LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS ANESTEZIOLOGIJOS KLINIKA
Abdominalinio sepsio sąlygoti MikroRNR biožymenų pakitimai sergant
gretutinėmis ligomis
Baigiamasis magistro darbas
Darbą atliko: Loreta Puleikytė, Medicina, VI k., 27 gr. Darbo mokslinis vadovas: gyd. Tomas Bukauskas Darbo mokslinis konsultantas: prof. dr. Andrius Macas
Kaunas 2019
2
TURINYS
1. SANTRAUKA... 3 2. SUMMARY... 4 3. PADĖKA... 5 4. INTERESŲ KONFLIKTAS... 55. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS... 5
6. SANTRUMPOS...6
7. SĄVOKOS... 8
8. ĮVADAS... 9
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI... 10
10. LITERATŪROS APŽVALGA... 11
10.1. Sepsio ir septinio šoko epidemiologija, etiologija ir patogenezė... 11
10.2. Sepsio ir sepsinio šoko diagnostika... 12
10.3. Gretutiniai susirgimai esant sepsiui...13
10.3. MikroRNR biologija...13
10.4. MikroRNR-146a-5p, mikroRNR-30d-5p ir mikroRNR-23a-3p raiška sepsio metu...14
11. TYRIMO METODIKA ir METODAI...17
12. REZULTATAI...21
12.1. Tiriamųjų charakteristika... 21
12.2. Sergamumas gretutinėmis ligomis...22
12.3. Demografinių rodiklių poveikis mikroRNR raiškų pokyčiui...23
12.4. Gretutinių susirgimų poveikis mikroRNR raiškų pokyčiui...25
12.5. Nutukimo, žalingų įpročių poveikis mikroRNR raiškų pokyčiui...26
12.6. Gretutinių susirgimų, žalingų įpročių ir nutukimo įtaka mikroRNR prognozei...27
13. REZULTATŲ APTARIMAS... 28
14. IŠVADOS...31
15. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...32
3
1. SANTRAUKA
Darbo autorius: Loreta Puleikytė
Darbo vadovas: dokt. Tomas Bukauskas Darbo konsultantas: prof.dr. Andrius Macas.
Darbo pavadinimas: : Abdominalinio sepsio sąlygoti MikroRNR biožymenų pakitimai sergant gretutinėmis ligomis
Darbo tikslas: Įvertinti molekulinių MikroRNR pokyčius sąlygotus abdominalinio sepsio esant gretutiniams susirgimams.
Tyrimo uždaviniai:
1. Įvertinti abdominaliniu sepsiu sergančių pacientų gretutinius susirgimus ir žalingus įpročius. 2. Įvetinti abdominaliniu sepsiu sergančių pacientų demografinių rodiklių, gretutinių ligų, žalingų įpročių poveikį mikroRNR raiškai.
3. Įvertinti abdominaliniu sepsiu sergančių pacientų gretutinių ligų, žalingų įpročių įtaką prognozuojant mikroRNR raišką.
Metodika: 2017 m. rugsėjo 1 d. – 2019 m. sausio 1 d. LSMUL KK atliktas tyrimas, kuriame buvo tirti abdominaliniu sepsiu sergantys pacientai, operuoti skubos tvarka. Duomenys gauti is T. Bukausko doktorantūros studijos, nagrinėjančios atsitiktine tvarka parinktų abdominaliniu sepsiu sergančių pacientų kraujo mikroRNR-30d-5p, mikroRNR-23a-3p, mikroRNR-146a-5p raišką. Vertinta pacientų būklė pagal ASA, SOFA skalę, rinkti duomenys apie pacientų demografinius rodiklius, gretutines ligas, žalingus įpročius. Duomenys apdoroti naudojant IBM SPSS 24.0
statistikos paketą.
Rezultatai: Imtį sudarė 40 pacientų, jų amžiaus vidurkis 64 metai. Dažniausi gretutiniai susirgimai - arterinė hipertenzija, anemija, I° nutukimas (atitinkamai 72,5%, 55%, 45%). Reguliariai rūkė 40% pacientų. Nustatytas statistiškai reikšmingas mikroRNR-30d-5p ir mikroRNR-23a-3p raiškos mažėjimas esant opaligės susirgimui (atitinkamai p=0,029, p=0,013). Visi kiti veiksniai neturi reikšmingo poveikio tirtų mikroRNR raiškai. Taip pat nenustatyta reikšminga gretutinių susirgimų, demografinių rodiklių, žalingų įpročių įtaka tikimybei, kad prognozuojama mikroRNR raiška didės ar mažės. Išvados: Pacientai, sergantys sepsiu ir turintys opaligę, mikroRNR-30d-5p ir mikroRNR-23a-3p raiška kraujo serume buvo mažesnė. Prognozuojant žymenų raiškos kitimą, įgyjant didesnę ar mažesnę raiškos vertę, gretutiniai susirgimai, žalingi įpročiai, demografiniai rodikliai įtakos neturėjo.
4
2. SUMMARY
Author: Loreta Puleikyte
Scientific supervisor: dr. Tomas Bukauskas Consultant: Andrius Macas, MD, PhD
Title: Abdominal sepsis-induced changes in microRNA biomarkers in the presence of co-morbidities Aim: Evaluate changes in molecular MicroRNA due to abdominal sepsis in comorbid diseases. Objectives:
1. Evaluate the co-morbidities and harmful habits of patients with abdominal sepsis.
2. Introduce the effects of demographic indicators, co-morbidities, harmful habits in patients with abdominal sepsis in microRNA expressions.
3. Evaluate the effect of abdominal sepsis in patients with co-morbidities, harmful habits in predicting microRNA expression.
Methods: A study conducted by LSMUL KK investigating abdominal sepsis in patients undergoing emergency surgery on 1 September 2017 – 1 September 2018. Data obtained from the Ph.D. study of T. Bukauskas studying the expression of microRNR-30d-5p, microRNR-23a-3p, microRNR-146a-5p in randomly selected abdominal sepsis patients. Patients were evaluated according to ASA, SOFA scale, patient demographics, co-morbidities, harmful habits were collected. Data processed using the IBM SPSS 24.0 statistical package. Results: The sample consisted of 40 patients, with an average age of 64 years. The most common co-morbidities are arterial hypertension, anemia, and I ° obesity (72.5%, 55%, 45%, respectively). 40% of patients smoked regularly. A statistically significant reduction in the expression of microRNR-30d -5p and microRNR-23a-3p was observed in the case of peptic ulcer disease (p = 0.029, p = 0.013, respectively). All other factors have no significant impact on the expression of the microRNA. Also, there is no significant influence on the likelihood that the predicted microRNA expression will increase or decrease as a result of the co-morbidity, demographic characteristics, and harmful habits. Conclusions: Patients with sepsis and peptic ulcer disease had lower serum microRNR-30d-5p and microRNR-23a-3p expression. By predicting the change in sign expression, gaining a higher or lower expression value, contraindications, harmful habits, demographic indicators did not affect.
5
3. PADĖKA
Dėkoju šio darbo vadovui gyd. Tomui Bukauskui, darbo konsultantui prof. dr. Andriui Macui už bendradarbiavimą, kantrybę ir pagalbą rengiant šį mokslinį darbą.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Interesų konflikto nebuvo. Autorės indelis – tyrimo rezultatai gauti apdorojus duomenis, gautus vykdant Tomo Bukausko doktorantūros darbą, jo metu suformuotoje pacientų grupėje. Autorė stebėjo duomenų rinkimą, vykdė dokumentavimą. Autorė savarankiškai interpretavo žymenų pokyčius.
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Baigiamasis magistro darbas atliktas gavus Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro leidimą Nr. BEC-MF-133 (išdavimo data 2017-12-14).
6
6. SANTRUMPOS
AH- arterinė hipertenzija
ASA- American society of anesthesiologists (Amerikos anesteziologų draugija) CD-cukrinis diabetas
CRB- C reaktyvinins baltymas
DIK- diseminuota intravaskulinė koaguliacija DPV-dirbtinė plaučių ventiliacija
dob- dobutaminas dop- dopaminas
GKS- Glasgow komų skalė IFN-γ- interferonas gama IL-1β- interleukinas 1-beta
IRAK1- su interleukino 1 receptoriu susijusi kinazė 1. IŠL-išeminė širdies liga
KMI- kūno masės indeksas Lent. -lentelė
LIFN- letinis inkstų funkcijos nepakankamumas LOPL-lėtinė obstrukcinė plaučių liga
LPS- lipopolisacharidas
MAP- (mean arterial pressure) vidutinis arterinis spaudimas MI-miokardo infarktas
7 Pav. -paveikslėlis
PV-prieširdžių virpėjimas PCT- prokalcitoninas
SAV- standartinis alkoholio vienetas
SUAS- sisteminio uždegiminio atsako sindromas
TLR-NF-κB- (tool like receptor- nuclear factor-kappaB)- tool tipo receptorius-branduolio faktorius kapa B
TNF-α- (tumor necrosis factor) - naviko nekrozės faktorius alfa TLR- tool like receptor(s)- tool tipo receptorius
TRAF6- (tumor necrosis factor receptor associated factor-6)- su naviko nekrozės faktoriaus receptoriumi susijęs faktorius 6
ŪIFN- ūminis inkstų funkcijos nepakankamumas ŪRDS- uminio respiracinio distreso sindromas VAS-vidurinis arterinis spaudimas
8
7. SĄVOKOS
mikroRNR (mikroribonukleorūgštis)- viengrandė, nekoduojanti endogeninė ribonukleorūgšties molekulė, kuri reguliuoja kitų organizmo genų ekspresiją.
mRNR (iRNR) (matricinė ar informacinė ribonukleorūgštis) – ribonukleorūgštis, kuri neša iš branduolio į baltymų sintezės vietą (citoplazmoje esančias ribosomas) informaciją apie baltymo pirminę struktūrą.
