SARCOCYSTIS GENTIES PIRMUONIŲ IDENTIFIKAVIMAS, PASISKIRSTYMAS GALVIJUOSE BEI ĮTAKA ŠEIMININKO ORGANIZMUI

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Vytautas Januškevičius

SARCOCYSTIS

GENTIES PIRMUONIŲ

IDENTIFIKAVIMAS,

PASISKIRSTYMAS GALVIJUOSE

BEI ĮTAKA ŠEIMININKO

ORGANIZMUI

veterinarija (A 002)

Disertacija rengta 2014–2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijoje, Veterinarinės patobiologijos katedroje.

Mokslinis vadovas

prof. habil. dr. Saulius Petkevičius (Lietuvos sveikatos mokslų

universi-tetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – A 002).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė:

prof. dr. Ingrida Monkevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – A 002).

Nariai:

habil. dr. Gediminas Valkiūnas (Gamtos tyrimų centras, gamtos mokslai,

biologija – N 010);

prof. dr. Modestas Ružauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

žemės ūkio mokslai, veterinarija – A 002);

dr. Aleksandr Novoslavskij (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

žemės ūkio mokslai, veterinarija – A 002);

dr. Smaragda Sotiraki (Veterinarijos mokslo institutas (Graikija), žemės

ūkio mokslai, veterinarija – A 002).

Disertacija ginama viešame Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Vete-rinarijos akademijos VeteVete-rinarijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. rugpjūčio 26 d. 13 val. prof. R. Karazijos auditorijoje.

Disertacijos gynimo vietos adresas: Tilžės g. 18, LT-47181 Kaunas, Lietuva.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES VETERINARY ACADEMY

Vytautas Januškevičius

PROTOZOA OF THE GENUS

SARCOCYSTIS

IN CATTLE:

IDENTIFICATION, DISTRIBUTION

AND IMPACT ON THE HOST

ORGANISM

Dissertation has been prepared at the Department of Veterinary Pathobiology at Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2014–2020.

Scientific Supervisor

Prof. Habil. Dr. Saulius Petkevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – A 002).

Dissertation is defended at the Veterinary Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:

Chairperson

Prof. Dr. Ingrida Monkevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – A 002).

Members:

Habil. Dr. Gediminas Valkiūnas (Nature Research Centre, Nature

Sciences, Biology – N 010);

Prof. Dr. Modestas Ružauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – A 002);

Dr. Aleksandr Novoslavskij (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – A 002);

Dr. Smaragda Sotiraki, (Veterinary Research Institute (Greece), Agri-cultural Sciences, Veterinary – A 002).

Dissertation will be defended at the open session of the Veterinary Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences on 26th _of

August, 2020, at 1 p.m. in the prof. R. Karazija auditorium. Address: Tilžės 18, LT-47181 Kaunas, Lithuania.

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS... 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14

1.1. Sarcocystis genties pirmuonių apibūdinimas ... 14

1.1.1. Sarcocystis rūšių parazituojančių galvijuose paplitimas ... 14

1.2.Sarkocistų morfologija ir vystymasis ... 16

1.2.1.Sarcocystis rūšių parazituojančių galvijuose morfologiniai skirtumai ... 19

1.3.Sarcocystis genties pirmuonys galvijuose, jų patogeniškumas ... 19

1.3.1. Sarkocistų sukeliami patomorfologiniai pakitimai galvijų organizme ... 22

1.3.2.Mėsos produktų užkrėstumas sarkocistomis ir įtaka jų kokybei ... 24

1.4.Sarcocystis genties pirmuonių identifikacija ... 26

1.4.1.Sarcocystis genties pirmuonių identifikacija tradiciniais metodais ... 28

1.4.2. Sarcocystis genties pirmuonių molekulinė identifikacija... 29

1.4.3.Sarcocystis spp. identifikacija galvijuose naudojant molekulinius metodus.. ... 29

1.5.Sarcocystis genties pirmuonių poveikis žmonių sveikatai ... 31

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 35

2.1. Tyrimų atlikimo etapai, vieta ir laikas ... 35

2.2. Tyrimų metodikos ... 40

2.2.1. Parazitologiniai tyrimai ... 40

2.2.2. Histomorfologinis tyrimas... 41

2.2.3. Kraujo biocheminiai tyrimai ... 42

2.2.4. Mėsos biocheminių rodiklių tyrimai ... 42

2.2.5. Mėsos bakterinės taršos tyrimai ... 46

2.2.6. Molekuliniai tyrimai ... 47

2.2.7. Statistinė analizė ... 52

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 54

3.1. Galvijų skerdenų ir produkcijos užkrėstumas Sarcocystis spp. ir užkrėstumo gausa ... 54

3.2.Sarkocistozės įtaka galvijų kraujo biocheminiams parametrams (gyvulio sveikatingumui) ... 63

3.4.Galvijų skerdenų užkrėstumo sarkocistomis įtaka mėsos kokybei

ir technologinėms savybėms ... 64

3.5.Sarkocistų morfologinė analizė ... 64

3.6. Molekulinių tyrimų rezultatai ... 67

3.6.1. Sarcocystis rūšių identifikacija naudojant 18S rRNR geno sekų analizę ... 67

3.6.2. Sarcocystis rūšių vidurūšinė įvairovė cox1 gene ... 70

3.6.3. Molekulinė Sarcocystis rūšių identifikacija iš bradizoitų suspensijos ... 76 4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 81 IŠVADOS ... 96 REKOMENDACIJOS ... 97 SUMMARY ... 98 BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 125 PASKELBTOS PUBLIKACIJOS ... 143

STRAIPSNIAI, KURIUOSE BUVO PASKELBTI DISERTACIJOS TYRIMŲ REZULTATAI ... 146

PRIEDAI ... 182

CURRICULUM VITAE ... 191

SANTRUMPOS

ALT – alaninaminotransferazė ALP – šarminė fosfatazė AR – aminorūgštys

AST (GOT) – aspartataminotransferazė ATP – Adenozin 5' trifosfatas

5.8S rRNR, 18S rRNR, 28S rRNR – ribosominės RNR genai bp – bazių pora

CK – kreatinkinazė

CNS – centrinė nervų sistema

cox1 – citochromo c oksidazės I subvieneto genas

dH2O – distiliuotas vanduo

dNTP – deoksiribonukleotidų trifosfatų mišinys EDTA – etilendiamino-tetraacetato rūgšties druska G6PDH – gliukozės-6-fosfato dehidrogenazė

ICDH – izocitrato dehidrogenazė

ITS – vidinis transkribuojamas regionas kDa – kilodaltonas

KSV – kolonijas suformuojantys vienetai KTU – Kauno technologijos universitetas LDH – laktatdehidrogenazę

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas mtDNR – mitochondrijų DNR

PBS – fosfatinių druskų buferis

PGR – polimerazinė grandininė reakcija PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija

RFIP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas RR – riebalų rūgštys

spp. – rūšys

SRR – sočiosios riebalų rūgštys

TAE – tiris-acetato-EDTA buferinis tirpalas

Tris – 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiolas Ta – pradmens hibridizacijos temperatūra

ĮVADAS

Didėjant žmonių populiacijai ir augant maisto poreikiui, mokslininkai atlieka vis daugiau tyrimų ir ieško būdų kaip apsaugoti gyvulius nuo įvairių ligų, mažinančių gaunamos produkcijos kiekį.

Šiuo metu pasaulyje yra apie 1 milijardas galvijų. Gyvulių auginimo eigoje juos veikia nemažai nepalankių aplinkos faktorių, didelė gyvulių koncent-racija, hipodinamija, fermos mikroklimato svyravimai ir kt., visa tai sąlygoja padidintas apkrovas jų organizmui. Gyvuliams prisitaikant, vyksta jų orga-nizmo funkcijų pasikeitimas ląsteliniame lygyje, tai dažnai sąlygoja jų imu-niteto nusilpimą, išauga gyvulių sergamumas sarkocistoze, apsunkinama ir kitų ligų eiga [1].

Kuriant gyvūnų sveikatos ir visuomenės sveikatos priežiūros sistemą, labai svarbu laiku ir kokybiškai ištirti zoonozių paplitimą, jų poveikį gyvūnų ir žmonių sveikatai, laiku užkirsti sukėlėjų patekimui į maisto grandinę [2]. Pastaruoju dešimtmečiu mokslinėje literatūroje vis didesnis dėmesys skiriams sarkocistozei. Sarcocystis rūšys gan plačiai paplitusios pasaulyje, ypač šil-tesnėse klimato zonose. Jos neaptinktos tik pasaulio arktinėse dalyse.

Sar-cocystis spp. yra priskiriama pirmuonių sporagyvių (Apicomplexa) tipui ir yra

pati gausiausia iš šešių Sarcocystidae šeimos genčių ir jai priskiriamos 196 rūšys [3]. Šiuo metu sarkocistų genties pirmuonys yra vieni iš labiausiai paplitusių parazitų naminiuose gyvuliuose [4]. Mokslinių tyrimų duomenimis [5], šiuo metu daugiau nei 220 sarkocistų rūšių atpažinta, tačiau tik 26 iš jų žinomas pilnas parazitavimo ciklas. Sarcocystidae šeima išskiriama iš kitų kokcidinių parazitų pagal dviejų šeimininkų vystymosi ciklą, jų sugebėjimą formuoti cistas tarpinių šeimininkų įvairių tipų audiniuose ir oocistų mor-fologiją [6].

