (n=13). Tuo tarpu 27,8 proc. (n=5) imties pacientams buvo diagnozuotas daugiažidininis naviko augimas (multicentrinis naviko tipas).

2 lentelė. Pasiskirstymas pagal naviko augimo tipą tiriamosios imties moterų ir vyrų tarpe bei tarp skirtingų amžiaus grupių (≤55 m. ir >55 m.) tarpe

Naviko

augimo tipas Imtis¹ Moterys¹ Vyrai¹

P reikšmė ≤55 m.¹ >55 m.¹ P reikšmė Solidinis 13 (72,2) 5 (62,5) 8 (80,0) 0,608 5 (62,5) 8 (80,0) 0,608 Multicentrinis 5 (27,8) 3 (37,5) 2 (20,0) 3 (37,5) 2 (20,0)

25 Antroje lentelėje pateikiami rezultatai, atspindintys glioblastomos naviko tipo pasiskirstymą tarp lyčių ir skirtingų amžiaus grupių. Patikrintos sąsajos tarp naviko tipo ir lyties bei skirtingų amžiaus grupių – tiriamojoje imtyje statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (p>0,05).

Kadangi, nustačius tirtos imties pacientų galvos navikų lokalizaciją galvos smegenyse buvo gautas didelis išsibarstymas, tolimesniuose tyrimo etapuose naviko lokalizacijos sąsajos su molekuliniais genetiniais žymenimis nebuvo nagrinėtos.

12.3 Tiriamosios imties pacientų MRT vaizduose matomų pakitimų kiekybiniai tūrio matavimai

Siekiant įvykdyti antrąjį uždavinį, buvo apskaičiuoti tyrimo metodikoje nurodyti tiriamosios imties (n=18) pacientų MRT vaizduose matomų pakitimų kiekybiniai tūrio kriterijai. 3D modelių pavyzdžiai pateikiami pirmame paveiksle.

1 2 3

1 pav. Trimačiai tūrių modeliai (1. Nekrozė; 2. Kontrastas.; 3. Edema)

Tiriamojoje imtyje nustatyta naviko centrinės nekrozės tūrio mediana 8564,0 mm³. Atitinkamai apskaičiuoti kiti tūriai: kontrastą kaupiančios naviko dalies – 30085,0 mm³, naviko sukeltos edemos - 84269,5 mm³, navikinio židinio – 43971,5 mm³, viso bendro pažeidimo – 125810,0 mm³. Trečioje lentelėje pateikiamos šių tūrių medianų, su minimaliomis ir maksimaliomis reikšmėmis, pasiskirstymas tarp moterų ir vyrų bei skirtingų amžiaus grupių tarpe. Kiekybinių tūrio kriterijų ryšys su lytimi bei amžiaus grupėmis patikrintas ir statistiškai reikšmingų sąsajų nenustatyta (p>0,05).

26 3 lentelė. Pasiskirstymas pagal apskaičiuotus MRT vaizduose navikų tūrių parametrus moterų ir vyrų

tarpe bei tarp skirtingų amžiaus grupių Kiekybinis

tūrio kriterijus¹

Lytis Amžiaus grupės

Moterys Vyrai ≤55 m. >55 m. Nekrozės tūris 8564,0 (1733,0;20638,0) 6751,0 (105,0;181836,0) 4165,5 (105,00;23951,0) 9703,5 (1733,00;181836,0) KKND² tūris 34808,0 (4796,0;57668,0) 26591,0 (3240,0;54139,0) 25050,0 (3240,0;35770,0) 32914,5 (4796,0;57668,0) Edemos tūris 81681,5 (30747,0;192593,0) 93083,5 (17428,0;279684,0) 71470,5 (17428,0;192593,0) 121651,5 (27827,0;279684,0) Židinio tūris 46553,50 (6529,0;65294,0) 39129,0 (3873,0;204872,0) 29852,5 (3873,0;55472,0) 46963,0 (6529,0;204872,0) BP³ tūris 120170,5 (86219,0;242945,0) 129589,0 (21301,0;411234,0) 101323,0 (21301,0;242945,0) 164391,0 (54472,0;411234,0) ¹Visi tūrio parametrai nurodomi mm³ (mediana, minimali ir maksimali reikšmės)