ASA klasė – Amerikos anesteziologų draugijos paciento fizinės būklės klasifikacija. Citokinai- smulkūs, ląstelės sekretuojami signaliniai baltymai.
Sepsis – organų funkcijos sutrikimas, įsivyravęs dėl sutrikusio organizmo imuninio atsako į infekciją.
SOFA – skalė naudojama diagnozuojant sepsį bei vertinant paciento fizinės būklės sunkumą ir mirštamumo riziką.
9
8. ĮVADAS
Sepsis tai kompleksinis, gyvybei pavojingas susirgimas, sukeltas neadekvataus organizmo atsako į infekciją [1]. Sepsis yra pagrindinė mirties priežastis esant infekcijai ir viena iš dažniausių miršties priežasčių intensyvios terapijos skyriuje [2;3]. Sepsis gali progresuoti į septinį šoką, dauginį organų nepakankamumą ir mirtį, ypač jeigu nebuvo anksti atpažintas ir pradėtas gydyti [4]. Studijos rodo, kad ankstyvas gydymas mažina mirštamumo dažnį [5]. Dėl atliktų daugelio tikslingų tyrimų ir gerėjančių medicinos paslaugų pastaruoju metu ankstyva sepsio diagnostika ir gydymas gerėja [1], tačiau mirštamumas nuo sepsio išlieka aukštas- 23-30% ir net 40-50 % esant sepsiniam šokui [3] Mirštamumą didina vyresnis amžius, gretutiniai susirgimai ir pasireiškusi organų disfunkcija [6]. 2016 metais priimti nauji sepsio ir sepsinio šoko (Sepsis-3) apibrėžimai, sutelkti į ankstyvą, su sepsiu susijusį, organų disfunkcijos atpažinimą [1].
Didelis skaičius biožymenų yra tiriami kaip galimi žymenys ankstyvai sepsio diagnostikai, prognozei ir gydymui. Jų vertės turėtų būti informatyvios kaip galima anksčiau [7;8]. Esant ribotumui specifiškų ir jautrių sepsio žymenų, vis daugiau tyrinėjami molekuliniai žymenys, kurie galėtų palengvinti ankstyvą sepsio diagnostiką ir prognozės vertinimą [9;10]. Studijos siūlo mikroribonukleorūgtis (mikrorRNR) naudoti kaip žymenį sepsio diagnostikai ir sunkumo nustatymui [11]. MikroRNR yra maži, nekoduojami RNR segmentai, kurie jungdamiesi su informacine RNR (iRNR), reguliuoja genų ekspresiją [12]. Tam tikrų MikroRNR raiška keičiasi esant skirtingoms ligoms ir vis labiau yra tyrinėjami kaip galimi ligų biomarkeriai [13]. Sutrikusi mikroRNR raiška pasireiškia esant kardiovaskulinėms ligoms, vėžiui, uždegiminėms, psichinėms ligoms ir patologinėms būklėms, sukeltoms esant sutrikusiai imuninei sistemai [14]. Esant audinių pažeidimui intaceliuliariai esančios mikroRNR yra išlaisvinamos už ląstelės ribų ir tampa cirkuliuojančiomis mikroRNR. [13] Be to, mikroRNR raiška yra stipriai veikiama ir aplinkos faktorių bei išorinių dirgiklių, tokių kaip uždegimas, hipoksija, gydymas vaistais [15].
Iki šiol nėra žinoma kurios ląstelės produkuoja tam tikrus cirkuliuojančius mikroRNR sepsio metu ir neaišku, kurie iš jau pasiūlytų mikroRNR biožymenų sepsio diagnostikai ateityje gali būti naudojami kaip diagnostikos ir gydymo priemonė, ar kiti kartu esantys susirgimai gali paveikti sepsiui specifiškų žymenų raišką. Specifiniai sepsiui žymenys padėtų pagerinti ansktyvą sepsio diagnostiką, jo valdymą ir didintų pacientų išgyvenamumą.
10
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas: Įvertinti molekulinių MikroRNR pokyčius, sąlygotus abdominalinio sepsio esant gretutiniams susirgimams.
Tyrimo uždaviniai:
1. Įvertinti abdominaliniu sepsiu sergančių pacientų gretutinius susirgimus ir žalingus įpročius.
2. Įvetinti abdominaliniu sepsiu sergančių pacientų demografinių rodiklių, gretutinių ligų, žalingų įpročių poveikį mikroRNR raiškai.
3. Įvertinti gretutinių ligų, žalingų įpročių įtaką prognozuojant mikroRNR raiškos vertę, abdominaliniu sepsiu sergantiems pacientams.
11
10.
LITERATŪROS APŽVALGA
10.1 Abdominalinės kilmės sepsis: epidemiologija, etiologija ir patogenezė
Preliminariai, išsivysčiusiose šalyse sepsio atvejų skaičius svyruoja apie 31,5 mln. kasmet ir 19,4 mln. sunkaus sepsio atvejų. Esant abdominalinės ir virškinamojo trakto infekcijos sukeltam sepsiui, 20-40% pacientų vystosi septinis šokas. [16]. Mirštamumas per 28 dienas, nepaisant gerėjančios pacientų gydymo taktikos išlieka aukštas – nuo 20% esant sepsiui ir apie 40 % įsivyravus septiniam šokui [2,3]. Preliminariais duomenimis, dėl sepsio miršta 5.3 mln. žmonių per metus [16].
Peritonitas yra pilvaplėvės, kuri apgaubia pilvo ertmę su organais uždegimas. Intraabdominalinė infekcija yra laikoma antra dažniausia sepsio priežastis po kvėpavimo takų infekcijos [17]. Jį dažniausiai sukelia bakterijos, tokios kaip E. coli, Enterococcus species, Bacteroides fragilis bei grybeliai [16; 18]. Dažniausiai peritonitas yra antrinis. Jį sukelia infekcija pilvaplėvės ertmėje, kuri dažniausiai atsiranda dėl tuščiavidurių organų perforacijos, anastomozės pralaidumo ar virškinamojo trakto traumų [18].
Sepsio patogenezė nusakoma molekuliniame, ląsteliniame ir organų lygmenyje. Lipopolisacharidai (LPS) arba endotoksinai inicijuoja uždegiminį procesą [19]. LPS yra pagrindinis išorinės sienelės komponentas gram-neigiamose bakterijose. LPS taip pat gali sukelti uždegimą esant gram-teigiamai ar grybelių sukeltam sepsiui dėl iš žarnų atsilaisvinusio LPS esant jų hipoperfuzijai [20]. Uždegiminis atsakas sepsio metu yra sukeliamas per tool tipo receptorių ( TLRs) aktyvaciją ir tool tipo receptorių-branduolio faktoriaus- kapa B (TLR-NF-κB) uždegimo kelio reguliaciją. Jo metu iš monocitų ir makrofagų atpalaiduojami prouždegiminiai citokinai, tokie kaip tumoro nekrozės faktorius alfa (TNFα), interleukinas-1 beta (IL-1β), interleukinas 6 (IL6) [21]. Jie sukelia sudėtingus endotelio pakitimus, padidėja leukocitų adhezija, vyksta vazodilatacija, padidėja barjero pralaidumas, gali formuotis audinių edema dėl intravaskuliariai esančių skysčių perėjimo į intersticiumą [22]. Organų sistemos lygyje sepsis gali sukelti sutrikimus kiekvienoje organų sistemoje. Jis gali sukelti šoką, kvėpavimo sunkcijos sutrikimą, diseminuotą intravaskulinę koaguliaciją (DIK), sutrikusią gliukozės kontrolę, sutrikdyti sąmonės būklę, sukelti ūminį inkstų funkcijos nepakankamumą (ŪIFN), antinksčių nepakankamumą, ileusą ar pakitusią kepenų funkciją. [22]
12 10.2 Sepsio diagnostika: sepsis ir sepsinis šokas
2016 metais publikuoti nauji sepsio ir sepsinio šoko (sepsis-3) apibrėžimai. Sepsis yra apibrėžiamas kaip gyvybei pavojingas organų veiklos sutrikimas, sukeltas neadekvataus organizmo atsako į infekciją [1]. Organizmas reaguoja, sukeldamas uždegimą, neuroendokrininį atsaką, krešumo pokyčius ir metabolinį atsaką. Organų disfunkcija vertinama naudojant SOFA skalę. [1;23].