Sarkocistos – tai viduląsteliniai vienaląsčiai pirmuonys, parazituojantys žmonių bei gyvūnų organizme [7]. Sarcocystis genčiai priskiriami paukščių, roplių ir žinduolių parazitai, turintys sudėtingą vystymosi ciklą, kuriame įprastai tarpinis šeimininkas būna žolėdis ar visaėdis, o galutinis – plėšrūnai ir žmonės [8, 9]. Daugumai sarkocistų rūšių būdingi specifiniai galutiniai ir tarpiniai šeimininkai. Tam tikros sarkocistų rūšys yra labiau specifiškos tarpiniams, o ne galutiniams šeimininkams [10]. Sarcocystis spp. sukeliama zoonozė gali pasireikšti beveik visiems šiltakraujams ir šaltakraujams gyvū-nams [11]. Tarpinio šeimininko organizme parazito vystymasis prasideda kai per pašarą ar vandenį užsikrečiama sarkocistų oocistomis. Tarpinio šeimi-ninko raumenyse ar CNS vystosi sarkocistos, o galutiniam šeimininkui suė-dus cistomis užkrėstos mėsos, žarnyne formuojasi sporuliuojančios oocistos, kurios su išmatomis patenka į aplinką [11]. Teigiama, kad sarkocistos

(Sarcocystis spp.), įskaitant ir zoonotines rūšis, parazituoja daugelyje Euro-poje maistui naudojamų gyvūnų rūšių ir yra patiriami ekonominiai nuostoliai dėl skerdenų brokavimo. Sarcocystis spp., priklausomai nuo rūšies ir už-sikrėtimo gausumo, gali sukelti ligą – sarkocistozę. Ligos simptomai papras-tai būna sunkesni tarpiniams šeimininkams, o gausaus užsikrėtimo atveju turi ir ekonominę reikšmę dėl suprastėjusios produkcijos gyvūnų mėsos kokybės ir jos kiekio [12, 13]. Naminių gyvulių populiacijoje sarkocistos plačiai pa-plitusios galvijuose, avyse bei kiaulėse ir sukelia nemažus ekonominius nuostolius [14]. Mokslinių tyrimų rezultatai parodė didelį galvijų užsikrėtimą sarkocistoze [15–18].

Patogeniškumas priklauso nuo sarkocistų rūšies bei užsikrėtimo gausumo [6]. Sarcocystis parazitų poveikis galutiniams ir tarpiniams šeimininkams yra skirtingas. Klinikiniai požymiai nėra specifiniai, o tokie veiksniai kaip stresas, laktacija, veršingumas, pašaro stoka ar įvairios kitos ligos gali apsunkinti sarkocistozės eigą. Vienu atveju klinikinių požymių gali nebūti, o kitu atveju gali pasireikšti anoreksija, gyvūnai netenka kūno masės, slenka plaukai, vystosi anemija, atsiranda didesnis nei įprastai seilėtekis, raumenų trūkčio-jimas, skausmas ir atrofija, bendras organizmo silpnumas, gyvūnai karščiuo-ja, vystosi edemos, hemoragijos, sumažėja pieno produkcikarščiuo-ja, reprodukcijos sutrikimai, pasitaiko abortų, pasireiškia neurologiniai sutrikimai, o kartais gyvūnai gali ir nugaišti [10, 19–21].

Užsikrėtę galutiniai šeimininkai (mėsėdžiai), tokie kaip šunys ir katės, į aplinką su išmatomis išskiria apie 200 milijonų oocistų [22]. Žmonės ir kelios beždžionių rūšys (makakos, babuinai, šimpanzės) taip pat gali būti galutiniai

S. suihominis ir S. hominis šeimininkai [23]. Žmonės sarkocistoze užsikrečia

suvalgę nepakankamai termiškai apdorotos kiaulienos, užkrėstos S.

suiho-minis, arba jautienos, užkrėstos S. hominis [15, 20]. Jiems liga pasireiškia

karščiavimu, raumenų, galvos skausmu ir kosuliu [10]. Mokslinėje litera-tūroje yra duomenų apie žmonių susirgimus šia liga suvalgius kiaulienos, galvijienos ar kitų gyvūnų mėsos, užkrėstos patogeninėmis žmogui rūšimis [24]. Maistui vartojant termiškai nepadorotą jautieną, užkrėstą S. hominis ir

S. heydorni sarkocistomis, gali pasireikšti pykinimo, vėmimo, suprastėjusio

apetito, diarėjos, dusulio ir kiti simptomai [25–27]. Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) pateikiamais duomenimis 50 proc. parazitų cistų, ran-damų kiaulių ir galvijų raumenyse, yra S. hominis ir S. suihominis. Taip pat didelį S. suihominis ir S. meischeriana paplitimą patvirtina Indijos moks-lininkų gauti duomenys. Nustatyta atitinkamai 47 proc. ir 43 proc. užsi-krėtusių kiaulių [28]. Dėl šios priežasties svarbu įvertinti patogeninių

Europos šalyse sarkocistozės paplitimas galvijų populiacijoje tirtas skir-tingu laikotarpiu. Pastaruoju dešimtmečiu atliktų mokslinių tyrimų duomeni-mis galvijuose šių pirmuonių paplitimas gali siekti nuo 60 proc. iki 100 proc. [29–33]. Prarandama labai daug lėšų dėl galvijų skerdenų sunaikinimo, kai joje poskerdiminio tyrimo metu aiškiai matomos sarkocistos. Tačiau ekonominius nuostolius įvertinti konkrečiau sudėtinga, nes galvijai beveik 100 proc. užsikrėtę mikrocistomis, todėl vizualiai sunku atskirti užkrėstus gyvulius nuo neužkrėstų, taip pat neįmanoma įvertinti dėl sarkocistozės su-prastėjusios produkcijos, sumažėjusio primilžio, prastesnės mėsos kokybės, sulėtėjusio prieauglio augimo. Mokslininkų pateikiami duomenys apie

sarko-cistozės paplitimą skirtinguose pasaulio regionuose labai skiriasi. Tyrimai atlikti skirtingais metodais, skiriasi laikotarpiai ir tyrimų apimtys, kai kurie tyrimai atlikti gana seniai ir neatspindi dabartinės užsikrėtimo sarkocistomis padėties.

Pastraisiais metais, naudojant morfologinius ir molekulinius DNR tyrimo metodus nustatytos šešios sarkocistų (Sarcocystis gentis) rūšys parazituojan-čios galvijų raumenyse – S. bovifelis, S. bovini, S. cruzi, S. hirsuta, S. heydorni ir S. hominis [25, 34]. Sarcocystis spp. galutiniai šeimininkai skiriasi.

Sarcocysti cruzi galutiniai šeimininkai yra šuninių, o S. hirsuta ir S. bovife-lis – katinių šeimų plėšrūnai [35, 36]. Kas platina S. bovini, nėra žinoma, tuo

tarpu S. hominis ir S. heydorni galutinis šeimininkas – žmogus [25, 37]. Lietuvoje pastaruoju dešimtmečiu užsikrėtimas sarkocistomis buvo tiria-mas medžiojamoje faunoje, didžiausią dėmesį skirinat maistui medžioja-miems gyvūnams t.y. stirnoms, šernams, tauriesiems elniams. Taip pat tirti briedžiai, laukinės antys ir žasys. Lietuvoje atliktų tyrimų duomenimis,

Sarcocystis genties pirmuonys yra plačiai paplitę tarp laukinių gyvūnų ir

paukščių [6]. Galvijų sarkocistozė Lietuvoje tirta prieš du dešimtmečius ir nustatyta, kad 90,6 proc. Lietuvoje mėsai auginamų galvijų buvo užsikrėtę sarkocistomis [38]. Pastaraisiais metais Lietuvoje Sarcocystis rūšimis užsi-rėtę nuo 10 iki 100 proc. naminių gyvūnų [39]. Be to, galvijų sarkocistos įsiterpia į maisto grandinę ir turi tiesiogines sąsajas su žmonėmis ir naminiais gyvūnais [39].

Lietuvoje galvijų sarkocistų rūšinė sudėtis, įvairių skerdenos raumenų už-teršimas ir užteršimo gausa, poveikis gyvulio organizmui, skerdenų ir mėsos kokybei, galimas poveikis žmogaus sveikatai nebuvo tirta.

Pažymėtina, kad cistas sudarančios Sarcocystis rūšys gali būti diferenci-juojamos naudojant įvairius metodus [102]. Vizualinės apžiūros metu sker-dykloje galima pastebėti tik makroskopinius pažeidimus, kuriuos nebūtinai sukels zoonotinės rūšys ir tai neleidžia diferencijuoti sarkocistų rūšių. Dife-renciacija gali būti atlikta naudojant įvairius metodus. Vienas iš jų – hema-toksilinu ir eozinu dažytų mėginių mikroskopija, kurios metu galime matyti

morfologinius skirtumus. Šio metodo trūkumas yra tyrimo jautrumas dėl riboto tiriamų raumenų mėginių dydžio, fiziologinių sarkocistų skirtumų, kurie gali priklausyti nuo jų amžiaus, šeimininko ląstelės tipo ir fiksacijos metodų (14, 23). Dažnai rūšių diferenciacijai pagal morfologines savybes reikalinga transmisinė elektronų mikroskopija. Molekulinės technologijos buvo pritaikytos sarkocistų aptikimui, naudojant audinių virškinimo metodą bradizoitų suspensijos išskyrimui (54, 55) arba naudojant kombinacijoje su histologiniu tyrimo metodu (56).

Morfologinė Sarcocystis rūšių diagnostika paremta elektronine sarkocistų sienelės analizė netinka rutininiam šių parazitų įvertinimui dėl didelių kaštų ir santykinai ilgų procedūrų, taip pat reikalinga aukšta tyrėjų kvalifikacija [77]. Tuo tarpu natyvinių ar histologinių sarkocistų preparatų šviesinės mikroskopijos tyrimai nėra pakankamai tikslūs atskiriant kai kurias fenoti-piškai panašias galvijus parazituojančias Sarcocystis rūšis [154]. Molekulinis

Sarcocystis rūšių nustatymas taikant atskirų cistų izoliavimą, PGR ir

sekoskaitą yra santykinai brangus ir reikalauja aukštos tyrėjų kompetencijos [72, 108, 154]. Kol kas minėti metodai nėra tinkami kasdieninėje praktikoje didesniems mėginių kiekiams tirti.

Naminiuose, o tuo pačiu ir laukiniuose gyvūnuose randamų sarkosporidijų tyrimai yra svarbūs dėl jų potencialaus pavojaus žmogui [114, 119]. Pastarųjų metų moksliniai pranešimai rodo didelį užkrėstumą S. hominis Europoje parduodamoje jautienoje [108]. Nustatytas santykinai didelis procentas (6,2 proc.) S. hominis užkrėstoje jautienoje, kilusioje iš Belgijos ir Italijos [29, 54, 79]. Kadangi Europos šalyse žmonių maistui gana dažnai naudojama žalia mėsa, tai gali kelti didelį pavojų žmonių sveikatai [54, 114].

