LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGIJOS CHEMIJOS KATEDRA

ANDŢEJ GAJEVSKI

PROPIONO RŪGŠTIES DARINIŲ TYRIMAS TITRIMETRINIAIS IR EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof. Liudas Ivanauskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGIJOS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

PROPIONO RŪGŠTIES DARINIŲ TYRIMAS TITRIMETRINIAIS IR EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. Liudas Ivanauskas

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantas Andţej Gajevski 2015

TURINYS

SANTRAUKA...5

SUMMARY...6

SANTRUMPOS...7

1. ĮVADAS...8

1.1. Darbo tikslas ir uţdaviniai...9

2. LITERATŪROS APŢVALGA...10

2.1. Nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo…..…...………..…………...10

2.2. Nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo klasifikacija………...……..……..10

2.2.1. Propiono rūgšties dariniai...11

2.2.2. Propiono rūgšties darinių veikimo mechanizmas...12

2.2.3. Ibuprofenas...12

2.2.4. Ketoprofenas...14

2.2.5. Ibuprofeno ir ketoprofeno tyrimo metodai...15

3. TYRIMO METODIKA...19

3.1. Tyrimo objektas ……….………..19

3.2. Tyrimo planavimas………..19

3.3. Titrimetrinė ibuprofeno ir ketoprofeno analizė...20

3.3.1. Aparatūra ir reagentai………...20

3.3.2. Standartinių tirpalų paruošimas titrimetrinei analizei...21

3.3.3. Vaistinių preparatų tirpalų paruošimas titrimetrinei analizei...21

3.3.4. Titrimetrinė analizė...21

3.4. ESC metodikos optimizavimas...22

3.4.1. Aparatūra ir priedai……….…22

3.4.2. Reagentai………...………22

3.4.3. Standartinių tirpalų paruošimas ESC analizei...23

3.4.4. Vaistinių preparatų tirpalų paruošimas ESC analizei...23

3.4.5. ESC metodikos pritaikymas tiriamoms vaistinėms medţiagoms...23

3.5. ESC metodikos validacija………..……..24

4. REZULTATAI……….….…..26

4.1. Titrimetrinė analizė……….….……26

4.1.1. Potenciometrinis titravimas………….……….……26

4.1.2. Tiesioginis titravimas taikant indikatorius...……….….28

4.2. ESC metodikos optimizavimas………32

4.3. ESC metodikos validacija………32

4.3.1. Specifiškumas……….………32

4.3.2. Rezultatų glaudumas...36

4.3.3. Aptikimo ir nustatymo ribos...38

4.3.4. Tiesiškumas...38

5. REZULTATŲ APTARIMAS...40

6. IŠVADOS...41

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...42

SANTRAUKA

A.Gajevski magistro baigiamasis darbas „Propiono rūgšties darinių tyrimas titrimetriniais ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais“ mokslinis vadovas prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Lietuvoje ir Pasaulyje skausmo malšinimas yra viena iš pagrindinių, vaistininko darbe sutinkamų, sveikatos prieţiūros problemų. Skausmui malšinti yra daug skirtingų vaistų, bet daţniausiai renkamasi nesteroidinius vaistus nuo uţdegimo. Ibuprofeno ir ketoprofeno veikliąsias medţiagas turintys vaistai daţnai naudojami svigydoje ar yra rekomenduojami gydytojų, kaip efektyvūs skausmą ir uţdegimą malšinantys vaistai. Sparčiai besivystančios technologijos paskatina modernesnių ir tikslesnių analizavimo metodų atsiradimą. Padidėja galimybės efektyviau kontroliuoti veikliosios medţiagos koncentraciją vaistuose visą jų galiojimo laiką. Išvengiama vaisto toksiškumo dėl per didelės koncentracijos veikliosios medţiagos vaiste arba nepakankamo vaisto poveikio dėl per maţos veikliosios medţiagos koncentracijos vaiste.

Darbo tikslas - palyginti Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjose aprašytas ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinės sudeties įvertinimo metodikas, optimizuoti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką šių veikliųjų medţiagų kokybiniam įvertinimui.

Tyrimo objektai ir metodai: propiono rūgšties dariniai (ibuprofenas, ketoprofenas). Naudoti preparatai Ibuprom 400mg, Ketonal 150mg. Tyrimų metodai: tiesioginis titraviams taikant indikatorius, potenciometrinis titravimas, efektyvioji skysčių chromatografija.

Tyrimo rezultatai: Atlikus kiekybinius tyrimus ibuprofeno ir ketoprofeno veikliosioms medţiagoms, taikant Europos farmakopėjoje aprašytais titrimetriniais metodais gaunami rezultatai: ibuprofeno tiriamojo tirpalo 440,6mg, standartinio tirpalo 440,3mg. Ketoprofeno rezultatai: tiriamojo tirpalo 190,75mg, standartinio tirpalo 188,75mg. Tiriant Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje aprašytais titrimetriniais metodais gaunami rezultatai: ibuprofeno tiramojo tirpalo 447,13mg, standartinio tirpalo 448,13mg. Ketoprofeno rezultatai: tiriamojo tirpalo 185,5mg, standartinio tirpalo 184,025mg

Optimizuota ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ibuprofeno ir ketoprofeno kokybinei analizei esant mišinyje. Taikant šią metodiką, pastebėtos praktinės galimybės efektyviai nustatyti ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinę sudėtį.

SUMMARY

A. Gajevski master thesis “Analysis of propionic acid derivates using titrimetric methods and high performanceliquid chromatography”/ scientific manager prof. dr.L. Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and ToxicologicalChemistry. - Kaunas.

In Lithuania and the world, pain relief is one of main tasks pharmacists have to deal with in their daily jobs. There are a lot of medicines for pain, but the most common choice usually is NSAIDs. Medications with ibuprofen and ketoprofen active substances often used as self-medications or are recommended by doctors as effective paint and inflammation relievers. Rapidly developing technology encourages more modern and more precise analytical methods to be invented, that increases the possibility of effectively control the active substance in drugs throughout thei shelf life. Newer analytical methods give better possibility to avoid drug toxicity due to too high concentration of active substance in drugs or insufficient drug effect due to lack of an active substance concentration in drug.

Purpose - to compare Europes and the United States Pharmacopoeias described ibuprofen and ketoprofen quantitative composition research methodologies, optimize and validate high performance liquid chromatographic method to separate a mixture of these drugs.

Materials and methods: The study objects are propionic acid derivatives: ibuprofen, ketoprofen. Used products Ibuprom 400mg, Ketonal 150mg. Research methods: direct titration using indicators, potentiometric titration, high performance liquid chromatography.