Sepsio diagnozavimui būtina įtarti ar patvirtinti įtariamą infekciją ir nustatyti ūmią organų disfunkciją [1]. Infekcija yra apibrėžiama kaip patologinis procesas sukeltas patogeninių ar potencialiai patogeninių mikroorganizmų invazijos į sterinius organizmo audinius, skysčius ar kūno ertmes [24]. Tačiau, infekcijos nustatymas kritinėse būklėse esantiems pacientams yra apsunkintas. Klinikiniai ir laboratoriniai požymiai tokie kaip tachikardija, karščiavimas, pakitęs leukoci tų skaičius yra nespecifiniai ir dažnai jie pasireiškia esant ir kitoms ūmioms būklėms. C reaktyvinis baltymas (CRB) ir prokalcitoninas (PCT) taip pat yra nespecifiniai [25]. CRB gali padidėti esant įvairiems uždegiminiams procesams, taip pat po nekomplokuotų chirurginių operacijų [26]. PCT yra specifiškesnis nei CRB, nors jis taip pat gali padidėti esant kitoms uždegiminėms sąlygoms tokioms kaip pankreatitas, būklei po politraumos ar didelės apimties operacijos[27]. Jeigu infekcijos požymiai yra neaiškūs, infekcijos židinys lieka neįrodytas, sepsis įtariamas pagal atsiradusią organų disfunkciją [1].
Skubios pagalbos skyriuje pacientą su įtariama infekcija ankstyvam paciento įvertinimui rekomenduojama naudoti qSOFA kriterijus. Sepsis įtariamas, kuomet yra nustatomi 2 iš esamų trijų kriterijų: kvėpavimo dažnis >21k/min; sistolinis AKS <100mmHg; arba yra sutrikusi sąmonė (GKS<15 balų) [1]. Vertinimas pagal qSOFA kriterijus, lemia didesnį hospitalinio mirštamumo prognozės tikslumą negu naudojant sisteminio uždegiminio atsako sindromo (SUAS) ar sunkaus sepsio kriterijus [22]. Esant nustatytam qSOFA balų padidėjimui, toliau turėtų būti tiriama dėl organų disfunkcijos [1].
Organų veiklos sutrikimą įvertiname naudojant SOFA skalę. Skalės balų vertė >2 balai rodo įsivyravusią organų disfunkciją [1]. Naudojant SOFA skalę yra vertinamas organų disfunkcijos sunkumas šešių organų sistemų: kvėpavimo, krešėjimo, hepatobiliarinės, kardiovaskulinės, renalinės ir neurologinės [23].
13 Sepsis gali progresuoti į sepsinį šoką. Septinis šokas yra susijęs su didesne mirštamumo rizika. [1] Jam esant pasireiškia kraujotakos, ląsteliniai ir metaboliniai sutrikimai, kurie lemia sumažėjusią audinių oksigenaciją ir perfuziją. Jis diagnozuojamas esant sepsiui ir nepaisant pakankamo skysčių skyrimo kartu yra abu kriterijai: reikalingas vazopresorių skyrimas užtikrinti vidutinį arterinį spaudimą (VAS) didesnį nei 65mmHg ir laktatų yra daugiau negu 2 mmol/L [1].
10.3 Gretutiniai susirgimai esant sepsiui
Sepsio rizika yra padidėjusi naujagimiams, sumažėjusi vaikystėje ir vėlgi išauga apie 50-60 gyvenimo metus. Pacientai sergantys sepsiu apie 65-us metus ir vyresni turi 2,3 karto didesnį mirštamumą nei jaunesni pacientai [28]. Senstanti populiacija gali būti susijusi su vis didėjančiu sepsio dažniu. Daugelis studijų rodo, kad sergantieji sepsiu dažniau yra vyrai, jų dažnis varijuoja 54-56% [29]. Tabako vartojimas bei rūkymo nutraukimas ankstesniu metu yra susiję su padidėjusia rizika sirgti sepsiu. Cukrinis diabetas, širdies nepakankamumas, lėtinės plaučių ligos, imunosupresija, kepenų ligos, vėžys, lėtinis inkstų funkcijos nepakankamumas didina sepsio riziką [30]. Literatūroje minima, kad esant gretutiniams lėtiniams susirgimams didžiausią įtaką sepsio sunkumui turi lėtinės plaučių ligos ir lėtinė inkstų liga [31]. Be to, cukrinis diabetas ir lėtinė inkstų liga yra susijusi su padidėjusiu mirštamumu dėl sepsio [32].
Taip pat yra nustatyta teigiama koreliacija tarp gretutinių susirgimų skaičiaus ir sepsio ar sepsinio šoko įsivyravimo . Esant daugiau nei 3 gretutinėms ligoms, pacientų mirštamumas reikšmingai padidėja nei sergant 1-3 gretutiniais susirgimais. Gretutinių susirgimų išsiaiškinimas įtariant ar diagnozuojant sepsį leistų gydytojui teikti tikslesnę informaciją apie paciento prognozę, padėtų nustatyti tikslią diagnozę bei leistų paskirti tinkamą gydymą [33].
10.4 MikroRNR biologija
Pirmoji mikroribonukleorūgštis (mikroRNR), lin-4, buvo atrasta Caenorhabditis elegans organizme 1993 metais. Lin-4 reguliuoja C. elegans vystymąsi, jungdamasi prie lin-14 matricinės ribonukleorūgšties (mRNR) ir inchibuoja LIN-14 baltymo ekspresiją [34]. MikroRNR yra apie 22-25 nukleotidų ilgio. MikroRNR reguliuoja genų ekspresiją
14 potranskripciniame lygyje, jungdamasi prie mRNR 3’ netransliuoto regiono [35]. Viena mikroRNR molekulė gali jungtis prie kelių ar kelių šimtų skirtingų mikroRNR [36]. Jungimosi vietų skaičius, komplementiškumas ir mRNR prieinamumas nulemia mikroRNR inchibiciją ar ekspresiją ir sukelia transliaciją ar degradaciją prisijungtos mRNR [37]. Daugiau negu 1800 mikroRNR yra identifikuotos žmogaus organizme [38]. Didžioji dalis cirkuliuojančių mikroRNR yra gautos iš kraujo ląstelių, taip pat iš kitų organų, tokių kaip širdis, plaučiai, inkstai, kepenys [39]. Cirkuliuojančios mikroRNR yra randamos mikropūslelėse tokiose kaip egzosomos, mikroplokštelės, apoptoziniai kūnai [39]. MikroRNR turi svarbią reikšmę ląstelės proliferacijos, diferenciacijos, apoptozės procesuose esant normaliam vystymuisi ar progresuojant ligai [35]. Dėl savo stabilumo yra vis didesnis susidomėjimas mikroRNR naudoti kaip diagnostinį ar prognostinį žymenį įvairiose ligose [8].
10.5 MikroRNR-146-5p, mikroRNR-30d-5p ir mikroRNR-23a-5p raiška sepsio metu
Pakitusi mikroRNR raiška sepsio metu svarbiausią reikšmę turi jo patofiziologijoje. Gausus skaičius mikroRNR turi svarbią reikšmę TLR-NF-κB uždegimo kelio reguliacijoje, dėl kurio sukeliamas uždegiminis atsakas sepsio metu. MikroRNR neigiamai reguliuoją minėtą uždegiminį kelią ir reguliuoja uždegiminių citokinų gamybą sepsio metu. Tai pat moduliuoja kraujagysių barjerą ir endotelio funkcijas sepsio metu [11]. Priklausomai nuo reguliuojamojo geno taikinio, mikroRNR gali veikti dviem būdais: sustiprinti prouždegiminius arba slopinti priešuždegiminius signalus, taip sustiprinant ar sumažinant sisteminį uždegiminį atsaką (SUA). [40]
Yra nustatyta, kad mikroRNR-146a-5p uždegiminiame procese veikia kaip inchibitorius. Jis reguliuoja IL-1β, IL-6 ir TNF-α raišką, jungdamasi prie su interleukinu 1 receptoriumi susijusios kinazės 1 (IRAK1), branduolio faktoriaus kapa B (NF-κB) signalo perdavimo kelyje ir jį silpnina [41]. Pastebėta, kad mikroRNR-146a-5p raiška uždegimo metu yra sumažėjusi [36]. MikroRNR-146a-5p buvo vienas pirmųjų mikroRNR kuris buvo pastebėtas esant uždegimui. Vėliau išsiaiškinta, jog jis turi svarbų vaidmenį kontroliuojant įgytą ir įgimtą imuninį atsaką [42]. Tyrime naudojant peles, esant in vivo mikroRNR-146a-5p delecijai pasireiškė organizmo hiperjautrumas ir suaktyvėję uždegiminiai procesai, taip pat autoimuniškumas. [40]
15 Atliktame tyrime tiriant 226 sepsiu sergančius pacientus ir 206 sveikus kontrolinius pacientus, mikroRNR-146a-5p raiška sunkiu sepsiu sergantiems pacientams buvo sumažėjusi lyginant su kontroline grupe [43]. Tai pat tam tikros studijos parodė, kad mikroRNR-146a-5p raiška yra sumažėjusi esant sepsiui lyginant su kontrolinės grupės ar SUA pacientais. Pacientams su neinfekciniu SUA raiška buvo padidėjusi. Teigiama, kad mikroRNR-146a-5p gali būti pasūlytas kaip diagnostinis sepsio markeris [44]. Atliktame tyrime, kuriame makrofagai ir kardiomiocitai buvo stimuliuojami LPS, abiejų tipų ląstelėse buvo pastebėta padidėjusi mikroRNR-146a-5p raiška. Yra žinoma, kad padidėjęs mikroRNR-146a-5p slopina LPS sukeltą NF-κB kelio aktyvumą. Dėl slopinamo signalo perdavimo kelio yra slopinama endotoksino sukelta citokinų produkcija kardiomiocituose, todėl padidėjusi mikroRNR-146a-5p ekspresija, mažindama NF-κB kelio aktyvaciją, taip žymiai sumažino dėl aklosios ataugos ligatūros ir punkcijos sukeltą širdies disfunkciją [45].
