Ieva Kanopkaitė
V kursas, 1 grupėSERGANČIŲJŲ LĖTINIU PERIODONTITU SEILIŲ
BALTYMINIAI ŽYMENYS
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbo vadovė
Dr. Ingrida Marija Pacauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
ODONTOLOGIJOS FAKULTETAS DANTŲ IR BURNOS LIGŲ KLINIKA
SERGANČIŲJŲ LĖTINIU PERIODONTITU SEILIŲ BALTYMINIAI ŽYMENYS
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbą atliko
magistrantas ... Darbo vadovas ...
(parašas) (parašas)
... ... (vardas pavardė, kursas, grupė) (mokslinis laipsnis, vardas pavardė)
20....m. ... 20....m. ...
(mėnuo, diena) (mėnuo, diena)
KLINIKINIO - EKSPERIMENTINIO BAIGIAMOJO MAGISTRINIO DARBO VERTINIMO LENTELĖ
Įvertinimas: ... Recenzentas: ...
(moksl. laipsnis, vardas pavardė)
Recenzavimo data: ... Eil
.N r.
BMD dalys BMD vertinimo aspektai
BMD reikalavimų atitikimas ir įvertinimas
Taip Iš dalies Ne
1
Santrauka (0,5 balo)
Ar santrauka informatyvi ir atitinka darbo turinį
bei reikalavimus? 0,2 0,1 0
2 Ar santrauka anglų kalba atitinka darbo turinį bei reikalavimus? 0,2 0.1 0
3 Ar raktiniai žodžiai atitinka darbo esmę? 0,1 0 0
4 Įvadas,
tikslas uždaviniai
(1 balas)
Ar darbo įvade pagrįstas temos naujumas,
aktualumas ir reikšmingumas? 0,4 0,2 0
5 Ar tinkamai ir aiškiai suformuluota problema, hipotezė, tikslas ir uždaviniai? 0,4 0,2 0
6 Ar tikslas ir uždaviniai tarpusavyje susiję? 0,2 0,1 0
7
Literatūros apžvalga (1,5 balo)
Ar pakankamas autoriaus susipažinimas su kitų
mokslininkų darbais Lietuvoje ir pasaulyje? 0,4 0,2 0
8
Ar tinkamai aptarti aktualiausi kitų
mokslininkų tyrimai, pateikti svarbiausi jų
rezultatai ir išvados? 0,6 0,3 0
9
Ar apžvelgiama mokslinė literatūra yra pakankamai susijusi su darbe nagrinėjama problema?
0,2 0,1 0
10 Ar autoriaus sugebėjimas analizuoti ir sisteminti mokslinę literatūrą yra pakankamas? 0,3 0,1 0 11 Medžiaga ir
metodai (2 balai)
Ar išsamiai paaiškinta darbo tyrimo metodika,
ar ji tinkama iškeltam tikslui pasiekti? 0,6 0,3 0
kriterijai? 13
Ar tinkamai aprašytos kitos tyrimo medžiagos ir priemonės (anketos, vaistai, reagentai, įranga
ir pan.)? 0,4 0,2 0
14
Ar tinkamai aprašytos statistinės programos naudotos duomenų analizei, formulės, kriterijai, kuriais vadovautasi įvertinant statistinio patikimumo lygmenį?
0,4 0,2 0
15
Rezultatai (2 balai)
Ar tyrimų rezultatai išsamiai atsako į iškeltą
tikslą ir uždavinius? 0,4 0,2 0
16 Ar lentelių, paveikslų pateikimas atitinka reikalavimus? 0,4 0,2 0
17 Ar lentelėse, paveiksluose ir tekste kartojasi informacija? 0 0,2 0,4
18 Ar nurodytas duomenų statistinis reikšmingumas? 0,4 0,2 0
19 Ar tinkamai atlikta duomenų statistinė analizė? 0,4 0,2 0
20
Rezultatų aptarimas (1,5 balo)
Ar tinkamai įvertinti gauti rezultatai (jų svarba,
trūkumai) bei gautų duomenų patikimumas? 0,4 0,2 0
21 Ar tinkamai įvertintas gautų rezultatų santykis su kitų tyrėjų naujausiais duomenimis? 0,4 0,2 0
22 Ar autorius pateikia rezultatų interpretaciją? 0,4 0,2 0
23 Ar kartojasi duomenys, kurie buvo pateikti kituose skyriuose (įvade, literatūros apžvalgoje, rezultatuose)?
0 0,2 0,3
24
Išvados (0,5 balo)
Ar išvados atspindi baigiamojo darbo temą,
iškeltus tikslus ir uždavinius? 0,2 0,1 0
25 Ar išvados pagrįstos analizuojama medžiaga; ar atitinka tyrimų rezultatus ? 0,2 0,1 0
26 Ar išvados yra aiškios ir lakoniškos? 0,1 0,1 0
27
Literatūros sąrašas (1 balas)
Ar bibliografinis literatūros sąrašas sudarytas
pagal reikalavimus? 0,4 0,2 0
28
Ar literatūros sąrašo nuorodos į tekstą yra teisingos; ar teisingai ir tiksliai cituojami
literatūros šaltiniai? 0,2 0,1 0
29 Ar literatūros sąrašo mokslinis lygmuo tinkamas moksliniam darbui? 0,2 0,1 0
30
Ar cituojami šaltiniai, ne senesni nei 10 metų, sudaro ne mažiau nei 70% šaltinių, o ne senesni kaip 5 metų – ne mažiau kaip 40%?
0,2 0,1 0
Papildomi skyriai, kurie gali padidinti surinktą balų skaičių
32 rekomendaci Praktinės jos
Ar yra pasiūlytos praktinės rekomendacijos ir
ar jos susiję su gautais rezultatais? +0,4 +0,2 0
Bendri reikalavimai, kurių nesilaikymas mažina balų skaičių
33
Bendri reikalavimai
Ar pakankama darbo apimtis (be priedų)
15-20 psl. (-2 balai) <15 psl. (-5 balai)
34 Ar darbo apimtis dirbtinai padidinta? -2 balai -1 balas
35 Ar darbo struktūra atitinka baigiamojo darbo rengimo reikalavimus? -1 balas -2 balai 36 Ar darbas parašytas taisyklinga kalba, moksliškai, logiškai, lakoniškai? -0,5 balo -1 balas 37 Ar yra gramatinių, stiliaus, kompiuterinio raštingumo klaidų? -2 balai -1 balas
38 Ar tekstui būdingas nuoseklumas, vientisumas, struktūrinių dalių apimties subalansuotumas? -0,2 balo balo -0,5
39 Plagiato kiekis darbe
>20% (nevert.
) 40
Ar turinys (skyrių, poskyrių pavadinimai ir puslapių numeracija) atitinka darbo struktūrą ir yra tikslus?
-0,2 balo balo -0,5
41
Ar darbo dalių pavadinimai atitinka tekstą; ar yra logiškai ir taisyklingai išskirti skyrių ir
poskyrių pavadinimai? -0,2 balo
-0,5 balo
42 Ar buvo gautas (jei buvo reikalingas) Bioetikos komiteto leidimas? -1 balas
43 Ar yra (jei reikalingi) svarbiausių terminų ir santrumpų paaiškinimai? -0,2 balo balo -0,5 44
Ar darbas apipavidalintas kokybiškai (spausdinimo, vaizdinės medžiagos, įrišimo kokybė)?
-0,2 balo balo -0,5
*Viso (maksimumas 10 balų):
*Pastaba: surinktų balų suma gali viršyti 10 balų.
TURINYS
SANTRUMPOS ... 14 SANTRAUKA ... 16 SUMMARY ... 17 ĮVADAS ... 12 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14 1.1. Lėtinis periodontitas... 141.2. Lėtinio periodontito diagnostika ... 14
1.3. Seilių sudėtis ... 16
1.4. Seilių panaudojimas diagnostikos tikslams ... 17
1.5. Seilėse esantys bio-junginiai, panaudojami lėtinio periodontito diagnostikai ... 18
1.5.1. Fermentai: ... 18
1.5.2. Specifiniai ir nespecifiniai baltymai:... 19
1.5.3. Kiti seilėse nustatyti biožymenys : ... 19
1.5.4. Su periodonto patologija susiję genai: ... 20
1.6. Seilėse esančių lėtinio periodontito žymenų testai ... 20
2. MEDŽIAGA IR METODAI ... 21 2.1.1. Medžiagos: ... 21 2.1.2 Tirpalai: ... 22 2.1.3 Antikūnai ... 22 2.2. Metodai: ... 23 2.2.1. Pacientų atranka: ... 23
2.2.2. Seilių mėginių rinkimas: ... 23
2.2.3. Baltymų koncentracijos nustatymas Bradford’o metodu ... 24
2.2.4. Baltymų elektroforezė (SDS-PAGE) ... 24
2.2.5. Baltymų analizė “Western blot” imunohibridizacijos metodu ... 25
2.2.6. Statistinė duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI ... 27 4. REZULTATŲ APTARIMAS... 34 IŠVADOS ... 37 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39 PRIEDAI ... 44
SANTRUMPOS
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas m. – metai mėn. – mėnesis d. – diena p – reikšmingumo lygmuo pav. – paveikslas pvz. – pavyzdžiui ir t.t. - ir taip toliau
CPITN (angl. community periodontal index of treatment needs) – bendras gydymo reikalingumo periodontologinis indeksas
PI (periodontal index) - periodontalinis indeksas
RANTES - (angl. Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted) – T limfocitų ir monocitų chemotaktinis veiksnys
iRNR - informacinė ribonukleino rūgštis Ig - imunoglobulinas
IL - interleukinas
DNR - deoksiribonukleorūgštis DPP IV - dipeptidilpeptidazė IV AAP - alanino aminopeptidazė AST - aminotransferazė
ALP - alanino aminotransferazė LDH - laktato dehidrogenazė MMP - matrikso metaloproteinazė
PAF - trombocitus aktyvuojantis faktorius
VGEF - kraujagyslinis endotelinis augimo faktorius TNFα - naviko nekrozės faktorius- α
HGF - hepatocitų augimo faktorius NF-KB - branduolio faktorius kappa B MIP - makrofagų uždegiminiai baltymai CD14 - limfocitų diferenciacijos antigenas 14 PGE2 - prostaglandinas E2
CRB - C reaktyvus baltymas
TRACP - tartratui atspari rūgštinė fosfatazė SR - serinu-argininu gausūs
SDS – natrio dodecilsulfatas
TAE – tris-acto rūgšties ir EDTA buferinis tirpalas TBE – tris-boro rūgšties ir EDTA buferinis tirpalas
TBST – tris-fosfatinis buferinis tirpalas su tween detergentu TEMED – N,N,N’,N’-tetrametiletilendiaminas
TMB – 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinas U2AF – U2 pagalbinis veiksnys HSP90 - termošoko baltymas 90
SERGANČIŲJŲ LĖTINIU PERIODONTITU SEILIŲ BALTYMINIAI
ŽYMENYS
SANTRAUKA
Problemos aktualumas ir darbo tikslas:
Lėtinis periodontitas - liga ne tik susijusi su pacientų gyvenimo kokybe, bet ir turinti įtakos sisteminei organizmo būklei. Šiuo metu naudojami periodonto ligų diagnostiniai metodai užima daug laiko ir yra pakankamai brangūs bei suteikia informaciją apie ligos sunkumą, bet ne aktyvumą. Egzistuojančias problemas padėtų išspręsti nauji lengvai įvykdomi diagnostiniai testai. Svarbu iš lengvai paimamų mėginių, tokių, kokios yra seilės, nustatyti baltyminius žymenis greitam ir lengvam lėtinio periodontito nustatymui. Darbo tikslas - panaudojus Western bloto metodą ir laboratorijoje turėtus įvairius antikūnius nustatyti ar/kaip kinta šių antikūnių aptinkamų baltymų ir bendras baltymų kiekis žmogaus seilėse ir įvertinti galimybę juos panaudoti kaip lėtinio periodontito žymenis.