²KKND – kontrastą kaupianti naviko dalis ³BP – bendras pažeidimas

Įvertinus trečioje lentelėje nurodytus kiekybinius tūrio kriterijus, apskaičiuoti visi įmanomi šių tūrių santykiai. Mažiausia mediana tiriamojoje imtyje nustatyta tarp centrinės naviko nekrozės ir bendro pažeidimo tūrių santykio 0,05 (0,000811 – 0,44). Atitinkamai mažiausia šio santykio mediana fiksuota moterų 0,06 (0,01 – 0,24), vyrų 0,04 (0,000811 – 0,44), ≤55 m. 0,04 (0,000811 – 0,24) ir >55 m. 0,06 (0,01 – 0,44) grupėse. Didžiausia mediana nustatyta tarp kontrastą kaupiančios naviko dalies ir židinio tūrių santykio 0,77 (0,11 – 0,99). Atitinkamai didžiausia šio santykio mediana fiksuota moterų 0,72 (0,59 – 0,88), vyrų 0,84 (0,11 – 0,99), ≤55 m. 0,82 (0,55 – 0,99), >55 m. 0,72 (0,11 – 0,89) grupėse. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp lyčių bei amžiaus grupių nerasta (p>0,05).

12.4 Sąsajos tarp tiriamosios imties pacientų glioblastomas charakterizuojančių MRT požymių ir išgyvenimo trukmės

Atliekant bendros pacientų išgyvenimo trukmės analizę nustatyta, kad du (11,1 proc.) tiriamosios imties pacientai mokslinio tyrimo atlikimo metu buvo gyvi. Dėl šios priežasties visa tiriamoji imtis (n=18)

27 bendros išgyvenimo trukmės atžvilgiu buvo nagrinėta dviem kryptimis. Pirmiausia išnagrinėtos sąsajos mirusių pacientų imtyje (n=16), vėliau visoje tiriamojoje imtyje įtraukiant ir gyvus pacientus.

Po atliktos operacijos ilgiausia išgyvenimo trukmės mediana tarp mirusių pacientų 11,0 mėn. Ilgiausia išgyvenimo trukmė 21 mėn., trumpiausia – 1 mėn. Moterų tarpe išgyvenimo trukmės mediana 11,0 (1,0 – 21,0) mėn., vyrų – 7,0 (2,0 – 21,0) mėn. Lyginant moteris ir vyrus pagal išgyvenimo trukmę, statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05). Jaunesnę pacientų grupę sudarė pacientai, kurių amžius buvo 55 m. ir jaunesni. Šioje grupėje išgyvenimo trukmės mediana 15,0 (7,0 – 21,0) mėn. Vyresniųjų grupėje, kuriems priklausė pacientai vyresni nei 55 m., mediana 6,5 (1,0 – 20,0) mėn. Palyginus šias dvi grupes pagal išgyvenimo trukmę, jos statistiškai reikšmingai skyrėsi (p=0,044).

Visos ištirtos imties (n=18) ilgiausia išgyvenimo trukmės mediana 12,0 (1,0 – 31,0) mėn. Ilgiausia išgyvenimo trukmė statistinės analizės atlikimo dieną buvo 31 mėn. Moterų grupėje išgyvenimo trukmės mediana buvo 13,5 (1,0 – 27,0) mėn. vyrų – 10,0 (2,0 – 31,0) mėn. Pacientų kurių amžius buvo ≤55 m. mediana 18,5 (7,0 – 31,0) mėn., o vyresnių (>55 m.) – 6,5 (1,0 – 20,0) mėn. Palyginus moteris ir vyrus pagal išgyvenimo trukmę, statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05), tačiau tarp jaunesnių ir vyresnių išgyvenimo trukmė statistiškai patikimai skyrėsi. (p=0,011).