Dėl duomenų trūkumo poveikis žmonių sveikatai nėra visiškai aiškus, kaip ir situacija tarp gyvūnų populiacijų [102]. Sukėlėjams nustatyti dažnai naudojamas daugiau kaip vienas tyrimo metodas tiriant skirtingas žaliavas, o rezultatai skiriasi priklausomai nuo metodo. Tyrimo metodai lyginti pagal tai, kokius duomenis galima gauti, kokia yra savikaina ir praktiniai aspektai. Tyrimo kaina yra kaip vienas iš vertinimo aspektų dėl to, kad tai labai svarbu renkantis tyrimo metodą. Dėl šios priežasties labai svarbu plėtoti ir nustatyti

labiausiai tinkamus diagnostinius ir analitinius metodus, kurie turėtų būti nau-dojami tyrimams, sarkocistų identifikavimui, o taip pat sisteminti informaciją apie maistui naudojamų gyvūnų užsikrėtimą patogeninėmis sarkocistų rūši-mis [102, 218].

Sarkocistos, kaip tyrimo objektas, buvo pasirinktos ir dėl įvairių vis dar esančių neaiškumų, t. y. jų zoonotinės reikšmės, pasireiškimo ir įtakos gy-vūnų sveikatai, gygy-vūnų gerovei bei jų sukeliamų ekonominių nuostolių. ES valstybėse narėse vykdoma stebėsena skerdyklose pagal reglamentą Nr. 854/2004 [40]. Tai leidžia aptikti makroskopinius pakitimus skerdenoje

ir ją brokuoti generalizuotos sarkocistozės atveju ar šalinti atskiras skerdenos dalis silpnos ar lokalizuotos sarkocistozės atveju. Tačiau apžiūros skerdyk-lose metu negalime matyti mikroskopinių pažeidimų, negalime diferencijuoti ir identifikuoti sarkocistų rūšių. Kuriant gyvūnų sveikatos priežiūros sistemą labai svarbu laiku ir kokybiškai ištirti patogenų paplitimą bei jų poveikį gyvūnų sveikatai [102]. Sarkocistozės įtaka gyvulių sveikatai iki šiol buvo tirta eksperimentinėmis sąlygomis. Dėl duomenų trūkumo poveikis gyvūnų sveikatai ir mėsos kokybei nėra visiškai aiškus, taip pat nėra pakankamai duomenų apie kraujo biocheminių rodiklių fiziologines vertes šios ligos atveju, daugeliu atvejų atliktų tyrimų rezultatai skiriasi. Eksperimentinio už-krėstumo metodas vertinamas dvejopai, nes natūraliomis gamtinėmis sąlygo-mis gali nepavykti atkartoti gautų rezultatų [26]. Duomenų apie mėsos koky-bės pokyčius, esant skirtingam užkrėstumo gausumui galvijų raumenyse, nėra. Prieinamoje mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie suminį amino rūgščių bei biogeninių aminų kiekį vartojimui tinkamoje sirgusių gyvulių mėsoje. Netirta ir įtaka riebalų rūgščių sudėčiai.

Maistui skerdžiamų gyvulių raumenyse randamų sarkocistų tyrimai yra svarbūs, nes užkrėstumas sarkocistomis, poveikis skerdenų kokybei nėra tiksliai žinomas. Naudojami skirtingi analizės metodai, tiriamos skirtingos kūno dalys ar vietos, dažnai tirta nedidelis kiekis imčių, neatsižvelgta į amžių lytį, veislę. Šie parazitai gali kelti grėsmę žmogaus sveikatai, nes Euro-poje populiaru valgyti menkai ar visai termiškai neapdorotą mėsą ir mėsos produktus. Mokslinėje literatūroje pasigendama rinkoje parduodamų žalios mėsos ir silpnai termiškai apdorotų gaminių išsamių tyrimų, siekiant įvertinti užkrėstumą sarkocistomis ir galimą pavojų žmogaus sveikatai, esant gausiam užkrėstumui Sarcocystis pirmuoniais, šiuose produktuose. Pastarųjų metų moksliniai pranešimai rodo Europoje parduodamos jautienos užkrėstumą S.

hominis [108]. Europos šalyse maistui gana dažnai naudojama žalia mėsa, o

tai gali kelti pavojų žmonių sveikatai [54, 114]. Lenkijoje ir Vokietijoje ištyrus vaikų fekalijas, atitinkamai 10,3 proc. ir 7,3 proc. mėginių aptikta sarkosporidijų [136]. Pasauliniu mastu ši liga diagnozuojama nuo 6 proc. iki 10 proc. žmonių populiacijos [75].

Darbo tikslas – nustatyti galvijų skerdenų raumenų užkrėstumą

sarko-cistomis bei užkrėstumo gausą, nustatyti Sarcocystis rūšis parazituojančias galvijuose, įvertinti įtaką gyvulio organizmui, mėsos kokybei.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti Lietuvoje augintų galvijų skerdenų raumenų užkrėstumą sarko-cistomis bei užkrėstumo gausą (palyginti priklausomybę nuo amžiaus, lyties ir veislės), sarkocistų pasiskirstymą įvairiose raumenų grupėse ir rinkoje parduodamoje galvijienos produkcijoje.

2. Įvertinti Sarcocystis spp. poveikį galvijų organizmui ir jų mėsos kokybei priklausomai nuo užkrėstumo gausos (galvijų kraujo biochemines savybes bei raumenų histopatologinius pakitimus, mėsos maistinę vertę, technolo-gines savybes, saugumą vartoti maistui).

3. Šviesiniu mikroskopu tiriant raumenų preparatus, suskirstyti galvijų rau-menyse rastas sarkocistas į morfologinius tipus ir įvertinti naudojamos metodikos tinkamumą Sarcocystis rūšių diagnostikai.

4. Identifikuoti galvijų raumenyse randamas Sarcocystis rūšis ir nustatyti aptiktų parazitų vidurūšinės genetinės įvairovės charakteristikas taikant 18S rRNR ir cox1 genų sekų analizę.

5. Optimizuoti molekulinę metodiką rutininei galvijuose aptinkamų

Sarco-cystis rūšių diagnostikai ir įvertinti rūšių pasiskirstymą tiriamuosiuose

mėginiuose.

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė. Ištirta sarkocistų, parazituojančių

galvijų raumenyse, rūšinė sudėtis. Pirmą kartą ištirti ir palyginti natūraliai sarkocistomis užsikrėtusių galvijų kraujo biocheminiai rodikliai. Nustatytas šių rodiklių kitimas priklausomai nuo užsikrėtimo gausumo. Taikant įprastinį morfologinį metodą preliminariai nustatyta, jog galvijų raumenyse vyrauja jiems labiausiai patogeniška S. cruzi. Nustatyta sarkocistų įtaka maistui skerdžiamų galvijų mėsos kokybei, maistinė vertei, sanitarinei kokybei, įver-tintas galimas pavojus žmonių užsikrėtimui. Naudojant raumenyse aptiktų sarkocistų DNR analizės metodus, galvijų raumenyse nustatytos trys sarko-cistų rūšys: S. bovifelis, S. cruzi ir S. hirsuta. Tirtasis cox1 regionas pasižy-mėjo dideliu kintamumu aptiktose rūšyse, kurios remiantis šio regiono sekų analize skyrėsi pagal populiacijų genetinę įvairovę ir struktūrą. Sarkocistų rūšių identifikacijai galvijų raumenyse patobulinta ir gauta efektyvi ir santykinai greita metodika, pagrįsta raumeninių audinių virškinimu ir PGR su rūšiai specifiniais pradmenimis. Taikant molekulinės Sarcocystis parazitų diagnostikos metodiką analizuotuose galvijų mėginiuose nustatytos keturios

Sarcocystis rūšys: žmogui patogeninė S. hominis, taip pat S. cruzi, S. bovifelis

1. LITERATŪROS

APŽVALGA

1.1. Sarcocystis genties pirmuonių apibūdinimas

Sarcocystis – tai pirmuonių gentis, priskiriama Apicomplexa tipui ir Sarcocystidae šeimai. Sarcocystidae šeima atskiriama nuo kitų kokcidinių

pagal fakulatatyvinį arba obligatinį heterokseninį vystymosi ciklą, sugebėjimą formuoti cistas tarpinių šeimininkų įvairių tipų audiniuose ir oocistų morfologiją. Nelytinės pirmuonio stadijos vystosi tarpiniuose šeimininkuose, kurie dažniausiai yra žolėdžiai gyvūnai. Lytinis pirmuonio dauginimasis vyksta galutiniuose šeimininkuose, kuriais dažniausiai būna mėsėdžiai [11]. Tyrėjų duomenimis šiuo metu galima išskirti keletą sarko-sporidijų gyvybinio ciklo tarpinių ir galutinių šeimininkų variantų. Daž-niausias iš jų yra žinduolis – žinduolis, o kiti žinduolis – roplys, žinduolis – paukštis, roplys – roplys, paukštis – žinduolis, paukštis – paukštis. Sarcocystis pirmuoniais užsikrečiama, kai oocistos ar sporocistos su galutinio šeimininko išmatomis patenka į aplinką ir su pašaru ar vandeniu į jautraus sukėlėjui tarpinio šeimininko virškinimo traktą, kur virškinimo sultys suardo sporo-cistos sienelę ir išsilaisvina sporozoitus [9, 50]. Sarcocystis gentis labai paplitusi gamtoje ir randama visame pasaulyje. Ją sudaro daugiau nei 200 rūšių parazitų, kurie kenkia žinduoliams (taip pat ir žmogui), paukščiams, ropliams ir galimai žuvims [9, 34]. Sarkocistų skaičius ir organizmo už-krėstumas kinta priklausomai nuo prarytų oocistų skaičiaus, rūšies, gyvūno rūšies ir jo imuniteto [14]. Daugiausia sarkocistų aptinkama skersaruožiuose širdies, liežuvio, stemplės, diafragmos ir skeleto raumenyse, o kai kurios sarkocistų rūšys gali būti aptinkamos ir lygiuosiuose žarnų raumenyse. Nedideli sarkocistų kiekiai randami CNS ir Purkinjė skaidulose širdyje [34]. Paukščiai gali būti kaip transportiniai šeimininkai S.neurona rūšiai. Pa-vyzdžiui, paukščiai sulesę oposumo išmatų, kuris yra galutinis šeimininkas, išsituština ir su apkrėstomis išmatomis išplatina sporocistas. Taip pat šio užkrato pernešėjais gali būti musės ar tarakonai [41].