Medžiaga ir metodai:
Surinkti 32 lėtiniu sunkiu generalizuotu periodontitu sergančiųjų (16) ir sveikų (16) pacientų seilių mėginiai. Atliktas seilėse esančių baltymų koncentracijos nustatymas Bradford’o metodu. Vykdyta baltymų elektroforezė. Seilėse esantys baltymai analizuoti „Western blot“ imunohibridizacijos metodu su anti-SR, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-HSP90 antikūniais. Duomenys įvertinti naudojant SPSS 17.0 statistinę programą.
Rezultatai:
Nustatėme, kad bendra baltymų koncentracija sergančiųjų lėtiniu sunkiu išplitusiu periodontitu seilėse (vidurkis - 0,82mg/ml) yra reikšmingai didesnė (p<0,001), nei sveikų asmenų seilėse (vidurkis - 0.24mg/ml). Su RNR brendimu susijusių SR baltymų kiekis migruojantis poliakrilamidiniame gelyje ties 35 kDa zona yra reikšmingai didesnis (raiška didesnė vidutiniškai 1,35 karto) sergančiųjų grupėje (p<0,022). Lėtinio sunkaus periodontito atveju aptinkamas padidėjęs SRSF1 baltymo kiekis.
Išvados:
Sergančiųjų lėtiniu sunkiu išplitusiu periodontitu pacientų, lyginant su sveikais asmenimis, seilėse randamas padidėjęs bendras baltymų kiekis ir 35 kDa gelio zonoje esančių SR baltymų kiekis.
SALIVARY BIOMARKERS OF CHRONIC PERIODONTITIS
SUMMARY
Relevance of the problem and aim of the work:
Periodontitis is associated with the patient‘s quality of life and has an impact on the overall health. Current methods used to diagnose periodontal diseases are time-consuming, economically inefficient and can provide information only on the disease severity but not on the disease activity. New quick easy-to-apply diagnostic tests, such as using salivary biomarkers, could help solve these problems. The aim of the study is to identify salivary biomarkers and overall protein concentration using Western blot method and antibodies against specific salivary proteins and to determine the possible use of such biomarkers.
Materials and methods:
32 salivary samples of patients with chronic severe generalized periodontitis (16) and healthy individuals (16) were collected. The total amount of protein was detected using Bradford‘s method. Protein electrophoresis was performed. Salivary proteins were analyzed applying “Western blot” immuno-hybridization method using anti-SR, anti-MMP-2, anti-MMP-9 and anti-HSP90 antibodies. Statistical analysis was performed using SPSS 17.0 program.
Results:
Total salivary protein concentration of patients with chronic severe generalized periodontitis (mean - 0,82mg/ml) significantly higher (p<0,001) than the control group (0,24mg/ml). The amount of SR protein migrating in polyacrylamide gel at 35kDA zone is significantly higher (p<0,022) than the control group (mean difference - 1.35 times). Higher amount of SRSF1 protein was detected in chronic periodontitis.
Conclusions:
Total protein concentration and total SR protein at 35kDA zone count was significantly higher in chronic severe generalized periodontitis patients’ saliva comparing with control group.
ĮVADAS
Nepaisant medicinos pažangos, gerėjančių gyvenimo sąlygų, ekonominio progreso, didesnio visuomenės informuotumo, periodonto ligos išlieka vienu didžiausių odontologijos iššūkių [1]. Lėtinis periodontitas yra šešta labiausiai paplitusi liga pasaulyje, pasitaikanti 11.2% populiacijos ir paveikusi apie 743 milijonus žmonių [2]. Periodonto ligų paveiktų pacientų skaičius nuo 1990 iki 2013 metų padidėjo 67% [3]. Europos Sąjungos statistikos duomenimis, apie 92% 25-64 metų Lietuvos gyventojų serga gingivitu arba lėtiniu periodontitu. Trečdaliui lietuvių reikalingas kompleksinis periodonto ligų gydymas [1]. Dvidešimt penkių atliktų studijų metu nustatyta, kad periodonto ligos, paveikdamos kramtymo funkciją ir pacientų šypsenos estetiką, daro reikšmingą įtaką sergančiųjų gyvenimo kokybei [4]. Be to, įrodyta, kad hematogeninės diseminacijos keliu bioplėvelėje esančios bakterijos, jų produktai ir pažeisto periodonto uždegimo mediatoriai (tokie kaip interleukinas 1-β, naviko nekrozės faktorius, ir t.t.) gali paveikti visą organizmą. Pastebimos asociacijos tarp lėtinio periodontito ir tokių sisteminių ligų kaip aterosklerozės, reumatoidinio artrito ir plaučių infekcijų [2]. Taip pat nustatytas lėtinio periodontito ryšys su lėtinėmis inkstų ligomis, vėžiu ir kognityvių funkcijų sumažėjimu [5]. Dėl periodonto ligų, netekus dantų, sumažėja kramtymo efektyvumas (kramtyme dalyvauja mažiau funkcinių porų - dantų, turinčių antagonistus). Taip atsitikus, pacientai renkasi lengviau kramtomą maistą, įtraukdami į mitybos racioną daugiau angliavandenių (tarp jų - cukraus) ir riebalų. Tokia nesubalansuota mityba gali sukelti cukrinį diabetą, netiesiogiai gali būti susijusi su kitomis sisteminėmis ligomis. Ankstyva lėtinio periodontito diagnostika, gydymas ir prevencija gali sumažinti šių ligų riziką, paciento diskomfortą ir pagerinti jo gyvenimo kokybę [2].
Periodonto ligų diagnostika yra atliekama odontologo ir susideda iš vizualinio tyrimo, dantenų kišenių matavimo, kraujavimo po zondavimo ir tokių klinikinių parametrų kaip dantenų recesija, dantų paslankumas ir furkacijų pažeidimų nustatymas. Papildoma diagnostinė priemonė - radiologinis tyrimas, parodantis kaulo, supančio dantį, kiekį [6]. Šie diagnostiniai metodai užima daug laiko ir yra pakankamai ekonomiškai brangūs [7]. Klinikinis ištyrimas užima daug laiko, yra subjektyvus ir dažnai yra nemalonus pacientams. Radiologinio diagnostinio metodo panaudojimas yra limituojamas esant kontraindikacijoms (pvz.: nėštumas ir t.t.) dėl žalingo rentgeno spindulių poveikio. Šiuo metu naudojamos diagnostinės priemonės suteikia informaciją apie ligos sunkumą bet ne aktyvumą ir jas panaudojant sunku nuspėti gydymo rezultatą [8].
13 Lėtinio periodontito atveju pacientai dažnai nejaučia skausmo ar bendrinių simptomų, todėl nesikreipia į specialistus pradinėse ligos stadijose. Reguliariai pas odontologą nesilankantys pacientai gali nežinoti ligos ankstyvių požymių arba juos ignoruoti ir kreiptis tik ligai pasiekus sunkaus lėtinio periodontito stadiją, kurios atveju reikalingas papildomas gydymas, t.y. giluminis kiuretažas, lopo ar regeneracinės operacijos ir net jį taikant, gali nepasisekti išsaugoti dantų [6].
Šias šiuo metu egzistuojančias problemas padėtų išspręsti naujų lengvai įvykdomų diagnostinių testų atradimas [6]. Molekulinė diagnostika - tai technika, naudojama lengvai ir neskausmingai paimamiems biologiniams markeriams nustatyti. Lėtinio periodontito diagnostikai galima naudoti seiles, nes jose yra nukleino rūgščių ir baltymų, kurie siejami su patologinėmis sąlygomis ir komplikacijomis, susijusiomis su šia liga [9]. Šiuo metu literatūroje sutinkami tokių elementų identifikavimo tyrimai - genominės (seilėse esančių DNR), transkriptominės (seilėse esančių iRNR) ir proteominės (seilėse esančių baltymų) analizės [10].
Problema: Literatūriniai duomenys apie baltyminių žymenų panaudojimą lėtinio periodontito
nustatymui yra riboti, todėl labai svarbu iš lengvai paimamų mėginių, tokių kaip seilės, nustatyti baltyminius žymenis greitai ir lengvai lėtinio periodontito diagnostikai.
Hipotezė: Sunkiu lėtiniu išplitusiu periodontitu (Periodontitis chronica difficilis generalisata)
sergančių pacientų seilėse, lyginant su kontroline grupe, bus pakitęs baltymu kiekis.
Tyrimo tikslas: Panaudojus Western bloto metodą ir laboratorijoje turėtus įvairius antikūnius įvairiems
baltymams identifikuoti, nustatyti ar/kaip kinta šių antikūnių aptinkamų baltymų kiekis žmogaus seilėse ir įvertinti galimybę juos panaudoti kaip lėtinio periodontito žymenis.