Siekiant įvertinti, ar yra sąsajos tarp MRT vaizduose išmatuotų radiologinių glioblastomas charakterizuojančių požymių – centrinės naviko nekrozės, kontrastą kaupiančios naviko dalies, naviko sukeltos edemos, navikinio židinio, bendro pažeidimo – ir tiriamų mirusių pacientų išgyvenimo trukmės, pacientai suskirstyti pagal išgyvenimo trukmę į tris grupes: 1) trumpiau nei 6 mėn., 2) 6 – 12 mėn., ir 3) ilgiau nei 12 mėn., bet ne 24 mėn. Ketvirtoje lentelėje pateikiamos tūrių medianų, su minimaliomis ir maksimaliomis reikšmėmis, pasiskirstymas tarp mirusių pacientų išgyvenimo grupių.

Atlikus analizę nustatyta, kad mirusių pacientų tarpe yra statistiškai reikšmingas (p=0,005) skirtumas tarp skirtingos išgyvenimo trukmės grupių MRT vaizduose išmatuoto glioblastomas charakterizuojančio kiekybinio tūrio kriterijaus – kontrastą kaupiančios naviko dalies (KKND) – požiūriu bei KKND/BP tūrių (p=0,031) ir KKND/edemos tūrių (p=0,049) santykių. Neparametrinis Mano–Vitnio testas pritaikytas nustatyti tarp kurių išgyvenimo grupių gauti statistiškai reikšmingi skirtumai. Rezultatai atskleidė, kad statiškai reikšmingas skirtumas yra tarp trumpiausios (<6 mėn.) ir ilgiausios (>12 – ≤24 mėn.) (p=0,008) bei vidutinės (6 – 12 mėn.) ir ilgiausios (p=0,007) išgyvenimo trukmės grupių. Tuo tarpu, tūrių santykiai reikšmingai skyrėsi tik tarp vidutinės ir ilgiausios išgyvenimo trukmės grupių (p=0,012 ir p=0,019, atitinkamai).

28 4 lentelė. Pasiskirstymas pagal MRT vaizduose matomų pakitimų kiekybinius tūrio matavimus ir tūrių

santykius tarp pacientų skirtingų išgyvenimo grupių . Kiekybinis tūrio kriterijus¹ <6 mėn. 6-12 mėn. >12 – ≤24 mėn. P reikšmė Nekrozės tūris 14048,5 (8068,0;45172,0) 7626,0 (2911,0;20638,0) 5176,0 (105,0;181836,0) 0,341 KKND² tūris 35138,00 (31047,0;51671,0) 34834,0 (23734,0;57668,0) 19507,0 (3240,0;29448,0) 0,005 Edemos tūris 168543,0 (68653,0;254389,0) 71815,0 (27827,0;279684,0) 76302,0 (17428,0;206362,0) 0,545 Židinio tūris 46963,00 (43562,0;96843,0) 55472,0 (26645,0;65294,0) 22065,0 (3873,0;204872,0) 0,180 BP³ tūris 212514,5 (118198,0;351232,0) 105692,0 (54472,0;344170,0) 122143,0 (21301,0;411234,0) 0,346 KKND²/BP³ tūrių santykis 0,2042 (0,11;0,29) 0,2988 (0,16;0,44) 0,1507 (0,04;0,23) 0,031 KKND²/edemos tūrių santykis 0,2940 (0,13;0,51) 0,4516 (0,19;1,13) 0,1859 (0,04;0,39) 0,049 ¹Nurodoma tūrio (mm³) ar tūrių santykio mediana , minimali ir maksimali reikšmės ²KKND – kontrastą kaupianti naviko dalis

