LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
VETERINARINĖS MAISTO SAUGOS STUDIJŲ PROGRAMA MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDRA
SONATA MIKOLAITIENĖ
2 kursas 2 grupė
VEIKSNIŲ, TURINČIŲ ĮTAKOS LIETUVOS KARVIŲ
MASTITŲ SUKĖLĖJŲ RŪŠIMS IR PAPLITIMUI , ANALIZĖ
THE ANALYSIS OF FACTORS, WHICH AFFECTING THE
LITHUANIA COWS MASTITIS PATHOGENS SPECIES AND
SPREAD
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc.dr. Loreta Šernienė
2
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBOSAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas
„ Veiksnių, turinčių įtakos Lietuvos karvių mastitų sukėlėjų rūšims ir paplitimui, analizė“. ... 1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(data) (katedros vedėjo/jos vardas pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas pavardė ) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
SANTRAUKA 4
ĮVADAS 5
1. LITERATŪROS APŢVALGA 6
1.1 Bakterijų ir somatinių ląstelių įtaka pieno kokybei 6
1.2 Karvių slaptųjų mastitų prieţastys 9
1.3 Mastitą sukeliantys mikroorganizmai 11
1.4 Mastito diagnostika 13
1.5 Mastito profilaktika ir gydymas 15
2. DARBO METODIKA 18
2.1 Tyrimų laikas ir vieta 18
2.2 Mikrobiologinis mastitų sukėlėjų identifikavimas 18
2.3 Mikroorganizmų jautrumo antibiotikams nustatymas 22
2.3 Statistinė duomenų analizė 23
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS 24
3.1 Mastito sukėlėjų paplitimo analizė 24
3.2 Sezono įtaka mastito sukėlėjams 25
3.3 Mastito sukėlėjų paplitimas skirtingose apskrityse 26
3.4 Mastito sukėlėjų jautrumo antibiotikams analizė 28
4. IŠVADOS 36
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS 37
6. SUMMARY 41
7. PRIEDAI 42
4
SANTRAUKA
Autorius: Sonata Mikolaitienė, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Veterinarijos akademija Maisto saugos ir kokybės katedra
Tema: Veiksnių, turinčių įtakos Lietuvos karvių mastitų sukėlėjų rūšims ir paplitimui, analizė Darbo vadovė: dr. Loreta Šernienė
Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedra.
Darbo apimtis: 42 puslapiai, 17 paveikslų, 4 lentelės.
Darbo tikslas : Išanalizuoti ir įvertinti veiksnius, turinčius įtakos karvių mastitų sukėlėjų rūšims ir paplitimui Lietuvoje.
Darbo uţdaviniai:
1. Įvertinti ir aprašyti Lietuvoje paplitusius karvių mastito sukėlėjus;
2. Statistiškai įvertinti ir aprašyti veiksnių (metų, sezono ir apskrities) įtaką mastitų sukėlėjų rūšims ir paplitimui kontroliuojamų karvių piene 2011 metais;
3. Atlikti mastitų sukėlėjų jautrumo antibiotikams duomenų analizę ir statistikai įvertinti priklausomybę tarp antibiotikų.
Magistro baigiamajame darbe buvo panaudoti VĮ „Pieno tyrimai“ laboratorijoje bakteriologiškai tirtų karvių, sergančių mastitu, duomenys. 2011metais buvo ištirta 2315 mastitu sergančios karvės. Daţniausiai identifikuota buvo Stphylococcus aureus - 33 proc., Staphylococcus
spp - 21 proc.,gramneigiamos lazdelės – 13 proc.,Streptococcus spp- 11 proc., Streptococcus agalactiae – 11 proc. Duomenų analizė parodė, kad mastitų sukėlėjai didţiausia problema pieno
kokybei tampa spalio, lapkričio ir gruodţio mėnesiais, t.y. tvartiniu laikotarpiu. Taip pat buvo nustatyta,kad mastitų sukėlėjai jautriausi buvo gentamicinui, amoksicilinui ir amoksicilino mišiniui su klovulanine rūgštimi.Analizė parodė, kad stipri teigiama koreliacija (r = 0,79) tarp mastito gydymui naudojamų antibiotikų buvo amoksicilino ir penicilino bei amoksicilino + klovulaninės rūgšties ir amoksicilino (r = 0,69).
5
ĮVADAS
Pieno ūkis – viena svarbiausių šalies ţemės ūkio šakų, turintis ne tik ekonominę, bet ir socialinę reikšmę. 2000 metais suarė 17 proc. bendrosios ţemės ūkio produkcijos vertės, o pieno produktų eksportas - virš 30 proc. viso ţemės ūkio ir maisto produktų eksporto.(Stankūnienė ir kt.,2008)
Pieno kokybę apibūdina visa eilė rodyklių. Svarbiausias iš jų - somatinių ląstelių skaičius (SLS). Didėjantis SLS nurodo, kad karvė serga daţniausiai pasitaikančia ginekologine liga mastitu. Ši ligos forma neturi jokių klinikinių poţymių ir nustatoma tik tiriant SLS. Daţnai slaptieji mastitai pereina į klinikinius. Klinikinis mastitas sukeliamas patogeninių mikroorganizmų. Tyrimais nustatyta, kad apie 95 proc. mastito atvejų sukelia agalaktinis streptokokas, auksinis stafilokokas, dysgalaktinis streptokokas, tešmens streptokokas ir ţarninė lazdelė (Japertas ir kt., 2001).
Nacionalinė mastito taryba JAV nustatė, kad išlaidos vienai karvei, sergančiai mastitu, gydyti siekia 180 JAV dolerių.Nuostolis dėl sumaţėjusių primilţių siekia apie 70 proc.Pienininkystės ūkiai daugiau nuostolių patiria dėl slaptojo negu dėl klinikinio mastito.( Paulauskas, 2010).
Nors mastitų sukėlėjai gana plačiai išanalizuoti, tačiau jų paplitimas Lietuvoje ir jautrumas antibiotikams nėra gerai ţinomi, todėl šiam darbui buvo pasirinktas darbo tikslas : Išanalizuoti ir įvertinti veiksnius, turinčius įtakos karvių mastitų sukėlėjų rūšims ir paplitimui Lietuvoje.
Darbo uţdaviniai:
1. Įvertinti ir aprašyti Lietuvoje paplitusius karvių mastito sukėlėjus;
2. Statistiškai įvertinti ir aprašyti veiksnių (metų, sezono ir apskrities) įtaką mastitų sukėlėjų rūšims ir paplitimui kontroliuojamų karvių piene 2011 metais;
3. Atlikti mastitų sukėlėjų jautrumo antibiotikams duomenų analizę ir statistiškai įvertinti priklausomybę tarp antibiotikų.
6
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Bakterijų ir somatinių ląstelių įtaka pieno kokybei
Siekiant išsaugoti natūralias pieno savybes ir pagaminti kokybiškus produktus, didţiausias dėmesys turi būti skiriamas švieţio pieno kokybei (Riaukienė, 1999). Pieno kokybės vertinimui, tiriami pieno kokybės rodikliais: bendras bakterinis uţterštumas tūkst./cm3, somatinių ląstelių skaičius
tūkst./cm3, inhibitorinės medţiagos ir pieno uţšalimo temperatura (oC) (Pieno supirkimo taisyklės,
2001).
Bendras bakterijų skaičius piene rodo, kiek pienas yra uţterštas bakterijomis. Bakterijų piene visiškai išvengti neįmanoma, tačiau jų skaičių sumaţinti galima.Pieno gamintojai turi rūpintis, kad į pieną nepatektų bakterijų, be to, greitai jį atšaldyti iki ţemos temperatūros (0 – 4°C temperatūros). Palankiausia temperatūra bakterijoms daugintis yra 20 – 40 °C. Kai kurios bakterijos veisiasi uţšalimo, o kitos – net 50 – 60 °C temperatūroje. Kai sąlygos netinkamos, bakterijos apmiršta ir nesidaugina (krentant temperatūrai, lėtėja jų dauginimasis). Tai viena iš prieţasčių, dėl kurios pamelţtą pieną reikia greitai atšaldyti (Shearer et al., 1992).
Švieţiai pamelţtas pienas turi medţiagų, kurios slopina mikroorganizmų dauginimąsi tam tikrą laiką. Tokias baktericidines medţiagas gamina sveikas tešmuo. Šių medţiagų kiekis tešmenyje priklauso nuo gyvulio sveikatos, tešmens būklės ir kt.Nors sveikame tešmenyje yra visos palankios sąlygos ( drėgmė, maisto medţiagos,temperatūra) bakterijoms daugintis, jos dauginasi labai pamaţu, o daugelis net ţūva. Švieţiai pamelţtas pienas pasiţymi savybe naikinti mikroorganizmus, o laikas , kurį pienas tų savybių turi – baktercidine faze.(Stankūnienė ir kt.,2008)
Baktericidinių medţiagų kiekis piene smarkiai sumaţėja gyvuliui susirgus virškinamojo trakto ligomis, mastitu ir kt. ligomis. Sveikos karvės piene bakterijų dauginimasis slopinamas vidutiniškai 2 val., bet tai priklauso nuo pamelţto pieno švaros, greito pieno atšaldymo.