1.1.1. Sarcocystis rūšių parazituojančių galvijuose paplitimas

Sarkocistozės palitimas maistui skerdžiamų gyvūnų mėsoje skirtingose šalyse tirtas skirtingais laikotarpiais. Pirmas užsikrėtimo sarkocistomis atvejis karvėms aprašytas Kanadoje 1961 metais, kiek vėliau galvijų sarkocistozės atvejai buvo aprašyti Didžiojoje Britanijoje, Airijoje, Norvegijoje, Austra-lijoje, JAV, Japonijoje, Kuboje ir kitose šalyse [81, 82].

1966-1974 metais atliktų tyrimų duomenimis galvijuose nustatytas 67 proc. paplitimas Austrijoje, 80 proc. Vokietijoje, 90,2 proc. Lenkijoje, 96,6 proc. Ispanijoje ir 93,3 proc. Olandijoje [96]. Heydorn 1972-1977 metais atlikto tyrimo metu Vokietijoje nustatė, kad visi galvijai vyresni nei 2 metų yra užsikrėtę sarkocistomis [96]. Daugumoje regionų, tame tarpe ir Naujojoje Zelandijoje [97], Belgijoje [98], Prancūzijoje [99], Irake [22], Olandijoje [100] ir Etiopijoje [101] galvijų užkrėstumas siekia beveik 100 proc. Tyrėjų duomenimis, Indijoje galvijų užsikrėtimas sarkocistoze sudarė 80 proc., iš 238 tirtų galvijų 29 buvo identifikuotos kaip S. hominis, 31 – S. hirsuta ir 186 – S. cruzi [102]. Vakarų Australijoje buvo nustatytas 52 proc. paplitimas [103]. Atlikti tyrimai parodė, kad 36,78 proc. iš JAV importuotos jautienos produkcijos ir 29,49 proc. iš Australijos importuotos jautienos produkcijos užkrėsta sarkocistomis [104].

Galvijų sarkocistozė Lietuvoje tyrinėta mažai. Remiantis 1994 metais atliktais tyrimais 90,6 proc. galvijų buvo užsikrėtę sarkocistomis [105].

Pastaruoju dešimtmečiu galvijų užsikrėtimas Sarcocystis rūšimis buvo tirtas įvairiose pasaulio šalyse ir gauti labai skirtingi rezultatai. Rusijoje at-liktų tyrimų duomenimis Saratovo bei Baškirijos srityse galvijų užkrėstumas sarkocistoze siekia 100 proc. [84, 106]. Teigiama, jog iš visų galvijų, užsi-krėtusių sarkocistoze, 82,2 proc. invazijos gausumas yra labai didelis [107]. Galvijų užsikrėtimas sarkocistoze Estijoje vidutiniškai sudaro 57,5 proc., o daugiausiai sarkocistoze užsikrėtę galvijai yra Rytų Estijos regione – 83,6 proc. [33]. Argentinoje sarkocistoze užsikrėtę 71,5 proc. galvijų [108], Indijoje – 58,74-80,3 proc. [53]. Irane atliktų tyrimų rezultatai patvirtina didelį, iki 100 proc., sarkocistų palitimą galvijų ir buivolų populiacijose [15, 109], taip pat Brazilijoje ir Turkijoje – 100 proc. [85], Mongolijoje – 96,9 proc. [110]. Tyrėjai [17] praneša apie sarkocistozės tyrimus Alžyre, galvijų sarkocistozė tirta ir Argentinoje [72]. Šiaurės Italijoje sarkospori-dijomis užsikrėtę 78,1 proc. skerdžiamų galvijų [29], Kolumbijoje – 4 proc. [111], Australijoje – 52 proc. [103], Malaizijoje – 36,2 proc. [112]. 2011 metais atliktas tyrimas Italijos regione Pjemonte parodė, kad galvijuose pa-plitimas viršija 80 proc. [29], o 2013 metais atliktame tyrime Sicilijoje auto-riai nustatė Sarcocystis spp. 91 proc. galvijų [73]. Skirtingų autorių duo-menimis Italijoje sarkocistoze užsikrėtę nuo 64 iki 91 proc. galvijų [29, 73, 113]. Ištyrus Italijos Pjemonto regiono galvijų mėsą buvo nustatytas 80–91 proc. galvijų užsikrėtimas sarkocistomis ir 68,0 proc. sudarė S. hominis [114]. Vokietijoje atliktų tyrimų duomenimis net 63 proc. tirtų galvijų buvo už-sikrėtę S. hominis [23]. Atliekant mokslinius tyrimus Vengrijoje buvo nu-statytas 66,0–78,1 proc. sarkocistų paplitimas galvijuose [30], Portugalijoje – 64,6–100 proc. [32], Prancūzijoje – 90–100 proc. [115].

Mokslininkai [44] pateikia apibendrinačius duomenis ir nurodo, kad dau-giausia galvijų užauginama ir didžiausi jautienos skerdenos kiekiai pasaulyje registruojami Azijoje [116]. Dėl didelės jautienos produkcijos paklausos šiame regione dažniausiai ir yra tiriama galvijų mėsa, jos užkrėstumas

Sar-cocystis spp. ir poveikis žmogaus sveikatai. Remiantis Dubey JP ir kt. [44]

knygoje nurodytais duomenimis, Europoje ištirta šiek tiek mažiau mėginių (5492), dar mažiau Okeanijoje (1516), Pietų Amerikoje (939) ir Afrikoje (214). Šiaurės ir Centrinė Amerika yra antroje vietoje pasaulyje pagal augi-namų ir vartojamų galvijų kilmės produktų kiekį, tačiau kol kas čia atlikta labai mažai tyrimų (214) [44, 116].

Šešiuose pasaulio geografiniuose regionuose atlikta 60 skirtingų tyrimų vertinant galvijų užsikrėtimą sarkocistomis. Didžiausias užsikrėtusių galvijų kiekis nustatytas Pietų Amerikoje (80,72 proc.), o mažiausias – Azijoje (52,23 proc.). Šiaurės Amerikoje užsikrėtusių galvijų kiekis sudaro 73,83 proc., Okeanijoje – 69,79 proc., Europos šalyse – 67,23 proc., Afriko-je – 52,94 proc. Manoma, kad santykinai nedidelis užsikrėtimas sarkocisto-mis Azijoje susijęs su rečiau užsikrėtusiosarkocisto-mis vietinėsarkocisto-mis galvijų veislėsarkocisto-mis [44].

Zoonotiniu požiūriu galvijų sarkocistozė užima svarbią vietą, nes žmogus yra S. hominis galutinis šeimininkas [113]. Įvairiose pasaulio šalyse, pa-vyzdžiui, Šiaurės Vietname [117], Argentinoje [108] ir Nigerijoje [118] buvo tirtas S. hominis paplitimas galvijuose. Ankstesnių tyrimų Italijoje duo-menimis 74,2 proc. galvijų buvo užsikrėtę S. cruzi, 1,8 proc. – S. hirsuta ir 42,7 proc. – S. hominis [54].

Vertėtų atkreipti dėmesį, kad sarkocistų aptikimui naudotos skirtingos metodikos ir tai galėjo lemti nustatytus užsikrėtimo pirmuonimi skirtumus geografiniuose regionuose.

1.2. Sarkocistų morfologija ir vystymasis

Sarkocista (gr. mėsos pūslelė) yra galutinė nelytinio vystymosi stadija, kuri randama skersaruožiuose žinduolių, paukščių ir šaltakraujų gyvūnų raumenyse. Sarkocistos, priklausomai nuo jų rūšies, skiriasi dydžiu ir forma. Kai kurios sarkocistos visada būna mikroskopinėmis (pvz: S. cruzi), o kitos tampa makroskopinėmis (pvz: S. gigantea, S. muris). Mikroskopinės sarko-cistos gali būti ilgos ir siauros arba trumpos ir plačios. Makroskopinės sarkocistos beveik visada turi siūlinę formą (išvaizdą) ir aptinkamos skeleto ar stemplės raumenyse – pavyzdžiui, Sarcocystis muris, arba gali būti ryžio grūdo (Sarcocystis rileyi), verpstės (Sarcocystis fusiformis) ar rutulio

(Sar-cocystis gigantea) formos [42]. Sarkocistą sudaro cistos sienelė, kuri gaubia

sienelės sandara ir storis skiriasi priklausomai nuo jų subrendimo laipsnio ir

Sarcocystis rūšies. Mikroskopuojant matoma lygi, ruožuota, vingiuota ar su

išaugomis sarkocistos sienelė. Nuo sarkocistų sienelės atsišakojanti septa sarkocistą dalina į atskiras, užpildytas zoitais, kameras. Jei septos plonesnės nei 2 µm mikroskopuojant jų nematyti arba jos būna neryškios. Priklausomai nuo sarkocistos subrendimo laipsnio jos struktūra keičiasi. Nesubrendęs cistozoitas yra rutulio formos ir vadinamas metrocitu, o po kelių pasidalijimų kai kurie metrocitai produkuoja banano formos zoitus, dar vadinamus bradizoitais [34]. Sarkocistos viduje metrocitai lokalizuojasi taip vadinamoje žievinėje, o bradizoitai šerdinėje zonoje. Senose didelėse sarkocistose bra-dizoitai kartais degeneruoja ir centrinėje sarkocistos dalyje juos pakeičia granulės arba globulės. Gyvybingos sarkocistos būna prisipildžiusios skysčio su metrocitais ir bradizoitais [6]. Subrendusi sarkocista gali turėti tūkstančius bradizoitų ir gali būti matoma plika akimi (S. gigantea avyse ir S. hirsuta galvijuose) [23]. Histologinius preparatus nudažius hematoksilinu ir eozinu metrocitai atrodo blyškesni negu bradizoitai. Tepinėliuose dažytuose Giemsa dažais metrocitai būna nuo apvalios iki ovalios formos ir rožinės spalvos [34]. Visiems Sarcocystis spp. šeimos atstovams būdingas sudėtingas heterok-seninis obligatinis vystymosi ciklas. Sarcocystis spp. vystymosi ciklui rei-kalingi du šeimininkai: tarpinis ir galutinis. Žolėdžiai ir visaėdžiai yra tarpiniai šeimininkai, o mėsėdžiai ir visaėdžiai – galutiniai [43]. Kai kurios sarkocistų rūšys gali praeiti vystymosi ciklą vienos rūšies gyvūnuose, bet ne tame pačiame organizme [34]. Nelytinis dauginimosi ciklas vyksta tarpinio šeimininko raumenyse ar centrinėje nervų sistemoje, kur formuojamos sar-kocistos, o lytinio dauginimosi ciklas vyksta galutinio šeimininko žarnyne [43]. Tarpiniai šeimininkai Sarcocystis genties parazitais užsikrečia su pašaru ar vandeniu prarydami sporocistas. Kiekviena sporocista sudaryta iš keturių sporozoitų. Sporozoitai išsilaisvina iš sporocistos virškinimo trakte [34]. Sporozoitams išsilaisvinus iš sporocistų prasideda merogonijų vystymasis (susidarymas). Pirmos kartos merogonija (šizogonija) vyksta kraujagyslių endotelyje, bet dažniausiai limfiniuose mazguose ir trunka apie 7–15 dienų po užsikrėtimo. Antros kartos merogonija susidaro merozoitams (šizontams) su krauju nukeliauvus į kapiliarus ir smulkias arterijas. Daugiausiai merozoitų aptinkama inkstų glomeruluose. Antros kartos šizontai aptinkami 19-46 dieną po sporocistų patekimo į parazito šeimininko organizmą [5]. Trečios kartos merozoitai randami kraujo ląstelėse ir aptinkami antrą mėnesį po užsikrėtimo. Merogonijos generacijų skaičius ir šeimininko ląstelės tipas, kuriame vyksta merogonija, priklauso nuo Sarcocystis rūšies. Po merogonijos prasideda sar-kocistos formavimasis: merozoitai prasiskverbia į raumenines ląsteles, vidu-ląstelinis merozoitas apsuptas parazitoforine vakuole tampa metrocitu, taip formuojasi sarkocistos, jos didėja ir bręsta. Metrocitai formuoja pusmėnulio