Tyrime su sepsiu sergančiais pacientais ir kontroline grupe nustatė, kad mikroRNR-146a-5p jungiasi prie 3’ netransiuoto regiono (3’UTR) IL-6 mRNR. Nustatyta, kad mikroRNR-146a-mikroRNR-146a-5p koncentracija atvirkščiai koreliavo su IL-6 geno ekspresija. Taigi, tyrime sepsiu sergantys pacientai turėjo sumažėjusią žymens raišką monocitinių ląstelių eilėje, o IL-6 raiška buvo padidėjusi. Taip pat nustatyta, kag IL-6 tiesiogiai korealiuoja su SOFA skalės balais sepsiu sergantiems pacientams [46]. Ansktesnės studijos parodė, kad mikroRNR-146a-5p sukelia prouždegiminių citokinų supresiją jungdamasis su tumoro nekrozės faktoriumi asocijuoto faktoriaus 6 (TRAF-6) ir IRAK-1 ir slopindamas NF-kB prouždegiminį signalinį kelią ir IL-6 ekspresiją [47].
Ūmus respiracinio distreso sindromas yra dažniausia komplikacija susijusi su sepsiu. Ši būklė gali sukelti ūmų kvėpavimo nepakankamumą. Atliktame tyrime su pelėmis, kurioms buvo suleistas lipopolisacharidas ir sukeltas ūminis respiracinio distreso sindromas (ŪRDS) ir ištyrius mikroRNR-23-5p serume ir plaučių audinyje, buvo pastebėtas šio žymens raiškos padidėjimas, ypač per 3-6 valandas [49]. Taip pat nustatyta teigiama koreliacija su TNF-α ir IL-1β in vivo ir in
vitro. Teigiama, kad mikroRNR-23a-5p galėtų būti naujas biomarkeris ankstyvai ŪRDS
16 MikroRNR-30d-5p raiškos pakitimai, veikiant bakterinei infekcijai žmogaus ląsteles, pastebėti nebuvo. Praėjus 5 valandoms po infekcijos, mikroRNR-30d-5p raiška buvo žymiai mažesnė, palyginus su neinfekuota kontroline grupe [49].
17
11.
METODIKA IR METODAI
11.1 Tyrimo organizavimas.
Gavus Lietuvos sveikatos mokslų universiteto bioetikos centro leidimą buvo atliktas retrospektyvinis tyrimas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno Klinikų (LSMUL KK) Anesteziologijos klinikoje, siekant įvertinti mikroRNR raiškos pokytį abdominaliniu sepsiu sergantiems pacientams, esant gretutinėms ligoms. Sepsis diagnozuotas naudojant Sepsis-3 kriterijus. MikroRNR raiškos duomenys gauti is T. Bukausko doktorantūros studijos, nagrinėjančios atsitiktine tvarka parinktų abdominaliniu sepsiu sergančių pacientų kraujo serumą prieš atliekant skubią chirurginę intervenciją infekcijos židinio šalinimui. Atrinktų pacientų klinikiniai duomenys buvo surinkti iš pacientų ligos istorijų, kurios buvo iškeliamos iš LSMUL KK archyvo. Duomenys buvo renkami ir išsaugomi naudojant Microsoft Excel 2016 programą. Tiriamųjų konfidencialumas buvo užtikrintas nesaugant tiriamųjų vardų, pavardžių, ar adresų. Kiekvienas atrinktas pacientas buvo koduojamas su individualiu kodu ir visi duomenys buvo surinkti naudojant tik paskirtą kodą. Pacientų duomenys buvo apdorojami statistiniais metodais. Gauti rezultatai skelbiami tik apibendrinti.
11.2 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas- pacientai įtraukti į T. Bukausko doktorantūros tyrimą. T.y. LSMUL KK gydyti abdominaliniu sepsiu sergantys pacientai ir jų veninis kraujas, kuriems skubos tvarka chirurgijos skyriuje buvo atliktos operacijos ir buvo įsivyravęs abdominalinės kilmės sepsis. 11.3 Tiriamųjų atranka.
Gretutinės ligos buvo analizuojamos pacientams, kuriems atliktos skubios abdominalinės operacijos ir diagnozuotas abdominalinės kilmės sepsis. Į tyrimą neįtraukti pacientai, kurie buvo tuo metu sergantys ar buvo sirgę onkologinėmis ligomis. Imties dydis - 40 pacientų. Tirta gretutinių ligų, žalingų įpročių, kūno masės indekso (KMI), demografinių rodiklių įtaka mikroRNR raiškos pokyčiui. Kiekviena tirta gretutinė liga suskirstyta į 2 grupes: a) serga b) neserga. Žalingi įpročiai taip pat suskirstyti į dvi grupes: a) turi žalingą įprotį b) neturi žalingo
18 įpročio. KMI įvetintas pagal tris grupes: a) normalus (<25 kg/m2), b) antsvoris (25-30 kg/m2) ir c) nutukimas( >30 kg/m2).
11.4 Tyrimo metodai.
1. Abdominalinės kilmės sepsis diagnozuotas laboratoriniais ir chirurginiais radiniais, taip pat remiantis Sepsis-3 kriterijais. SOFA balai skaičiuoti prieš operaciją. SOFA įvertis apskaičiuotas pagal SOFA kriterijus (1 lentelė) naudojant skaičiuoklę. Vertinta būklė pagal ASA klasę.
Lentelė Nr. 1. SOFA kriterijai Sistema Balai 0 1 2 3 4 PaO2/FiO2 (mmHg) >400 <400 <300 <200+DPV <100+DPV Trombocitų skaičius (x103/µl) >150 <150 <100 <50<20 Bilirubino kiekis (µmol/l) >20-32 33-101 102-204 >204 Hipotenzija (VAS, µg/kg/min)
VAS>70mmHg VAS<70mmHg Dop ≤5 arba dob Dop >5 arba epi ≤0,1 arba nor ≤0,1 Dop >15 arba epi >0,1 arba nor>0,1 GKS (balai) 15 13-14 10-12 6-9 <6 Kreatininas (µmol/l) Šlapimo išskyrimas (ml/d) <110 110-170 171-299 300-400 <500 >400 <200
GKS – Glasgow komų skalė, VAS – vidurinis arterinis spaudimas, DPV – dirbtinė plaučiių ventiliacija, dop – dopaminas, dob – dobutaminas, epi – epinefrinas, nor – noradrenalinas
19 2. Naudojant tiriamųjų pacientų ligos istorijas buvo registruojami pacientų klinikiniai duomenys apie:
a) Demografinius paciento duomenis : amžius, lytis, abdominalinio sepsio priežastis, alkoholio vartojimas, rūkymas, kūno masės indeksas.
Alkoholio žalingas vartojimas nustatytas, jeigu jo per savaitę suvartojama daugiau negu 40 standartinių alkoholio vienetų (SAV) vyrams ir daugiau negu 28 SAV moterims. Kūno masės indeksas apskaičiuotas ir paskirtas į vieną iš grupių: normalus KMI (<25 kg/m2), antsvoris (25-30 kg/m2) ir nutukimas( >30 kg/m2).
b) Gretutinius susirgimus : kardiovaskulinės ligos t.y. arterinė hipertenzija (AH), prieširdžių vrpėjimas (PV), išeminė širdies liga (IŠL), endokrininės ligos t.y. cukrinis diabetas (CD), šlapimą išskiriančių organų (lėtinis inkstų funkcijos nepakankamumas) (LIFN) ir kraują gaminančių organų (anemija) ligos.
c) Bendro kraujo tyrimo (Hb, eritrocitų, leukocitų skaičius), biocheminių rodiklių duomenys (kreatininas, šlapalas, glikemija), uždegiminiai rodikliai (CRB).
3. T.Bukausko doktorantūros tyrimo metu prieš operaciją buvo imti tiriamųjų kraujo serumo ėminiai. Mėginiai buvo tiriami laboratorijoje PGR (RT-qPCR) metodu. Tirta šių, serume cirkuliuojančių mikroRNR raiška: mikroRNR-30d-5p, mikroRNR-23a-3p, mikroRNR-146a-5p. Cel-mikroRNR-39-3p buvo naudojamas tiriamųjų mikroRNR raiškų normalizacijai. Kiekvieno mikroRNR gautas ciklų skaičius (Cp) buvo lygintas su normalizacijai naudoto mikroRNR vidutiniu ciklų skaičiumi. Gauta reliatyvi mikroRNR raiška . MikroRNR raiška buvo įvertinta kaip raiškos skirtumas (dCp). Vidutinė dCp vertė buvo apskaičiuota kiekvienoje sudarytoje grupėje. Apskaičiuotos vidutinės dCp vertės buvo lygintos tarp grupių. Vertinta ar pacientų, turinčių tam tikras gretutines ligas, žalingus įpročius ar demografinius rodiklius reliatyvi mikroRNR raiška reikšmingai skiriasi nuo neturinčių.