Results: The quantitative analysis of ibuprofen and ketoprofen active substances, using the European Pharmacopoeia described volumetric methods yield results: ibuprofen 440,6mg test solution, standard solution 440,3mg. Ketoprofen results: 190,75mg test solution, standard solution 188,75mg. The examination of the United States pharmacopoeia described volumetric methods yield results: ibuprofen 447,13mg test solution, standard solution 448,13mg. Ketoprofen results: 185,5mg test solution, standard solution 184,025mg.

Optimized and validated HPLC method for ibuprofen and ketoprofen qualitative analysis and mixture separation. The application of this methodology reported in practical ability to effectively determine, ibuprofen and ketoprofen quantitative composition.

SANTRUMPOS

NVNU – Nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo

NSAID – Nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo (Nonsteroidal anti-inflammatory drug) ATC klasės - Anatominė terapinė cheminė klasifikacija

COX-1 – Ciklooksigenazė 1 COX-2 – Ciklooksigenazė 2 DDD – Didţiausia dienos dozė

ESC – Efektyvioji skysčių chromatografija

HPLC - Efektyvioji skysčių chromatografija (High performance liquid chromatography) PGE1 – Prostaglandinas E1

PGE2 – Prostaglandinas E2 PGF2 – Prostaglandinas F2 PGD2 – Prostaglandinas D2 TxA2 – Tromboksanas A2

IUPAC - Tarptautinės grynosios ir taikomosios chemijos sąjunga (International Union of Pure and Applied Chemistry)

Rf – Sulaikymo faktorius (Retardation factor) UV – Ultravioletiniai spinduliai

MS – Masių spektroskopija

SSN – Santykinis standartinis nuokrypis TFA – Trifluoracto rūgštis

1. ĮVADAS

Skausmas yra vienas daţniausių organizmo sutrikimo pojūčių, kuris pablogina ţmogaus gyvenimo kokybę: sumaţina gebėjimą judėti, sutrikdo miego kokybę, lėtina ligonio sveikimą po ligos, neigiamai veikia darbingumą ir psichiką [1]. Skausmas ir uţdegimas daţnai malšinami medikamentiniu būdu. Ţmonės malšina skausmą tokiais analgetikais kaip paracetamolis, aspirinas. Tinkamas skausmo malšinimas ne tik gerina ligonio gyvenimo kokybę, bet pagreitina sveikimą ir organizmo funkcijų atsistatymą. Daţniausiai pasirenkami nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo (NVNU). Lietuvoje priešuţdegiminių ir priešreumatinių vaistų suvartojimas nuo 2010 iki 2013 metų padidėjo 22 proc., per pastaruosius metus padidėjo 5 proc., todėl matoma tendencija, kad ateityje šios ATC klasės vaistų suvartojimas dar labiau padidės [2]. Šios klasės vaistai yra pirmaeiliai reumatinių sąnarių uţdegimo ir minkstųjų audinių ligų, ūminiam ir lėtiniam skausmui gydyti. Senyvo amţiaus pacientai ypač daţnai kenčia nuo lėtinio skausmo. Remiantis epidemiologinių tyrimų rezultatais, Europoje kas penktas vyresnio amţiaus ţmogus pastoviai vartoja skausmą malšinančius vaistus [11]. NVNU analgezines ir priešuţdegimines savybes lemia ciklooksigenazės (COX-1 ir COX-2) sintezės inhibicija. NVNU yra veiksmingi ir maţai toksiški vaistai, todėl nemaţa jų dalis parduodami be recepto. Vieni iš daţniausiai Lietuvoje parduodamų NVNU yra ibuprofenas ir ketoprofenas. Pagal bendrinį pavadinimą, ibuprofenas patenka į Lietuvos labiausiai suvartojamų vaistinių preparatų sąrašą ir 2013m. suvartota 19,619 DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną [6].

Analizinės chemijos uţdavinys yra kurti naujas ir optimizuoti jau esamas analizės metodikas su analitinių technologijų pagalba tam, kad būtų galima tiksliau įvertinti veikliąsias medţiagas vaistiniuose preparatuose. Tobulėjant analitinei aparatūrai ir analizės metodams, būtina atnaujinti farmakopėjinius straipsnius.

Veikliosios medţiagos stebėsena preparate yra būtina norint uţtikrinti jo saugumą ir efektyvumą visą jo galiojimo laiką. Ibuprofeno ir ketoprofeno suvartojimas auga visame pasaulyje. Dėl šios prieţasties buvo palygintos Europos ir Jungtinių valstijų farmakopėjų tyrimo metodikos taikomos ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybiniam įvertinimui. Kokybiniam nustatymui naudota optimizuota ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika. Gauti rezultatai padės geriau valdyti ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinius ir kokybinius rodiklius preparatuose, bus uţtikrinta kontrolė veikliosios medţiagos koncentracijos nukrypimų vaiste nuo terapinės dozės.

1.1. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas: palyginti Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjose aprašytas ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinės sudėties tyrimo metodikas, optimizuoti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką šių veikliųjų medţiagų kokybinei sudėčiai nustatyti esant mišinyje.

Darbo uţdaviniai:

1. Atlikti ibuprofeno kiekybinius įvertinimus pagal Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjose aprašytas metodikas ir palyginti rezultatus.

2. Atlikti ketoprofeno kiekybinius įvertinimus pagal Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjose aprašytas metodikas ir palyginti rezultatus.

3. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką ibuprofeno ir ketoprofeno mišiniui atskirti.

4. Validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, tinkamą ibuprofeno ir ketoprofeno kokybinei sudėčiai įvertinti, esant mišinyje.

2. LITERATŪROS APŢVALGA

2.1. Nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo

Nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo (NVNU) yra pagrindinė grupė vaistų, skiriamų ūminiam ir lėtiniam skausmui gydyti. Šie vaistai efektyviai slopina skausmą maţindami audinių uţdegimo reakcijas [5]. Vaistų nuo uţdegimo eros pradţia laikoma 1763m. kai atrandamas natrio salicilatas. Salicilatai daţnai sukeldavo virškinamojo trakto komplikacijas, todėl jie buvo plačiai tyrinejami, siekiant šių komplikacijų išvengti. 1897 m. Feliksas Hoffmanas (Felix Hoffman) ir Friedrichas Bayeris (Friedrich Bayer) atrado acetilsalicilo rūgštį, dar ţinomą kaip aspiriną. Aspirino atradimas paspartino kitų panašios struktūros vaistų atsiradimą, tokių kaip indometacinas ir fenilbutazonas. Šiuo metu yra virš 40 nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo ir jų nuolat daugėja [3,34].