1 lentelė.Pieno baktericidinės fazės trukmės priklausomybė nuo pieno temperatūros.(Mišeikienė ir kt.,2008)
Pieno tempertūra, °C Baktericidinės fazės trukmė, val.
Pieno tempertūra, °C Baktericidinės fazės trukmė, val.
37 2 13 - 14 18
30 2,3 10 24
25 6 5 36
7
Taigi atšaldytame piene susidaro nepalankios sąlygos mikrobams daugintis. Pieną reikia kuo skubiau atšaldyti iki 4 – 6 °C temperatūros.
Superkamo pieno bakterinis uţterštumas turi būti ne didesnis kaip 100 tūkst/cm3
.(Pieno supirkimo taisyklės, 2001).
Somatinės ląstelės – tai pieno liaukos epitelinės ląstelės (1 – 20 proc.) ir leukocitai. Sveikos karvės piene somatinių ląstelių būna maţiau nei 100 tūkst./ml, o sergančios slaptuoju mastitu – daugiau kaip 200 tūkst./ml (Japertas, 1998, 1999).
Somatinių ląstelių būna ir sveikų karvių piene, o neţymus jų padidėjimas yra natūrali apsauginė ląstelių funkcija prieš tešmens uţdegimus (Koivula, 2005). Lietuvai įstojus į ES, pagal bendrus ES reglamentus SLS piene turėtų neviršyti 400 tūkst./ml. (Valstybės ţinios, 2005). N. Zelandijoje, Australijoje, Kanadoje SLS piene turi būti maţiau nei 500 tūkst./ml (Sargeant et al., 1998; Norman et al., 2000).
Svarbiausias veiksnys, turintis įtakos somatinių ląstelių skaičiaus padidėjimui piene, yra į pieno liauką patekusi uţdegimą sukelanti infekcija. Uţdegimą sukelia į ją patekę ir besidauginantys patogeniniai mikroorganizmai. Uţdegimo metu sumaţėja pieno sintezės aktyvumas, pakinta pieno sudėtis, padidėja somatinių ląstelių skaičius. Uţdegimo intensyvumas priklauso nuo karvių šėrimo, kitų biologinių veiksnių ir uţdegimą sukėlusio patogeno. Padidėjęs somatinių ląstelių skaičius rodo pieno liaukos uţdegimą (Japertas, 2000).
Iš literatūros šaltinių (Japertas,2000) ţinome, kad dauguma tešmens uţdegimų atsiranda per pirmuosius tris laktacijos mėnesius. Lietuvoje slaptaisiais mastitais serga nuo 5 iki 45 % visų karvių. Dėl mastitų netenkama iki 20 – 30 % pieno. Kadangi, mastitais sergančių karvių pienas yra nesuperkamas, patiriami dideli nuostoliai.
Padidėjęs somatinių ląstelių kiekis – įvairaus laipsnio mastitų pasekmė, o somatinės ląstelės blogina pieno kokybę ir rūšį. Somatinių ląstelių skaičiaus padidėjimo prieţastimi gali būti ne tik mastitai, bet ir stresas (Japertas, 1999).
Paţangios technologijos galvijininkystėje karvių organizme gali sukelti stresą, kurio metu pakinta metabolizmo lygis, fiziologinės funkcijos, fermentų aktyvumas. Dėl to išsiskiria daug citokinų, kai kuriuose organuose gali vystytis uţdegiminiai procesai,susilpnėja laktogenezės proceso intensyvumas bei produktyvumas.( Drackley et al.,2006).
8
Tyrimais nustatyta, kad padidėjus SLS piene,sumaţėja riebalų,laktozės,kalcio,vitaminų (ypač vitamino C),kazeino, pagausėja natrio, chloro, albuminų ir globulinų.Padidėja tokio pieno pH (net iki 6,9 ir daugiau) ir oksidacinis aktyvumas (Hurley, 2003).
Rudejevienės ( 2007) teigimu sergančių slaptuoju mastitu karvių piene sumaţėja bendrųjų baltymų (1 proc.),kazeino (6–18 proc.), laktozės (5–20 proc.), riebalų (4–12proc.). Galvijų augintojai patiria nuostolių dėl sumaţėjusios pieno produkcijos (20 proc.),gydymo išlaidų (20–25 proc.), pablogėjusios pieno kokybės ir ankstyvo karvių brokavimo (30–35 proc.).Taip pat nustatyta, kad somatinių ląstelių skaičiui 1 ml piene padidėjus100 tūkst., pieno primilţis sumaţėja 2,5 proc.
VĮ „Pieno tyrimai“ laboratorijoje taikomas somatinių ląstelių ląstelių skaičiavimas somatinių ląstelių skaičiaus tėkmės citometrijos metodu matuokliu Somascope (1pav.) pagal LST EN ISO 13366-2:2006+AC:2007 „Pienas. Somatinių ląstelių skaičiavimas.2-oji dalis.Fluorooptoelektroninių skaitiklių naudojimo vadovas“.
1 pav. Somatinių ląstelių skaičiaus matuoklis „Somascope MK2
„Somascope MK2“veikia fluorooptoelektroniniu principu. Pirmiausiai tiriamas pienas sumaišomas su daţomuoju tirpalu. Šis mišinys patenka į prietaiso dalį, kiuvetę, kuri apšviečiama specialios ultravioletinės lempos skleidţiamais spinduliais. Kiekviena nudaţyta ląstelė švyti, o speciali kompiuterio programa suregistruoja gautus signalus ir taip suskaičiuoja pieno somatinių ląstelių skaičių.
9
2 lentelė. Infekcijos paplitimas ir pieno sumaţėjimas, priklausomai nuo somatinių ląstelių skaičiaus padidėjimo (Eberhard et al., 2002)
Somatinių ląstelių skaičius, tūkst./ml
Infekuotų tešmens ketvirčių bandoje, % Pieno produkcijos sumaţėjimas, % 200 6 0 500 16 6 1000 32 18 1500 48 29
Pieno gamintojai, siekdami gauti iš karvių didelius pieno primilţius ir kokybišką pieną, turi tinkamai rūpintis gyvulių prieţiūra. H. Tripp ir kt. autorių (1999) teigimu, ūkininkai turi tinkamai priţiūrėti net karvių nagus. Jungtinėje Karalystėje kasmet 60 karvių iš 100 turi nagų paţeidimų. Jungtinėse Amerikos Valstijose pirmą mėnesį po apsiveršiavimo nagų ligomis suserga apie 24 proc. karvių. Iš nagų ligomis sergančios karvės per laktaciją primelţiama 350 – 400 kg. pieno maţiau.Daţniausiai nagų ligos diagnozuojamos karvėms, sergančioms medţiagų apykaitos ligomis.Todėl labai svarbu subalansuoti karvių mitybos racioną.
Kaip teigia S. Japertas(1998), norint gaminti kokybišką pieną, reikia taikyti geras karvių laikymo ir prieţiūros sąlygas, laikytis rekomenduojamų higieninių – sanitarinių sąlygų bei tinkamai atlikti pirminį pieno apdorojimą. Tuo tikslu neuţtenka pasikliauti vien pirminiais sudėties ir kokybės rodikliais. Pieno mėginiai siunčiami į bešališką tyrimų laboratoriją pieno sudėties bei kokybės rodiklių (riebalų, baltymų, somatinių ląstelių, bendro bakterinio uţterštumo, inhibitorinių medţiagų, pieno uţšalimo temperatūros, laktozės (pieno cukraus), urėjos nustatymui .
1.2 Karvių slaptųjų mastitų prieţastys
Mastitas – viena iš brangiausių pieninio tipo karvių ligų. 60–70 proc. visų nuostolių, patiriamų dėl karvių ligų, tenka mastitui.
Ekonominiai nuostoliai susidaro:
• dėl pieno produkcijos sumaţėjimo - 50–55 proc., • gydymo išlaidos - 20–25 proc.,
10
Slaptuoju mastitu Lietuvoje serga apie 50 proc. laktuojančių karvių. Karvei sergant slaptuoju mastitu, dėl pieno produkcijos sumaţėjimo per laktaciją patiriama apie 400 litų nuostolio (Japertas ir kt.,2001).
Jei klinikine mastito forma registruojama 2- 5 proc. laktuojančių ir uţtrūkintų karvių, tai slaptuoju tešmens uţdegimu serga iki 50 proc. karvių. Lietuvoje šia uţdegimo forma serga 44- 47 proc. karvių.( Klimaitė, 2005).