Tyrimo uždaviniai:
1. Palyginti sveikų ir lėtiniu sunkiu generalizuotu periodontitu sergančių pacientų seilėse bendrą baltymų kiekį.
2. Panaudojus laboratorijoje turėtus antikūnius nustatyti jų detektuojamų baltymų kiekio pokyčius sergančiųjų sunkiu lėtiniu išplitusiu periodontitu (Periodontitis chronica difficilis generalisata) seilėse.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Lėtinis periodontitas
Periodontas yra dantį supančių struktūrų visuma, kurią sudaro dantenos, danties šaknies cementas, periodonto raištis ir alveolinės ataugos kaulas [11]. Lėtinis periodontitas - infekcinė liga. Uždegiminės reakcijos, susijusios su jungiamojo audinio jungties praradimu, sukelia alveolinės ataugos kaulo vainikinės dalies, palaikančios dantis kaule, rezorbciją [12]. Ją sukelia dantų bioplėvelėje esantys mikroorganizmai. Šių patogenų buvimas yra inicijuojantis veiksnys lėtiniam periodontitui atsirasti. Ligą sukelia nepakankamos individo imuninės reakcijos į minėtus patogenus [13]. Lėtinį periodontitą sukelia ne konkretaus mikroorganizmo buvimas, bet bendro mikroorganizmų santykio pasikeitimas [14]. Bakterijos, turinčios didžiausią įtakos ligai išsivystyti, yra Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola ir Tannerella forsythia. Kiti pagrindiniai identifikuojami mikroorganizmai - Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Peptostreptococcus migros, Eikenella corrodens [15]. Uždegiminėse reakcijose dalyvauja imuninės ląstelės: neutrofilai, T ir B limfocitai, makrofagai. Jos produkuoja specifinius uždegimo mediatorius, sukeliančius jungiamojo periodonto audinio destrukciją [16]. Pirminėje periodonto pažeidimo stadijoje pakitimai gali būti matomi tik histologiškai. Bakterijų metaboliniai produktai sukelia jungties epitelio ląstelių atsaką - jos produkuoja citokinus ir stimuliuoja neuropeptidų išsiskyrimą. Vyksta uždegiminių ląstelių migracija ir komplemento sistemos aktyvacija. Gali būti stebimas dantenų kraujavimas. Vėlesnio pažeidimo stadijoje vyksta perėjimas nuo pirminių imuninių reakcijų į antrines, kur vyrauja imunoglobulinai ir kolagenolitiniai reiškiniai. Jungties praradimas šioje stadijoje stebimas ir kliniškai, ir histologiškai. Ligai progresuojant, pažeidimas pereina ir į alveolinės ataugos kaulą, sukeldamas jo netekimą [17].
1.2. Lėtinio periodontito diagnostika
Diagnostiniai metodai turėtų suteikti informaciją diferencinei diagnostikai, ligos stadijai, vietai, stiprumui ir prognozei nustatyti. Jie turėtų būti tinkami naudoti visai populiacijai, suteikti galimybę pažeistose vietose diferencijuoti aktyvią stadiją nuo neaktyvios ir nuspėti gydymo eigą ir efektyvumą bei uždegimo laipsnį [8]. Diagnostiniai metodai taip pat turi pasižymėti jautrumu - rodikliu, rodančiu,
15 kad sergančio žmogaus duomenys patvirtina ligą ir specifiškumu - rodikliu, rodančiu, kad sveiko žmogaus duomenys patvirtina jog jis yra sveikas. Deja, dažniausiai diagnostinis metodas pasižymi arba vienu, arba kitu kriterijumi [12].
Norint diagnozuoti lėtinį periodontitą ir įvertinti ligos sunkumo laipsnį, naudojami tokie klinikiniai parametrai kaip dantenų kišenės zondavimo lygis, jungties vieta, kraujavimas zonduojant, apnašų indeksai ir radiologinis tyrimas, vertinant alveolinės ataugos kaulo rezorbciją. Rečiau diagnostikai naudojami mikrobiologiniai tyrimai, norint nustatyti patogenines bakterijas bei vertinama imuninės sistemos veikla dantenų vagelės skystyje [18].
Pagrindinis diagnostinis metodas šiais laikais vis dar yra periodonto kišenių matavimas [12]. Šis metodas turi keletą trūkumų. Diagnozuojant lėtinį periodontitą, zonduojamų kišenių gylis turi būti bent 2-3 mm, kuriam pasiekti reikalingas tam tikras destrukcijos laipsnis. Dėl to sunku nustatyti ligą pirminio pažeidimo stadijose [19]. Lėtinio periodonto pažeidimo stadija nustatoma pagal jungties praradimą - lengvai formai priskiriamas 1-2 mm praradimas, vidutinei - 3-4 mm, o sunkiai - 5 ir daugiau mm [20]. Tai subjektyvus metodas, nes kišenės gylis gali priklausyti nuo tiriančiojo panaudojamos jėgos zondavimo procedūros metu. Taip pat, esant aktyviam uždegimui, zondo galiukas gali ir nepasiekti sveiko dantenų audinio. Rezultatas taip pat gali priklausyti nuo zondo formos ir galiuko storio [21].
Šios priežastys verčia ieškoti alternatyvių diagnostinių metodų. Kartu su tradiciniais diagnostiniais kriterijais, uždegimą ir periodonto audinių pažaidą įvertinti gali būti naudojami biocheminiai mediatoriai - uždegimo biožymenys, mikrobiologinės diagnostinės procedūros, imunologiniai ir genetiniai metodai [18].
Biožymuo - junginys, kurį galima pamatuoti objektyviai ir naudoti kaip normalaus, patogininio biologinio procesų, farmakologinių efektų į terapinį gydymą indikatorius. Tai - organizme sintetinamos molekulės, kurias galima panaudoti norint vertinti sveikatos būklę, ligos pradžią, atsaką į gydymą ir prognozę [22].
Biožymenys gali būti suskirstomi į tris kategorijas: 1. Rodantys esamą ligos stadiją. 2. Padedantys nuspėti būsimą ligos eigą. 3. Padedantys nuspėti ligos atsiradimą, pacientui esant sveikam [23].
1.3. Seilių sudėtis
Seilės visų pirma yra skystis, kurį išskiria egzokrininės seilių liaukos ir kurį sudaro 99% vandens. Šiame skystyje taip pat randama elektrolitų, baltymų, (fermentų, imunoglobulinų ir kitų antimikrobinių faktorių, glikopeptidų, albuminų, polipeptidų, oligopeptidų) svarbių burnos ertmės sveikatai. Skystyje taip pat randama gliukozės ir azoto junginių turinčių produktų (šlapalo ir amoniako) [24]. Negalima teikti, kad tai - tik seilių liaukų produktas, nes sekretavus į burnos ertmę, seilėse taip pat randama nosiaryklės sekreto, dantenų vagelės skysčio, maisto likučių, kraujo komponentų (plazmos baltymų, eritrocitų ar leukocitų uždegimų, sužalojimo atveju) [25], gleivinės transudato iš visų burnos ertmės paviršių ir deskvamuotų epitelio ląstelių [26].
Seilėse baltymų kiekis svyruoja nuo 0.5 iki 3 mg/ml. Baltymų koncentracija yra stabili ir nepriklauso nuo sekrecijos greičio. 30-40 % baltymų esančių seilėse yra sintetinami seilių liaukose. Likę baltymai yra iš kraujo serumo, gleivinės, imuninių ir deskvamuoto epitelio ląstelių ir mikroorganizmų [27]. Baltymai sudaro 0.3% visų seilių sudėties. Didžiausią dalį seilėse randamų baltymų sudaro prolino amino rūgščių likučiais gausūs baltymai, sudarantys apie 70% paausinės seilių liaukos sekreto. Nors daugelis baltymų, randamų seilėse, yra seilių liaukų sekrecinės kilmės, seilėse taip pat yra pasyvi dalis serumo kilmės baltymų. Pavyzdžiui, iš dantenų vagelės skysčio, ypač esant uždegimui, seilėse randami serumo kilmės baltymai, tokie kaip albuminai arba Zn-alfa2-glikoproteinai. Be to, burnos ertmėje esančiose seilėse randami ir baltymai iš endotelio ląstelių ir neutrofilų [28]. Taip pat seilėse randama α-amilazė ir žymiai mažesnėmis koncentracijomis aptinkami antibakteriniai baltymai, tokie kaip lizocimas, laktoferinas, imunoglobulinai (pagrinde - IgA) ir histatinai [29]. Ištyrus spektrofotometrijos metodu, buvo identifikuoti 35 664 skirtingų peptidų sudarančių 4161 baltymų žmonių seilėse. 1946 jų buvo bakterinės kilmės, o 2090 buvo eukoratinės, žmogaus organizmo, kilmės. Buvo nustatyta didesnė komplemento sistemos ir uždegimo mediatorių ekspresija pacientų, sergančių lėtiniu periodontitu, seilėse [30].
Seilių baltymai turi daug funkcijų - dalyvauja imuniniame atsake, mažina kalcio įsodinimą, prisideda prie skonio suvokimo, dalyvauja virškinime, dalyvauja burnos ertmės apsauginėse reakcijose, transkripcijoje, signalų perdavime, chemotaksyje bei ląstelių judėjime [31].
17
1.4. Seilių panaudojimas diagnostikos tikslams
Seilėse esantys baltymai yra įvairių biologinių reakcijų rodikliai. Tokioms reakcijoms priklauso virškinimas (pvz.: amilazė, peptidazė, maltazė ir t.t.), apsauginės reakcijos burnos ertmėje ir virškinamajame trakte (imunoglobulinai, cistatinai, lizocimas ir t.t.), kardiovaskulinės sistemos veikla (histaminas, kalikreinas ir t.t.), kraujodara (eritropoetinas, timocitų transformacijos faktoriai ir t.t.) ir nervų sistemos veikla (nervų augimo faktoriai (veiksniai)). Dėl to seilės gali būti naudojamos neinvazyviai klinikinei įvairių ligų diagnostikai [32]. Seilių baltymai yra lengvai pasiekiamas šaltinis patologiniams pokyčiams nustatyti todėl yra patogi sistema nustatant/atrandant burnoje vykstančių patologinių pokyčių biožymenis[33].