2.2. Nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo klasifikacija

NVNU klasifikacija pagal cheminę sudėtį:

 Salicilatai (acetilsalicilo rūgštis, difunisalis, salsalatas)

 Propioninės rūgšties dariniai (ibuprofenas, naproksenas, fenoprofenas, ketoprofenas, flurbiprofenas, oksaprozinas, loksoprofenas)

 Acto rūgšties dariniai (indometacinas, sulindakas, etodolakas, ketorolakas, diklofenakas, nabumetonas)

 Enlinės rūgšties dariniai (mefenamo rūgštis, meklofenaminė rūgštis, flufenaminė rūgštis, tolfenaminė rūgštis)

 Paraaminofenolio dariniai (paracetamolis)  Pirazolono dariniai (dipiridonas)

 Selektyvūs COX-2 inhibitoriai (celekoksibas, rofekoksibas, valdekoksibas, parekoksibas, lumirakoksibas, etorikoksibas, firokoksibas)

2.2.1. Propiono rūgšties dariniai

Viena iš NVNU rūšių yra propiono rūgšties dariniai. Propiono rūgšties dariniai pasiţymi visomis NVNU būdingomis farmakokinetinėmis savybėmis (1 lentelė) [7].

1 lentelė. NVNU būdingos farmakokinetinės savybės

Absorbcija Pasiskirstymas Metabolizmas Ekskrecija

 Gerai rezorbuojasi iš virškinamojo trakto.  Didţiausia koncentracija plazmoje susidaro po 1-2 val.  Intensyviai jungiasi su plazmos baltymais.  Patenka į sąnarių skystį.  Prasiskverbia per placentą.  Patenka į motinos pieną ir į CNS.  Daugiausia metabolizuojama kepenyse.  Daugiausia pašalima metabolitų pavidale per inkstus.

Visų NVNU veikimas yra panašus, tačiau skiriasi vaistų veikimo trukmė, stiprumas bei nepageidaujamų poveikių daţnumas [3]. Propiono rūgšties dariniai yra greitai absorbuojami, koncentracijos piką pasiekia per 1-2 valandas. Konkretaus vaisto skausmą malšinantis poveikis trunka nuo 2 iki 12 valandų. Propiono rūgšties dariniai labai gerai jungiasi su kraujo plazmos baltymais (99%), paprastai jungiasi prie albumino, kas uţtikrina vaisto pasiskirstymą po visą organizmą. Nuo 1973 m. ketoprofenas yra priešuţdegiminis vaistas, vartojamas skausmui malšinti ir karščiavimui maţinti. Jis yra vienas stipriausių prostaglandinų sintezės inhibitorių. Tokį poveikį nulemia (+)S-enantiomeras deksketoprofenas, o (-)R-(+)S-enantiomeras tokio poveikio neturi. Santykinis geriamojo 25 mg deksketoprofeno dozės biologinis pasisavinimas toks pat kaip 50 mg geriamojo ketoprofeno dozės. Išgėrus deksketoprofeno, didţiausia koncentracija plazmoje susidaro po 15 – 45 min., išgėrus ketoprofeno, didţiausia koncentracija plazmoje susidaro po 0,5 – 3 val. Ibuprofenas taip pat priklauso propiono rūgšties darinių grupei. Farmakokinetinės šių preparatų savybės lemia gerą jų absorbciją, nors, vaistus vartojant valgio metu, absorbcijos greitis maţėja, bet absorbuojama visa preparato dozė. Kaip ir visų NVNU, didţiausias šių preparatų trūkumas – neigiamas poveikis virškinamąjam traktui [13].

2.2.2. Propiono rūgšties darinių veikimo mechanizmas

Propiono rūgšties darinių kaip ir visų NVNU poveikis priklauso nuo jų sugebėjimo slopinti fermentą prostaglandino sintazę, ciklooksigenazę I ir II (COX I ir COX II), taip sumaţinant prostaglandinų sintezę. Ţinomos dvi ciklooksigenazės: COX-1 izofermentas dalyvauja sintezėje prostaglandinų, būtinų palaikant virškinamojo trakto gleivinės vientisumą, inkstų kraujotaką, homeostazę, jis paprastai randamas visuose audiniuose, ir COX-2 izofermentas dalyvauja prostaglandinų sintezėje

uţdegimo ţidinyje, turi įtakos inkstų hemodinamikai, nedideli jo kiekiai yra smegenyse, inkstuose, kauluose, kiaušidėse, gimdoje, trachėjos epitelyje ir plonosiose ţarnose. Svarbu tai, kad abi šios izoformos randamos ir endotelio ląstelėse, bet vyrauja COX-1. Propiono rūgšties dariniai priskiriami prie neselektyviųjų COX I ir COX II inhibitorių, todėl jie panašiai slopina abu fermentus. Veikimo mechanizmo esmė yra prostaglandinų sintezės sumaţinimas dėl ciklooksigenazės aktyvumo sumaţėjimo. Slopinamas arachidono rūgšties virsmas į prostaglandinus (PGE1, PGE2, PGF2, PGD2) ir tromboksano (TxA2) sintezė trombocituose [13].

2.2.3. Ibuprofenas

Remiantis IUPAC ibuprofenas yra (RS)-2-[4-(2-metilpropil)fenil]propano rūgštis priklausanti nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo, propiono rūgšties darinių klasei. Veiklioji medţiaga vartojama skausmui malšinti esant būklėms tokios kaip osteoartritas, artritas, patinę sąnariai, sausgyslių uţdegimas, apatinės nugaros dalies skausmas ir patempimai. Jis taip pat gali būti naudojamas danties, galvos skausmui ir po operaciniam skausmui malšinti [23].

Ibuprofeno fiziko-cheminės savybės. Balti, kristaliniai milteliai ar bespalviai kristalai. Tirpūs metanolyje, acetone, beveik netirpūs vandenyje [17].

Ibuprofenas yra optiškai aktyvi medţiaga, turinti S ir R izomerus. Rinkoje esantis vaistas turi vienodą santykį šių izomerų. Biologiškai aktyvus yra tik S izomeras, organizme fermentas

(2-arylpropionyl-CoA epimerase) paverčia R formą į veiklią S formą [34].

Ibuprofeno vartojimo rekomendacijos. Dozavimas priklauso nuo būklės ir amţiaus. Suaugusiųjų osteoartrito ir reumatoidinio artrito gydymui skiriama pradinė 400-800 mg dozė kas 6-8 valandas, rekomenduojama neviršyti 3200 mg per parą. Pacientai sergantys reumatoidiniu artritu vartoja didesnę dozę nei sergantis osteoartritu.

Lengvam ar vidutinio stiprumo skausmui malšinti (pvz, dantų skausmas, galvos skausmas), rekomenduojama dozė 200-400 mg kas 4-6 valandas. Vartojant didesne kartinę dozę nei 400 mg efektyvumas nepadidėja.