4. Siekinat apskaičiuoti įtaką tikimybei, kad esant tam tikroms gretutinėms ligoms, žalingiems įpročiams ar nutukimui, mikroRNR įgis didesnę ar mažesnę reikšmę, taikyta binarinė logistinė regresija. Siekiant gauti dvireikšmius žymens kintamuosius ir sudarytį šį modelį, mikroRNR raiška buvo įvertinta panaudojant ribines reikšmes. Ribinės reikšmės paskaičiuotos gydytojo T. Bukausko disertaciniame darbe, naudojant ROC (angl. Receiver operating characteristic) analizę.
20 Jos nustatytos tiriant referentinės ir septinės grupės pacientus. Sepsiu sergančių pacientų mikroRNR-30d-5p raiška buvo mažesnė nei -0,355, mikroRNR-23a-5p mažesnė nei -0,5842 ir mikroRNR-146a-5p raiška mažesnė nei -0,4354 lyginant su sepsiu nesergančiais pacientais. Modelyje lyginta, ar tam tikras tiriamasis veiksnys turi įtakos tikimybei, kad mikroRNR raiška pakis t.y. įgis didesnę ar mažesnę reikšmę. Rezultatai statistiškai reikšmingi, jei apskaičiuota kriterijaus p reikšmė mažesnė už reikšmingumo lygmenį 0,05.
5. Duomenys apdoroti naudojant IBM SPSS 24.0 statistikos paketą. Prieš atliekant statistinę duomenų analizę patikrintas surinktų duomenų normalumas (Shapiro-Wilk testas). Pagal gautus rezultatus, jų skirstinys buvo normalusis arba labai artimas normaliajam. Dėl to statistinei analizei naudoti parametriniai metodai: dviejų tiriamųjų grupių rezultatų palyginimui – Stjudento t kriterijus nepriklausomoms imtims, o daugiau nei dviejų – One Way ANOVA kriterijus. Priklausomybės ryšiai tarp dviejų veiksnių buvo vertinami apskaičiavus Pearsono koreliacijos koeficientą. Požymių pasiskirstymo tarp tiriamųjų grupių įvertinimui naudotas Chi kvadrato kriterijus. Apskaičiuoti modelių parametrų įverčiai ir įvertintas pastarųjų statistinis reikšmingumas, naudojant statistinio rekšmingumo lygmenį, 𝛼 = 0.05.
21
12.
REZULTATAI
12.1 Tiriamųjų charakteristika
Tiriamąją imtį sudarė 40 pacientų. 20 (50%) moterų ir 20 (50%) vyrų. Pacientų bendras amžiaus vidurkis 64,05 ± 14,4 m. Vyrų (69,25 ± 11,86) amžiaus vidurkis statistiškai reikšmingai didesnis negu moterų (59,10 ± 15,01), p=0,023, r=3,601. Dažniausia abdominalinio sepsio infekcijos priežastis- skrandžio opos perforacija (42,5%, n=17), antra pagal dažnumą- divertikulo perforacija (15%, n=6), kitos priežastys pateiktos lentelėje Nr. 2. Pagal ASA klasę, didžioji dalis pacientų buvo įvertinti IV (45%, n=18) ir III (37,5%, n=15) klasėmis. Pasiskirtymas kitose klasėse pateiktas pav. Nr.1. Pagal SOFA klasifikaciją, didžioji dalis pacientų pasiskirstė grupėje, kurioje balų ≤3 (45%, n=18). Grupėse, kuriose SOFA balai 4-6 ir ≥7, pacientai atitinkamai pasiskirstė- 25% (n=12) ir 30% (n=12) (lent. Nr. 3).
Lentelė Nr. 2 Tiriamųjų abdominalinio sepsio priežastys
Infekcijos priežastis Pacientų skaičius Pacientų dalis(%)
Skrandžio opos perforacija 17 42,5
Divertikulo perforacija 6 15
Kirmėlinės ataugos perforacija 5 12,5
Dvylikapirštės žarnos opos perforacija
3 7,5
Jatrogeninė žarnų perforacija 3 7,5
Siūlių nesandarumas 2 5
Storosios žarnos plyšimas 2 5
22 Lentelė Nr. 3 Tiriamųjų pasiskirstymas į grupes pagal SOFA balus
SOFA balai Pacientų dalis % (n-pacientų skaičius)
<3 45% (n=18)
4-6 25% (n=12)
>7 30% (n=12)
Pav. Nr. 1 Tiriamųjų pasiskirstymas pagal ASA klases
12.2 Sergamumas gretutinėmis ligomis
Visi tirti pacientai turėjo bent vieną gretutinį susirgimą. Dažniausi nustatyti susirgimai- AH (n=29; 72,5%) anemija (n=22; 55%) ir I° nutukimas (n=16; 45%) vertinant pagal KMI. Kitų susirgimų, taip pat žalingų įpročių dažniai nurodyti lentelėje Nr. 4.
Vertinant visus abdominaliniu sepsiu sergančius pacientus, jų VAS buvo 85 ± 12 mmHg. Iš jų, arterine hipertenzija sirgusiųjų VAS buvo 90 ±16 mmHg, nesirgusiųjų- 82 ±25 mmHg (p=0,284, r=0,363). Vidutinis ŠSD- 98 k/min. Vidutinis ŠSD turintiems PV - 102 k/min, neturintiems aritmijos – 89 k/min (p=0,111, r=0,274). Vidutinė pacientų gliukozės koncentracija- 6,5 (3,14;34) mmol/l. Gliukozės koncentracijos vidurkis CD sergantiems- 5,81±1,83 mmol/l, nesergantiems- 6,66±1,83 mmol/l (p=0,390, p>0,05). Vidutinis pacientų eGFG-55 ml/min/1.73m2
,
kreatininas- 147 (62;706) µmol/l, šlapalas- 8,3 (3,2;37) mmol/l. Sergančių LIFN vidutinis eGFG-
1 (2,5%) 15 (37,5%) 18 (45%) 6 (15%) 0 5 10 15 20 I II III IV V P aci entų ska ič ius ASA klasė
23 37,07 ml/min/1.73m2. Pacientų vidutinis eritrocitų skaičius- 3,91± 0,58 x 1012/l, Hb-122,25±32,7 g/dl, HCT-35,8%. Vidutinis eritrocitų skaičius esant anemijai - 3,55±0,59 x 109/l, nesant - 4,41±0,58 x 109/l (p<0,001). Vidutinis Hb kiekis sergantiems anemija- 97,45±17,59 mmol/l, nesergantiems- 142,72±17,56 mmol/l, (p<0,001). Vidutinis CRB- 207,5±146,7mg/l, vidutinis leukocitų kiekis- 9,9± 4,74 x109/l.
Lentelė Nr.4 Tiriamųjų pasiskirstymas pagal gretutines ligas ir žalingus įpročius Gretutinis susirgimas Pacientų skaičius n ( %)
AH n=29 (72,5%) IŠL n=10 (25%) PV n=7 (17,5%) CD n=5 (12,5%) LIFN n=2 (5%) Opaligė n=10 (25%) Anemija n=22 (55%) KMI kg/m2 <25 n=15 (37,5%) 25-30 n=5 (17,5%) >30 n=18 (45%) Rūkymas n=16 (40%)
Žalingas alkoholio vartojimas n=5 (12,5%)
12.3 Demografinių rodiklių poveikis tiriamų mikroRNR-30d-5p, mikroRNR-23a-3p, mikroRNR-146a-5p raiškos pokyčiui.
Stjudento t kriterijus nepriklausomoms imtims parodė, kad statistiškai reikšmingų skirtumų tarp lyčių pagal mikroRNR-30d-5p, mikroRNR-23a-3p, mikroRNR-146a-5p raišką negauta (atitinkamai p= 0.431, p=0,543, p=0,796).
Vertinant amžiaus poveikį mikroRNR raiškai, lentelėje Nr.5 matoma, kad šioje tiriamųjų imtyje vyresnis amžius buvo susijęs su mažesne mikroRNR-30d-5p ir mikroRNR-23a-3p raiška, tačiau šis koreliacinis ryšys nebuvo statistiškai reikšmingas (5 lentelė).
24 Lentelė Nr.5 Amžiaus poveikis mikroRNR raiškai.
mikroRNR biožymenys Amžius
MikroRNR-30d-5p Koreliacijos koeficientas -0.232
P reikšmė 0.150
N 40
MikroRNR-23a-3p Koreliacijos koeficientas -0.294
P reikšmė 0.065
N 40
MikroRNR-146a-5p Koreliacijos koeficientas -0.070
P reikšmė 0.669
N 40
Palyginus vyresnių nei 60 metų ir jaunesnių pacientų mikroRNR biožymenų raiškos kitimą, statistiškai reikšmingų skirtumų tarp jų nenustatyta. MikroRNR-30d-5p (p=0,189), mikroRNR-23a-3p (p=0,096), mikroRNR-146a-5p (p=0,872).