Seilėse esantys fermentai, hormonai, antikūnai, antimikrobiniai agentai ir augimo faktoriai pasiekia seiles iš kraujo pereidami per tarpląstelinius tarpus (pasyvios intraceliulinės difuzijos arba aktyvaus transporto būdu) arba aplink ląsteliniu keliu (ekstraląsteline ultrafiltracija). Dėl to seilės funkciškai yra kažkiek panašios į kraujo serumą. Baltymai jose randami žemesnėmis koncentracijomis [34], tačiau pritaikant naujausias technologijas, galima išskirti ir seilėse esančius mažesnius baltymų kiekius [35]. Seilių rinkimas diagnostinės analizės tikslais turi daug privalumų - yra nebrangus, neinvazyvus, sumažinama infekcijos tikimybė, yra patrauklesnis pacientams metodas. Seiles užšaldžius lengva laikyti [26]. Palyginus su serumu, seiles taip pat lengviau pritaikyti daugkartinei diagnostikai, nes jos nesudaro krešulių. Jos taip pat yra ekonomiškesnis variantas [35].
Seilės gali būti surinktos skirtingomis formomis:
1. Nestimuliuotos seilės - seilės, išskirtos seilių liaukų ramybės metu, be egzogeninių dirgiklių. Jos tinkamesnės diagnostikai, nei stimuliuotos seilės, nes pastarose baltymų kiekis yra mažesnis ir tuomet jie gali būti sunkiau aptinkami.
2. Stimuliuotos seilės - seilės, kurios yra sekretuojamos kaip atsakas į skoninius arba kramtomuosius dirgiklius.
3. Seilių liaukose esančios seilės prieš jas sekretuojant į burnos ertmę [36].
Seilių DNRanalizė suteikia galimybę identifikuoti invazyvių patogenų buvimą ir genų pakitimus [37]. DNR seilėse nustatyta tarp 1.8 – 128.4 μg/ml (vidurkis - 21.6 μg/ml). Maždaug 70% randamo DNR yra paties individo, o 30% DNR nustatoma iš burnos ertmės mikrobiotos [10]. Seilėse esančių DNR kiekis yra mažas, todėl reikiamos sekos, prieš jas analizuojant, yra padauginamos naudojant polimerazės grandinės reakcijos metodą [38].
Transkriptominė seilių analizė yra gan sudėtinga, nes iRNR nėra stabili ir seilse esančių fermentų poveikyje lengvai suyra. Seilėse iš kurių centrifugavimo būdu yra pašalintos ląstelės nustatyta nuo 0.108 ± 0.023 μg/ml iki 6.6 ± 3.6 μg/ml RNR. Tarp jų nustatyta 3000-6400 žmogaus ivairių iRNR izoformų rūšių [10]. Tai, kad seilėse iš kurių ląstelės yra pašalintos,vis tiek randama RNR grindžiama tuo, kad panašiai kaip ir kraujo plazmoje, seilėse dalis RNR grandinės dėl su RNA sąveikaujančių baltymų yra apsaugotos nuo degradacijos [39].
Proteominė analizė yra svarbus diagnostinis įrankis, kuris yra naudojamas ląsteliniams baltymams, kurių raiška reaguoja į organizmo pokyčius, identifikuoti [33]. Baltymų raiškos bei modifikacijos pokyčiu nustatymui šiuo metu yra naudojamos įvairios metodikos, tokios kaip vienakryptė ar dvikryptė gelių elektroforezė, Western bloto metodas, masių spekrtrofotometrija ir t.t. [40].
1.5. Seilėse esantys bio-junginiai, panaudojami lėtinio periodontito diagnostikai
Gilėjant periodonto kišenėms, daugėja dantenų vagelės skysčio bei aktyvių ligos stadijų metu seilėse nustatomi padidėję uždegimo mediatorių kiekiai [41]. Seilėse esantys fermentai, specifiniai ir nespecifiniai baltymai, antikūnai ir kitos medžiagos gali būti naudojamos kaip lėtinio periodontito ir audinių destrukcijos biožymenys [42].
1.5.1. Fermentai:
Seilėse esantys fermentai yra sintezuoti mikroorganizmų, polimorfonuklearinių leukocitų, burnos ertmės epitelinių ląstelių ir seilių liaukų [43]. Šie fermentai - įvairios proteazės, išskiriamos iš fagocitinių ląstelių. Joms priklauso katepsinas B ir katepsinas K [8] katepsinas G bei dipeptidilpeptidazė IV (DPP IV) ir alanino aminopeptidazė (AAP) [22]. Taip pat iš polimorfonuklearinių ląstelių išskiriamą neutrofilų elastazė, myeloperoksidazė [8], chitinazė ir heksaminidazė [42]. Įrodyta, kad tokių fermentų kaip aspartato aminotransferazė (AST), alanino aminotransferazė (ALP) ir laktato dehidrogenazė (LDH) raiškos/aktyvumo pokyčiai seilėse gali būti naudojami sekant lėtinio periodontito progresavimą ir gydymo efektyvumą [44]. Šiam tikslui taip pat galima būtu naudoti matrikso metaloproteinazes 8 ir 9 (MMP-8 ir MMP-9), po periodonto terapijos jų sumažėjusių fermentų kiekiai seilėse padeda nustatyti ligos stabilizavimą. Taip pat lėtiniu periodontitu sergančių žmonių seilėse nustatomi padidėję fermentų laktoferino [42], lizocimo, β-glukuronidazės [22], β-glukozidazės, β-galaktozidazės, kolagenazės, esterazės, gelatinazės, kalikreino, kinazės, tripsino
19 [18], o lėtinio periodontito - ir α-amilazės kiekiai seilese [45]. Kaulo destrukciją, būdinga periodonto uždegimui, taip pat rodo osteokalcinas, osteonektinas, šarminė fosfatazė ir telopeptidazės [43].
1.5.2. Specifiniai ir nespecifiniai baltymai:
Lėtinio periodontitu sergančių žmonių seilėse randami specifiniai uždegimui baltymai - imunoglobulinai IgA, IgG, IgM [22]. Imunoglobulinas A turi du pogrupius - IgA1 randamą serume ir IgA2 randamą sekreciniuose skysčiuose, tarp jų - ir seilėse [43]. Taip randami padidėję faktorių - trombocitus aktyvuojančio faktorio (PAF), kraujagyslinio endotelinio augimo faktoriaus (VGEF), naviko nekrozės faktoriaus-α (TNF-α) hepatocitų augimo faktoriaus (HGF) [42], bei epidermio augimo faktoriaus [43]. Seilėse randami uždegimui būdingi citokinai - interleukinai 1β (IL-1β), 6 (IL-6), 11 (IL-11), 17 (IL-17). Santykis tarp citokinų NF-KB, RANKL ir osteopotegrino (OPG) padeda sekti ligos eigą [8]. Kaip atsakas į IL-1-β, seilėse aptinkami chemokinai - CCL3 (MIP-1α), CXCL8 (IL-8), CXCLL10 ir seilėse tirpus CD14 (SCD14) [45]. Nustatant IL-1β, MMP-8, MIP-1α ir OPG veiksnių seilėse kiekius galima spręsti apie ligos stadija ir atsaką į gydymą [44]. Lėtiniu periodontitu sergančių pacientų seilėse taip pat nustatyti padidėję cistatinų C ir SN kiekiai, o padidėjęs cistatino S kiekis kaip tik nustatytas sveikų pacientų seilėse [18]. TIMP-1 (metalo proteinazių inhibitorius audiniuose), susijusio su metaloproteinazių apykaita, baltymo kiekis taip pat sumažeja periodonto patologijos atveju. Sergančiųjų seilėse taip pat randama prostaglandino E2 (PGE2) [8], albuminų, vitaminą D surišančių,
kalcį surišančių baltymų, α2- makroglobulinų, komplemento C3 [45], MG2 mucinų, histatino [43],
heopterino ir fibronektino. CRB (C-reaktyviojo) baltymo padidėjęs kiekis nustatomas sergančiųjų seilėse kaip atsakas į uždegimą [42]. Tiriant baltymų aktyvumą ir veiklą, nustatyti padidinti haptoglobino, prolaktino kiekiai ir S100A9, PSP, S100A8 baltymų raiška [44]. Kol kas tik dantenų vagelės skystyje, tačiau kaip lėtinio periodontito žymenys nustatyti onkostatinas M, karboksiterminalinis I tipo kolageno telopeptidas [8] ir TRACP 5b [45].
1.5.3. Kiti seilėse nustatyti biožymenys :
Lėtiniu periodontitu sergančių žmonių seilėse taip pat randamos amino rūgštys, ypač prolinas, padidėjęs kacio jonų kiekis (tačiau šiuo metu yra dar per mažai įrodymų, kad pastaruosius galima naudoti kaip lėtinio periodontito žymenis). Įrodyta, kad padidėjęs kortizolio lygis seilėse susijęs su periodonto patologija. Su blogu kvapu siejami padidėję lakių dalelių - vandenilio sulfido, metimerkaptano kiekiai, pirolinai ir piridinai [18]. Oksidacinio streso indikatorius 8-hidroksi-2-deoksiguanozino kiekis, azoto oksido (NO) radikalas, reikalingas normaliai neutrofilų ir makrofagų funkcijai ir jį kontroliuojančios arginazės kiekiai taip pat susiję su periodonto patologija. Nustatytas ir su B-ląstelių limfoma-2 susijusios transkripcijos neutrofiluose padidėjusi ekspresija lėtiniu periodontitu
sergančių pacientų seilėse [42]. Taip pat yra iškelta hipotezė, kad lėtiniu periodontitu sergančių žmonių seilėse randama daugiau epitelio keratinų [43].
1.5.4. Su periodonto patologija susiję genai:
Nustatyti daugiau, nei 70 genų, asocijuojamų su lėtiniu periodontitu. Laboratorijose nustatoma nukleotidiniai interleukinų (pvz.: IL-1, IL-6) geno polimorfizmai, kurių dėka numatoma didesnė tikimybė susirgti lėtiniu periodontitu. Šie polimorfizmai taip pat pažymi didesnė dantų praradimo ir sunkių periodontito formų riziką [46].