Karščiavimui rekomenduojama dozė yra 200 mg. Rekomenduojama ibuprofeno paros dozė suaugusiems yra 1200-1800 mg. Maksimali paros dozė yra 50 mg/kg.

Dozavimas pagal amţių arba svorį vaikams nuo 6 mėnesių iki 12 metų pateikiamas 2 lentelėje [36].

2 lentelė. Ibuprofeno dozavimas pagal amžių ir svorį

Amţius Svoris Dozė

6–11 mėnesiai 5–8 kg 50 mg 12–23 mėnesiai 8–10 kg 75 mg 2–3 metai 11–16 kg 100 mg 4–5 metai 16–21 kg 150 mg 6–8 metai 22–27 kg 200 mg 9–10 metai 27–32 kg 250 mg 11 metai 33–43 kg 300 mg

Nepageidaujami poveikiai vartojant ibuprofeną. Daţniausiai pasitaikantis neigiamas poveikis: pykinimas, dispepsija, virškinimo trakto opos/kraujavimas, padidėję kepenų fermentų kiekiai, viduriavimas, vidurių uţkietėjimas, kraujavimas iš nosies, galvos skausmas, galvos svaigimas, bėrimas, druskos ir skysčių susilaikymas ir hipertenzija.

Retai pasitaikantys nepageidaujami poveikiai yra: stemplės išopėjimas, širdies nepakankamumas, hiperkalemija, inkstų funkcijos sutrikimas, sumišimas ir bronchų spazmas [37].

Vartojant ibuprofeną didėja širdies ir kraujagyslių rizika. Lėtinis ibuprofeno naudojimas tiesiogiai koreliuoja su rizika hipertenzijai ir miokardo infarkto rizikai, ypač chroniškai vartojant

dideles dozes. Vyresnio amţiaus hipertenzija sergantiems pacientams, didelės ibuprofeno paros dozės ţymiai padidina sistolinį kraujospūdį [24].

Toksinis poveikis virškinimo traktui (pvz., kraujavimas, išopėjimas, perforacija), gali atsirasti su ar be perspėjančių simptomų. Didesnę riziką turi vyresnio amţiaus ligoniai, rūkantieji, alkoholiu piktnaudţiaujantys asmenys. Kartu vartojant protonų siurblio inhibitorius (pvz., omeprazolis) arba selektyvius COX-2 inhibitorius (pvz., celekoksibas) sumaţina šių nepageidaujamų reakcijų tikimybę [27].

Lietuvoje registruoti vaistiniai preparatai

Tabletės: Brufen 200, 400, 600, 800 mg, Butifen 400mg, Ibumax 200, 400, 600mg, Ibuprofen Polfa 200mg, Ibuprofen-Grindeks 200mg, Ibuprom 200,400 mg.

Geriamoji suspensija: Abfen 40mg/ml, Brufen 20mg/ml, Ibufanti 20mg/ml, Ibuprofen Inteli 100mg/5ml.

Gelis Deep Relief (ibuprofenas, levomentolis) 50mg/g, kremas Dolgit 5g/100g.

2.2.4. Ketoprofenas

IUPAC nurodo, kad ketoprofenas yra (RS)-2-(3-benzoylphenyl)propano rūgštis priklausanti nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo, propiono rūgšties darinių klasei. Veiklioji medţiaga vartojama raumenų ir skeleto ir sąnarių sutrikimams, tokiems kaip osteoartritas, ir reumatoidinis artritas, patinę sąnariai, sausgyslių uţdegimas. Taip pat naudojamas dismenorėjos, pooperacinio skausmo, skausmingoms ir uţdegiminėms ligoms, tokioms kaip ūminė podagra arba minkštųjų audinių sutrikimas ir siekiant sumaţinti karščiavimą [40].

Ketoprofeno fiziko-cheminės savybės. Balti, kristaliniai milteliai ar bespalviai kristalai. Tirpūs metanolyje, acetone, beveik netirpūs vandenyje [18].

Ketoprofeno vartojimo rekomendacijos. Dozavimas priklauso nuo būklės ir amţiaus. Suaugusiųjų osteoartrito ir reumatoidinio artrito gydymui skiriama pradinė 75mg dozė kas 4 valandas, rekomenduojama neviršyti 300mg per parą. Pacientai sergantys reumatoidiniu artritu vartoja tokią pačią dozę kaip ir sergantis osteoartritu.

Skausmui malšinti (pvz, dantų skausmas, galvos skausmas), rekomenduojama 25 iki 50 mg gerti kas 6 iki 8 valandas. Dozė gali būti didinama iki 75 mg.

Esant karščiavimui rekomenduojama 12,5 mg ketoprofeno dozę gerti kas 4 valandas [29]. Nepageidaujami poveikiai vartojant ketoprofeną. Daţnaiausiai pasitaikantis nepageidaujamas poveikis: dispepsija, pilvo pūtimas, pykinimas, vėmimas, dujų kaupimasis ţarnyne, viršutinės pilvo dalies deginimas.

Rečiau pasitaikantis nepageidaujamas poveikis: miokardo infarkto ir insulto neţymus padidėjimas, anemija, nemiga, dusulys, dermatitas, egzema, prakaitavimas, galvos skausmas, padidėjęs arterinis kraujo spaudimas [20, 31].

Lietuvoje registruoti vaistiniai preparatai Tabletės: Ketonal 150mg, Keto 50mg 100mg.

Gelis: Fastum 25mg/g, Ketoprofen sopharma 25mg/g, Begsan 25mg/g.

2.2.5. Ibuprofeno ir ketoprofeno tyrimo metodai

Nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo kiekybiniams ir kokybiniams parametrams įvertinti naudojamos įvairios instrumentinės analizės metodikos: konduktometrija, refraktometrija, potenciometrija. Chromatografiniai metodai: efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), dujų chromatografija, micelių elektrokinetinė chromatografija, kapiliarinė elektroforezė.

Chromatografija – cheminės analizės metodas, paremtas veikliųjų medţiagų pasiskirstymu tarp dviejų fazių. Chromatografinės analizės metodikos naudojamos medţiagų atskyrimui, identifikavimui ir kiekio nustatymui.

Plonasluoksnė chromatografija (PC) – chromatografijos rūšis, kai judrioji fazė yra tirpiklis ar tirpiklių mišinys juda stacionaria faze, inertiniu paviršiumi, plokštele padengta plonu tolygiu sorbento sluoksniu ir nėša tiriamąją medţiagą. Chromatografavimui pasibaigus, plokstelė dţiovinama ir ryškinama remiantis tiramųjų medţiagų savybėmis. Atlikus ryškinimą ant plokštelės matomos dėmės ir jų poslinkis nuo pradinės padėties - tai leidţia nustatyti pagrindinį kokybinį parametrą Rf . Metodas palyginus su ESC yra pigus, paprastas, tačiau maţiau jautrus.