Karvė nuolat yra veikiama išorinių veiksnių, kurie silpnina jos apsauginius barjerus. Atlikti tyrimai parodė, kad karvės mastitu daţniau serga tvartiniu laikotarpiu.Dėl prastos tvartų ventiliacijos, daţniausiai susidaro gera terpė mikroorganizmams daugintis uţdaroje patalpoje. Karvės išskiria daug šilumos ir drėgmės, dėl to tvarto temperatūra pakyla.Tai padidina tvarto uţterštumą bakterijomis, kurios sukelia tešmens uţdegimą. Be to, karvės suėda maţiau pašaro, sumaţėja jų produktyvumas, karvės tampa jautresnės infekcijai( Ţakas, 2002).
Kai kuriuose literatūros šaltiniuose (Japertas,Minkevičius,2001) autoriai nurodo, kad karvės mastitu daţniau serga vasarą, nes daug mikroorganizmų platina musės.Taip pat ypač daug infekcijos atvejų nustatyta ten kur karvių laikymo vietose buvo aptikta ţarnyno bakterijų.
Kuo karvė jaunesnė, tuo mastito sukėlėjams atsparesnė. Literatūros duomenimis mastitams atsparesnės jaunesnės karvės: pirmaveršės - 29,8 proc., antraveršės - 32,4 proc., trečiaveršės - 20,0 proc., ketvirtaveršės - 22,0 proc., penkiaveršės – 93,0 proc. Kuo didesnis primilţis, tuo atsparumas maţesnis (Klimaitė , 2005).
Karvių sergamumui slaptuoju mastitu įtakos turi: karvių šėrimas;
laikymo sąlygos; karvių amţius;
11
3 lentelė. Karvių, sergančių tešmens uţdegimu, pieno sudėties pakitimai (Aniulis E., Japertas S. 2001; Sederevičius A., LVA. 2004)
Sudėtinės dalys Sveikų karvių pienas, proc. Sergančiųjų slaptuoju mastitu karvių pienas, proc.
Sausosios medţiagos 8.9 8,8 Riebalai 3.5 3.2 Laktozė 4.9 4.4 Baltymai 3.61 3.36 Kazeinas 2.8 2.3 Išrūgų baltymai 0.8 1.3 Serumo albuminai 0.02 0.07 Laktoferinas 0.02 0.1 Imunoglobulinai 0.1 0.6 Natrio 0.057 0.105 Chloro 0.091 0.147 Fosforo 0.173 0.157 Kalcio 0.12 0.04
Iki 70- 80 proc. dėl mastito patiriamų nuostolių sudaro subklinikinio mastito sukeliami padariniai. Subklinikinis mastitas – tai padidėjęs somatinių ląstelių skaičius ir sumaţėjęs pieno primilţis. (Scott, Laar, Bostedt H. 2002 ).
1.3 Mastitą sukeliantys mikroorganizmai
Mastitą gali sukelti daugiau kaip 140 rūšių mikroorganizmų.Mastitą sukeliančios bakterijos skirstomos į patogenines ir sąlyginai patogenines.Sąlyginai patogeniniai mikroorganizmai sukelia tešmens uţdegimą ir nusilpus karvės imuninei sistemai jų labai padaugėja karvės aplinkoje .
12
2 pav. Daţniausiai pasitaikantys mastito sukėlėjai (VĮ “Pieno tyrimai”, informacija)
Mikroorganizmai
Infekcijos
pasireiškimo periodas pasireiškimasInfekcijos Platinimas melžimo
metu Pasveiki-mo proc. Per laktaciją Karvei
užtrūkus Slaptas Klinikinis
Staphylococcus aureus l. daţnai retai l. daţnai retai l. daţnai 20-70
Streptococcus agalactiae l. daţnai retai l. daţnai l. daţnai l. daţnai 80-100
Streptococcusdysgalactiae daţnai daţnai l. daţnai retai retai 80-100
Streptococcus uberis daţnai l. daţnai daţnai l. daţnai retai 60-80
Streptococcus faecalis daţnai retai retai l. daţnai retai
-Escherichia coli l. daţnai daţnai retai l. daţnai retai 70-90
Pseudomonas daţnai retai l. daţnai retai retai
-Corynebacterium pyogenes retai l.daţnai retai l. daţnai daţnai
-Mycoplasma l. daţnai retai retai l. daţnai l. daţnai
-Dažniausiai sutinkami tešmens uždegimo sukėlėjai
Jei mastitas yra sukeltas patogeninių mikroorganizmų, labiausiai pakinta pieno sudėtis ir somatinių ląstelių skaičius. Toks mastitas, padaro didţiausius ekonominius nuostolius. Koaguliazei negatyvūs stafilokokai (KNS) ir korinebakterijos laikomi sąlyginai patogeniniais mikroorganizmais.Šių mikroorganizmų sukelto uţdegimo metu, somatinių ląstelių padaugėja tik 2-3 kartus. Sąlyginai patogeniniai mikroorganizmai retai sukelia klinikinį mastitą, pasiţymintį pieno sudėties pakitimais ar stipriu pieno produkcijos sumaţėjimu.
Auksinis stafilokokas ir agalaktinis streptokokas yra uţkrečiamieji mastitą sukeliantys patogenai, kurių pagrindinis šaltinis yra uţkrėstas tešmuo. Šie infekcijos sukėlėjai tarp karvių plinta melţimo metu, per neplautas rankas ir kt. . Mastitas daţniausiai yra lėtinis ir slaptasis, bet su periodiniais klinikiniais epizodais.
13
patogenais karvė gali iš naujo uţsikrėsti melţiant, bet daţniausiai uţsikrečiama laikotarpiu tarp melţimų. (Japertas S. ir k t.,2001).
Tyrimais nustatyta, kad apie 95 proc. mastito atvejų sukelia agalaktinis streptokokas, auksinis stafilokokas, dysgalaktinis streptokokas, tešmens streptokokas ir ţarninė lazdelė. Auksinis stafilokokas yra labai uţkrečianti bakterija (patogeniška). Jo uţtenka maţiau nei 10 bakterijų, kad būtų sukeltas tešmens uţdegimas. Šis sukėlėjas greitai prasiskverbia į tešmens audinius. Uţsikrėtus po šešių valandų jis jau randamas ir tešmens parenchimoje. Patekęs į parenchimą sudaro mikropūlinukus. Nusilpus organizmui, iš šių inkapsuliuotų pūlinukų bakterijos vėl patenka į alveoles ir uţdegimas atsinaujina. Šis sukėlėjas gali formuoti neturinčius sienelių darinius (bakterijų L formas). Todėl auksiniai stafilokokai gali būti atsparūs antibiotikams, kurie veikia būtent ląstelės sienelę (ß-laktaminai (penicilinai), aminoglikozidai ir kt.). Be to, kai kurie stafilokokai gamina ir išskiria medţiagas (fermentus), kurios trukdo antibiotikams juos sunaikinti (Japertas ir kt., 2001).
Auksiniai stafilokokai, patekę į pieno liauką, ne tik sukelia uţdegimą, bet ir gamina karščiui atsparius enterotoksinus, kurie patekę į pieną niekur nedingsta, o juos perdirbant patenka ir į pieno produktus. Valgant tokius pieno produktus galima apsinuodyti ( Japertas ir kt., 2002).
Pradedant mastitu sergančių karvių gydymą, pirmiausia labai svarbu nustatyti prieţastį, kodėl karvės serga tešmens uţdegimu, t. y. patikrinti melţimo įrangos darbą, melţiklių būklę, įvertinti melţimo higieną, laikymo sąlygas ir guoliavietes, karvių mitybą ir kitus aplinkos veiksnius.
Siekiant nustatyti, koks mikroorganizmas sukėlė tešmens uţdegimą, dar prieš gydymą reikia paimti pieno mėginius mikrobiologiniam tyrimui. Gavus tyrimų rezultatus, būtina pasitarti su veterinarijos gydytoju, kuris gydymo būdas gali būti pats efektyviausias (ar pakanka gydymo homeopatiniais vaistais, ar geriau taikyti homeopatiją ir gydymą antibiotikais kartu, ar jau tinka gydymas tik antibiotikais). Homeopatiniai preparatai maţiau efektyvūs, jei tešmens uţdegimą sukelia auksinis stafilokokas ar agalaktinis streptokokas, tačiau jie efektyvesni įveikiant kitus sukėlėjus. Svarbu paţymėti, kad ţinant kokiai grupei (uţkrečiamų mikroorganizmų ar aplinkos) priklauso pieno mėginiuose vyraujantys mikroorganizmai, pačiam ūkininkui nesunku nustatyti ir šalinti mastito prieţastis.