formos bradizoitus. Merozoitų generacijų skaičius skiriasi priklausomai nuo šeimininko ląstelės tipo bei Sarcocystis rūšies [6]. Po kelių pasidalijimų metrocitai virsta cistozoitais, kurie yra invaziniai galutiniam šeimininkui. Parazito brendimo laikas tarpiniame šeimininke skiriasi kiekvienai

Sarco-cystis rūšiai ir vidutiniškai trunka 2 mėnesius, bet gali tęstis ir iki 12 mėnesių,

kol susiformuoja bradizoitai ir jie tampa užkrečiami galutiniams šeiminin-kams [23]. Tarpinių šeimininkų raumenyse susidariusios cistos būna pailgos, išsidėsčiusios išilgai raumenų skaidulų, nuo 0,5 iki 5 mm ilgio, todėl gali būti matomos ir plika akimi. Šios cistos yra invazinės (užkrečiamos) galutiniams šeimininkams – mėsėdžiams gyvūnams, taip pat žmogui [44]. Ne visos sar-kocistų rūšys yra patogeniškos tarpiniams šeimininkams. Visumoje, sarkocis-tų rūšys, kurios perduodamos per šuninių šeimos atstovus, yra labiau pa-togeniškos, nei tos, kurias platina kiti galutiniai šeimininkai [7]. Sarkocitų patogeniškumas priklauso nuo rūšies, užsikrėtimo intensyvumo ir lokaliza-cijos organizme [20].

Galutiniai šeimininkai suserga sarkocistoze prarydami raumeninį ar ner-vinį audinį su subrendusiomis sarkocistomis. Virškinimo metu iš sarkocistos bradizoitai atsipalaiduoja skrandyje ir plonosiose žarnose. Bradizoitai skver-biasi į plonojo žarnyno gleivinę ir transformuojasi į vyriškus (mikro) ir mo-teriškus (makro) gamontus. Iš subrendusio mikrogamonto gametos išsilais-vina ir žiuželių pagalba aktyviai juda į makrogamonto periferiją. Susijungus mikro- ir makrogamontams susiformuoja zigota ir vystosi oocistos. Gameto-gonijos ir apvaisinimo procesas gali trukti 24 valandas [34]. GametoGameto-gonijos procesas yra asinchroninis, todėl vienu metu galima aptikti oocistas ir ga-montus. Gametogonijos lokalizacija ir parazituojamų ląstelių tipai varijuoja priklausomai nuo rūšies ir gametogenezės stadijos. Oocistos sporuliuoja plo-nojo žarnyno jungiamojo audinio sluoksnyje (lot. laminapropria). Sporulia-cija vyksta asinchroniškai, todėl tuo pačiu laiku randamos nesporuliavusios ir sporuliavusios oocistos. Po trijų branduolio pasidalijimų susiformuoja dvi sporocistos su keturiais sporozoitais. Sporocistos su fekalijomis patenka į aplinką. Daugumos Sarcocystis rūšių oocistos/sporocistos išmatose randamos po 7–14 dienų ir oocistų/sporocistų išskyrimas dažniausiai trunka iki kelių mėnesių [6]. Nesubrendusios sarkocistos ir šizointai yra nepavojingi galuti-niams šeimininkams. Po pakartotinio pasidalijimo sarkocistos būna pripil-dytos bradizoitais ir šiuo metu jos tampa invazinės mėsėdžiams. Sarkocistos invazinėmis paprastai tampa apie 75 dieną po patekimo į organizmą, tačiau šis laikas varijuoja priklausomai nuo rūšies [34].

1.2.1. Sarcocystis rūšių parazituojančių galvijuose morfologiniai skirtumai

Morfologiškai identifikuojant Sarcocystis rūšis, svarbiausias požymis – tarpinio šeimininko raumenyse suformuojamos sarkocistos sienelės sandara. Atsižvelgiant į morfologinius sarkocistų požymius yra išskiriamos šešios galvijuose parazituojančios rūšys: S. cruzi – kaspino formos, plonasienės cistos (< 1 μm), 183–1000 μm ilgio ir 20–100 μm pločio, cistų sienelės išaugos siūlinės, plonos, ties pamatu smailėjančios, bukais galais, iki 0,3 µm pločio, apie 3,5 µm ilgio; S. bovini – cigaro, cilindro formos, cistų galai bukesni už S.bovifelis, storasienės cistos (iki 6 µm), 1000–3000 μm ilgio ir 100–200 μm pločio, cistų sienelės išaugos link viršūnės smailėja, ties viduriu stambesnės, apie 1,5 µm pločio ir 7 µm ilgio; S. bovifelis – cigaro, cilindro formos, smailesniais galais už S. bovini, storasienės cistos (iki 6 µm), 1000– 3000 μm ilgio ir 100–200 μm pločio, cistų išaugos piršto formos, viršūnėje ir ties pamatu tokio paties storio, 5–6 μm ilgio; S. heydorni – kaspino formos, plonasienės cistos (1–1,5 μm), apie 1000 μm ilgio ir 80 μm pločio, išaugų dydis svyruoja 0,3–0,5 × 0,5–0,9 µm, jos yra trumpos ir plačios; S. hominis – cigaro arba ovalo formos, storasienės cistos (iki 6 µm), 700–2600 μm ilgio ir 50–150 μm pločio, išaugos yra apie 0,7 µm pločio ir 7 µm ilgio; S. hirsuta – kaspino formos, storiasienės cistos (3–7 µm), 800–8000 μm ilgio iki 500– 1000 μm pločio, išaugų forma panaši į pirštą, ties viršūne ir pamatu vienodo storio, 5–7 μm ilgio [23, 25, 35, 44].

Pažymėtina, kad morfologinė Sarcocystis rūšių parazituojančių galvijuose diagnostika yra sudėtinga. Naudojant šviesinę mikroskopiją galima atskirti

S. cruzi, S. hirsuta ir S. heydorni rūšis. Subrendusios S. hirsuta sarkocistos

yra makroskopinės, o kitų rūšių cistos aptinkamos mikroskopuojant. Šviesi-niu mikroskopu nesimato trumpų S. heydorni cistų išaugų, o S. cruzi formuoja mikroskopuojant matomas plonas, siūlines išaugas. S. bovini, S. bovifelis ir

S. hominis morfologiškai tarpusavyje labai panašios, mikroskopuojant

sudė-tinga diferencijuoti, todėl identifikuojant šias rūšis rekomenduojama morfo-loginius metodus derinti su molekuliniais [35, 73, 95].

1.3. Sarcocystis genties pirmuonys galvijuose, jų patogeniškumas

Ilgą laiką buvo manoma, kad galvijuose parazituoja trys Sarcocystis rūšys – S. cruzi (galutiniai šeimininkai šuninių šeimos žinduoliai), S. hirsuta (galutiniai šeimininkai katinių šeimos žinduoliai) ir S. hominis (galutiniai šeimininkai žmogus ir kiti primatai) [75]. Galutiniams šeimininkams sarko-cistos dažniausiai nesukelia ligos klinikinių požymių [23, 45–47].

Prie galvijuose aptinkamų Sarcocystis rūšių priskirta S. sinensis, kurios

gyvybinis ciklas nebuvo pakankamai ištirtas [76]. Ši Sarcocystis rūšis buvo aptikta Azijiniame buivole (lot. Bubalus bubalis) ir nustatyta, kad jos mor-fologija skiriasi nuo rūšies, randamos galvijų raumenyse, o 2015 metais ši

Sarcocystis rūšis pavadinti S. rommeli [77]. Tais pačiais metais, atlikus

mo-lekulinius tyrimus (cox1 sekų analizę) paaiškėjo, kad S. rommeli vadinamą sarkocistų rūšį galvijuose sudaro dvi rūšys – S. bovini, kurios galutinis šei-mininkas nežinomas ir S. bovifelis, kurios galutiniai šeimininkai yra katinių šeimos žinduoliai [35]. Be to, 2015 m. Kinijoje atliktų tyrimų duomenimis teigiama, kad egzistuoja dar viena galvijuose parazituojanti sarkocistų rūšis –

S. heydorni, kurios galutinis šeiminkas yra žmogus [25]. Taigi, remiantis

naujaisiais mokslinių tyrimų duomenimis, galvijuose aptinkamos šešios

Sarcocystis genties parazitų rūšys: S. bovifelis, S. bovini, S. cruzi, S. hirsuta, S. heydorni ir S. hominis.

Tyrėjų nuomone, Sarcocystis spp. įskaitant ir zoonotines rūšis, parazituoja daugelyje Europoje maistui naudojamų gyvūnų rūšių ir kai kurios iš jų yra patogeninės. Priklausomai nuo sarkocistų rūšies ir užsikrėtimo gausos, gali pasireikšti ligos simptomai. Ligos simptomai paprastai būna sunkesni tarpi-niams šeimininkams, o gausus užsikrėtimas sarkocistomis turi ir ekonominę reikšmę dėl sumažėjusios gyvūno masės ir mėsos kokybės [12]. Dažniausiai sarkocistos pasižymi didesniu patogeniškumu tarpiniams, o ne galutiniams šeimininkams. Galutiniams šeimininkams sarkocistos įprastai nesukelia ligos klinikinių požymių [23, 45–47].