³BP – bendras pažeidimas

Analizuojant visą tiriamąją imtį, pacientai pagal išgyvenimo trukmę buvo suskirstyti į dvi išgyvenimo grupes: į pirmąją pateko pacientai, kurie išgyveno 12 mėn. ir trumpiau, į antrąją – daugiau nei 12 mėn. Siekta nustatyti ar tiriamojoje pacientų imtyje nagrinėjami MRT pakitimų tūriai ir jų santykiai statistiškai reikšmingai skiriasi tarp šių skirtingo išgyvenimo pacientų grupių. Penktoje lentelėje pateikiami rezultatai tarp pacientų išgyvenusių ≤12 mėn. ir >12 mėn.

29 5 lentelė. Radiologinių glioblastomas charakterizuojančių MRT pakitimų kiekybinių tūrio kriterijų ir jų

santykių skirtumai išgyvenimo grupėse Kiekybinis tūrio kriterijus¹ ≤12 mėn. >12 mėn. P reikšmė Nekrozės tūris 10347,0 (2911,0;45172,0) 5176,0 (105,0;181836,0) 0,31 KKND² tūris 34834,0 (23734,0;57668,0) 19507,0 (3240,0;35770,0) 0,003 Edemos tūris 92237,0 (27827,0;279684,0) 76302,0 (17428,0;206362,0) 0,508 Židinio tūris 49545,0 (26645,0;96843,0) 22065,0 (3873,0;204872,0) 0,058 BP³ tūris 135799,0 (54472,0;351232,0) 122143,0 (21301,0;411234,0) 0,402 KKND²/BP³ tūrių santykis 0,2907 (0,11;0,44) 0,1503 (0,04;0,23) 0,024 KKND²/edemos tūrių santykis 0,4278 (0,13;1,13) 0,1857 (0,04;0,39) 0,015 ¹Nurodoma tūrio ar tūrių santykio mediana, minimali ir maksimali reikšmės ²KKND – kontrastą kaupianti naviko dalis

³BP – bendras pažeidimas

Statistinė analizė atskleidė, kad kontrasto kaupiančios naviko dalies (KKND) tūris, KKND/BP ir KKND/edemos tūrių santykiai tarp pacientų išgyvenusių ≤12 mėn. ir >12 mėn. statistiškai reikšmingai skyrėsi (atitinkamai p=0,003, p=0,024 ir p=0,015). Taip pat nustatyta, kad nėra statistiškai reikšmingų skirtumų tarp visos imties išgyvenimo grupių nagrinėjant kitus tyrimo metodikoje nurodytus tūrių santykius (p>0,05), todėl duomenys nėra pateikti penktoje lentelėje.

12.5 GFAP bei AREG genų raiškos dažnis ištirtų glioblastomų navikiniame audinyje

Išnagrinėjus iš LSMU NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos gautus užkoduotus tiriamosios imties pacientų navikų molekulinius genetinius duomenis, nustatyta, kad GFAP geno raiška buvo ištirta aštuoniolikai (n=18) iš 83, o AREG geno raiška – penkiolikai (n=15) imties atvejų. Kiek ir kokių genų buvo tirta bei kokios genų kombinacijos vyravo tarp pacientų glioblastomų navikinių audinių, pateikiama pirmoje diagramoje. Daugiau nei 83,0 proc. (n=15) atvejų sudarė grupė, kurioje buvo ištirti

30 abu genai. GFAP geno raiškos grupėje 66,7 proc. (n=12) atvejų buvo nustatyta sustiprinta geno raiška, o AREG geno grupėje 80,0 proc. (n=12) atvejų geno raiška buvo prislopinta. Dažniausia pasitaikiusi genų kombinacija – GFAP-Up/AREG-Down nustatyta 53,0 proc. (n=8) tirtos imties atvejų.