Nustačius dažniausią peritonito sukeltą priežastį, mikroRNR raiškos pokytis buvo lygintas tarp pacientų kuriems abdominalinės kilmės sepsį sukėlė perforuota opa ir pacientų kuriems sepsį sukėlė kitos priežastys. Nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai mikroRNR-30d-5p ir mikroRNR-23a-3p žymenų raiškų pokyčiams. Sergančių opalige mikroRNR-30d-5p (p=0,029) ir mikroRNR-23a-3p (p=0,013) vidutinė dCp vertė buvo statistiškai reikšmingai mažesnė, negu esant kitoms peritonitą sukėlusioms priežastims. Pacientų, kurių peritonito priežastis opos perforacija, minėtų biožymenų raiška yra labiau mažėjanti, lyginant su pacientais, neturėjusiais opaligės (6 lentelė).
Lentelė Nr. 6. Sergančių ir nesergančių opalige palyginimas pagal mikroRNR raiškos pokytį.
Opaligė N Vidutinė dCp vertė Standartinis dCp nuokrypis P reikšmė mikroRNR-30d-5p neserga 23 -3.4159 0.82393 0.029 serga 17 -3.9954 0.76418 mikroRNR-23a-3p neserga 23 0.3328 1.73334 0.013 serga 17 -1.1319 1.77333 mikroRNR-146a-5p neserga 23 -1.4168 10.81856 0.697 serga 17 -2.7707 10.76903
25 12.4 Gretutinių susirgimų poveikis tiriamų mikroRNR-30d-5p, mikroRNR-23a-3p, mikroRNR-146a-5p raiškos pokyčiui.
Vertinant gretutinių ligų poveikį 30d-5p, 23a-3p, mikroRNR-146a-5p raiškai nustatyta, kad visos gretutinės ligos neturi statistiškai reikšmingo poveikio žymenų raiškai. MikroRNR vidutinė dCp reikšmė sergant ir nesergant tam tikra gretutine liga reikšmingai nesiskyrė (7 lentelė).
Lentelė Nr.7 Sergančiųjų ir nesergančiųjų gretutine liga palyginimas pagal mikroRNR raišką Gretutinė
liga MikroRNR Liga N
Vidutinė dCp reikšmė Standartinis dCp nuokrypis P reikšmė MikroRNR-30d-5p ne 11 -3.4454 0.70707 0.236 taip 29 -3.7789 0.89554 AH MikroRNR-23a-3p ne 11 0.1568 2.21896 0.275 taip 29 -0.5301 1.66230 MikroRNR-146a-5p ne 11 -3.3625 8.46537 0.558 taip 29 -1.2543 11.79207 MikroRNR-30d-5p ne 33 -3.6362 0.79510 0.677 PV taip 7 -3.7847 1.09579 MikroRNR-23a-3p ne 33 -0.2123 1.79904 0.578 taip 7 -0.6547 2.33396 MikroRNR-146a-5p ne 33 -2.0144 10.49887 0.978 taip 7 -1.8875 12.38979 IŠL ne 30 -3.6285 0.86804 0.772 MikroRNR-30d-5p taip 10 -3.7078 0.82626 ne 30 -0.3202 2.07136 0.907 MikroRNR-23a-3p taip 10 -0.2484 1.63825 ne 30 -0.3872 12.23008 0.246 MikroRNR-146a-5p taip 10 -4.1636 7.97780 CD ne 35 -3.7198 0.82554 0.257 MikroRNR-30d-5p taip 5 -3.2589 0.93013 ne 35 -0.3849 1.91498 0.403 MikroRNR-23a-3p taip 5 0.3771 1.59375 ne 35 -2.4569 10.34895 0.474 MikroRNR-146a-5p taip 5 1.2611 13.66082 ne 38 -3.6586 0.74928 0.961
26 MikroRNR-30d-5p taip 2 -3.6745 1.15743 LIFN ne 38 -0.4022 1.81822 0.489 MikroRNR-23a-3p taip 2 0.0977 2.13491 ne 38 -1.8883 10.83114 0.911 MikroRNR-146a-5p taip 2 -2.3501 10.76731 ne 18 -3.5112 0.91832 0.310 MikroRNR-30d-5p taip 22 -3.7858 0.77086 ne 18 -0.2028 1.90314 0.795
Anemija MikroRNR-23a-3p taip 22 -0.3608 1.89691
ne 18 -3.9528 7.51581 0.277
MikroRNR-146a-5p taip 22 -0.3880 12.65341
12.5 Nutukimo, žalingų įpročių poveikis mikroRNR-30d-5p, mikroRNR-23a-3p, mikroRNR-146a-5p raiškos pokyčiui.
ANOVA statistinės analizės rezultatai neatskleidė statistiškai reikšmingų skirtumų vertinant mikroRNR-30d-5p (p=0,994), mikroRNR-23a-3p (p=0,756), mikroRNR-146a-5p (p=0,208) raiškos pokyčius priklausomai nuo paciento KMI grupės. Apskaičiavus Pearsono koreliacijos koeficientus taip pat nenustatyta statistiškai reikšmingų ryšių pagal KMI dydį. MikroRNR-30d-5p (r=0,139, p=0,392), mikroRNR-23a-3p (r=0,048, p=0,767), mikroRNR-146a-5p (r=0,079, p=0,627).
Anksčiau minėtų žymenų raiškos pokyčiai rūkančių ir nerūkančių pacientų (atitinkamai p=0,328, p=0,465, p=0,637) bei žalingai vartojančių ir nevartojančių alkoholį pacientų (atitinkamai p=0,536, p=0,819, p=0,651) statistiškai reikšmingai nesiskyrė.
27 12.6 Gretutinių susirgimų, žalingų įpročių ir nutukimo įtaka mikroRNR prognozei
Į logistinės regresijos modelį buvo dedami kintamieji, kurie pagal kitus atliktus testus (šiuo atveju Stjudento t, ANOVA, Pearsono koreliacija) su prognozuojamu kintamuoju (mikroRNR-23a-3p, arba mikroRNR-146a-5p) yra statistiškai reikšmingai susiję. Šiame tyrime reikšmingas ryšys rastas buvo tarp pacientų, kurie buvo operuoti dėl opos perforacijos, ir kurių sepsio priežastis buvo kita liga. Tačiau logistinės regresijos modelis prognozuojant mikroRNR-23a-3p raišką nebuvo statistiškai reikšmingas (p=0,072, p>0,05). Tai reiškia, kad gretutiniai susirgimai neparodė poveikio, galinčio reikšmingai įtakoti ir pakeisti nustatytas mikroRNR raiškas, būdingas sepsiniams pacientams. Visgi, opaligės požymio šansų santykio reikšmė yra 3,265. Tai reiškia, jog šansai, kad sergantys opalige turės mažėjančią mikroRNR-23a-5p raišką (t.y. žymens raiška bus mažensė nei -0,5842) lyginant su nesergančiais yra 3,265 karto didesni, tačiau negalime teigti kad šansas yra statistiškai reikšmingai didesnis (p=0,072). Taip pat, negalime teigti, kad tai bus visoje populiacijoje, kadangi šansų santykio intervalas (0,879; 12,128).
Logisinės regresijos modelis prognozuojant mikroRNR-146a-5p raiškos didėjimą ar mažėjimą taip pat nebuvo statistiškai reikšmingas (p=0,904, p>0,05). Tačiau pastebima, kad turintiems opaligę yra 1,125 karto didesni šansai jog jų mikroRNR-146a-5p žymens raiška bus mažesnė nei -0,4354. Visgi, negalime teigti kad tai bus visoje populiacijoje, nes šansų santykio intervalas (0,167; 7,600), tad šansas nėra statistiškai reikšmingai didesnis (8 lentelė).
Lentelė Nr. 8 Opaligės įtaka tikimybei, jog liga turi įtakos mikroRNR raiškai
MikroRNR
Šansų santykis
Šansų santykio intervalas
P reikšmė Mažiausia reikšmė Didžiausia reikšmė MikroRNR-23a-3p 3,265 0,879 12,128 0,072 MikroRNR-146a-5p 1,125 0,167 7,600 0,904
28
13.