1.4 Mastito diagnostika
14
reikia imtis skubių priemonių,kad gydymas būtų efektyvus.Subklinikinio mastito diagnostikai atliekami specialūs pieno tyrimai ne rečiau kaip 1 kartą per mėnesį. Atskirai tiriant kiekvieno ketvirčio pieną gaunami tikslesni rezultatai nei tiriant sumaišytą visų ketvirčių pieną. Tokie tyrimai turi būti pakankamai greiti, kad būtų galima kuo anksčiau nustatyti tešmens būklę ir įvertinti uţdegimo intensyvumą.( Špakauskas, Jodkonis 2001)
Klimienės(2003) teigimu subklinikinius mastitus nustatome tik ţinodami somatinių ląstelių skaičių (SLS). Šis rodiklis tiksliai apibūdina karvių bandos prieţiūrą ir karvių sveikatą, pagal jį nustatoma pieno rūšis ir sprendţiama apie gyvulio tešmens būklę.
SLS karvių piene nustatomas tiesioginiu (Preskoto–Brido), elektroniniu („Fossomatic“, „Anadis“, „Somascope MK2“ ir kt.).Veterinarijos gydytojų tarpe be laboratorinių tyrimų labai svarbūs yra greitieji (ekspres) mastitų diagnostikos testai( CMT, Mastestas, Mastirapid, Mastitis test NK ir kt.), kuriais atsiradusius pokyčius piene galima įvertinti melţimo metu.
Ekspres diagnostikos testas atliekamas:
Į spec. lėkštelės duobutes melţimo pabaigoje iš kiekvieno tešmens ketvirčio primelţiama po 2 – 3 ml pieno;
Įpilama testo tirpalo 2 – 3 ml;
Po 10 – 15 min. vizualiai vertinama reakcija; pieno klampumas vertinamas nuo 1 iki 5 balų. Kuo didesnis somatinių ląstelių skaičius piene, tuo mišinys yra klampesnis. Pastaruoju metu tiksliausiu testu diagnozuojant mastitą, pripaţintas somatinių ląstelių (80 proc. - 85 proc. sudaro leukocitai, eritrocitai, epitelio ląstelės) skaičiavimas, nes uţdegimo metu šių ląstelių skaičius 1 ml pieno padidėja iki keletos milijonų.
Dabar daugelyje pasaulio šalių taikomi standartizuoti testai SLS piene nustatyti. Daţniausiai naudojamos paviršiaus aktyvios medţiagos ir indikatoriai. Iš ţinomesnių testų taikomi šie: CMT (California Mastitis Test), Mastestas, Mastirapid, Mastitis Test, Mastitis test NK, Bernburg Reagent, Stara Zagora, Profilac Reagent, Sofija ir kt. Testų sudėtyje esančios paviršiaus aktyvios medţiagos suardo somatinių ląstelių sieneles ir jų branduolius bei skatina jų agliutinaciją į gumulėlius. Suirusios ląstelės pienui suteikia klampumą ir tąsumą. Kuo didesnis somatinių ląstelių skaičius piene, tuo mišinys yra klampesnis.
15
poţymiai, tačiau Streptococcus uberis sukeltus mastitus nevisada pavyksta nustatyti. ( Milner P. et al., 1996 )
Kiti autoriai laikosi nuomonės, kad PEL nėra tikslus mastitų nustatymo būdas (Batra T.R., McAllister A.J. 1984; Lansbergen L.M.T.E.,et al.,1994 ).Tačiau matuojant PEL tiesiog kiekvieno melţimo metu, mastitų nustatymas patogesnis, nereikia veţioti pieno bandinių į laboratoriją. Tačiau dėl nedidelės koreliacijos PEL nustatymas neturi būti taikomas kaip vienintelė mastitų nustatymo priemonė. (Nielen M.,et al. 1993 )
Lietuvoje PEL tyrimai nėra paplitę, nors šiuo tyrimu galima nustatyti iki 53 – 55 % slaptų mastitų, tikrinant PEL, pieno primilţį, pieno temperatūrą kiekvieno melţimo metu. Manoma, kad PEL koreliuoja su bakteriologinio ir citologinio tyrimo rezultatais. PEL įtakos turi ir kiti veiksniai: laktacijos stadija, pieno riebumas, įvairios ligos ir kt. (Jodkonis ,1999; Aniulis , Japertas , 2001;)
Pasiūlytas originalus greito daţymo metodas „Testsimplest“, šis mėginys tinkamas mikroskopuoti po 15 min. Galima suskaičiuoti ne tik somatinių ląstelių skaičių, bet ir diferencijuoti juos pagal rūšis. ( Sandholm M. 1995 ) Šiuo metu yra naudojami instrumentiniai SLS nustatymo metodai (Fossomatic“, „Coulter Counter“ ) (Sandholm M. 1995 ).
Slapto mastito diagnostikai vartojami įvairūs metodai, kurie nustato pieno fizinius ir cheminius pokyčius, tačiau pieno savybių pasikeitimas ne visada gali būti pieno liaukos patologijos rodikliu ir daţnai priklauso nuo gyvulio fiziologinės būklės, šėrimo bei laikymo sąlygų, laktacijos periodo. ( Špakauskas, 2000 ).
1.5 Mastito profilaktika ir gydymas
Profilaktikos tikslas yra sumaţinti mastito sukėlėjų kiekį karvių bandoje. Tam reikia sudaryti tinkamas mitybos ir laikymo sąlygas karvėms, laikytis zoohigienos reikalavimų, kad mastito sukėlėjų plitimo grandinė būtų nuolat nutraukiama.
Pagrindinės mastito profilaktinės priemonės: tinkamos karvių laikymo sąlygos;
tinkamos mitybos sąlygos;
tvarkinga, gerai sureguliuota melţimo įranga;
melţimo higiena;
ankstyva mastito diagnostika ir gydymas;
16 lazerio terapija.(Paulauskas, 2010)
Gyvuliai turi būti laikomi sausose pakreiktose patalpose. Tvartai turi būti gerai vėdinami, juose neturi būti skersvėjų.Reikia reguliariai šalinti susikaupusį mėšlą ir srutas. Mastitu sergančios karvės melţiamos po to kai pamelţiamos sveikos karvės. Reikia saugoti karvių tešmenis nuo traumų,suţeidimų, sergančias karves kuo skubiau gydyti. Sergančias lėtiniu mastitu karves būtina brokuoti, nes jos yra mastito infekcijos šaltinis visai bandai. Karves, kurių tešmenys stipriai paţeisti uţdegimo, taip pat patariama brokuoti. Kad mastitas neįsisenėtų, reikia jį gydyti kuo efektyvesnėmis priemonėmis.
Paskutinieji tyrimai parodė, kad natūralus gyvulio pasipriešinimas mastitui priklauso nuo vitaminų, esančių bandos mityboje – labiausiai nuo racione esančių vitamino E ir mikroelemento seleno. Vitaminas E ir selenas stiprina leukocitų antibakterinę veiklą, antibiotikų pernešimą iš kraujo į tešmenį, maţina uţdegimo procesus tešmens audiniuose. Tyrimais nustatyta, kad padidinus racione vitamino E ir seleno kiekį, klinikinio mastito atvejų ankstyvosios laktacijos stadijoje sumaţėja iki 57 proc., vėlesnės laktacijos perioduose – apie 32 proc. Svarbu, kad minėtų medţiagų kiekis neviršytų nustatytos normos. Suaugusiai karvei rekomenduojamos tokios vitaminų ir mikroelementų normos: vitamino A 100 – 150 tūkst. tarptautinių vienetų (TV), vitamino E laktuojančioms karvėms 400 – 800 TV, uţtrūkusioms – 1200 TV; seleno 6 mg, vario 200 – 250 mg ir cinko 900 – 1200 mg.( Japertas, Aniulis,2001).
Gydyti antibiotikais slaptą mastitą tiksliai nenustačius sukėlėjo nepatartina. Beveik 80 proc. atsinaujinančių mastitų prieţastis yra auksinis stafilokokas: ši bakterija taip giliai įsiskverbia į sekrecinį pieno liaukos epitelį, jį paţeidţia, jog šis perauga jungiamuoju audiniu. Todėl jokie vaistai ar profilaktinės priemonės nepadeda.(Aniulis, Japertas, 2001).
17
Literatūros šaltiniuose teigiama, kad lazerio spindulių veikimas siejamas su pokyčiais ląstelėje (Gao et al., 2006). Priklausomai nuo patologinio proceso eigos ir spindulių intensyvumo, lazerio spinduliai stabilizuoja ląstelės membraną, suaktyvina ATF sintezę (Karua et al., 2005). Sustiprėja azoto oksidų, histamino, seratonino, prostaglandinų sintezė, išsiplečia kraujagyslės. Lazerio spinduliams veikiant padidėja leukocitų aktyvumas, skatinama vaskuliarizacija, sureguliuojama vietinė temperatūra, maţėja uţdegimo simptomai. Atlikus bandymus su laboratoriniais gyvūnais nustatyta, kad ţemo intensyvumo lazerio spinduliai ardo ir Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus kultūras, skatina kraujagyslių atsistatymą (Bayat et al., 2006). Pastaroji mikroorganizmų rūšis ypač daţnai randama karvių sergančių slaptuoju mastitu, piene.