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) - metodas kurio metu chromatografinis išskirstymas atliekamas mėginio tirpalą leidţiant per kolonėlę, kuri yra uţpildyta sorbentu. Analizės esmė yra ta, kad tiramojo mėginio medţiagos yra nevienodai giminingos sorbentui, todėl iš kolonėlės jie yra išplaunami skirtingu laiku. Pirmiausia išplaunamos medţiagos, kurios yra maţiausiai giminingos sorbentui, vėliausiai išplaunamos labiau giminingos. Išplautas medţiagas ir jų išplovimo laikus fiksuoja prie ESC sistemos prijungtas tam tikros rūšies detektorius (UV, MS, fotodiodų ir kiti). Chromatogramoje skirtingos medţiagos vaizduojamos skirtingomis smailėmis ir skirtingu jų sulaikymo laiku [14,15,19,26,33].

Moksliniuose straipsniuose daţniausiai pasitaikančios ESC sąlygos taikomos ibuprofenui: L1-ODS-1 kolonėlė (5 µm, 250 mm×4,6 mm ), tirpiklių sistema sudaryta iš metanolio-vandens (0,1 proc. TFA); kolonėlė C8 (150 × 4,6 mm, 5 μm), tirpiklių sistema sudaryta iš metanolio, acetonitrilo ir amonio acetato [10,32].

Moksliniuose straipsniuose daţniausiai pasitaikančios ESC sąlygos taikomos ketoprofenui: kolonėlė (250 mm × 4 mm, 5 μm), tirpiklių sistema sudaryta iš acto rūgšties, pašarmintos 0,1N NaOH tirpalu iki pH 4 su 35 proc. acetonitrilo; kolonėlė (125 mm × 4 mm, 5 μm), tirpiklių sistema sudaryta iš acetonitrilo, vandens ir fosfatinio buferio su pH 4 (40:58:2, v/v/v) [16,43].

Remiantis Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų Farmakopėjos straipsniais, ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybiniam nustatymui taikomos potenciometrinio titravimo ir tiesioginio titravimo naudojant indikatorius metodikos [17,18].

Potenciometrija yra elektrocheminės analizės metodas, pagrįstas elektrovaros jėgos matavimu tarp indikatorinio elektrodo ir palyginamojo elektrodo, panardinto į tiriamąjį tirpalą. Potenciometrinė analizė pagrįsta elektrinio potencialo šuolio, atsirandančio tarp tirpalo ir į jį panardinto elektrodo, matavimu. Šis šuolis, paprastai vadinamas elektrodo potencialu, priklauso nuo jonų aktyvumo tirpale ir nuo cheminių reakcijų metu kintančių elektrocheminių tirpalo savybių.

Potenciometrija skirstoma į dvi rūšis:

 Tiesioginė potenciometrija dar kitaip vadinama jonometrija

 Netiesioginė potenciometrija vadinama potenciometrinis titravimas

Tiesiogines potenciometrijos analizės metu sudaroma elektrodinaminė matavimo grandinė iš indikatorinio ir palyginamojo elektrodų. Indikatorinis elektrodas parenkamas toks, kad būtų selektyvus tam tikriems jonams ir jo potencialas priklausytų nuo tiriamųjų jonų aktyvumo. Palyginamasis (etaloninis) elektrodas yra pastovaus potencialo. Elektrodai dedami į tiriamąjį tirpalą ir matuojama elektrovaros jėga.

Netiesioginės potenciometrijos analizės metu tiriamasis tirpalas titruojamas pasirinktu titrantu ir stebimas potencialo šuolis atsirandantis tarp tiriamojo tirpalo ir į jį panardinto elektrodo. Įvykus potencialo šuoliui nustatomas ekvivalentinis taškas, tai parodo titravimo pabaigą. Potenciometrinis titravimas yra pranašesnis uţ tiesioginę potenciometriją, nes gaunami rezultatai yra tikslesni ir pati analizė yra trumpesnė. Palyginus su titrimetrine analize potenciometrinis titravimas yra pranašesnis tuo, kad galima tirti spalvotus, drumstus ar labai praskiestus tirpalus, analizei atlikti nereikia naudoti indikatorių. Tiriamojo junginio koncentracija apskaičiuojama greitai ir nenaudojant sudėtingų skaičiavimų.

Analizę galima atlikti naudojant automatinius potenciometrinius titratorius, kurie nustatytomis salygomis atlieka analizę automatizuotai ir nustato ekvivalentinį tašką, todėl išvengiama ţmogiškųjų klaidų galimybė [9].

Nustačius ekvivalentinį tašką ir turint titravimui sunaudotą titranto tūrį, apskaičiuojamas medţiagos kiekis pagal chemines formules. Panaudojant formulę apskaičiuojamas reagento titras:

𝑇𝑟 𝑥 =

𝐶𝑁(𝑟)× 𝐸𝑥

1000

- reagento titras pagal nustatomą medţiagą

- reagento tirpalo ekvivalentų molinė koncentracija - nustatomos medţiagos ekvivalentų molio masė

Pagal formulę apskaičiuojama medţiagos koncentracija:

Ax – nustatomos medţiagos koncentracija - reagento titras pagal nustatomą medţiagą Vr – titruojant sunaudotas reagento tūris [44]

Tiesioginė titrimetrinė analizė taikant indikatorius. Taikant tiesioginį titravimą naudojant indikatorius yra vienas seniausių kiekybinės analizės metodų. Metodo principas yra pagrįstas

ekvivalentų dėsniu, kai analizuojama medţiaga reaguoja su parinktu reagentu tiksliais ekvivalentiniais kiekiais.

Kiekybinė analizė atliekama naudojant kolbą, biuretę ir matavimo pipetę. Tikslus analizuojamos medţiagos tirpalo kiekis, pipetės pagalba, perkeliamas į kolbą ir titruojamas biuretėje esančiu tikslios koncentracijos reagentu iki pasiekiamas ekvivalentinis taškas. Pasiektas ekvivalentinis taškas nurodo, kad suvartoto reagento kiekis yra lygus kolboje buvusios analizuojamos medţiagos ekvivalentų kiekiui [28].

Ekvivalentinio taško nustatymas yra sudėtingas titravimo etapas. Daţniausiai ekvivalentiniam taškui nustatyti naudojami indikatoriai, bet priklausomai nuo reaguojančių medţiagų, galima naudoti ir pH-metrus, ampermetrus ar spektrometrus. Indikatoriai tai medţiagos, kurios reaguoja su analizuojamu junginiu arba su reagentu ir sudaro spalvinius junginius. Priklausomai nuo indikatoriaus, pasiekus ekvivalentinį tašką, esantis tirpale indikatorius sureaguoja su reagento pertekliumi ir pasikeičia tirpalo spalva. Įvykus spalvos pasikeitimui, titravimas nutraukiamas ir nustatomas tikslus kiekis reagento naudoto titravimui.