1.6. Seilėse esančių lėtinio periodontito žymenų testai
Praktikoje šių biomarkerių žinios pritaikomos kuriant testus lėtinio periodontito diagnostikai. Amerikoje taikomi du testai: odontologai surenka seilių mėginius ir siunčia juos į laboratoriją. Su tikslu nustatyti seilėse esančias tam tikras DNR sekas atliekama DNR-polimerazės grandininės reakcijos analizė. Vienas šių testų padeda identifikuoti seilėse esančius patogeninius mikroorganizmus, kitas padeda identifikuoti padidintos rizikos grupės pacientus genetinių testų pagalba, nustatydamas paciento polinkį produkuoti IL-1 padidintus kiekius uždegimo metu [6]. Šie testai sukurti OralDNA® laboratorijos. MyPerioPath® yra minėtas bakterinis, o MyPerioID® - genetinio polinkio testas [47].
Paslėpto kraujo seilėse testas (Salivary occult blood test - SOBT) sukurtas Japonijoje. Šis testas panaudoja anti-žmogaus-hemoglobino antikūnį. Šis testas, autorių teigimu, yra alternatyva tradicinėms diagnostinėms procedūroms, tačiau pilnai jų pakeisti negali [48].
Minėti pirmos kartos testai gali būti skirti ankstyvesnių stadijų bei polinkio lėtiniam periodontitui diagnostikai, kuomet tam tikri žymenys aptinkami pacientų seilėse. Šių testų trūkumas - nėra nustatoma tiesioginė koreliacija tarp tam tikro mikroorganizmo arba imuninių reakcijų agento ir periodonto pažeidimo laipsnio [6].
Taip pat kuriami šiuolaikine mikrogardelių metodu paremti diagnostikos tyrimai. Tokių metodų panaudojimas padės diferencijuoti sveikus pacientus, nuo sergančiųjų lėtiniu periodontitu pagal CRP lygmenį. Sistema vadinama Electronic Taste Chip (ETC). Didelės ETC esančių antikūnių koncentracijos leis nustatyti ypač mažus CRB kiekius [23]. Tačiau mikrogardelių metodas šiuo metu nėra tikslus, todėl gauti rezultatai vis dar yra tikrinami eksperimentiškai.
21
2. MEDŽIAGA IR METODAI
2.1.1. Medžiagos:
2-merkaptoetanolis (Merck); Acto rūgštis (Merck); Agarozė (Roth); Agarozė (Roth);
Amonio peroksodisulfatas (APS) (Fluka-Sigma); Boro rūgštis (Sigma);
Bromfenolio mėlis (Roth);
Chromatografinis popieriaus (Whatman) DTT (Sigma);
EDTA (Roth);
Etanolis (Vilniaus degtinė); Etidžio bromidas (Sigma); Glicerolis (Roth); Glicinas (Roth); HCl (Roth); HEPES (Roth); KH2PO4 (Reachim); Metanolis (Sigma); Na2HPO4×2H2O (Roth);
NaCl (Acros Organics);
Nitroceliuliozinė membrana (Sigma); Pieno milteliai (Roth);
Ponceau S (Merck);
Proteazių inhibitorių kokteilis (Roth) SDS (Roth);
TEMED (Fluka-Sigma); TMB (Merck);
TRIS (Roth);
2.1.2 Tirpalai:
PBS buferinis tirpalas: 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4×2H2O, 1,8 mM KH2PO4.
TBS buferinis tirpalas: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl.
TBST buferinis tirpalas: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20. 4x Tris-Cl/SDS buferinis tirpalas, pH 6,8 (0,5 M Tris, 0,4% SDS).
4x Tris-Cl/SDS buferinis tirpalas, pH 8,8 (1,5 M Tris, 0,4% SDS). 0,5 M EDTA tirpalas, pH 8,0.
1x baltymų elektroforezės buferinis tirpalas: 25 mM Tris, 250 mM Glycine, 0.1% SDS. 1x baltymu pernešimo buferinis tirpalas: 26 mM Tris, 108 mM glicino, 20% metanolio.
1x baltymų mėginio užnešimo buferis: 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% Glycerol, 1% merkaptoetanolio, 12.5 mM EDTA, 0.02% Bromfenolio mėlio dažo.
10% SDS tirpalas.
1% agarozė: 1% agarozės 1x TAE buferiniame tirpale. 1,5 % agarozė: 1,5 % agarozės 1× TBE buferiniame tirpale. Etidžio bromido tirpalas: 0,5 μg/ml etidžio bromidas.
1x TAE buferinis tirpalas: 40 mM Tris Acto rūgšties, 1 mM EDTA (pH 8,0). 1x TBE buferinis tirpalas: 45 mM Tris-Boro rūgšties, 0,001 M EDTA (pH 8,0).
Membranos išvalymo buferinis tirpalas: 100 mM 2-merkaptoetanolis, 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl (pH6,8).
2.1.3 Antikūnai
Triušio anti-metalo proteinazės 2 ir 9.
Pelės monokloninis anti-HSP90 (Thermo Fisher Scientific). Pelės monokloninis anti‐SR (Milipore).
Pelės monokloninis anti-β-aktinas (Abcam). Pelės monokloninis anti-SRSF1 (Abcam).
Polikloniniai ožkos anti-triušio antriniai antikūnai, konjuguoti su krienų peroksidaze (DakoCytomation).
23
2.2. Metodai:
2.2.1. Pacientų atranka:
Tyrimo dalyviai - sunkia išplitusia lėtinio periodontito (Periodontitis chronica difficilis generalisata) forma sergantys žmonės bei kontrolinė grupė - pacientai be periodonto patologijos. Pacientų apžiūros metu buvo remtasi šiais diagnostiniais kriterijais:
1. Remiantis dantenų kišenių gyliu: sunkiai lėtinio periodontito formai priskiriamos 5mm ir gilesnės kišenės. Generalizuota forma diagnozuojama tada, kai šios kišenės nustatomos daugiau, nei 30% zonduojamų vietų [49]. Kontrolinės grupės pacientų kišenių zondavimo gylis - ne daugiau 2mm.
2. Remiantis CPITN indeksu: skiriant balus nuo 0 iki 5 atsižvelgiant į periodonto audinių būklę. (0 - be patologijos, 1- kraujavimas po zondavimo, 2- virš/podanteninės dantų apnašos, 3- kišenės 3,5-5,5mm, 4- kišenės gilesnės, nei 6 mm, 5- dantų nėra) Šios reikšmės buvo priskiriamos ištyrus 16, 21, 26, 36, 41, 46 periodonto audinių būklę. Imama didžiausia reikšmė [50]. Tiriamųjų grupei priskirti pacientai su 4 ir didesne didžiausia CPITN reikšme. Kontrolinės grupės pacientų CPITN reikšmė - 0 arba 1.
3. Remiantis periodontiniu indeksu (PI): tiriami visi dantys ir priskiriami balai pagal šiuos vertinimo kriterijus: 0 - nėra ligos požymių, 1 - lengvas gingivitas, 2 - gingivitas, 6 - gingivitas su periodontinės kišenės formavimusi, 8 - pažengusi periodonto destrukcija, kai kramtymo funkcija prarasta. Balai sudedami ir dalinami iš tiriamų dantų skaičiaus. Rezultatai vertinami pagal gautąjį vidurkį: sveiki audiniai - 0-0,2, gingivitas - 0,3-0,9, prasidėjusi destrukcinė periodonto liga - 0,7-1,9, pažengusi destrukcinė periodonto liga - 1,6-5,0 ir terminalinė destrukcinės periodonto ligos stadija - 3,8-8,0 balai [51]. Tiriamųjų grupei priskirti pacientai su 3,2 ir didesne reikšme. Kontrolinės grupės pacientų PI reikšmė - 0,8 ir mažesnė.
Tyrime dalyvavo nerūkantys, sisteminėmis ligomis nesergantys, medikamentų nevartojantys 18 - 65 metų amžiaus pacientai.
2.2.2. Seilių mėginių rinkimas:
Tyrimas buvo atliekamas nuo 2018-01-01 iki 2018 03 15. Seilių mėginių rinkimui iš pacientų buvo gautas bioetikos komisijos leidimas Nr. BEC-CF-87. Seilių mėginiai buvo paimti vizito pas gydytoją odontologą - periodontologą vizito metu Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Dantų ir burnos ligų klinikoje. Taikytas „spjovimo“ seilių rinkimo metodas. Jo metu seilėms leidžiama susikaupti burnoje ir išspjaunama į specialiai paruošta mėgintuvėlį taip užtikrinant
pakankamą seilių kiekį esant žemam tėkmės greičiui [36]. Taip pacientų prašoma taip pripildyti 1.5 ml talpos mėgintuvėlį, kuriame yra 5µl proteazių inhibitorių mišinio, naudojamo siekiant sumažinti fermentinį baltymų yrimą, kurį sukelia endogeninių proteazių veikla [52]. Seilės pernešamos leduose (+4°C), kurie naudojami kaip laikina priemonė kelioms valandoms sustabdyti baltymų degradaciją [10]. Mėginiai buvo saugomi -80ºC temperatūroje [53].
2.2.3. Baltymų koncentracijos nustatymas Bradford’o metodu
Baltymų koncentracijos tirpaluose nustatomos naudojantis Bradford’o metodu. Kalibracinei kreivei sudaryti paruošiami žinomos BSA koncentracijos (0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml ir 1 mg/ml BSA) tirpalai. 10 μl kiekvieno tirpalo (kontrolinis tirpalas – 10 μl vandens) sumaišoma su 1 ml Bradford’o reagento, gerai išmaišoma, laikoma 5 min. tamsoje ir matuojama kiekvieno mėginio šviesos sugertis 595 nm bangoje. Iš gautų duomenų sudaroma kalibracinė kreivė – sugerties priklausomybė nuo baltymo koncentracijos. Išmatavus atitinkamai paruošto tiriamojo tirpalo sugertį, pagal sudarytą kalibracinę kreivę nustatoma baltymų koncentracija [54].
2.2.4. Baltymų elektroforezė (SDS-PAGE)
Baltymų elektroforezė denatūruojančiomis sąlygomis poliakrilamidiniame gelyje atliekama keliais etapais.
Gelių užpylimas:
10 % skiriamojo gelio sudėtis:10 % akrilamidas-bisakrilamidas, 0,375 M Tris (pH 8,8), 0,1% SDS, 0,1 % APS, 0,01 % TEMED.