1diagrama. Imties pacientų glioblastomų navikiniame audinyje tirtų genų, šių genų raiškos bei genų raiškos kombinacijų dažnis atvejų skaičiumi glioblastomų navikiniame audinyje

Išnagrinėtas tiriamosios imties pacientų glioblastomų navikiniuose audiniuose ištirtų GFAP ir AREG genų raiškų pasiskirstymas moterų ir vyrų tarpe, bei tarp ≤55 m. ir >55 m. amžiaus grupių. Duomenys pateikiami šeštoje lentelėje.

6 lentelė. Pasiskirstymas pagal genų raiškos būseną atvejų skaičiumi moterų ir vyrų tarpe bei skirtingose amžiaus grupėse

Genas Raiška¹ Imtis² Moterys² Vyrai² ≤55 m.² >55 m.² GFAP Up 12 (66,7) 4 (50,0) 8 (80,0) 5 (62,5) 7 (70,0) Down 6 (33,3) 4 (50,0) 2 (20,0) 3 (37,5) 3 (30,0) AREG Up 3 (20,0) 2 (25,0) 1 (14,3) 2 (33,3) 1 (11,1) Down 12 (80) 6 (75,0) 6 (85,7) 4 (66,7) 8 (88,9) ¹Up – sustiprinta geno raiška, Down – prislopinta geno raiška

31 Moterų grupėje, tiek sustiprinta, tiek prislopinta GFAP geno raiška buvo nustatyta 50 proc. (n=4) atvejų, o 75,00 proc. (n=6) sudarė pacientės, kurioms buvo prislopinta AREG geno raiška. Atitinkamai vyrų grupėje vyravo sustiprinta GFAP geno raiška (80 proc.) ir prislopinta AREG geno raiška (85,7 proc.). Jaunesnių pacientų (≤55 m.) tarpe nustatyta 62,5 proc. (n=5) atvejų sustiprinta GFAP ir 66,7 proc. (n=4) atvejų AREG genų raiška. Vyresnių pacientų grupėje (>55 m.) atitinkamai – sustiprinta GFAP (70 proc.) ir prislopinta AREG (88,9 proc.) genų raiška. Patikrinus tirtų genų raiškos dažnio sąsajas moterų ir vyrų bei jaunesnių ir vyresnių pacientų grupėse, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (p>0,05).

12.6 Sąsajos tarp tiriamosios imties pacientų išgyvenimo trukmės ir GFAP bei AREG genų raiškos.

Šiam tyrimo etapui atlikti suformuotos dvi pacientų grupės: GFAP geno grupė – 16 pacientų (27,1 proc. tiriamosios imties pacientų), AREG geno grupė – 14 (23,7 proc.). Šiose grupėse išanalizuota tirtų genų raiška, kurios pasiskirstymas atvejų skaičiumi skirtingose mirusių pacientų išgyvenimo trukmės grupėse nurodytas septintoje lentelėje.

7 lentelė. Pasiskirstymas atvejų skaičiumi pagal tirtų genų raiškos būseną skirtingose išgyvenimo trukmės grupėse

Genas Raiška¹ Imtis² <6 mėn.² 6 – 12 mėn.² >12 – ≤24 _mėn.² Trukmė ³

GFAP Up 10 (62,5) 4 (100,0) 2 (40,0) 4 (57,1) 7,0 (1,0 - 21,0) Down 6 (37,5) 0 (0,0) 3 (60,0) 3 (42,9) 12,5 (6,0 - 21,0) AREG Up 3 (21,4) 0 (0,0) 1 (20,0) 2 (33,3) 16,0 (11,0 - 20,0) Down 11 (78,6) 3 (100,0) 4 (80,0) 4 (66,7) 7,0 (1,0- 21,0) ¹Up – sustiprinta geno raiška, Down – prislopinta geno raiška

²Nurodytas atvejų skaičius n ir išraiška proc.