Lazerio terapija yra puiki priemonė,kuri naudojama profilaktiškai. Lazeriu rekomenduojama apdoroti:
melţiamas karves;
uţtrūkusias karves;
paršavedes prieš ir po apsiparšiavimo;
paršelių lizdus;
galvijų prieauglį;
kumeles;
arklių prieauglį. (Paulauskas,2010)
18
2. DARBO METODIKA
2.1 Tyrimų laikas ir vieta
Magistrantūros baigiamasis darbas atliktas 20012 – 20014 metai Lietuvos Sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje.
Tyrimui atlikti duomenys buvo paimti iš VĮ “Pieno tyrimai” duomenų bazės. Darbe panaudoti 2011 metų mastito sukėlėjų mikrobiologinių tyrimų protokolų duomenys.
2.2 Mikrobiologinis mastitų sukėlėjų identifikavimas
VĮ “Pieno tyrimai” laboratorijoje yra nustatomi mastito sukėlėjai iš pieno. Bakteriologiniai tyrimai atliekami akredituotoje pagal LST EN ISO/IEC 17025 standarto reikalavimus laboratorijoje. Mastito sukėlėjai identifikuojami pagal standartizuotą metodiką SDP 5.4.4.B.6 „Pagrindinių mastitą sukeliančių bakterijų nustatymas piene“ (2009). Metodas pagrįstas mastito sukėlėjų, esančių pieno mėginyje, sugebėjimu aerobinėmis sąlygomis ant standţios agarizuotos mitybos terpės 37 °C ± 1 ºC temperatūroje per 24 val. - 72 val. suformuoti tik jiems būdingas kolonijas ( nenustatomi anaerobiniai mastito sukelėjai, mikoplazmos, mikobakterijos).
19
Mastito sukėlėjų išskyrimas iš pieno ir jų identifikavimas vyksta pagal schemą pavaizduotą 3 pav.
3 pav. Mastito sukėlėjų tyrimo schema
20
4 pav. Staphylococcus aureus kolonijos 5 pav. Mišri mikroflora Neteisingai paimtas mėginys
Iš tiriamų kolonijų ruošiamas mikroskopinis tepinėlis ir daţomas Gramo būdu: ant objektinio stiklelio uţlašinamas maţas lašelis vandens. Nuo lėkštelės iš pasirinktos kolonijos( augintos 18 – 24 val.) kilpele paimamas nedidelis kiekis mikroorganizmų, keliskart paliečiamas lašelis ir išsklaidomas stiklelio paviršiuje, kad susidarytų tepinėlis. Po to tepinėlis išdţiovinamas ore ir fiksuojamas perbraukiant jį kelis kartus virš spiritinės lemputės liepsnos. Ant taip paruošto tepinėlio uţlašinamas genciano violeto tirpalas, po 1 min. nupilamas daţas ir uţpilamas lugolio tirpalas. Vėl palaukiama 1 min. ir tepinėlis nuplaunamas distiliuotu vandeniu. Tada ant stiklelio pilamas etanolis tol, kol neišsiskirs violetinė spalva.Palenktas stiklelis švelniai nuplaunamas vandeniu tam, kad būtų pašalintas etanolis.Uţpilama 1 minutei safranino daţu, nuplaunamas silpna vandens srove ir išdţiovinamas. Jei bakterijų ląstelės mėlynos arba violetinės vadinamos gramteigiamomis (Gram +), jei nusidaţo roţine arba raudona – gramneigiamos ( Gram - ) bakterijos.
Bakterijų ląstelių daţymas Gramo būdu leidţia apibūdinti bakterijų morfologiją ir jas klasifikuoti į gramteigiamas ir gramneigiamas – pagal tai, kaip daţosi šiuo būdu. Gramteigiamos bakterijos nuo gramneigiamų gali būti atskiriamos KOH testo pagalba.
21
Streptokokai ir stafilokokai yra gramteigiamos rutulinės bakterijos (nusidaţo mėlyna arba violetine spalva). Streptokokai mikroskopiniame tepinėlyje išsidėsto pavieniui arba grandinėlėmis. Stafilokokai mikroskopiniame tepinėlyje išsidėsto pavieniui arba krūvelėmis, panašiomis į vynuogių kekę.
Streptokokai nuo stafilokokų atskiriami katalazės testu. Išaugintų bakterijų kolonija mikrobiologine kilpele nuimama nuo terpės ir paskleidţiama ant objektinio stikliuko. Po 30 sekundţių uţlašinamas lašas 3 proc.vandenilio peroksido tirpalas. Jei mišinys pradeda putoti (mikroorganizmai gamina katalazę, kuri suskaido vandenilio peroksidą į vandenį ir dujinį deguonį), tai kolonoją galima priskirti stafilokokams, jei reakcija neįvyko, koloniją galima priskirti streptokokams.
Koagulazės testas padeda nustatyti ar stafilokokas gamina koagulazės fermentą.Vieną koloniją tiriamojo mikroorganizmo sėjame į 0,5 ml atskiestos triušio kraujo plazmos, inkubuojame 37°C temperatūroje termostate. Teigiamą reakciją galime stebėti po 2 – 18 valandų. Plazmos koaguliazės reakcija bus teigiama, jei palenkus mėgintuvėlį į šoną aiškiai matysis pusiau kieta arba kieta plazma, neigiama reakcija – skysta plazma.
Staphylococcus aureus nuo kitų stafilokokų gali būti atskirtas CAMP testo pagalba. Šis testas
atliekamas naudojant ţinomą Streptococcus agalactiae kamieną.Tuo tikslu ant kraujo agaro per lėkštelės vidurį pasėjama Streptococcus agalactiae kultūra, o iš šonų statmenai ir 5 mm nuo
Streptococcus agalactiae pasėjimo linijos sėjama įtariamo stafilokoko kultūra. Jei pasėlių susidūrimo
zonoje susiformuoja kastuvėlio arba pusmėnulio pavidalo skaidri hemolizės zona, tokiu atveju stafilokoką galima priskirti Staphylococcus aureus rūšiai.
Streptokokai patikrinami pagal jų sugebėjimą hidrolizuoti eskuliną. Aplink kultūras, kurios hidrolizuoja eskuliną, ultravioletinių spindulių šviesoje (366 nm) matomos tamsios zonos, o kitur eskulinas švyti neonu. Tarp eskuliną hidrolizuojančių streptokokų daţniausiai pasitaiko Streptococcus
uberis ir enterokokai (Enterococcus faecalis ir Enterococcus faecium).
Eskulino nehidrolizuojantys (eskulin -) streptokokai įvertinami pagal hemolizės tipą.Aiškias α hemolizės zonas suformuoja Streptococcus dysgalactiae, kuris patvirtinamas C grupės streptokokų latekso agliutinacijos testu.
Streptokokų serologinis nustatymas atliekamas su B ir C serologinių grupių serumais. Į mėgintuvėlį įpylama 0,4 ml ekstraktinio reagento ir įdedama 2 – 5 panašias kolonijas, nemaišoma. Mėgintuvėlis yra patalpinamas 10 minučių į termostatą 37o
22
įlašinamas 1 lašas latekso reagento ir 1 lašas ekstrakto. Teigiama reakcija yra tada, jei agliutinacija įvyksta per 30 sekundţių.
Gramneigiamos bakterijos testuojamos greituoju E. coli testu. Tam naudojama chromokulto agaro terpė. Metodas paremtas tuo, kad koliforminėms bakterijoms būdingas fermentas β-D galaktozidazė skaido Salmon-GAL substratą ir koliforminių bakterijų kolonijos nusidaţo raudona spalva, o Escherichia coli būdingas fermentas β-D-gliukuronidazė skaido substratus X gliukuronidą ir Salmon-GAL, ir Escherichia coli kolonijos nusidaţo tamsiai mėlyna ar violetine spalva. Kitos – gramneigiamos bakterijos – bespalvės kolonijos. Testuojama bakterija nuo kraujo agaro su eskulinu persėjama ant chromokulto agaro ir auginama 24 val 37°C temperatūroje. E. coli ant šios terpės uţauga violetinės arba tamsiai mėlynos spalvos, kiti koliformai nusidaţo raudonos spalvos.Tamsiai mėlynos ar violetinės kolonijos patikrinamos, uţlašinus ant jų po lašą Kovačo reagento. Jei po kelių sekundţių reagentas nusidaţo vyšnine spalva – reakcija teigiama, kolonija yra tikrai E. coli. Proteus atpaţįstama iš kolonijų išvaizdos. Tai greitai augančios bakterijos. Paprastai per parą jos išsiplečia per visą lėkštelės agaro paviršių ir turi specifinį nemalonų kvapą.