Švelniai purtant tirpalai sumaišomi ir įpilami į ertmę tarp stiklų. Ant viršaus užpilama 1 ml izopropanolio. Sustingus skiriamajam geliui (polimerizacija vyksta ~ 30 min), izopropanolis nupilamas, gelio paviršius praplaunamas distiliuotu vandeniu ir nusausinamas filtriniu popieriumi. Ant viršaus pilamas koncentruojantis gelis.
4 % koncentruojančio gelio sudėtis: 4 % akrilamidas-bisakrilamidas, 0,125 M Tris (pH 6,8), 0,1 % SDS, 0,1 % APS, 0,01 % TEMED.
Užpylus viršutinį gelį, šukomis suformuojami šulinėliai. Sustingus geliui, šukos ištraukiamos, šulinėliai praplaunami elektrodiniu buferiniu tirpalu ir forma įstatoma į aparatą.
Mėginių paruošimas:
Mėginiai elektroforezei lygiomis dalimis sumaišomi su du kartus koncentruotu buferiniu tirpalu (Sample buffer), turinčiu 2-merkaptoetanolio, denatūruojami 10 min kaitinamajame bloke 100ºC temperatūroje, atvėsinami lede ir įnešami į gelio šulinėlius.
25 Elektroforezės eiga:
Elektroforezė atliekama vertikaliame aparate. Viršutinis ir apatinis aparato rezervuarai užpildomi 1x baltymų elektroforezės buferiniu tirpalu. Mėginiai įnešami į šulinėlius po elektrodinio buferinio tirpalo sluoksniu. Elektroforezė atliekama, esant 120 V įtampai. Dažo frontui išėjus iš gelio, elektroforezė dar tęsiama 5 min. Po to srovės šaltinis išjungiamas, stiklai atskiriami vienas nuo kito ir nupjaunamas koncentruojantis gelis. Priklausomai nuo tolimesnių tyrimų, skiriamasis gelis dažomas ir džiovinamas arba atliekamas baltymų pernešimas iš gelio ant nitroceliuliozinės membranos [54].
2.2.5. Baltymų analizė “Western blot” imunohibridizacijos metodu
Baltymų analizė „Westernblot“ imunohibridizacijos metodu atliekama pagal žemiau pateikta metodiką:
Po baltymų elektroforezės atliekamas baltymu pernešimas iš poliakrilamidinio gelio ant nitroceliuliozinės membranos. Vonelėje su 1x baltymu pernešimo buferiniu tirpalu suformuojamas pernašos „sumuštinis“: ant poroloninio pagrindo dedami du 3 mm storio chromatografinio popieriaus lakštai,skiriamasis gelis su jame išfrakcionuotais baltymais, nitroceliuliozinė membrana, dar du 3 mm storio chromatografinio popieriaus lakštai ir poroloninis pagrindas ant viršaus. Pernašos „sumuštinis“ suformuojamas taip, kad neliktų oro burbulų ir įstatomas į baltymų pernešimo aparatą. Baltymų pernešimas atliekamas 1 h 1x baltymų pernešimo buferiniame tirpale, šaldant ir esant 100 V įtampai. Po baltymų pernešimo baltymų pernešimo ant membranos efektyvumo nustatymui membrana buvo dažoma Ponceau S tirpalu. Vėliau membrana 1 h blokuojama 5 % pieno miltelių TBST tirpale, kambario temperatūroje. Membrana 16 val. inkubuojama su pagal gamintojo rekomendacijas TBST tirpalu praskiestais pirminiais antikūnais, +4°C temperatūroje. Membrana plaunama TBST tirpalu 2 kartus po 15 min. Membrana 2 val. inkubuojama su pagal gamintojo rekomendacijas TBST tirpalu praskiestais antriniais antikūnais, kambario temperatūroje. Membrana plaunama TBST tirpalu 3 kartus po 15 min. Baltymų detekcija atliekama naudojant TMB reagentą [54].
Membranos paruošimas pakartotiniam naudojimui:
Membrana užpilama membranos išvalymo buferiu ir inkubuojama 30 min 50oC temperatūroje. Po inkubacijos membrana 2 kartus po 10 min. kambario temperatūroje plaunama TBST buferiu. Membrana 1 h blokuojama 5 % pieno miltelių TBST tirpale, kambario temperatūroje.
Po to membrana vėl gali būti inkubuojama su pagal gamintojo rekomendacijas TBST tirpalu praskiestais pirminiais antikūnais, +4°C temperatūroje [54].
2.2.6. Statistinė duomenų analizė
Bendros baltymų koncentracijos ir SR baltymų seilėse kiekio duomenų analizei atlikti buvo naudojamas SPSS 17.0 statistinės programos paketas (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0. Chicago: SPSS Inc.).
Tolydūs dydžiai buvo įvertinti šiomis statistinėmis charakteristikomis: vidurki, kuris pateikiamas kartu su standartine paklaida, mediana.
Atliktas Kolmogorovo - Smirnovo testas.
Bendrai baltymų koncentracijai nustatytas p<0,001. SR baltymų kiekiui nustatyti, naudojant ryškumo parametrus, nustatytas p<0,022, naudojant standartizuoto kiekio palyginimo su kontroline grupe parametrus, SR baltymų kiekiui nustatytas p<001. Šie duomenys gauti remiantis neparametriniu Mann-Whitney testu dviem nepriklausomoms imtims. Visais atvejais p reikšmė buvo laikoma reikšmingumo lygmeniu (rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, jei p<0,05).
Atliktas ROC testas slenkstinei baltymų koncentracijos seilių mėginiuose reikšmei nustatyti sergantiems lėtiniu periodontitu. Nustatyta slenkstinė bendros baltymų koncentracijos mėginiuose reikšmė.
27
3. REZULTATAI
Darbe pristatomi tyrimai buvo atlikti LSMUL Kauno klinikų Neuroonkologijos ir genetikos laboratorijoje, prižiūrint dr. Arūnui Kazlauskui.
Tyrime dalyvavo 32 pacientai: 19 moterų (59% visų tiriamųjų) ir 13 (41%) vyrų. Iš jų 16 priklausė kontrolinei grupei - sveikiems, 16 priklausė lėtiniu generalizuotu sunkiu periodontitu sergančių pacientų grupei.
Visų pirma, paimtuose seilių mėginiuose Bradfordo metodu (2.2.3.) buvo nustatinėjamas baltymų kiekis. Gauti rezultatai (1 lentelė) parodė kad baltymų kiekis sergančiųjų pacientų seilėse visada yra didesnis, palyginus su baltymų koncentracija sveikų pacientų seilių mėginiuose. Visų mėginų baltymų koncentracijos reikšmių vidurkis - 0,5325 mg/ml (standartinis nuokrypis 0,3983), mediana - 0,4250. Kontrolinės grupės mėginių baltymų koncentracijos reiškmių vidurkis- 0,2425 mg/ml (standartinis nuokrypis 0,10970), mediana - 0,2500, o sergančiųjų periodontitu baltymų koncentracijos vidurkis - 0,8225 (standartinis nuokrypis 0,36935), mediana - 0,9350.
Gautų duomenų statistinis vertinimas stačiakampe diagrama, remiantis neparametriniu Mann-Whitney testu, pateiktas 1 paveikslėlyje. Gauta p<0,05 reikšmė parodo, kad padidėjusi baltymų koncentracija periodontitu sergančių pacientų seilėse yra statistiškai reikšmingai didesnė už koncentraciją sveikų (kontrolinės grupės) pacientų seilėse ir gali būti naudojama kaip vienas iš periodontito diagnostinių požymių.
1 pav. Baltymų koncentracijos seilių mėginiuose stačiakampė diagrama, atsižvelgiant į tiriamųjų
grupes. (p<0,001, remiantis neparametriniu Mann-Whitney testu dviem nepriklausomoms imtims). Kontrolinė grupė Sergantieji
Lentelė Nr. 1. Baltymų koncentracija (mg/ml) sveikųjų ir sergančiųjų seilių mėginiuose.
Remiantis ROC testu, nustatyta slenkstinė baltymų koncentracijos seilių mėginiuose reiškmė, sergantiems sunkiu lėtiniu generalizuotu periodontitu nustatyti - >0,425 mg/ml. Šia reikšme pasižymėjo 93,8% visų sergančių lėtiniu periodontitu grupės mėginių.
Įvertinus seilėse nustatytas baltymų koncentracijas, jose esantys baltymai buvo išskirstyti naudojant vienakryptę denatūruojančią baltymų elektroforezę poliakrilamidiniame gelyje (2.2.4.). Į susiformavusius poliakrilamidinio gelio šulinėlius buvo įnešta po 15-30 µg seilių baltymų. Po elektroforezės, baltymai iš gelio buvo pernešti ant nitroceliuliozinės membranos (2.2.5.). Membrana, nudažyta Poncau S reagentu (2.2.5.), parodyta 2 paveikslėlyje.
2-as paveikslėlis parodo, kad baltymai iš poliakrilamidinio gelio buvo efektyviai pernešti ant nitroceliuliozinės membranos.
Eil.
Nr. Kontrolinė grupė Sergančiųjų grupė
1. 0,18 0,45 2. 0,28 0,94 3. 0,42 0,96 4. 0,34 0,93 5. 0,25 0,50 6. 0,44 1,56 7. 0,29 0,43 8. 0,19 1,00 9. 0,08 1,22 10. 0,22 0,33 11. 0,27 0,97 12. 0,10 0,69 13. 0,04 0,43 14. 0,25 0,97 15. 0,27 1,34 16. 0,26 0,44
29
2 pav. Pernešti ant nitroceliuliozinės membranos seilių baltymai nudažyti Poncau S reagentu. 1-4
takeliai nesveikų pacientų seilių mėginiai. 5-8 takeliai sveikų pacientų seilių mėginiai. M - baltymų molekulinio svorio standartas.
Kaip pažymėta literatūroje, seilėse aptinkamos metaloproteinazės [55], šaperonai [56] bei su RNR sąveikaujantys baltymai [30]. Todėl konkrečių baltymų, galimų periodontito žymenų nustatymui, pasirinkti laboratorijoje turėti 4 antikūniai: prieš metaloproteinazes 2 ir 9 (anti-MMP-2 ir anti-MMP-9), prieš šaperoną HSP90 (anti-HSP90) ir priešsu RNR sąveikaujančius SR baltymus (anti-SR).