Patogeniškumo stiprumas priklauso nuo rūšies, sukėlėjo dozės, lokaliza-cijos organizme, šeimininko rezistentiškumo, gyvūno patiriamo streso. Tar-piniams šeimininkams užsikrėtimas Sarcocystis genties pirmuonimis daž-niausiai yra besimptomis, tačiau pasitaiko ir ūmios sarkocistozės atvejų, pasireiškiančių įvairiais klinikiniais simptomais, tokiais kaip silpnumas, anoreksija, diarėja, svorio netekimas, raumenų trūkčiojimai, CNS sutrikimai ir kita, o retais atvejais pasibaigiančių netgi gyvūno žūtimi [72, 74, 78]. Ryškesni klinikiniai požymiai pasireiškia tiems gyvūnams, kurių imuninė sistema nusilpusi [45]. Šiuolaikinės ūkininkavimo sistemos, o taip pat gyvulio adaptavimasis prie besikeičiančių klimatinių sąlygų silpnina organizmo atsparumą. Esant tokioms sąlygoms išauga gyvulių sergamumas sarkocistoze, apsunkinama ir kitų ligų eiga [1].

Galvijams sarkocistozė kartais yra susijusi su keliais sindromais ir patolo-gijomis: ūmi sarkocistozė (Dalmenio liga) yra reta, eozinofilinis miozitas ir slaptoji miopatija taip pat pasitaiko gana retai [4, 79]. Pirmą kartą klinikiniai galvijų sarkocistozės požymiai aprašyti Kanadoje 1961 metais. Ontarijo pro-vincijoje pasireiškė neaiškios etiologijos susirgimas, kuriam buvo

chrakte-ringa anoreksija, anemija, kacheksija, generalizuotas limfadenitas, hiperseli-vacija, raumenų tremoras, plaukų iškritimas (ypač uodegos gale), lokalinės opos snukio ertmėje ir stemplėje. Autorių teigimu, iš susirgusių 25 karvių nugaišo 17 [80]. Kiek vėliau galvijų sarkocistozės atvejai buvo aprašyti Didžiojoje Britanijoje, Airijoje, Norvegijoje, Australijoje, JAV, Japonijoje, Kuboje ir kitose šalyse [81, 82]. Pirmasis laukinių atrajotojų klinikinės sarko-cistozės atvejis aprašytas 2000 m. [83]. Esant ūmiai sarkocistozei, galvijams gali išsivystyti įvairūs CNS sutrikimai, kurie pasireiškia nevalingu akies obuolio trūkčiojimu (nistagmas), nugaros raumenų mėšlungiu ir gulėjimu ant šono (opistotonusas). Pasireiškus CNS sutrikimams gyvuliai gaišta [44].

Gyvuliams, sergantiems ūmia sarkocistoze, vystosi eozinifilinis miozitas, pasireiškia raumenų spazmai, išliesėjimas, hemoragijos, gelta, pneumonija, anemija, blogėja skerdenos kokybė, galimi abortai ir neurologiniai sutrikimai, o retais atvejais ši liga gali baigtis gyvūno mirtimi [75]. Veršingos karvės gali abortuoti paskutiniame veršingumo periode. Veršeliams sutrinka augimas ir jie gali nugaišti dėl išsekimo [26].

Sergantiems poūmia sarkocistoze gyvuliams būdingas lėtesnis augimas, bet poveikio skerdenos kokybei nenustatyta. Lėtine sarkocistoze sergantys gyvuliai atrodo pavargę, daug guli, kai kurie vaikščioja ratu, netenka masės, jų maži priesvoriai, suprastėja skerdenos kokybė, nuslenka plaukai ant pasturgalio, uodegos bei kaklo srityse [46, 47]. Lėtinės ligos eigos atveju

S. cruzi galvijams gali sukelti centrinės nervų sistemos sutrikimus [84, 85].

Mokslinių tyrimų duomenimis, viena grupė galvijų, pasveikusių nuo sarkocistozės, negalėjo pilnai atsistatyti ir galiausiai nugaišo dėl kacheksijos. Taip pat užfiksuoti keli atvejai, kai gyvuliams pasireiškė nekrozinis ence-falitas, o užsikrėtimas S. hominis sukėlėju buvo besimptomis [75]. Dėl su-prastėjusisos vilnos, skerdienos, pieno produkcijos ir kokybės, gyvulių augin-tojai kasmet patiria didelių ekonominių nuostolių. Mėsa, kurioje matomos sarkocistos ar jų sukelti pakitimai nėra tinkama prekybai ir turi būti bro-kuojama [20].

Ekspermentiškai užkrėtus veršelius sarkocistomis jiems pasireiškė karš-čiavimas, anoreksija, masės netekimas, seilėtekis, plaukų slinkimas kaklo, ausų ir uodegos srityje, ašarojimas ir gaišimas [86]. Gyvuliams, dažniausiai galvijams ir avims, užsikrėtusiems didelėmis sarkocistų dozėmis, sukeliami abortai [87].

Iš galvijuose (taip pat buivoluose ir bizonuose) randamų sarkocistų rūšių,

S. cruzi – labiausiai patogeniška rūšis tarpiniams šeimininkams [34, 88].

Užsikrėtus S. cruzi, galvijų sergamumas ir gaištamumas yra gana didelis. Ši rūšis plačiai paplitusi pasaulyje ir yra dažniausiai aptinkama galvijuose iš visų sarkocistų rūšių [89].

Tačiau nežinoma ar būtent ši rūšis galvijams sukelia eozinofilinį miozitą, nes eksperimentiškai užkrėstiems galvijams eozinofilinis miozitas nepasi-reiškė [90]. Eksperimentinių tyrimų metu pastebėta, kad gyvulius užkrėtus 1000 ar mažiau sporocistų pasireiškia nežymūs klinikiniai simptomai, o užsikrėtimas 5 milijonais sporocistų iššaukia gyvūno gaišimą [91].

Sarcocystis hirsuta ir S. hominis yra mažiau patogeninės rūšys galvijams

nei S. cruzi. Į gyvulio organizmą patekus 100 000 ar daugiau sporocistų jie pradeda karščiuoti, viduriuoti, vystosi anemija, tačiau neaprašyta nė vieno gaišimo atvejo dėl užsikrėtimo šių rūšių sporocistomis [92]. Sarkocistų patogeniškumo galvijams tyrimai atlikti tuo laikotarpiu, kai buvo manyta, kad juose parazituoja trys rūšys, o S. bovini ir S. bovifelis tuo metu dar buvo priskiriamos S. hominis rūšiai. Keliama prielaida, kad galvijams S. bovini ir

S. bovifelis patogeniškumas yra panašus į S. hominis [35]. Neseniai atrastos S. heydorni rūšies patogeniškumas nėra tirtas [3].

Kraujo biocheminiai parametrai yra svarbūs diagnozuojant ligą, įvertinant jos poveikį organizmui, prognozuojant ligos eigą, bei taikant gydymą. Para-zitinių ligų atveju gyvūnų organizme pristingama vitaminų ir mikroelementų, vystosi anemija [93]. Prieinamoje mokslinėje literatūroje rasta labai mažai duomenų apie kraujo klinikinius tyrimus šios ligos atveju.

Mokslinių tyrimų duomenimis, veršelius eksperimentiškai užkrėtus

Sarco-cystis cruzi, padidėjo laktatdehidrogenazės (LDH) ir aldolazės (ALD)

pa-rametrai veršelių kraujo plazmoje, o gliukozės-6-fosfato dehidrogenazės (G6PDH) ir izocitratdehidrogenazės (ICDH) reikšmės buvo nepakitusios. Taip pat užsikrėtusiems veršeliams buvo nustatytas sumažėjęs fermentų ak-tyvumas ilgiausiame nugaros raumenyje (LDH, ALD), diafragmos raume-nyse (ALD, G6PDH) ir širdies raumenyje (LDH, ALD). Teigiama, kad plaz-mos fermentų aktyvumo padidėjimo priežastis yra glikolitinių fermentų nu-tekėjimas iš pažeistų raumenų [78].

Taip pat Klinkon su bendrautoriais [94] teigia, kad dar nėra pakankamai duomenų apie veršelių kraujo biocheminių rodiklių fiziologines vertes ir daugeliu atvejų atliktų tyrimų rezultatai skiriasi.

1.3.1. Sarkocistų sukeliami patomorfologiniai pakitimai galvijų organizme

Sarkocistozės požymių pasireiškimas priklauso nuo patekusių į organizmą sarkocistų kiekio ir nepalankių organizmą veikiančių veiksnių, pavyzdžiui streso ar veršingumo. Dažniausiai sarkocistos aptinkamos lygiuosiuose ir skersaruožiuose (I arba II tipo raumenų skaidulose) miocituose, Purkinjė skaidulose širdyje ir nervinėse ląstelėse smegenyse. Degeneraciniai pokyčiai matomi miocituose po merozoitų invazijos. Pirmiausia nustatoma endotelio

ląstelių hipertrofija su pirmos kartos šizontų išsivystymu arterijose ir arte-riolėse, po to seka perivaskulinė ar intersticinė organų infiltracija mono-nuklearinėmis ląstelėmis. Mononuklearinės ląstelės aptinkamos po 11 dienų po užsikrėtimo ir gali būti aptinkamos dar keletą mėnesių po užsikrėtimo. Iš uždegiminių ląstelių vyrauja limfocitai, makrofagai, plazminės ląstelės ir eozinofilai. Tačiau sarkocistų invazijos atveju uždegiminės reakcijos gali ir nebūti. Mikroskopiškai audiniuose matomos generalizuotos hemoragijos, nekrozės židiniai aptinkami daugelyje organų, įskaitant skeleto raumenis, širdį, inkstus [34]. Audiniuose vyrauja uždegiminio, o ne degeneracinio

pobūdžio pakitimai [34]. Tokie pakitimai kaip vaskulitas, hemoragijos ir miocitų nekrozė yra susijusi su merozoitų patekimu į miocitus. Sarkocistų sukeliami degeneraciniai pakitimai raumenyse būna apsupti neutrofilų, ezino-filų, mononuklearinių ir gigantinių ląstelių [43]. Mokslinių tyrimų duome-nimis galvijų sarkocistozė gali sąlygoti eozinofilinį miozitą t. y. specifinę uždegiminę reakciją su eozinofilų susikaupimu skersaruožiuose raumenyse. Šis uždegimas gali būti aptinkamas akių, gerklų, skeleto ir širdies raumenyse [34]. Eozinofilinis miozitas dažniausiai aptinkamas galvijuose [45].