2.3 Mikroorganizmų jautrumo antibiotikams nustatymas
Mikroorganizmų jautrumui antibiotikams nustatyti naudoti skirtingų koncentracijų „Oxoid“ kompanijos antibiotikų diskai: tetraciklino (30μg), gentamicino, (10μg), neomicino, (30μg), novobiocino (30μg), cefaleksino (30 μg), penicilino (10 μg), amoksicilino (25 μg), kloksacilino (5 μg), rifampicino( 5 μg), streptomicino (10 μg), ampicilino 10 μg, amoksicilino ir klovulaninės rūgšties (30 μg), enrofloksacino (5 μg). Pagal diskų gamintojo lenteles atskirai vertinta kiekviena antimikrobinė medţiaga. Vertinimas atliktas pagal klinikines ribines atsparumo reikšmes.
Metodas: išaugusios 3 – 5 mikroorganizmų kolonijos yra nuimamos nuo agaro paviršiaus ir išmaišomos su mėsos peptono sultiniu (po 4 ml). Kultivuojama 35 – 37o
23
2.4 Statistinė duomenų analizė
24
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS
3.1 Mastito sukėlėjų paplitimo analizė
2011 metų atliktų tyrimų duomenimis VĮ „Pieno tyrimai“ laboratorijoje iš 2315 ištirtų mėginių Staphylococcus aureus rasta 33 proc. mėginių , Staphylococcus spp. - 11 proc . mėginių ,
Streptococcus agalictiae - 11proc. mėginių.,Streptococcus disgalactiae - 2 proc.,gramteigiamos
lazdelės – 5 proc., gramneigiamos – 13 proc.
Iš 2315 tirtų atvejų , mastito sukėlėjų nustatyta 2283 atvejai ( 98,62 proc.), 32 atvejai (1,38 proc.) mastito sukėlėjų nerasta (6 pav.)
Diagramoje matome mastitų sukėlėjų grafinę analizę :
Daţniausiai aptinkamas Staphylococcus aureus 33% Staphylococcus spp. 21% Gramneigiamos lazdelės 13% Streptococcus agalactiae 11% Streptococcus spp. 11% Streptococus disgalactiae 2% Mieliagrybiai 1% Enterococcus spp. 3% Gramteigiamos lazdelės 5%
6 pav. 2011m. mastito sukėlėjų paplitimas
Analizuojant 2315 tirtų atvejų 2011m. daţniausiai mėginiuose buvo aptikti Stphylococcus
aureus - 33 proc., Staphylococcus spp - 21 proc.,gramneigiamos lazdelės – 13 proc.,Streptococcus spp-
11 proc., Streptococcus agalactiae – 11 proc.
25
Lietuvos karvių mastitai taip pat daţniausiai sukeliami S. Aureus (33 proc.visų tirtų teigiamų (mikroorganizmais uţkrėstų) mėginių).
3.2 Sezono įtaka mastito sukėlėjų paplitimui
Mastitu karvės gali sirgti bet kuriuo metų laiku. JAVmokslininkų tyrimų duomenimis, temperatūrai nukritus iki -180C, karvės primilţis per parą gali sumaţėti nuo 0,5 iki 1,8 kg, o
temperatūrai pakilus iki +300C, primilţis sumaţėja net 2 -3,5 kg. Teigiama, kad aukšta temperatūra
ţalingesnė uţ ţemą ,o staigūs terminės aplinkos pokyčiai gali būti pavojingesni nei pastovi aukšta ar ţema temperatūra ilgą laiką (Roth Z., et al. 2001).
Analizuojant 2011m. atliktus tyrimų duomenis matome, kad bakteriologiškai ištyrus sergančių karvių pieno mėginius iš 2315 tirtų atvejų mastitais sergančių karvių skaičius maţiausias buvo rugsėjo, sausio, vasario mėn., didţiausias – lapkritį, gruodį, spalį, rugpjūtį.
86 87 99 113 130 157 106 386 66 335 403 346 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 S a us is V a s a ri s K ov a s B a la nd is G egu ţė B ir ţe lis Li e pa R ug pj ūt is R ug sė jis S pa li s La pk ri ti s G ruo di s A tv e ja i
7 pav. Mastito sukėlėjų nustatymo atvejai
26
karvės suėda maţiau pašarų, sumaţėja produktyvumas, jos tampa jautresnės infekcijai ( Japertienė R., Japertas S. 2003). Iš literatūros šaltinių (Ţakas, 2002) taip pat ţinoma, kad pieno sudėtinės dalys ir jų kiekiai piene kinta priklausomai nuo metų laiko, nes skirtingu metų laiku jos šeriamos skirtingos vertės pašarais.
Iš diagramos pavaizduotos 8 pav. matome, kad visais metų laikais daugiausia atvejų identifikuota Staphylococcus aureus.
4 8 18 2 65 154 150 111 38 51 80 77 119 230 247 141 26 38 34 20 44 51 81 78 20 74 143 66 14 17 11 9 12 15 41 11 11 1 2 0 50 100 150 200 250 300 Pavasaris Vasara Ruduo Ţiema Atvejai
Nėra augimo Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Staphylococcus aureus Gramteigiamos lazdelės Streptococcus agalactiae Gramneigiamos lazdelės Streptococcus disgalactiae Enterococcus spp. Mieliagrybiai
8 pav. 2011m. mastito sukėlėjų nustatymo atvejai skirtingu metų laiku
Galima patvirtinti teiginį, kad auksinis stafilokokas yra sunkiai išnaikinamas. Beveik 80 proc. atsinaujinančių mastitų prieţasčių yra S.aureus. Sunkiausi infekcijos atvejai daţniausiai pasireiškia šiltuoju ir lietingu metų laiku. Iš diagramos matome, kad 2011m. vasara ir ruduo buvo labai palankūs patogeniniams mikroorganizmams daugintis. Uţkrečiamas bakterijas šiltuoju metų periodu padeda platinti įvairūs vabzdţiai ir musės.
3.3 Mastito sukėlėjų paplitimas skirtingose apskrityse
27 1 5 3 4 3 5 11 3 38 42 30 78 88 92 109 14 20 23 27 26 58 78 9 40 62 67 125 124 146 161 2 5 13 17 20 12 29 20 2 5 29 23 64 57 43 31 1 15 21 38 31 54 81 62 8 3 1 5 5 12 17 3 1 4 13 8 12 17 21 1 2 4 3 4 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Alytaus Vilniaus Kauno Tauragės Marijampolės Panevėţio Šiaulių Klaipėdos
A
tv
e
ja
i
Nėra augimo Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Staphylococcus aureus Gramteigiamos lazdelės Streptococcus agalactiae Gramneigiamos lazdelės Streptococcus disgalactiae Enterococcus spp. Mieliagrybiai
9 pav. Mastito sukėlėjų nustatymo atvejai apskrityse.
Bet iš diagramos matyti, kad Staphylococcus aureus atvejų visose apskrityse identifikuota daugiausiai: Klaipėdos – 161, Šiaulių – 146, Panevėţio 124, Marijampolės – 125, Tauragės – 67, Kauno – 62, Vilniaus – 40, Alytaus – 9.Didelis mastitu sergančių karvių skaičius gali būti sąlygotas sugrieţtintų standarto LST 1137:2003 „Ţalias karvių pienas. Kokybės reikalavimai. Nustatymas ir
28
3.4 Mastito sukėlėjų jautrumo antibiotikams analizė
Sergančių mastitu karvių gydymas turi būti labai tikslus – gydyti reikia tik tais antibiotikais, kuriems jautrus sukėlėjas, kitaip bus skatinamas atsparių (antibiotikams) sukėlėjų dauginimasis.
Pagal 2011 m. VĮ „Pieno tyrimai“ surinktus mikrobiologinių tyrimų duomenis nustatėme mastitų sukėlėjų jautrumą antibiotikams vertinant pagal jautrumo zoną nuo 1 iki 3 balų: 3 - jautrus, 2 - vidutiniškai jautrus, 1 - atsparus. Gauti rezultatai pavaizduoti 10 – 17 diagramose.