Visų pirma, buvo bandomi anti-metaloproteinazės antikūnai, atpažįstantys MMP-2 ir MMP-9 metaloproteinazes. Tačiau, bandymą pakartojus du kartus, signalo ant membranos su šiais antikūniais mums gauti nepavyko. Todėl vėl buvo kartojamas visas procesas ir šį kartą tikslinių baltymų detekcijai buvo naudojamas anti-HSP90 antikūnis. Tačiau, kaip ir ankstesniu atveju, bandymą pakartojus keletą kartų, gauti signalo ant membranos mums nepavyko.
Kadangi apie šių baltymų buvimą seilėse literatūroje duomenų nėra, gali būti, kad šių baltymų kiekiai seilėse yra labai maži ir jų aptikimas naudojant Western bloto metodą yra ribotas. Dėl ribotų lėšų, antikūnai naudoti šių baltymų aptikimui buvo seni (daugiau kaip 3 metų), todėl taip pat neatmetama galimybė, kad jie buvo neveiksnūs.
1 2 3 4 5 6 7 8 M 20 kDa 25 kDa 85 kDa 50 kDa 35 kDa
Kiti seilėse esančių baltymų aptikimui naudoti antikūnai prieš su RNR sąveikaujančius baltymus - anti-SR. Šie antikūnai, pagal jais prekiaujančios kompanijos duomenis, aptinka ne vieną bet kelis SR šeimos baltymus.
Gauti seilių tyrimo rezultatai naudojant šį antikūnį parodė kad seilėse naudojant Western bloto metodą galima aptikti šiuos baltymus (3 paveikslėlis). Nors antikūnis aptinka ir didesnės molekulinės masės baltymus (50 kDa ir daugiau), tačiau vėlesni tyrimai parodė kad didesnės molekulinės masės baltymai seilių mėginiuose ne visada aptinkami (3 paveikslėlis, 5 ir 6 takeliai), todėl buvo nutarta apsistoti ties 35 kDa žyme aptinkamais baltymais.
Kadangi kai kuriuose mėginiuose dėl nedidelio baltymo kiekio mums nepavyko naudojant šį metodą aptikti SR baltymų, todėl analizuotas mėginių kiekis buvo ne 32, kaip baltymų koncentracijos atveju, bet 28 (14 sveikų ir 14 sergančiųjų).
3 pav. Seilių imunoblotas naudojant anti-SR antikūnį. 1, 2 ir 5 takeliai sveikų asmenų seilių mėginiai, 3,
4 ir 6 takeliai sergančių lėtiniu sunkiu generalizuotu periodontitu pacientų seilių mėginiai. M - baltymų molekulinio dydžio standartas. β-aktinas naudotas kaip užnešimo kiekio ant gelio kontrolė.
Gautų duomenų analizei buvo naudota MultiGauge analizės kompiuterinė programa. Analizės duomenys pristatyti 2-oje lentelėje.
85 kDa 50 kDa 35 kDa -aktinas 1 2 3 4 5 6 M
Kontrolinė gr. Sergantieji Kontrolinė Sergantieji
31
Lentelė Nr. 2. SR baltymų seilėse kiekis naudojant ryškumo parametrus. Eil. Nr. Kontrolinė grupė Sergančiųjų grupė 1. 599982 744223 2. 467453 530915 3. 249019 524211 4. 478748 680760 5. 281469 401509 6. 542549 702246 7. 903175 1043856 8. 810058 1004732 9. 853833 930514 10. 901012 965781 11. 683093 862245 12. 883026 1032689 13. 761322 1153917 14. 595231 1082650
Gautų duomenų statistinio įvertinimo stačiakampė diagrama, remiantis neparametriniu Mann-Whitney testu, pateikta 4 paveikslėlyje. Gauta p<0,022 (p<0,05) reikšmė parodo, kad padidėjes 35 kDa zonoje SR baltymų kiekis periodontitu sergančių pacientų seilėse yra statistiškai reikšmingai didesnis už kiekį sveikų (kontrolinės grupės) pacientų seilėse ir gali būti naudojamas kaip vienas iš periodontito žymenų.
2,0e+5 4,0e+5 6,0e+5 8,0e+5 1,0e+6 1,2e+6 S R b al tym u k ie ki s n aud oj an t r yš kum o pa ra m et rus
4 pav. SR baltymų seilėse kiekio naudojant ryškumo parametrus stačiakampė diagrama,
atsižvelgiant į tiriamųjų grupes. (p<0,022, remiantis neparametriniu Mann-Whitney testu dviem nepriklausomoms imtims).
Kad būtų paprasčiau, žemiau pateikta 3 lentelė, kurioje 35 kDa gelio zonoje esančių SR baltymų kiekis sveikuose žmonėse prilygintas 1, o sergančių duomenys padalinti iš sveikų pacientų. Tai parodo kiek kartų SR baltymų esančių 35 kDa zonoje kiekis yra padidėjęs sergančiųjų žmonių seilėse, palyginus su kiekiu, aptinkamu sveikų žmonių seilėse.
Gauti rezultatai parodė, kad lėtinio sunkaus generalizuoto periodontito atveju 35 kDa gelio zonoje randamas vidutiniškai 1,26 karto padidėjęs SR baltymų kiekis.
33
Lentelė Nr. 3. SR baltymų seilėse kiekis naudojant ryškumo standartizuoto kiekio palyginimo su
kontroline grupe parametrus.
Eil. Nr.
Kontrolinė
grupė Sergančiųjų grupė
1. 1 1,24 2. 1 1,14 3. 1 2,11 4. 1 1,42 5. 1 1,43 6. 1 1,29 7. 1 1,16 8. 1 1,24 9. 1 1,09 10. 1 1,07 11. 1 1,26 12. 1 1,17 13. 1 1,52 14. 1 1,82
Paprastai ties 35 kDa zona migruoja du panašios molekulinės masės SR baltymai: SRSF1 (35 kDa) ir SRSF2 (33kDa). Norėdami išsiaiškinti, kurio konkrečiai baltymo kiekis didėja, buvo panaudoti specifiniai anti-SRSF1 antikūniai. Rezultatai parodė, kad lėtinio sunkaus generalizuoto periodontito atveju seilėse aptinkamas padidėjęs SRSF1 baltymo kiekis.
5 pav. Seilių imunoblotas naudojant anti-SRSF1 antikūnį. β-aktinas naudotas kaip užnešimo kiekio ant
gelio kontrolė. Kontrolinė gr. Sergantieji SRSF1 -aktinas
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Seilės - žmogaus biologinis skystis, kurį labai lengvai ir neskausmingai galima paimti ir naudoti diagnostiniams testams. Šiuo metu, dėl per mažo duomenų kiekio apie seilių panaudojimą diagnostikoje, jos nėra plačiai naudojamos kaip biologinė medžiaga ligoms bei jų stadijai nustatyti. Todėl atliktame darbe mes patyrinėjome, ar seilėse esantys atskiri baltymai gali buti panaudojami ankstyvajai lėtinio periodontito diagnostikai. Mes parodėme, kad ne tik atskiri baltymai, bet ir bendra jų koncentracija seilėse gali buti panaudojama kaip vienas lėtinio periodontito žymenų. Nustatyta padidėjusi bendra baltymų koncentracija seilėse visiškai atitinka literatūros duomenis, kur pažymima, kad sunkaus lėtinio generalizuoto periodontito atveju seilėse aptinkama padidėjusi baltymų koncentracija [57-60]. Kita vertus, padidėjęs seilėse esančių baltymų kiekis taip pat nustatomas ir autoimuninių ligų (Sjogreno sindromo, cistinės fibrozės), širdies - kraujagyslių sistemos ligų, cukrinio diabeto, infekcinių ligų (tokių kaip ŽIV), burnos vėžio, dantų ėduonies ar kitų burnos gleivinės pažeidimų (infekcinių ligų ar sužalojimų) atvejais [61]. Reikėtų pažymėti, kad seilėse aptikta padidėjusi bendra baltymų koncentracija nustatoma uždegiminių procesų atveju ir nėra specifiška būtent sunkiam generalizuotam lėtinam periodontitui diagnozuoti.
Kaip parodyta literatūroje, seilėse aptinkamos metaloproteinazės [55], šaperonai [56]. Matrikso metaloproteinazės yra svarbios daugeliui biologinių ir patologinių procesų ir dalyvauja ekstraląstelinio matrikso hidrolizavime [62]. Matrikso metaloproteinazių inicijuojamos baltymus ardančios kaskadinės reakcijos prisideda prie periodonto audinių destrukcijos. Jos taip pat aktyvuoja citokinų ir įvairių fermentų (pvz.: myeloperoksidazių ir t.t.) išsiskyrimą iš neutrofilų granulių, kuris sukelia jungiamojo audinio katabolines reakcijas ir degradaciją [55].
Atliktame darbe, panaudojus specifinius antikūnus, atpažįstančius metaloproteinazes 2 ir 9, rezultatų negauta. Tai galbūt galima paaiškinti jų mažu kiekiu seilėse, tuo, kad tyrinėtos metaloproteinazės yra labai dideli baltymai (>120kDa), todėl jų pernešimas iš gelio ant membranos yra labai neefektyvus ir lėšų ribotumu.
Molekuliniai šaperonai - tai baltymai, kurie padedantys kitų makromolekulinių struktūrų surinkimui ar išardymui. Paprastai jie dalyvauja ląstelės baltymų teisingos tretinės struktūros susidaryme. Šiame procese vienas svarbesnių yra šaperonas HSP70, mažesne svarba pasižymi HSP90. HSP90 dalyvauja ląstelės receptorių palaikyme neaktyviojoje būsenoje [63, 64].
35 Pagal literatūros žinias, seilėse aptinkamas šaperonas - HSP70. Laboratorijoje antikūnų prieš šį šąperoną nebuvo. Tačiau turėti antikūnai prieš šaperoną HSP90, todėl buvo bandoma seilėse aptikti šį baltymą. Bandymą pakartojus kelis kartus, signalo ant membranos su antikūniais, aptinkančiais šį baltymą, mums gauti nepavyko. Tai galbūt parodo, kad šio baltymo seilėse aptikimas, naudojant Western bloto metodą, yra ribotas dėl per mažo šio baltymo seilėse kiekio. Neatmetama galimybė, kad nesuveikė pirminis anti-HSP90 antikūnis.