Galvijams eozinofilinio miozito klinikiniai požymiai nenustatomi, jie atrodo sveiki [79]. Pirmo tipo eozinofilinio miozito atveju histomorfologiniai, tiriamųjų raumenų pakitimai yra apibūdinami kaip granuliomos, kurių centre aptinkami degeneruoti eozinofilai ir nekrozuotos raumenų skaidulos, apsup-tos epitelioidinėmis ląstelėmis bei fibroziniu audiniu [90]. Esant pirmojo tipo eozinofiliniam miozitui aptinkamos sarkocistos. Antrojo tipo eozinofilinis miozitas pasitaiko rečiau, tačiau lengviau nustatomi patomorfologiniai paki-timai raumenyse. Jie būna nuo ryškiai žalios iki blankiai gelsvos spalvos ir gali būti iki 15 cm diametro. Eksperimentinėmis sąlygomis gyvulius užkrėtus sarkosporidijomis eozinofilinio miozito nepavyko sukelti. Atlikti tyrimai parodė, kad eozinofilinis miozitas pasitaiko ženkliai rečiau nei užsikrėtimas sarkocistomis. Teigiama, kad ryšys tarp eozinofilinio miozito ir sarkocistozės vis dar neišaiškintas [90]. Visgi įrodyta, kad eozinofilinio miozito pažeistose vietose yra sarkocistų ir aptinkamos rūšys yra tokios pačios kaip raumenyse be miozito požymių [79]. Kita vertus teigiama, kad eozinofilinis miozitas nustatomas gan retai, o galvijų užsikrėtimas sarkocistomis yra labai didelis. Šios patologijos priežastys nėra aiškios, tačiau spėjama, kad pažeidimai gali būti susijęs su viena specifine sarkocistų rūšimi [79].

Nervinės sarkocistozės forma galvijams aprašyta tiriant 9 mėnesių galviją, kuris nugaišo pasireiškus nerviniams sutrikimams. Atlikus galvos smegenų mėginių histomorfologinį tyrimą buvo aptikta išplitusi židininė nekrozė, me-ningoencefalitas ir dideli šizoitų ir merozoitų kiekiai [34].

Sarkocistozės atveju vizualiai patomorfologinio tyrimo metu gali būti nu-statoma edema ir nekrozės židiniai limfiniuose mazguose, kurie dažniausiai

aptinkami 15 dieną po užsikrėtimo. Praėjus 26 dienos po užsikrėtimo ap-tinkami kiti makroskopiniai pakitimai iš kurių būdingiausi yra išplitusios kraujosrūvos seroziniuose dangaluose, širdies ir skeleto raumenyse, o taip pat akies odenoje. Ūmios sarkocistozės atveju skeleto raumenys atrodo margi arba dryžuoti su šviesiomis zonomis ir išplitusiomis, skirtingo dydžio (taš-kelių, dėmių ruoželių pavidalo) kraujosrūvomis. Ūmios sarkocistozės atveju sumažėja kūno riebalų kiekis, riebalai būna geltoni, drebučių konsistencijos. Lėtinės sarkocistozės atveju perikardo ir antinkščių riebalų atrofija su kal-cifikacijos židiniais [34].

1.3.2. Mėsos produktų užkrėstumas sarkocistomis ir įtaka jų kokybei

Pastarųjų metų moksliniai pranešimai rodo Europoje parduodamos jau-tienos užkrėstumą S. hominis [108]. Nustatytas didelis procentas S. hominis pirmuoniais užkrėstos jautienos kilusios iš Belgijos ir Italijos [29, 54, 79]. Italijos prekybos centruose atliktų tyrimų duomenimis – 6,2 proc. jautienos produktų buvo užkrėsti S. hominis, 6,6 proc. – S. hirsuta , 37 proc. – S. cruzi [108]. 2007 m. Belgijoje buvo tirta smulkinta jautiena ir nustatyta, kad užter-šimas sarkocistomis siekia 97,4 proc.. Kadangi tiek Belgijoje, tiek kitose Europos šalyse žmonių maistui gan dažnai yra naudojama žalia mėsa, tai gali kelti pavojų žmonių sveikatai [54, 114].

Šiaurės vakarų Irane, Tabrizo mieste, ištyrus parduodamų mėsainių pa-plotėlius, nustatytas jų užrerštumas Sarcocystis cistomis [120]. Apžiūros metu makroskopinų cistų nebuvo rasta. Mikroskopinio tyrimo metu iš 96 mėginių 54 (56,25 proc.) buvo rasta bent viena sarkocista. Esminio skirtumo tarp pramoniniu ir tradiciniu būdu pagamintų mėsainių užkrėstumo sarko-cistomis nebuvo nustatyta [120]. Virškinimo metodu ištyrus po 25 mėginius mėsainių, dešrelių ir dešrainių, sarkocistomis buvo užkrėsta 14 mėsainių (56 proc.), 2 dešrelės (8 proc.) ir 5 dešrainiai (20 proc.) [121].

Brazilijoje, San Paulo mieste, naudojant šviesinį ir elektroninį mikro-skopus, buvo ištirta penkiasdešimt kebabų mėginių iš 25 arabiško maisto restoranų. Visuose mėginiuose rasta sarkocistų, 94 proc. mėginių aptikta

S. hominis, 70 proc. – S. hirsuta ir 92 proc. – S. cruzi [27].

2008 m. Jungtinėse Amerikos Valstijose atlikto tyrimo metu buvo sie-kiama nustatyti jautienos gaminių, parduodamų nedideliuose prekybos cent-ruose, užkrėstumą Sarcocystis spp. Buvo surinkti 48 mėginiai, kurie buvo tirti histomorfologiniu ir PGA metodu. Gauti rezultatai parodė, kad 31 mėginys buvo teigiamas ir identifikuota S.cruzi [56].

Japonijos nacionalinio užkrečiamų ligų instituto duomenimis šalyje už-registruoti 37 apsinuodijimo arkliena atvejai, mėsa buvo pirkta turguje

Kumamoto regione. Atlikus tyrimus arklienoje buvo rasta Sarcocystis fayeri cistų [122].

Vokietijoje, atlikto tyrimo metu buvo paimti mėginiai iš 12 žmonių, kurie valgė žalią jautieną arba kiaulieną galimai užkrėstą sarkocistomis. Teigiami tyrimo rezultatai buvo nustatyti 6 žmonėms. Jiems taip pat buvo diagnozuoti gastrito arba enterito simptomai. Buvo nustatyta, kad žmonės užsikrėtė S.

ho-minis paderme [9].

Europoje buvo registruoti apsinuodijimo žvėriena atvejai, kai valgę in-tensyviai sarkocistomis užkrėstos šaldytos stirnienos žmonės viduriavo, jiems taip pat pasireiškė pykinimo ir vėmimo simptomai [123]. 2007 metais Vo-kietijoje pasireiškė grupinis žmonių susirgimas sarkocistoze, kai jie maistui vartojo saliami dešrą [24].

Mokslinėje literatūroje pasigendama rinkoje parduodamų žalios mėsos ir silpnai termiškai apdorotų gaminių išsamių tyrimų, siekiant įvertinti užkrės-tumą sarkocistomis ir galimą pavojų žmogaus sveikatai, esant šių produktų gausiam užkrėstumui Sarcocystis pirmuonimis.

Dažniausiai sarkocistozė nėra diagnozuojama prieš skerdimą, nes gyvuliai ja serga be jokių klinikinių simptomų. Vadovaujantis Europos Tarybos reg-lamentu Nr. 854/2004 [40], jokie specifinių pirmuonių nustatymo metodai nenumatyti ir jų atlikti nereikalaujama. Tačiau skerdena turi būti brokuojama, jei esant gausiam užkrėstumui sarkocistos matomos plika akimi raumeni-niame audinyje. Esant eozinofiliniam miozitui, sukeltam sarkocistų, galvijų raumenyse pastebimi mėlynai žalsvos spalvos plotai. Skerdenos dalys, ku-riose matomi tokie pažeidimai taip pat turi būti brokuojamos. Mikroskopinės cistos yra labiau paplitusios nei makroskopinės ir jos gali sukelti didžiulius ekonominius nuostolius [7].

Įtaka mėsos kokybei priklauso nuo gyvulių mėsos užkrėstumo sarko-cistomis gausumo [124]. Sarkocistozė sąlygoja didesnę skerdenos bakte-rinę taršą, prastesnį mėsos brendimą, skoninių savybių pasikeitimą, kinta maistinė vertė, sutrumpėja mėsos laikymo laikas [106].

Sarkocistomis užkrėsta mėsa pasižymi blogesnėmis juslinėmis savybėmis, nes suminis amino rūgščių kiekis byloja apie greitesnį mėsos gedimą, pri-klausantį nuo užkrėstumo sarkocistomis gausumo. Sarkocistomis užkrėstos mėsos baltymuose nustatomas didesnis prolino kiekis, kaip dezamininimo proceso pažeidimo pasekmė kinta pakeičiamų ir nepakeičiamų amino rūgščių sudėtis (pavyzdžiui, lecitino, fenilalanino, lizino, valino, arginino kiekis pa-didėja 2,5-4 kartus, o tuo tarpu alanino metionino, triptofano kiekis sumažėja 1,5 karto). Sarkocistoze sergančių gyvulių mėsoje sumažėja laisvo vandens, viduląstelinių riebalų, baltymų, pelenų kiekis, padidėja proteolitinių fermentų aktyvumas, sumažėja fosforo, cinko, jodo kiekis. Užkrėstos mėsos kokybė ypač pablogėja po 48 val. laikant ją kambario temperatūroje ji tampa

netinkama žmonių maistui, tuo tarpu neužkrėsta sarkocistomis mėsa per tą patį laikotarpį kambario temperatūroje būna tik įtartino šviežumo [125, 126]. Vertinant galvijienos kokybę svarbūs tokie rodikliai kaip surišto ir ne-surišto vandens kiekis, vandens rišlumas, viduląstelinių riebalų kiekis, tripto-fano ir oksiprolino santykis, mėsos švelnumas. Vidutiniškai ir gausiai sarko-cistomis užkrėstoje galvijienoje aptinkama mažiau surišto vandens ir riebalų, o laisvo vandens ir oksiprolino kiekis yra didesnis nei neužkrėstoje mėsoje, taip pat sarkocistomis užkrėstoje mėsoje nustatytas mėsos švelnumo suma-žėjimas [127].