Staphylococcus spp. vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
2.94 2.94 2.87 2.78 2.74 2.60 2.48 2.45 2.38 2.31 1.58 1.43 0.82 0.66 0.70 0.82 0.81 0.75 0.73 0.67 0.55 0.41 0.35 0.33 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 G e nt a m ic ina s A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s N e om ic ina s R if a m pi c ina s K lok s a c il ina s Te tr a c ik li na s C e fa le k s ina s A m ok s ic il ina s S tr e pt om oc ina s E nrof lok s a c ina s N ov ob ioc ina s P e ni c il ina s 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 Vid. σ
10 pav. Staphylococcus spp. jautrumas antibiotikams
Lietuvos karvių mastito sukėlėjai daţniausiai yra Staphylococcus spp. genties bakterijos – net 58,6 proc. visų diagnozuotų mastitų 2008 – 2010 metais (Klimienė ir kt.,2012).Todėl atsparumo antibiotikams vertinimas yra svarbus rodiklis tinkamai parenkant gydymą. Mūsų tyrimai parodė, kad
staphylococcus spp genties bakterijos, vertinant pagal jautrumo zoną, buvo labai jautrios gentamicinui
29
Streptococcus spp. vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
2.86 2.84 2.53 1.94 1.81 1.77 1.73 1.70 1.57 1.39 1.16 1.09 0.41 0.54 0.77 1.00 0.97 0.47 0.33 0.67 0.63 0.89 0.77 0.85 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 A m ok s ic il ina s A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s G e nt a m ic ina s P e ni c il ina s R if a m pi c ina s K lok s a c il ina s N e om ic ina s C e fa le k s ina s E nrof lok s a c ina s Te tr a c ik li na s S tr e pt om oc ina s N ov ob ioc ina s 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Vid. σ
11 pav. Streptococcus spp. jautrumas antibiotikams
Japertienės ir kitų Lietuvos tyrėjų duomenimis (2009) streptokokų sukeltą uţdegimą veiksmingiausiai gydo penicilinas,ampicilinas,amoksicilinas ir kloksacilinas.Iš 11pav. diagramos matyti, kad Streptococcus spp. genties bakterijos buvo jautriausios amoksicilinui (2,86±0,41), taip pat amoksicilinui su klovulanine rūgštimi(2,84±0,54) ir gentamicinui(2,53±0,77),o atspariausios novobiocino poveikiui( 1,09±0,38) .
Staphylococcus aureus vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
2.96 2.84 2.73 2.66 2.62 2.34 2.25 2.23 2.04 1.53 1.43 1.20 0.26 0.53 0.49 0.60 0.78 0.78 0.83 0.66 0.77 0.83 0.55 0.60 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 G e nt a m ic ina s K lok s a c il ina s N e om ic ina s R if a m pi c ina s A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s Te tr a c ik li na s C e fa le k s ina s E nrof lok s a c ina s S tr e pt om oc ina s A m ok s ic il ina s N ov ob ioc ina s P e ni c il ina s 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 Vid. σ
30
Litertūros šaltiniuose teigiama( Japertienė, Japertas,2009), kad tešmens uţdegimo, kurio sukėlėjas yra auksinis stafilokokas, gydymo veiksmingumas per 25 metus sumaţėjo apytiksliai nuo 80 iki 36,4 proc.Savaiminio pasveikimo daţnis per tą patį laikotarpį sumaţėjo nuo 45 iki 25 proc. Tai skaičiai, kurie kelia nerimą. Taip yra dėl to, kad mastitą sukeliantys mikroorganizmai gerai prisitaikė prie aplinkos.Iš mūsų diagramos matyti, kad S.aureus kultūros jautrios buvo gentamicinui (2,96±0,28), taip pat kloksacilinui (2,84±0,53), o atspariausios buvo veikiant penicilinui (1,20±0,60; 12pav.).
Gramneigiamų lazdelių vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
2.87 2.37 2.21 2.13 1.97 1.90 1.85 1.74 1.52 1.26 1.24 1.10 0.41 0.86 0.71 0.87 0.75 0.86 0.85 0.89 0.75 0.62 0.65 0.30 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 G e nt a m ic ina s A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s N e om ic ina s Te tr a c ik li na s E nrof lok s a c ina s A m ok s ic il ina s R if a m pi c ina s P e ni c il ina s S tr e pt om oc ina s C e fa le k s ina s K lok s a c il ina s N ov ob ioc ina s 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Vid. σ
13 pav. Gramneigiamų lazdelių jautrumas antibiotikams
31
Gramteigiamų lazdelių vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
2.86 2.79 2.57 2.38 2.31 2.26 2.24 2.04 1.97 1.86 1.62 1.38 0.46 0.64 0.88 0.93 1.00 0.74 0.90 0.85 0.78 0.78 0.72 0.55 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 G e nt a m ic ina s A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s A m ok s ic il ina s N e om ic ina s Te tr a c ik li na s P e ni c il ina s R if a m pi c ina s E nrof lok s a c ina s K lok s a c il ina s C e fa le k s ina s S tr e pt om oc ina s N ov ob ioc ina s 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Vid. σ
14 pav. Gramteigiamų lazdelių jautrumas antibiotikams
Koliforminės bakterijos paprastai uţteršia ţalią pieną. Kadangi pasterizuojant jos ţūva, šių bakterijų tyrimas naudojamas kaip šiluminio apdorojimo arba popasterizacinės taršos indikatorius. Koliforminių bakterijų buvimas pasterizuoto pieno produktuose leidţia spręsti apie blogas sanitarines sąlygas arba blogus apdorojimo būdus technologinio proceso metu (Walstra, 1999).Jų gydymas antibiotikais yra pakankamai efektyvus. Gramteigiamų lazdelių jautrumas labiausiai išryškėjo veikiant gentamicinui (2,86±0,46),maţiau jautrios buvo neomicinui (2,38±0,78) ir tetraciklinui (2,31±0,78), o atsparios buvo novobiocinui(1,38±0,64;14 pav.).
Streptococcus agalctiae vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
2.98 2.88 1.90 1.88 1.73 1.65 1.43 1.34 1.19 1.17 1.04 1.03 0.22 0.36 0.24 1.00 0.99 0.83 0.80 0.68 0.49 0.44 0.41 0.19 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s A m ok s ic il ina s P e ni c il ina s K lok s a c il ina s R if a m pi c ina s G e nt a m ic ina s C e fa le k s ina s E nrof lok s a c ina s Te tr a c ik li na s N e om ic ina s N ov ob ioc ina s S tr e pt om oc ina s 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Vid. σ
32
Uţsienio tyrėjų duomenimis ( Bray, 2006) S. agalactiae bakterijos gyvena tešmenyje ir negali egzistuoti uţ liaukos ribų ilgą laiką. Jie yra jautrūs penicilinui ir vieną kartą pašalinus, paprastai, į bandą negrįţta, nebent yra perkamos uţkrėstos karvės. Streptococcus agalactiae rūšies bakterijos priskiriamos prie kontaginių arba uţkrečiamųjų mikroorganizmų. Mūsų turimais duomenimis jos jautriausios buvo amoksicilinui su klovulanine rūgštimi (2,98±0,22),o atspariausios streptomicinui( 1,03±0,24; 15 pav.).
Streptococcus disgalactiae vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
2.96 2.93 2.58 2.45 2.37 2.12 1.82 1.47 1.35 1.16 1.12 1.00 0.00 0.28 0.26 0.76 0.90 0.94 0.86 0.91 0.50 0.53 0.37 0.43 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s A m ok s ic il ina s G e nt a m ic ina s K lok s a c il ina s P e ni c il ina s R if a m pi c ina s C e fa le k s ina s N e om ic ina s E nrof lok s a c ina s S tr e pt om oc ina s Te tr a c ik li na s N ov ob ioc ina s 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Vid. σ
16 pav. Streptococcus disgalactiae jautrumas antibiotikams
S. dysgalactiae gali gyventi beveik bet kur: tešmenyje, didţiajame prieskrandyje, išmatose ir
33
Enterococcus spp. vidutinis jautrumas veikliajai medžiagai
3.00 2.88 2.65 2.21 1.89 1.84 1.73 1.71 1.47 1.35 1.06 1.04 0.32 0.30 0.19 0.52 0.61 0.84 0.88 0.99 0.83 0.86 0.77 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 A m ok s ic il ina s + k lov . rūg š ti s A m ok s ic il ina s P e ni c il ina s G e nt a m ic ina s Te tr a c ik li na s K lok s a c il ina s C e fa le k s ina s R if a m pi c ina s N e om ic ina s E nrof lok s a c ina s N ov ob ioc ina s S tr e pt om oc ina s 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Vid. σ
17 pav. Enterococcus spp. jautrumas antibiotikams
Enterococcus spp genties bakterijos jautriausios buvo, kaip ir streptokokai, amoksicilinui su
klovulanine rūgštimi(3,00±0,01), o atspariausios streptomicinui(1,04±0,19; 17 pav.).
Išanalizavus duomenis matyti, kad iš sergančių karvių pieno išskirti mikroorganizmai vertinant pagal jautrumo zoną jautriausi buvo gentamicinui ir amoksicilinui taip pat amoksicilinui su klovulanine rūgštimi. Svarbu paţymėti, kad ţinant kokiai grupei (kontaginių mikroorganizmų ar aplinkos) priklauso pieno mėginiuose vyraujantys mikroorganizmai, pačiam ūkininkui nesunku nustatyti ir šalinti mastito prieţastis.
34
4 lentelė. Antibiotikų koreliacijos statistiniai rodikliai
Tet – tetraciklinas; Klo – kloksacilinas; Gen – gentamicinas; Neo – neomicinas; Nov – novobiocinas; Pen – penicilinas; Str – streptomicinas; Rif – rifampicinas; Amo – amoksicilinas; Amo+k.r. – amoksicilinas+klovulaninė rūgštis; Cef – cefaleksinas; Enr – enrofloksacinas.