REZULTATŲ APTARIMAS
Beveik pusė tirtų pacientų pagal SOFA skalę pasiskirstė grupėje ≤3 balai. Tai rodo, jog pakankamai didelė dalis pacientų buvo ne itin sunkios būklės. Santykinai didelis kiekis pacientų buvo priskiriami ASA III klasei, t.y. pacientai su sunkia sistemine liga. Tai gali būti blogai kontroliuojamas CD, lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL), KMI>40kg/m2
,
galutinės stadijos lėtinė inkstų liga su reguliariai atliekamomis dializėmis, implantuotas širdies stimuliatorius, diaugiau nei prieš 3 mėnesius buvęs miokardo infarktas (MI), insultas ar atliktas koronarinių arterijų stentavimas. Rekomenduojamose ASA vertinimo gairėse, siūloma, jog esant sepsiui ASA klasė turėtų būti mažiausiai IV, t.y. pacientai su sunkia sistemine liga, kuri kelia grėsmę gyvybei. Tai nėra griežti kriterijai, tačiau siūloma IV grupei priskirti pacientus kurie mažiau nei prieš 3 mėnesius yra sirgę MI, insultu ar atliktas koronarinių arterijų stentavimas, taip pat pacientai su DIK, sergantys sepsiu, respiraciniu distreso sindromu, ar turintys galutinės stadijos lėtinę inkstų ligą kuriems atliekamos nereguliarios dializės [50].Vertinant gretutinių ligų poveikį mikroRNR-30d-5p, mikroRNR-23a-3p, mikroRNR-146a-5p raiškos pokyčiui nustatyta, kad statistiškai reikšmingą poveikį raiškos kitimui turi opaligė. Didžiai daliai tirtų pacientų su opaligės susirgimu, jų sepsio priežastis buvo opos perforacija. Reikšmingas minėų biožymenų raiškos sumažėjimas esant opaligei galėjo atsispindėti ne tik dėl ligos, bet ir uždegimo buvimo. Visi sepsiu sergantys pacientai turi įsivyravusį uždegimą, tačiau ne visi turėjo opaligės susirgimą ar opos perforaciją. Taigi, opaligė, galėjo turėti poveikį anksčiau minėtų žymenų raiškai. Literatūroje aprašoma, jog mikroRNR-146a-5p raiška yra padidėjusi esant lėtiniam aktyviam gastritui [51]. Tai pat, nustatytas šio žymens padidėjimas skrandžio epitelinėse ląstelėse bei gleivinėje esant H. Pylori infekcijai [52]. Įvertinus kitų gretutinių susirgimų ar žalingų įpročių vartojimą, nenustatyta statistiškai reikšmingo poveikio tirtų mikroRNR raiškos kitimui. Tačiau ši duomenų analizė turi keletą metodinių trūkumų. Dėl nedidelės tiriamųjų imties statistiškai reikšmingi skirtumai tarp grupių galėjo būti sunkiau aptinkami.
Medicininėje literatūroje yra aprašoma, kad tam tikros ligos turi įtakos tiriamųjų žymenų raiškai. Nustatyta, kad mikroRNR-23a-3p gali būti susijęs su pooperaciniu prieširdžių virpėjimu po koronarinių arterijų stentavimo operacijų [53]. Taip pat nustayta, kad pacientai, sergantys II
29 tipo cukriniu diabetu ar turintys nutukimą turėjo didesnę mikroRNR-30d-5p ir mikroRNR-146-5p raišką, lyginant su nesergančiais, turinčiais normalų gliukozės kiekį kraujyje ar normalų KMI turinčiais pacientais [54;55;56]. MikroRNR-146a-5p ir mikroRNR-30d-5p raiška taip pat teigiamai korealiuoja su pilvo riebalinio audinio išskiriamais SFRP4 (secreted flizzled related protein 4), kurie yra susiję su uždegimu ir padidėjusiu insulino rezistentiškumu esant nutukimui. [55]. Tačiau šie tyrimai atlikti su nesergančiais sepsiu pacientais. Kadangi literatūroje aprašoma, jog mikroRNR-146a-5p raiška kinta uždegimo ar infekcijos metu, CD ar KMI poveikis biožymens raiškai gali būti netikslus, ypač esant nedidelei pacientų imčiai. Taip pat literatūroje aprašoma, jog padidėjusi mikroRNR-30d-5p raiška esant dideliam gliukozės kiekiui kraujyje koreliavo su padidėjusia insulino geno ekspresija, bet nebuvo susijusi su insulino sekrecijos didėjimu. Taigi, manoma, kad mikroRNR-30d-5p taikiniai, neigiamai reguliuoja insulino geno ekspresiją, nepriklausomai nuo insulino sekrecijos [56].
Tirint lėtinės inkstų ligos poveikį mikroRNR raiškai, reikšmingų rezultatų galėjo būti negauta dėl itin mažos sergančiųjų LIFN imties (n=2). Iš šiame tyrime tirtų mikroRNR, literatūroje didžiausias dėmesys esant lėtinei inkstų ligai skiriamas mikroRNR-30-5p raiškai. Rašoma, kad esant inkstų funkcijos pažeidimui, atliktame tyrime su pelėmis ir ištyrus mikroRNR-30d-5p raišką šlapime, nustatyta šio biožymens koreliacija su inkstų pažeidimo sunkumu. Taip pat aliktas tyrimas su žmonėmis lyginat žymens raišką šlapime tarp sergančių židinine segmentine glomeruloskleroze ir sveikų asmenų. Tyrime pastebėta padidėjusi mikroRNR-30d-5p ekspresija sergantiems lėtine inkstų liga [58].
Vertinant žalingų įpročių poveikį MikroRNR raiškai, reikšmingo poveikio nebuvo nustatyta. Tyrime rūkymo, taip pat žalingo alkoholio vartojimo įvertinimas galėjo būti netikslus, nes pacientų pateikti duomenys apie rūkymą ir alkoholio vartojimą gal būti subjektyvūs. Literatūros duomenimis, tyrime su sveikais tiriamaisiais, mikroRNR-30d-5p raiška reikšmingai skyrėsi tarp tiriamųjų kurie rūkė, ir kurie prieš mėnesį buvo metę rūkyti [55]. MikroRNR-30d-5p raiška taip pat buvo reikšmingai sumažėjusi plaučių karcinoma sergantiems pacientams kurie rūkė, lyginant su nerūkančiais pacientais [57].
Nustatant veiksnių įtaką biožymenų raiškos reikšmingam padidėjimui ar sumažėjimui ir įvertinant įtaką prognozei, kad raiška įgis didesnę ar mažesnę reikšmę, reikšmingos įtakos nenustatyta. Vertinant mikroRNR-23a-3p ir mikroRNR-146a-5p raišką negauta reikšminga
30 tikimybė, jog tiriamos ligos ar žalingi įpročiai turėtų įtakos tirtų mikroRNR raiškų padidėjimui ar sumažėjimui. Tirti veiksniai neturėtų įtakoti mikroRNR raišką, būdingą sepsiu sergantiems ar nesergantiems pacientams. Visgi, nustatyti didesni šansai, jog esant opaligei mikroRNR raiškos pokytis bus didesnis ir raiška bus mažėjanti. Tačiau esanti opos perforacija gali būti ir infekcinio proceso priežastis, dėl kurio mikroRNR raiškos galėjo mažėti. Tuo tarpu tirti kiti gretutiniai susirgimai nebuvo priežastis sepsio įsivyravimui.
31
14.
IŠVADOS
1. Dažniausi gretutiniai susirgimai abdominaliniu sepsiu sergantiems pacientams- arterinė hipertenzija, anemija, I° nutukimas.
2. Gretutinės ligos, žalingi įpročiai neturi reikšmingo poveikio tirtų mikroRNR raiškai. 3. Pacientai, kurių sepsio priežastis buvo opos perforacija turėjo mažesnę mikroRNR-30d-5p
ir mikroRNR-23a-3p raišką nei turintys kitą sepsį sukėlusią priežastį (atitinkamai p=0,029, p=0,013).
4. Prognozuojant žymenų raiškos kitimą, įgyjant didesnę ar mažesnę raiškos vertę, gretutiniai susirgimai, žalingi įpročiai, demografiniai rodikliai įtakos neturėjo.
32
15.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1) Vertinti pacientų būklę pagal SOFA skalę ir naudoti ją sepsio diagnostikai, atsižvelgiant į Sepsis-3 kriterijus.
2) Kuo anksčiau išsiaiškinti tikslią informaciją apie gretutines ligas ir atsižvelgti taikant ankstyvą sepsio gydymo būdą.
3) Atlikti tolimesnius tyrimus specifinių sepsio žymenų aiškinimui, naudojant kuo didesnes pacientų imtis.
33
16.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 2016; 315:801-810.
2. SepNet Critical Care Trials G. Incidence of severe sepsis and septic shock in German intensive care units: the prospective, multicentre INSEP study. Intensive Care Med. 2016; 42:1980–9.
3. Vincent JL, Marshall JC, Namendys-Silva SA, et al: Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit. Lancet Respir Med 2014; 2: 380-386.
4. Czura CJ: “Merinoff symposium 2010: sepsis”-speaking with one voice. Mol Med 2011; 17: 2-3.
5. Kumar A, Roberts D, Wood KE, Light B, Parrillo JE, Sharma S, et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med. 2006 Jun. 34(6):1589-96.
6. Shapiro N, Howell MD, Bates DW, Angus DC, Ngo L, Talmor D. The association of sepsis syndrome and organ dysfunction with mortality in emergency department patients with suspected infection. Ann Emerg Med. 2006 Nov. 48(5):583-90, 590.
7. C. Pierrakos and J.-L. Vincent, “Sepsis biomarkers: a review,” Critical Care, vol.14, no.1, articleR15,2010.
8. J. D. Faix, “Biomarkers of sepsis,” Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, vol.50, no.1, 23–36,2013
9. Vincent JL. The Clinical Challenge of Sepsis Identification and Monitoring: 2016, PLOS Medicine 13(5): e1002022.
10. Rhodes A, Evans LE, Alhazzani W, Levy MM, Antonelli M, Ferrer R, et al. Surviving Sepsis Campaign: International Guidelines for Management of Sepsis and Septic Shock: 2016. Critical Care Med. 2017;45: 486–552.