³Nurodyta išgyvenimo trukmės mediana mėnesiais bei maksimali ir minimali reikšmė

Išanalizavus genų raiškos dažnį skirtingose išgyvenimo grupėse nustatyta, kad didžiausia bendros išgyvenimo trukmės mediana GFAP geno grupėje buvo 12,5 (6,0 – 21,0) mėn., kai geno raiška buvo prislopinta. Didžiausia bendros išgyvenimo trukmės mediana AREG geno grupėje buvo 16,0 (11,0 - 20,0)

32 mėn., kai geno raiška buvo sustiprinta. Mažiausios bendros išgyvenimo trukmės medianos, kai GFAP geno raiška buvo teigiama, o AREG neigiama, sutapo – 7,0 (1,0 – 21,0). Statistiškai reikšmingo išgyvenimo trukmės skirtumo tarp sustiprintos ir prislopintos GFAP ir AREG genų raiškos būsenos grupių nenustatyta (p>0,05).

Visos imties statistinė analizė tirtų genų raiškos atžvilgiu parodė, kad GFAP geno imtyje sustiprintos ir prislopintos geno raiškos dažnis buvo vienodas – atitinkamai po 6 atvejus tarp pacientų išgyvenusių ≤12 mėn. ir >12 mėn. Up grupėje ir po 3 atvejus Down grupėje. AREG geno imtyje tiek tarp pacientų išgyvenusių 12 mėn. arba mažiau, tiek tarp išgyvenusių daugiau nei 12 mėn. vyravo prislopinta AREG geno raiška (atitinkamai 7 (87,5 proc.) ir 5 (71,4 proc.) atvejai). Lyginant tirtų genų raišką tarp moterų ir vyrų, jaunesnių (≤55 m.) ir vyresnių (>55 m.) pacientų, bei skirtingos išgyvenimo trukmės grupių statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (p>0,05).

12.7 Sąsajos tarp tiriamosios imties pacientų glioblastomų radiologinių kiekybinių MRT pakitimų tūrio kriterijų ir GFAP bei AREG genų raiškos

Vykdant trečiąjį uždavinį siekta nustatyti, ar yra sąsajos tarp tiriamosios imties pacientų glioblastomas charakterizuojančių radiologinių pakitimų kiekybinių tūrio kriterijų ir navikiniame audinyje ištirtų GFAP bei AREG genų raiškos. Kadangi GFAP (n=18) ir AREG (n=15) genai buvo ištirti nevienodam atvejų skaičiui, statistiškai reikšmingo ryšio paieška atlikta kiekvieno geno imčiai atskirai. Abiejų genų raiška buvo išreikšta teigiama arba neigiama skaitine reikšme, kur pliuso ženklas nurodė sustiprintą (Up), o minuso – prislopintą tiriamojo geno raišką (Down). Abiejų tirtų genų grupėse pasitaikė tiek prislopinta tiek sustiprina genų raiška.

Atlikta sąsajų analizė parodė, kad GFAP geno grupėje statistiškai reikšmingo ryšio (p>0,05) tarp šio geno raiškos skaitinės reikšmės ir MRT vaizduose išmatuotų radiologinių glioblastomų charakteristikų nenustatyta. Ištirtoje AREG geno grupėje nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys (p=0,037) tarp šio geno raiškos skaitinės reikšmės ir bendro pažeidimo (BP) tūrio. Spirmeno koreliacijos koeficientas minėtu atveju lygus -0,543, t.y., ryšys tarp kintamųjų yra vidutinio stiprumo. AREG geno imtyje galima pastebėti tendenciją, kad didėjant edemos tūriui (Rs=-0,425) ir navikinio židinio tūriui (Rs=-0,425) nustatoma silpnėjanti geno raiška, nors statistiškai reikšmingų sąsajų nenustatyta (abiem atvejais p=114). Sąsajų tarp radiologinių naviko tūrio charakteristikų ir įvairių tūrio santykių analizės rezultatai pateikiami aštuntoje lentelėje.