Tet Klo Gen Neo Nov Pen Str Rif Amo Amo+k.r. Cef Enr
35
Gramteigiamų lazdelių sukeltą uţdegimą galima gydyti streptomicinu arba neomicinu, penicilinu arba cefaleksinu, rifampicinu arba amoksicilinu (r = 0,47), kloksacilinu arba amoksicilinu (r= 0,54), penicilinu arba amoksicilinu (r = 0,61), amoksicilinu - cefaleksinu (r=0,58), kloksacilinu arba cefaleksinu (r = 0,62). Ryšys matomas ir tarp amoksicilino ir amoksicilino su klovulanine rūgštimi (r = 0,66).
Streptococcus spp. mikroorganizmų sukeltą uţdegimą galima gydyti cefaleksinu arba
kloksacilinu, nes tarp jų nustatyta vidutinė teigiama koreliacija (r = 0,53) ir streptomicinu arba neomicinu (r = 0,46), nes taip pat yra vidutinė teigiama koreliacija.
Streptococcus agalctiae sukėlėjus galima gydyti neomicinu arba gentamicinu, taip pat -
cefaleksinu arba penicilinu (r = 0,46).
Tarp gydymui naudojamų antibiotikų novobiocino ir kloksacilino (r = 0,50), taip pat cefaleksino ir kloksacilino (r = 0,47) ir amoksicilino + klovulaninė rūgštis ir penicilino (r = 0,51) nustatyta vidutinė teigiama koreliacija gramneigiamų lazdelių sukelto uţdegimo gydymui. O tarp amoksicilino ir penicilino buvo gauta stipri teigiama koreliacija (r = 0,79), taip pat tarp amoksicilino + klovulaninė rūgštis ir amoksicilino (r = 0,69), taigi šie antibiotikai stipriai papildo vienas kitą ir esant organizmo pripratimui prie vieno antibiotiko, galima keisti kitu.
Vidutinio stiprumo teigiama koreliacija tarp antibiotikų neomicino ir streptomicino (r = 0,47), rifampicino ir streptomicino (r = 0,46) ir rifampicino ir neomicino (r = 0,53) rodo, kad jie gali būti pakaitomis naudojami gydant disgalaktinio streptokoko rūšies bakterijų sukeltus mastitus. Panašūs tarpusavio ryšiai pastebėti ir tarp tetraciklino ir kloksacilino (r = 0,48), cefaleksino ir kloksacilino (r = 0,58), amoksicilino ir penicilino (r = 0,51) ir cefaleksino bei enrofloksacino (r = 0,56), skirtų enterokokų sukelto uţdegimo gydymui.
36
4. IŠVADOS
1. Iš 2315 tirtų pieno mėginių mastito sukėlėjai nustatyti 2283 atvejais ( 98,62 proc.). 2. Daţniausiai identifikuoti buvo Stphylococcus aureus - 33 proc., Staphylococcus spp (21 proc.), gramneigiamos lazdelės (13 proc.), Streptococcus spp bei Streptococcus agalactiae (11 proc.),
3. Mastitais daţniausiai karvės serga tvartiniu, o ne ganykliniu laikotarpiu. Maţiausias sergančių karvių skaičius nustatytas rugsėjo mėn., didţiausias - lapkričio.
4. Mastito sukėlėjų įvairovė didelė visose apskrityse, daţniausiai nustatomas mastitų sukėlėjas visose jose - Stphylococcus aureus.
5. Mastito sukėlėjai jautriausi buvo gentamicinui, amoksicilinui ir amoksicilino mišiniui su klovulanine rūgštimi.
37
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Aniulis E., Japertas S. Karvių mastitas. Kaunas, 2001. P. 1 – 104.
2. Batra T.R., McAllister A.J. A comparison of mastitis detection methods in dairy cattle. Can. J. Anim Sci., 1984. 64. P. 305.
3. Booth J.M., The use of cowside tests for mastitis. Mastitis Newsletter, International Dairy Federation. 1990. N. 15. P.2.
4. Bayat M., Vasheghani M. M., Razavi N. J. Effect of low - level helium-neon laser therapy on the healing of third-degree burns in rats. Photochem Photobiol B. 2006. Vol. 83. P. 87–93. 5. David Bray, MS, and Brent Broaddus, MS. How to Reduce Mastitis and Somatic Cell Counts in
Your Dairy Herd. Department of Animal Sciences University of Florida, Gainesville. IFA Dairy Extension University of Florida, Seffner, 2006.
6. Drackley J., Donkin S.S.,Reynolds C. K. Major Advances in Fundamental Dairy Cattle Nutrition.J.Dairy Sci. 2006.Vol.89. P.1324 – 1336.
7. Eberhart R. J, Oliveira A. J., De Gallo C. R. O sistema petrifilm como alternativa aos metodes traditionais para contagem total de microorganismos aerobios e coliformes totais em leite cru refrigerado. Higiene Alimentar 2002, 16 (100), P. 116−126.
8. Gao X., Chen T., Xing D., Wang F., Pei Y., Wei X. Single cell analysis of PKC activation during proliferation and apoptosis induced by laser irradiation. J Cell Physiol. 2006. Vol.206. P. 441– 8.
9. Haile-Mariam M., Bowman P. J., Goddard M. E. Genetic and environmental relationship
among calving interval, survival, persistency of milk yield and somatic cell count in dairy cattle. Livestock Production Science. 2003. Vol.80.P.189-200.
10. Heald C. W., Kim T., Sischo W. M., Cooper J. B., Wolfgang D. R. A computerized mastitis decision aid using farm-based records: an artificial neural network approach. J. Dairy Sci. 2000. Vol. 83. P. 711-720.
11. Hurley W. L. Lactation biology. Departament of Animal Science university of Illinois. 2003. P. 43–233.
12. Japertienė R., dr. S. Japertas, Maţiau somatinių ląstelių - geresnė pieno produktų kokybė. LVA Mano ūkis, ţurnalas (2006/3).
13. Japertas S. Kad pienas būtų kokybiškesnis. Mano ūkis. 2000. Nr. 1. P. 22.
38
15. Japertas S. Stresas ir pieno kokybė. Mano ūkis. 1999. Nr. 6. P. 4.
16. Japertas S., Minkevičius V. Pienas ir jo kokybė. Valstybės įmonė „Pieno tyrimai“. 2001, 4 – 8p, 11 – 20 p, 30-31p.
17. Japertas S., Minkevičius V. Pienas ir jo kokybė. 2002. P. 56
18. Japertienė R., Japertas S. Tešmens uţdegimo poţymis- padidėjęs somatinių ląstelių skaičius. Mano ūkis. 2003. N. 1. P. 26- 27.
19. Japertienė R., Japertas S. Tešmens uţdegimu sergančių karvių gydymas. Mano ūkis. 2009. N5.P 1
20. Jodkonis L. Karvių slaptų mastitų bei patogeninių stafilokokų ir streptokokų piene nustatymas. Daktaro disertacija. LVI, 1999. P.10-15.
21.. Koivula M., Negussie E., Mantysaari E.A. Genetic Parameters for Test-day Somatic Cell
Count at Different Lactation Stages of Finnish Dairy Cattle. Livestock Production Science, 2004. Vol. 90. P. 145 – 157.
22. Koivula M., Mäntysaari E. A., Negussie E., Serenius T. Genetic and Phenotypic Relationships Among Milk Yield and Somatic Cell Count Before and After Clinical mastitis. J. Dairy Sci, 2005. Vol. 88. P. 827-833.
23. Klimienė I., Mockeliūnas R., Butrimaitė- Ambrozevičienė Č. Karvių mastitas. Tyrimai Lietuvoje. Veterinarija ir zootechnika. 2005. N. 31. P. 67–76.
24. Klimienė I., Mockeliūnas R., Butrimaitė- Ambrozevičienė Č., Ruţauskas Mm,Šiugţdinienė R.,Špakauskas V., Matusevičius A.,Pereckienė A.Stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno, įvairovė ir atsparumas antimikrobinėms medţiagoms. Veterinarija ir zootechnika.2012 T. 57 (79).
25. Klimienė J. Nedelsdami gydykime mastitus. Valstiečių laikraštis. 2003. N. 12. P.6.
26. Klimaitė J. Karvių, sergančių slaptuoju mastitu, diagnostika, gydymas ir profilaktika. Daktaro disertacija. Kaunas, 2005. P. 138.
27. Kitchen B. J. Review of the progress of dairy science: bovine mastitis:milk compositionial chantes and related diagnostic test. Journal of Dairy Research, 1981. 48. P. 167.
28. Klimaitė J., Aniulis E. Staphylococcus aureus treatment and efficacy of medications „ Noroclar“, „ Synolax LC“ and „ Synolax RTU“. International scientific conference proceedings. Jelgara. 2004. P. 116 – 122.