3. TYRIMO METODIKA

3.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektai - nereceptiniai nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo Ibuprom 400 mg ir Ketonal 150 mg, įsigyti Lietuvos vaistinėse. Vaistų forma – geriamosios tabletės. Tiriamųjų tablečių sudėtis pateikiama 3 lentelėje.

3 lentelė. Tiramųjų tablečiųIbuprom 400 mg ir Ketonal 150 mg sudėtis

3.2.Tyrimo planavimas

Ibuprofeno ir ketoprofeno veikliųjų medţiagų atskyrimui, identifikavimui ir kiekio nustatymui tiriamosiose tabletėse buvo apţvelgta mokslinė literatūra. Taikytas potenciometrinis titravimas ir tiesioginis titravimas taikant indikatorius pagal Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjose pateiktas metodikas. Ibuprofenui taikytas potenciometrinis titravimas aprašytas Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje ir Europos farmakopėjoje aprašytas tiesioginis titravimas taikant indikatorius. Ketoprofenui taikytas potenciometrinis titravimas aprašytas Europos farmakopėjoje ir tiesioginis titravimas taikant indikatorius aprašytas Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje. Remiantis moksliniais šaltiniais, optimizuotas ir validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas veikliųjų medţiagų mišiniui atskirti, identifikuoti ir kiekybiškai vertinti. Palyginus gautus tyrimų rezultatus paaiškėjo, kad šis efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra tikslus, greitas, tinkamas medţiagų mišiniui atskirti, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui.

Pavadinimas

Ibuprom 400mg

Ketonal 150mg

Veiklioji meždiaga Ibuprofenas 400mg Ketoprofenas 150mg

Pagalbinės medţiagos Kukurūzų krakmolas, povidonas,

mikrokristalinė celiuliozė, kroskarmeliozės natrio druska, stearino rūgštis, bevandenis koloidinis silicio dioksidas. Tabletės

plėvelė: karnaubo vaškas, daţiklis Opadry II White33G 28707 (hipromeliozė, titano dioksidas (E171), makrogolis 3000, laktozės monohidratas, triacetinas).

Magnio stearatas, bevandenis koloidinis silicio dioksidas, povidonas, mikrokristalinė celiuliozė, hipromeliozė E464.

3.3. Titrimetrinė ibuprofeno ir ketoprofeno analizė

Titrimetrinė ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinė analizė atlikta taikant du titravimo metodus - tiesioginį titravimą taikant indikatorius ir automatinį potenciometrinį titravimą.

3.3.1. Aparatūra ir reagentai

Potenciometriniam titravimui naudota:

 Schott Titroline easy automatinis titratorius ir pH matuoklis (Mainz, Germany) (3 pav.)  Kombinuotas stiklo ir sidabro chlorido elektrodas.

 Naudotas titrantas 0,1 N natrio hidroksido tirpalas

3 pav. Automatinis titratorius “Schott Titroline easy” [41]

Tiesioginiam titravimui su indikatoriais taikyta:

 Laboratorinė įranga: biuretė, matavimo kolba, stovas, svarstyklės  Indikatoriai: fenolftaleinas, fenolio raudonasis

3.3.2. Standartinių tirpalų paruošimas titrimetrinei analizei

Ruošiamas ibuprofeno standartinis tirpalas. Atsveriama 450 mg ibuprofeno, jis perkeliamas į 100 ml tūrio kolbutę. Ištirpinamas 50 ml etanolyje nuolatos maišant.

Paruošiamas ketoprofeno standartinis tirpalas. Atsveriama 200 mg ketoprofeno, jį perkeliame į 100 ml tūrio kolbutę. Ketoprofenas ištirpinamas 25 ml etanolio ir 25 ml vandens mišinyje nuolatos maišant.

3.3.3. Vaistinių preparatų tirpalų paruošimas titrimetrinei analizei

Ibuprofeno tiriamąjam tirpalui paruošti imama 2-ejų sutrintų tablečių masė (1,300 g). Atsveriama masė atitinkanti 450 mg ibuprofeno 0,733 g (tikslus svoris), masė perkeliama į 100 ml tūrio kolbą ir tirpinama 50 ml etanolyje. Kolba dedama į ultragarso vonelę 10-čiai minučių geriasniam ištirpimui. Prieš titravimą tirpalas nufiltruojamas pro popierinį filtrą.

Ketoprofeno tiriamąjam tirpalui paruošti imama 2-ejų sutrintų tablečių masė (0,55 g). Atsveriama masė atitinkanti 200 mg ketoprofeno 0,366 g (tikslus svoris), masė perkeliama į 100 ml tūrio kolbą ir tirpinama 25 ml etanolio ir 25 ml vandens mišinyje nuolatos maišant. Kolba dedama į ultragarso vonelę 10-čiai minučių geriasniam ištirpimui. Prieš titravimą tirpalas nufiltruojamas pro popierinį filtrą.

3.3.4. Titrimetrinė analizė

Titrimetrinė ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinė analizė atlikta taikant tiesioginį titravimą su indikatoriais ir automatinį potenciometrinį titravimą. Ibuprofenas ir ketoprofenas tirti kaip silpnos rūgštys, naudota neutralizacijos reakcija, kiekvienas tirpalas buvo titruojamas 0,1 N NaOH tirpalu. Naudoti lyginamieji tirpalai pagaminti iš ibuprofeno ir ketoprofeno standartų. Taikant tiesioginį titravimą tirpalai titruojami iki spalvos pasikeitimo. Taikant potenciometrinį titravimą tirpalai titruoti iki įvyksta elektrinio potencialo šuolis, atsirandantis tarp tirpalo ir į jį panardintų elektrodų, potencialo šuolis nurodo titravimo pabaigą. Tyrimas kartotas penkis kartus (n=5). Gauti rezultatai palyginti.