Atlikus mėsos kokybės vertinimą pagal skirtingus rodiklius: vandens rišlumą, rūgštingumą (pH), spalvingumą, marmuringumą, ji buvo nežymiai pakitusi lyginant su neužkrėsta mėsa [34]. Tačiau sarkocistomis užkrėstos mėsos vandens rišlumas buvo patikimai mažesnis [128].

Tiriant sarkocistomis užkrėstą mėsą nustatyta, kad glikogeno kiekis kinta atvirkščiai proporcingai sarkocistų kiekiui. Didėjant sarkocistų mėsoje gli-kogeno sumažėja iki 273 ± 15,80 mg, o mėsos laikymo metu gligli-kogeno kiekis intensyviau mažėja neužkrėstoje mėsoje, nei sarkocistomis užkrėstoje gyvu-lių mėsoje. Esant gausiam užkrėstumui raumenyse nustatyta hipoglikemija t.y. glikogeno kiekio mažėjimas sarkocistozės atveju vyko žymiai lėčiau nei sveikų gyvulių mėsoje. Daroma prielaida, kad mėsos užkrėtimas sarkocis-tomis gali daryti įtaką mėsos brendimo procesui. Esant gausiam užkrėstumui nustatytas mažesnis pieno rūgšties kiekis, t. y. pieno rūgšties kaupimas mėsos laikymo mėtu sarkocistimis užkrėstoje mėsoje vyko žymiai lėčiau. O mėsos pH buvo 6,5–6,8, peroksidazės reakcija buvo neigiama. Tuo tarpu vidutinio užkrėstumo atveju pH ir peroksidazės reakcijos kitimas buvo mažiau išreikš-tas, o esant silpnam užkrėstumui buvo toks pats kaip sveikų gyvulių [127].

Tyrimų duomenimis pH vertė stipriai padidėja sarkocistomis užkrėstoje mėsoje, o mėsos vandeningumo rodikliai mažesni, palyginant su neužkrėsta gyvūnų mėsa [128].

1.4. Sarcocystis genties pirmuonių identifikacija

Tarpiniuose ir galutiniuose šeimininkuose gali parazituoti skirtingų rūšių sarkocistos, todėl norint kontroliuoti žmonių ir įvairių ekonominiu atžvilgiu naudingų gyvulių užsikrėtimą sarkocistomis, yra svarbu tiksli sarkocistų identifikacija įvairiuose šeimininkuose [51].

Šiuo metu ES šalyse narėse vykdoma parazitinių ligų stebėsena oficialios apžiūros (poskerdiminio tyrimo) metu skerdyklose, kaip tai yra nurodyta Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 854/2004 [40] nusta-tančiame specialiąsias gyvūninės kilmės produktų, skirtų vartoti žmonėms, oficialios kontrolės taisykles. Be vizualinės apžiūros vieninteliai reikalaujami

pjūviai galvijų raumenyse yra išoriniuose ir vidiniuose kramtomuosiuose raumenyse (netaikoma gyvūnams, jaunesniems kaip 6 sav. amžiaus) ir išil-ginis pjūvis visų amžiaus grupių galvijų širdyse. Smulkiems atrajotojams ir kiaulėms reikalaujamas tik išilginis širdies raumenų pjūvis. Taip pat atlie-kama stemplės vizualinė apžiūra ir palpacija. Vizualinės apžiūros metu sker-dykloje galima pastebėti tik makroskopinius pažeidimus, kurie nebūtinai gali būti sukelti zoonotinių sukėlėjų ir tai apsunkina sarkocistozės diagnostiką.

Sarkocistas galima aptikti naudojant įvairius metodus. Vienas iš jų – raumenų mėginių tyrimas kompresoriniu metodu, kuomet suspaustos tiria-mojo audinio iškarpos yra mikroskopuojamos ir jose ieškoma sarkocistų [52]. Taip pat gali būti taikoma hematoksilinu ir eozinu dažytų mėginių mikro-skopija. Šio metodo trūkumas yra ribotas tiriamų raumenų mėginių dydis, taip pat morfologiniai sarkocistų skirtumai priklauso nuo jų amžiaus, šeimininko ląstelės tipo ir fiksacijos metodo [23]. Mikrosarkocistas (< 1 mm) formuojan-čių sarkosporidijų platintojai yra šunys arba žmonės (ir galbūt kiti primatai), o formuojančių makrosarkocistas (> 1 mm) galutiniai šeimininkai yra katės [53].

Sarkocistos gali būti identifikuojamos atsižvelgiant į jų morfologiją [23]. Vienas svarbiausių požymių sarkocistų rūšims identifikuoti yra cistos siene-lės ultrastruktūros ypatumai. Dažnai sarkocistų rūšies identifikavimas atlie-kamas remiantis morfologine cistų sienelės sandara: storis, lygumas, išaugos [42]. Dažnai morfologinės struktūros nustatymui reikalinga transmisinė elektronų mikroskopija. Taip pat sarkocistų aptikimui buvo pritaikytos mole-kulinio tyrimo technologijos, taikant bradizoitų išskyrimą audinių virškinimo metodu [54, 55] arba naudojant kombinacijoje su histologiniu tyrimo metodu (dažymas ir mikroskopavimas) [56]. Tačiau toks metodas nėra tinkamas kasdieninėje praktikoje dideliems mėginių kiekiams tirti.

Nustatant ELISA metodu serologiškai teigiamus gyvulius negalima iden-tifikuoti sarkocistų rūšies, nes tarp sarkocistų rūšių yra aukštas kryžminis imunitetas [57]. Todėl mokslininkai [58] savo tyrimuose sarkocistų serodia-gnostikai taikė netiesioginės hemagliutinacijos testą.

Pastaruoju metu Sarcocystis genties parazitų identifikavimui taikomi tradiciniai parazitologiniai ir molekuliniai tyrimo metodai. Sarcocystis rūšys diagnozuojamos naudojant morfologinį identifikavimą, pagrįstą sarkocistų morfologijos palyginamąja analize ir lygiagrečiai atliekami gyvybinio ciklo nustatymo eksperimentai. Tačiau tradiciniai metodai nėra pakankamai tiks-lūs. Nustatyta, kad Sarcocystis spp gali parazituoti ne viename, o keliuose galutiniuose ir tarpiniuose šeimininkuose. Tame pačiame tarpiniame šeimi-ninke arba taksonomiškai artimuose šeimininkuose randamos morfologiškai sunkiai atskiriamos sarkocistos, o jų dydis ir forma gali kisti priklausomai nuo amžiaus ir fiksavimo metodo. Tikslu išaiškinant taksonominius Sarcocystis

parazitų netikslumus buvo pradėta taikyti DNR analizė. Norint nustatant sarkosporidijų rūšis derinami tradicinių parazitologinių ir molekulinių tyrimų rezultatai [44].

1.4.1. Sarcocystis genties pirmuonių identifikacija tradiciniais metodais

Tradiciniais parazitologiniais metodais identifikuojant Sarcocystis rūšis vertinama parazitų morfologija arba gyvybinis ciklas. Svarbiausias morfo-loginis Sarcocystis rūšies požymis yra sarkocistos sandara. Nustatant sarko-sporidijų rūšis, oocistų, sporocistų, merontų ir metrocitų fenotipiniai požy-miai netinka, nes skirtingos rūšys šiose stadijose viena nuo kitos beveik ne-siskiria, o merozoitų ir metrocitų morfologija kinta kiekvieno dalijimosi metu. Bradizoitai Sarcocystis parazitų rūšies identifikacijai, taip pat paprastai netinka, išskyrus retas išimtis, pavyzdžiui, nustatant sarkocistų rūšis, sudarančias sarkocistas žąsinių paukščių raumenyse [59].

Identifikuojant skirtingų rūšių sarkocistas, esminis požymis yra cistos sienelės sandara. Nustatant sarkocistos sienelės morfologinius požymius, matuojamas sienelės išaugų ilgis, tarpų tarp išaugų plotis, įvertinama išaugų forma, kraštas (lygus arba dantytas), bei vidinė sandara (mikrofilamentai, mikroglobulės ir kita). Cistos dydis ir forma kinta jai bręstant, taip pat audi-niuose, kuriuose randama. Pavyzdžiui, širdyje cistos dažnai būna smulkios ir apvalesnės, palyginus su cistomis skeleto raumenyse [60]. Identifikuojant sarkocistas pagal morfologinius požymius naudojama šviesinė mikroskopija (ruošiant histologinius arba natyvinius preparatus) arba elektroninė mikro-skopija (skenuojanti ir transmisinė). Dažnai šviesinės mikroskopijos nepa-kanka, kad nustatyti skirtingas rūšis tame pačiame šeimininke, o elektroninė mikroskopija brangus ir sudėtingas tyrimas [56]. Naudojant transmisinę elektroninę mikroskopiją cistų sienelės priskiriamos tam tikram morfolo-giniam tipui. Elektroninės mikroskopijos metodu, pirmoje sarkocistų klasi-fikacijoje atsižvelgiant į sienelės sandarą, buvo išskirti 24 sarkocistų tipai [26], kiek vėliau, atsižvelgiant į sienelės sandarą sarkocistos suskirstytos į 37 tipus [61]. Pastaruoju metu išskirti 42 sarkocistų sienelių tipai, o kai kurie iš jų suskirstyti į dar smulkesnius potipius [44]. Tačiau ir skirtingų Sarcocystis rūšių cistos sienelės požymiai gali beveik nesiskirti.

Identifikuojant sarkocistas nustatomi ir jų šeimininkai, vykdoma gyvybi-nio ciklo analizė. Eksperimento būdu užkrečiami potencialūs tarpiniai šeimi-ninkai jiems suduodant tiriamosios rūšies sporocistų, o potencialūs galutiniai šeimininkai – šeriant juos raumeniniu audiniu su sarkocistomis. Tačiau

Sarcocystis identifikacija atliekant gyvybinio ciklo eksperimentus nėra tiksli,