Remiantis literatūros duomenimis, seilėse aptinkami su RNR sąveikaujantys baltymai [30]. Todėl toliau buvo bandoma seilėse aptikti su RNR sąveikaujančius baltymus. Tuo tikslu buvo panaudotas laboratorijoje turėtas anti-SR antikūnis atpažįstantis visą eilę taip vadinamų SR baltymų.
SR baltymai – tai baltymų šeima, kurios nariai N- baltymo galinėje sekoje turi vieną ar daugiau sąveikos su RNR sritį, o C-galė seka sudarytą iš pasikartojančių serino/arginino aminorūgščių likučių (RS sritis). SR baltymai randami daugumos eukariotų ląstelėse ir dalyvauja pre-iRNR splaisinge ir RNR metabolinuose procesuose. Šiuo metu šiai šeimai priklauso 12 baltymų, žymimų raidėmis SRSF (angl.„SR splicing factor“) ir skaičiumi nuo 1 iki 12 pagal atradimo seką [65, 66]. Laboratorijoje turėtas antikūnis aptiko taip vadinamus šešis pagrindinius SR baltymus: SRSF1 (molekulinė masė - 33 kDa), SRSF2 (35 kDa), SRSF3 (20 kDa), SRSF4 (75 kDa), SRSF5 (40 kDa), SRSF6 (55 kDa). Dėl ribotos poliakrilamidinio gelio skiriamosios gebos, SRSF1 ir SRSF2 baltymai vienas nuo kiti neatsiskiria ir pasakyti, kurio iš šių baltymų kiekis ligos atveju yra didesnis, neįmanoma. Todėl pradžioje darbe naudotas terminas - 35 kDa zonoje esantys baltymai.
Tolimesni individualių baltymų tyrimai parodė, kad lėtinio periodontito atveju didėja konkrečiai SRSF1 baltymo kiekis. Parodyta, kad SRSF1 turi kritinę funkciją širdies vystymuisi, embriogenezei, audinių susidarymui, ląstelių judėjimui ir gyvybingumui [67]. SFRS1 taip pat yra proto-onkogenas galintis veikti kaip onkoproteinas [68, 69]. Kadangi mes nustatėme, kad lėtinio sunkaus generalizuoto periodontito atveju seilėse didėja ląstelinių baltymų, kurie yra lokalizuoti ląstelių branduolyje [70], kiekis, galima daryti išvadą, kad sunkaus lėtinio periodontito atveju, vykstant periodonto destrukciniams procesams, sergančiųjų seilėse padaugėja osteoblastų, osteoklastų ir periodonto raiščio ir dantenų fibroblastų [71].
Apibendrinant, gauti rezultatai parodė, kad bendra baltymų koncentracija ir su RNR sąveikaujančių SR baltymų, migruojančių poliakrilamidiniame gelyje ties 35 kDa zona, kiekis seilėse
gali būti naudojami kaip lėtinio periodontito žymenys. Detalesnė atskirų baltymų analizė, pirmą kartą parodė, kad lėtinio sunkaus generalizuoto periodontito atveju, seilėse aptinkamas padidėjęs SRSF1 baltymo kiekis. Kadangi seilėse didėja ląstelinių baltymų kiekis, taip pat galima daryti išvadą, kad sunkaus lėtinio periodontito atveju, sergančiųjų seilėse padaugėja ląstelių, atsiradusių dėl audinių destrukcijos. Kadangi buvo naudotas nedidelis mėginių kiekis, tikslesniam periodontito galimų baltyminių žymenų įvertinimui reikia tolesnių tyrimų su žymiai didesniu kiekiu mėginių.
Interesų konfliktas:
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
Padėka:
Dėkoju LSMUL Kauno klinikų Neuroonkologijos ir genetikos laboratorijos dr. vyr. mokslo darbuotojui Arūnui Kazlauskui, už darbo metodikos pamokymą, darbo eigos sekimą bei rezultatų analizės konsultacijas.
37
IŠVADOS
1. Sergančiųjų lėtiniu sunkiu išplitusiu periodontitu pacientų, lyginant su sveikais asmenimis, seilėse randamas padidėjęs bendras baltymų kiekis.
2. Lyginant su sveikais asmenimis, sergančiųjų lėtiniu sunkiu generalizuotu periodontitu seilėse didėja 35 kDa gelio zonoje esančių SR baltymų kiekis.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Pirmą kartą parodyta, kad lyginant su sveikais asmenimis, sergančiųjų lėtiniu sunkiu generalizuotu periodontitu seilėse didėja SRSF1 baltymo kiekis.
2. SR baltymų kiekio padidėjimas lėtiniu sunkiu išplitusiu periodontitu sergančiųjų seilėse gali būti naudojamas kaip vienas iš lėtinio periodontito baltyminių biožymenų.
39
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. S Kravitz AB, Cowpe J, Barnes E. Manual of Dental Practice 2015: Lithuania, in EU Manual of Dental Practice 2015 C.o.E. Dentists, Editor: Cardiff University, Wales, United Kingdom; 2015, p. 12.
2. Tonetti MS, Jepsen S, Jin L, Otomo-Corgel J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. J Clin Periodontol. 2017; 44(5):456-462.
3. Jepsen SBJ, Buchalla W, Carvalho JC, Dietrich T, Dörfer C, Eaton KA, Figuero, E, Frencken JE, Graziani F, Higham SM, Kocher T, Maltz M, Ortiz-Vigon A, Schmoeckel J, Sculean A, Tenuta LMA, van der Veen MH, Machiulskiene V. Prevention and control of dental caries and periodontal diseases at individual and population level: consensus report of group 3 of joint EFP/ORCA
workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 2017; 44(18): S85–S93.
4. Ferreira MC, Dias-Pereira AC, Branco-de-Almeida LS, Martins CC, Paiva SM. Impact of periodontal disease on quality of life: a systematic review. J Periodontal Res. 2017. 52(4): 651-665.
5. Nazir MA. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. Int J Health Sci (Qassim). 2017;11(2):72-80.
6. Kim JJ, Kim CJ, Camargo PM. Salivary biomarkers in the diagnosis of periodontal diseases. J Calif Dent Assoc. 2013;41(2):119-24.
7. Ulvi K, Gursoy EK. Editorial: Use of Saliva in Diagnosis of Periodontitis: Cumulative Use of Bacterial and Host-Derived Biomarkers. Front Cell Infect Microbiol. 2016. 6.
8. Buduneli, Kinane DF. Host-derived diagnostic markers related to soft tissue destruction and bone degradation in periodontitis. J Clin Periodontol. 2011;38 Suppl 11:85-105.
9. Wang A., Wang CP, Tu M, Wong DTW. Oral Biofluid Biomarker Research: Current Status and Emerging Frontiers. Diagnostics (Basel). 2016;6(4).
10. Fabian TK, Fejerdy P, Csermely P. Salivary Genomics, Transcriptomics and Proteomics: The Emerging Concept of the Oral Ecosystem and their Use in the Early Diagnosis of Cancer and other Diseases. Curr Genomics. 2008;9(1):11-21.
11. Palumbo A. The Anatomy and Physiology of the Healthy Periodontium, Gingival Diseases - Their Aetiology, Prevention and Treatment, D.F. Panagakos, Editor: InTech. 2011.
12. Savage A, Eaton KA, Moles DR, Needleman I. A systematic review of definitions of periodontitis and methods that have been used to identify this disease. J Clin Periodontol. 2009;36(6):458-67. 13. Fernandez-Solari J, Barrionuevo P, Mastronardi CA. Periodontal Disease and Its Systemic
Associated Diseases. Mediators Inflamm. 2015:153074.
14. Scapoli L, Girardi A, Palmieri A, Testori T, Zuffetti F,Monguzzi R, Lauritano D, Carinci F. Microflora and periodontal disease. Dent Res J (Isfahan). 2012;9(Suppl 2): S202-6.
15. Popova C, Panova VD, Panov V. Microbiology of Periodontal Diseases. A Review. Biotechnol Biotechnol Equip. 2014; 27(3):3754-3759.
16. Bascones A, Gamonal J, Gomez M, Silva A, Gonzalez MA. New knowledge of the pathogenesis of periodontal disease. Quintessence Int. 2004;35(9):706-16.
17. Cekici A , Kantarci A, Hasturk A, E. Van Dyke T. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontol 2000. 2014;64(1):57-80.
18. Kaufman E, Lamster IB. Analysis of saliva for periodontal diagnosis-a review. J Clin Periodontol. 2000;27(7):453-65.
19. Giannobile WV, Beikler T, Kinney JS, Ramseier CA, Morelli T, Wong DT. Saliva as a diagnostic tool for periodontal disease: current state and future directions. Periodontol 2000. 2009;50(1):52-64.
20. American Academy of Periodontology Task Force Report on the Update to the 1999 Classification of Periodontal Diseases and Conditions. J Periodontol. 2015;86(7):835-8.
21. Larsen C, Barendregt DS, Slot DE, Van der Velden U, Van der Weijden F. Probing pressure, a highly undervalued unit of measure in periodontal probing: a systematic review on its effect on probing pocket depth. J Clin Periodontol. 2009;36(4):315-22.
22. Zia A, Khan S, Bey A, Gupta ND, Mukhtar-Un-Nisar S. Oral biomarkers in the diagnosis and progression of periodontal diseases. Biology and Medicine. 2011;3(2):45-52.
23. Srivastava N, Nayak PA, Rana S. Point of Care- A Novel Approach to Periodontal Diagnosis-A Review. J Clin Diagn Res. 2017;11(8):ZE01-ZE06.
24. de Almeida Pdel V, Grégio AM, Machado MA, de Lima AA, Azevedo LR. Saliva composition and functions: a comprehensive review. J Contemp Dent Pract. 2008;9(3):72-80.
25. Chiappin S, Antonelli G, Gatti R, De Palo EF. Saliva specimen: a new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clin Chim Acta. 2007;383(1-2):30-40.
26. Khurshid Z, Zafar MS, Najeeb S, Zohaib S. Human Saliva: A Future Diagnostic Tool. EC Dent Sci. 2016;3(6):635-636.