3.4. ESC metodikos optimizavimas

3.4.1. Aparatūra ir priedai

• ESC chromatografas: Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, USA) (4 pav.) • ESC kolonėlė: 150 × 4,6 mm, 3 μm ACE18 kolonėlė (Advanced Chromatography Technologies, Scotland)

• Detektorius: fotodiodų matricos detektorius Waters 996 (Waters Corporation, Milford, USA) • Programinė įranga: Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, USA)

4 pav. ESC chromatografas „Waters 2695”

3.4.2. Reagentai

 Acetonitrilas (grynumas ≥ 99.9 proc., Sigma-Aldrich Corporation, Germany)

 Trifluoracto rūgštis 0.1 proc., (grynumas ≥ 99 proc., Sigma-Aldrich Corporation, Germany)  Dejonizuotas vanduo, gaminamas laboratorijoje (Millipore, USA)

Smailių identifikavimui eksperimente buvo naudojami ibuprofeno ir ketoprofeno standartai :  Ibuprofenas (grynumas ≥ 97 proc., Sigma-Aldrich Corporation, Germany)

3.4.3. Standartinių tirpalų paruošimas ESC analizei

Atsveriama po 50 mg ibuprofeno ir ketoprofeno, jie perkeliami į 100 ml tūrio kolbutes. Medţiagos ištirpinamos įpylus nedidelį kiekį metanolio nuolat maišant. Kiekvienoje kolbutėje tirpalai skiedţiami metanoliu iki ţymės. Kolbutės dedamos į ultragarso vonelę 10-čiai minučių. Prieš injekuojant į ESC sistemą tirpalai filtruojami pro 0,22 μm nailoninius švirkštinius filtrus (diametras - 13 mm, Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany).

3.4.4. Vaistinių preparatų tirpalų paruošimas ESC analizei

Ibuprofeno tiriamąjam tirpalui imama vienos sutrintos tabletės turinys (0,680 g). Atsveriama masė atitinkanti 100 mg ibuprofeno 0,17 g (tikslus svoris), masė perkeliama į 100 ml tūrio kolbą ir tirpinama 100 ml metanolyje. Kolba dedama į ultragarso vonelę 10-čiai minučių geriasniam išmaišymui. Prieš injekuojant į ESC sistemą tirpalas filtruojamas pro 0,22 μm nailoninį švirkštinį filtrą (diametras - 13 mm, Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany).

Ketoprofeno tiriamąjam tirpalui imama vienos sutrintos tabletės turinys (0,290 g). Atsveriama masė atitinkanti 100 mg ketoprofeno 0,193 g (tikslus svoris), masė perkeliama į 100 ml tūrio kolbą ir tirpinama 100 ml metanolyje. Kolba dedama į ultragarso vonelę 10-čiai minučių geriasniam išmaišymui. Prieš injekuojant į ESC sistemą tirpalas filtruojamas pro 0,22 μm nailoninį švirkštinį filtrą (diametras - 13 mm, Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany).

3.4.5. ESC metodikos optimizavimas tiriamoms vaistinėms medţiagoms

Vaistinių preparatų analizė atlikta Waters 2695 chromatografu ir fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA. Veikliųjų medţiagų atskyrimui naudota 150 mm ilgio, 4,6 mm skersmens, 3 μm dalelių dydţio ACE18 kolonėlė. Termostate palaikyta pastovi 25º C temperatūra. ESC schema vaizduoja 5 paveikslas. Analizėje naudotas injekcijos tūris - 10 μl tiriamojo tirpalo. Judrios fazės tėkmės greitis – 1,0 ml/min. Taikyta dviejų eliuentų gradientinė sistema: išgrynintas vandenuo parūgštinto fosforo rūgštimi iki pH 2,5 (A) ir acetonitrilas (B). Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo laikus bei UV absorbcijos spektrus 210 – 400 nm intervalo ribose sutapimus.

5 pav. Efektyviosios skysčių chromtografijos schema[12]

3.5. ESC metodikos validacija

Norint taikyti ESC metodiką, privaloma ją validuoti. Metodikos validavimas – tai proceco patvirtinimas, kuris uţtikrina aukštą patikimumą. Metodikos validacija atliekama pagal pasirinktus validacijos parametrus, tinkančius konkrečiam prietaisui, procedūrai ar kt., remiantis mokslinių gairių rekomendacijomis (pvz., “FDA Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods, 2014”). Šiuo atveju ESC metodikai validuoti parinkti tokie parametrai :

 Specifiškumas  Glaudumas

 Metodo aptikimo riba  Metodo nustatymo riba  Tiesiškumas

Vertinant ESC metodo specifiškumą, lyginamos analičių ir etaloninių tirpalų chromatogramos, chromatografinių smailių sulaikymo laikai. Sutapus analičių ir standartų specifiškumo parametrams, metodas vertinamas kaip specifiškas.

Rezultatų glaudumas yra nustatomas įvertinus metodikos pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą. Pakartojamumas įrodomas nustatytomis sąlygomis, atliekant šešis to pačio mėginio matavimus, naudojant identifikuotų smailių sulaikymo laikus, smailių plotų vidurkius ir standartinį nuokrypį, skaičiuojant santykinį standartinį nuokrypį (SSN) (angl. RSD proc. arba CV proc.). Tarpinis preciziškumas įrodomas nustatytomis sąlygomis, atliekant analizę skirtingomis dienomis. Vaistiniams preparatams santykinis standartinis nuokrypis netūrėtų būti didesnis nei 5 proc.

Tiesiškumas – tai gebėjimas gauti rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi tiriamo junginio koncentracijai analizuojamame mėginyje [4]. ESC metodikos validavimo metu, smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos turi būti tiesiška visiems tiriamiesiems junginiams analizuojamame koncentracijų intervale. Visų komponentų koreliacijos koeficientų R2 vertės privalo būti artimos vienetui. Tuomet tiesiškumas atitinka keliamus reikalavimus ir remiantis šiuo kriteriju, metodas yra tinkamas kiekybiniam tyrimui [21,42].

3.6. Statistinis duomenų vertinimas

Duomenys statistiškai įvertinti naudojant kompiuterines programas „SigmaPlot 12.5“ (Systat Software Incorporation, JAV) ir „MS Excel 2007“ (Microsoft Corporation, JAV). Pateikiami duomenys išraiška vidurkis ± vidutinė kvadratinė paklaida. Įvertintas statistinių hipotezių patikimumas (p˃0,05).

4. REZULTATAI

Tyrimo metu naudotos Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjų metodikos ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinei sudėčiai tirti. Europos farmakopėjoje ibuprofenui taikomi indikatorinis titravimo analizės metodas, o ketoprofenui potenciometrinio titravimo analizės metodas. Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje ibuprofenas analizuojamas pagal potenciometrinį titravimo metodą, o ketoprofenas pagal indikatorinį titravimo metodą. Tyrimo metu remtasi skirtingomis metodikomis, siekiant palyginti rezultatus ir nustatyti, kuri iš taikytų metodikų yra pranašesnė. Atlikus mokslinių šaltinių analizę, ibuprofeno ir ketoprofeno identifikavimui ir kiekio nustatymui, optimizuotas ir validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Atlikta statistinė rezultatų analizė parodė, kad efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra tinkamas ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinei analizei.