11. Kingsley, S.M.K. & Bhat, B.V. Inflamm. Res. 2017; 66: 553.
12. Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004; 116: 281–97.
34 13. Wang GK, Zhu JQ, Zhang JT, Li Q, Li Y, He J, Qin YW, Jing Q. Circulating microRNA: A novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans. Eur Heart J. 2010; 31:659–666.
14. Ardekani A, Naeini M. The role of MicroRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol 2010; 2:161–179
15. Martirosyan A, De Martino A, Pagnani A, Marinari E. ceRNA crosstalk stabilizes protein expression and affects the correlation pattern of interacting proteins. Sci Rep. 2017; 7:43673.
16. Fleischmann, C. et al. Assessment of global incidence and mortality of hospital-treated sepsis — current estimates and limitations. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 193, 259–272.
17. De Waele JJ. Abdominal sepsis. Curr Infect Dis Rep 2016; 18: 23.
18. Calandra T, Cohen J. The international sepsis forum consensus conference on definitions of infection in the intensive care unit. Critical Care Med 2005; 33: 1538-48.
19. Gustot, T. Multiple organ failure in sepsis: prognosis and role of systemic inflammatory response. Curr. Opin. Crit. Care 17, 153–159.
20. Opal, S. M. et al. Relationship between plasma levels of lipopolysaccharide (LPS) and LPS-binding protein in patients with severe sepsis and septic shock. J. Infect. Dis.1999; 180: 1584–1589.
21. Van der Poll T, van Deventer SJH. Cytokines and anticytokines in the pathogenesis of sepsis. Infect. Dis. Clin. N. Am. 1999; 13: 413–426.
22. Aird WC. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood 2003; 101: 3765- 77.
23. Vincent JL, Moreno R, Takala J, Willatts S, De Mendonça A, Bruining H, et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. Intensive Care Med. 1996; 22: 707–10.
24. Levy MM, Fink MP, Marshall JC, Abraham E, Angus D, Cook D et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit Care Med. 2003;31: 1250–1256.
25. Vincent JL, Teixeira L: Sepsis biomarkers. Value and limitations. Am J Respir Crit Care Med 2014; 190:1081–1082.
35 26. Santonocito C, De L, I, Donadello K, Moussa MD, Markowicz S, Gullo A et al. C-reactive
protein kinetics after major surgery. Anesth Analg. 2014;119: 624–629.
27. Mofidi R, Suttie SA, Patil PV, Ogston S, Parks RW. The value of procalcitonin at predicting the severity of acute pancreatitis and development of infected pancreatic necrosis: systematic review. Surgery. 2009;146: 72–81.
28. Martin GS, Mannino DM, Moss M. The effect of age on the development and outcome of adult sepsis. Crit Care Med 2006; 34: 15-21.
29. Banta JE, Joshi KP, Beeson L, et al. Patient and hospital characteristics associated with inpatient severe sepsis mortality in California, 2005-2010. Crit Care Med 2012; 40: 2960 6
30. Esper AM, Moss M, Lewis CA, et al. The role of infection and comorbidity: Factors that influence disparities in sepsis. Crit Care Med 2006; 34: 2576-82.
31. Henry E. Wang, Nathan I. Shapiro, Russell Griffin, Monika M. Safford, Suzanne Judd, George Howard PLoS One. 2012; 7(10): e48307.
32. Wang HE, Gamboa C, Warnock DG, Muntner P. Chronic kidney disease and risk of death from infection. Am J Nephrol. 2011; 34: 330–336.
33. Bristol Whiles, Amanda Deis, Patrick Miller, Steven Simpson. Comorbid Conditions Predict Outcomes in Patients with Severe Sepsis. Chest world congress 2016; Volume 149, Issue 4, Supplement, Page A170.
34. Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell; 1993; 75(5), 843-54.
35. Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004; 116: 281–97.
36. Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 2005; 120: 15–20.
37. Kiriakidou M, Tan G S, Lamprinaki S, M De Planell-Saguer, Nelson P T et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell 2007; 129(6), 1141-51.
38. Kozomara A, Griffiths-Jones S.miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic acids research. 2014; 42: D68-73.
36
39. Zampetaki A, Willeit P, Drozdov I, Kiechl S, Mayr M. Profiling of circulating microRNAs: from single biomarkers to re-wired networks. Cardiovasc Res 2012; 93: 555–62.
40. Clambey, ET, McNamee, EN, Westrich, JA, Glover, LE, Campbell, EL, Jedlicka, P, de Zoeten, EF, Cambier, JC, Stenmark, KR, Colgan, SP, Eltzschig, HK Hypoxia-inducible factor-1α-dependent induction of FoxP3 drives regulatory T-cell abundance and function during inflammatory hypoxia of the mucosa.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109 E2784– 93.
41. Garo LP, Murugaiyan G. Contribution of microRNAs to autoimmune diseases. Cell Mol Life Sci. 2016; 73: 2041–2051.
42. Boldin, MP, Taganov, KD, Rao, DS, Yang, L, Zhao, JL, Kalwani, M, Garcia-Flores, Y, Luong, M, Devrekanli, A, Xu, J, Sun, G, Tay, J, Linsley, PS, Baltimore, D miR-146a is a significant brake on autoimmunity, myeloproliferation, and cancer in mice.. J Exp Med. 2011; 208 1189–201.
43. Shao Y, Li J, Cai Y, Xie Y, Ma G, Li Y, et al. The functional polymorphisms of miR-146a are associated with susceptibility to severe sepsis in the Chinese population. Mediators Inflamm. 2014; 2014: 916202.
44. Wang L, Wang HC, Chen C, Zeng J, Wang Q, Zheng L, et al. Differential expression of plasma miR-146a in sepsis patients compared with non-sepsis-SIRS patients. Exp Ther Med. 2013; 5: 1101–4
45. Gao M, Wang X, Zhang X, Ha T, Ma H, Liu L, et al. Attenuation of cardiac dysfunction in polymicrobial sepsis by microRNA-146a is mediated via targeting of IRAK1 and TRAF6 expression. J Immunol. 2015; 195:672–82.
46. Zhou J, Chaudhry H, Zhong Y, Ali MM, Perkins LA, Owens WB, et al. Dysregulation in microRNA expression in peripheral blood mononuclear cells of sepsis patients is associated with immunopathology. Cytokine. 2015; 71:89–100
47. S. Li, Y. Yue, W. Xu, S. Xiong MicroRNA-146a represses mycobacteria-induced inflammatory response and facilitates bacterial replication via targeting IRAK-1 and TRAF-6 PLoS ONE, 2013; 8: e81438.
37 48. Liu S, Liu C, Wang Z, Huang J, Zeng Q. microRNA-23a-5p acts as a potential biomarker for sepsis-induced acute respiratory distress syndrome in early stage. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2016; 62:31–7.
49. Jennifer zur Bruegge, Christina Backes, Greta Gölz, Georg Hemmrich-Stanisak, Lydia Scharek-Tedin. MicroRNA Response of Primary Human Macrophages to Arcobacter
Butzleri Infection. 2016 Jun 24; 6(2): 99–108.
50. ASA Physical Status Classification System. Last aproved by ASA house of Delegates on October 15, 2014.
51. Jun-Won Chung, Seok Hoo Jeong, Sun Mi Lee, Jhang Ho Pak, Gin Hyug Lee, et al. Expression of MicroRNA in Host Cells Infected with Helicobacter pylori. 2017. 11(3): 392–400.
52. Li, N. et al. H. pylori related proinflammatory cytokines contribute to the induction of miR-146a in human gastric epithelial cells. Mol. Biol. Rep.2012; 39: 4655–4661.
53. Feldman A, Moreira DAR, Gun C, Wang HL, Hirata MH, de Freitas Germano J, et al. Analysis of circulating mir-1, mir-23a, and mir-26a in atrial fibrillation patients undergoing coronary bypass artery grafting surgery. Ann Hum Genet 2017; 81: 99–105. 54. Opal, S. M. et al. Relationship between plasma levels of lipopolysaccharide (LPS) and
LPS-binding protein in patients with severe sepsis and septic shock. J. Infect. Dis. 1999; 180: 1584–1589.
55. Yury O. Nunez Lopez, Gabriella Garufi, Magdalena Pasarica, Attila A. Seyhan. Elevated and Correlated Expressions of miR-24, miR-30d, miR-146a, and SFRP-4 in Human Abdominal Adipose Tissue Play a Role in Adiposity and Insulin Resistance. International Journal of Endocrinology. 2018, Article ID 7351902, 7 pages. https://doi.org/10.1155/2018/7351902
56. Schroen B, Heymans S. MicroRNAs and beyond: the heart reveals its treasures. Hypertension. 2009; 54(6): 1189–1194.
57. Seike M, et al. MiR-21 is an EGFR-regulated anti-apoptotic factor in lung cancer in never-smokers. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106: 12085–12090.
58. Wang N1, Zhou Y, Jiang L, Li D, Yang J, Zhang CY, Zen K. Urinary microRNA-10a and microRNA-30d serve as novel, sensitive and specific biomarkers for kidney injury. 2012;7(12):e51140.