4.1. Titrimetrinė analizė

Ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinei sudėčiai tirti buvo atlikti titravimai naudojant Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjines metodikas. Palyginti tokie metodikų parametrai: rezultatų tikslumas ir išbarstymas.

Siekiant įvertinti vaistinės medţiagos koncentracijų pokyčius tiriant skirtingomis metodikomis, buvo analizuojami tirpalai iš vaistinių preparatų ir jų standartų. Duomenys sisteminti, titruojant kiekvieną mėginį penkis kartus.

4.1.1. Potenciometrinis titravimas

Norint geriau įvertinti automatizuoto potenciometrinio titravimo metodo kiekybinius nustatymo parametrus buvo nustatyta tiriamojo tirpalo koncentracija ir standartinio tirpalo koncentracija. Gauti duomenys palyginti.

Naudojant automatizuotą potenciometrinį titravimo metodą, nustatytos ketoprofeno tiriamojo tirpalo ir standartinio tirpalo koncentracijos. Tyrimas kartotas penkis kartus. Rezultatų vidurkiai pateikti 6 paveiksle.

6 pav. Ketoprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų koncentracijos, gautos taikant automatizuotą potenciometrinį titravimą

Tiriamąjam ir standartiniam tirpalams ruošti buvo imta po 200 mg ketoprofeno, kas atitinka (0,366 g) tablečių masės. Atlikus potenciometrinį titravimą, gautos maţesnės ketoprofeno

koncentracijos reikšmės, tačiau yra leistinose ribose. Tiriamojo ketoprofeno tirpalo koncentracija nustatyta didesnė uţ standartinio tirpalo koncentraciją. Statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p ˃ 0,05).

Naudojant automatizuotą potenciometrinį titravimo metodą, nustatytos ibuprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų koncentracijos. Tyrimas kartotas penkis kartus, rezultatų vidurkis pateikiamas 7 paveiksle.

7 pav. Ibuprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų koncentracijos, gautos taikant automatizuotą potenciometrinį titravimą

Tiriamąjam ir standartiniam tirpalams ruošti buvo imta po 450 mg ibuprofeno, kas atitinka (0,733 g) tablečių masės. Atlikus potenciometrinį titravimą, gautos maţesnės ibuprofeno

koncentracijos reikšmės, tačiau yra leistinose ribose. Tiriamojo ibuprofeno tirpalo koncentracija nustatyta maţesnė uţ standartinio tirpalo koncentraciją. Statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p ˃ 0,05).

Tokie ibuprofeno ir ketoprofeno koncentracijų skirtumai tarp tiriamojo ir standartinio tirpalų tiriant juos potenciometriškai galėjo atsirasti dėl leidţiamų koncentracijos nukrypimų tabletėse (±5 proc.), netenkant dalies vaistinės medţiagos ruošiant tirpalus, svarstyklių paklaidų, įrenginio paklaidos [45].

4.1.2. Tiesioginis titravimas taikant indikatorius

Nustatant veikliosios medţiagos koncentraciją taikant tiesiogini titravimą su indikatoriumi buvo titruoti tiriamasis ir standartinis tirpalai, jų rezultatai palyginti ir nustatyta ar rezultatų skirtumai yra statistiškai reikšmingi.

Naudojant tiesiogini titravimo metodą taikant indikatorius, nustatytos ketoprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų koncentracijos. Tyrimas kartotas penkis kartus, apskaičiuotas rezultatų vidurkis. (8 pav.).

8 pav. Ketoprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų koncentracijos, gautos taikant tiesioginį titravimą su indikatoriumi

Tiriamąjam ir standartiniam ketoprofeno tirpalams ruošti buvo imta po 200 mg veikliosios medţiagos, kas atitinka (0,366 g) tablečių masės. Atlikus tiesioginį titravimą naudojant indikatorius, gautos maţesnės ketoprofeno koncentracijos reikšmės, tačiau jos yra leistinose ribose. Nors nustatyta tiriamojo ketoprofeno tirpalo koncentracija didesnė uţ standartinio tirpalo koncentraciją, statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p ˃ 0,05).

Naudojant tiesioginį titravimo metoda taikant indikatorius, nustatytos ibuprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų koncentracijos (9 pav.).

9 pav. Ibuprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų koncentracijos, gautos taikant tiesioginį titravimą su indikatoriumi

Tiriamąjam ir standartiniam ibuprofeno tirpalams ruošti buvo imta po 450 mg veikliosios medţiagos, kas atitinka (0,733 g) tablečių masės. Atlikus tiesioginį titravimą naudojant indikatorius, gautos maţesnės ibuprofeno koncentracijos reikšmės, tačiau yra leistinose ribose. Nustatyta tiriamojo ibuprofeno tirpalo koncentracija didesnė uţ standartinio tirpalo koncentraciją, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p ˃ 0,05).

Atliekant potenciometrinius ir indikatorinius titravimus, gauti veikliosios medţiagos koncentracijų skirtumai tarp ibuprofeno ir ketoprofeno tiriamojo ir standartinio tirpalų. Šie koncentracijų skirtumai galėjo atsirasti dėl nevienodo spalvinio titravimo pabaigos nustatymo, leidţiamų koncentracijos nukrypimų tabletėse (± 5 proc.), netenkant dalies vaistinės medţiagos ruošiant tirpalus, svarstyklių paklaidos [45].

4.1.3. Titravimo rezultatų palyginimas

Atlikus ketoprofeno ir ibuprofeno titravimus, sudarytas tiriamųjų tirpalų grafinis rezultatų palyginimas.

Ketoprofeno tiriamojo tirpalo kiekybinės analizės rezultatai taikant tiesioginį titravimą su indikatoriumi ir automatizuotą potenciometrinį titravimą pateikiami(10 pav.).

10 pav. Ketoprofeno tiriamojo tirpalo rezultatų palyginimas pagal medžiagos koncentracija (mg)

Ibuprofeno tiriamojo tirpalo kiekybinės analizės rezultatai taikant tiesioginį titravimą su indikatoriumi ir automatizuotą potenciometrinį titravimą pateikiami (11 pav.).

11 pav. Ibuprofeno tiriamojo tirpalo rezultatų palyginimas pagal medžiagos koncentracija (mg)

182 184 186 188 190 192 1 2 3 4 5 Ket o p ro fe n o k o n ce n tra ci ja (m g) Mėginio numeris Tiesioginis titravimas su indikatoriumi Automatizuotas potenciometrinis titravimas 436 438 440 442 444 446 448 1 2 3 4 5 Ib u p ro fe n o k o n ce n tra ci ja (m g) Mėginio numeris Tioesioginis titravimas su indikatoriumi Automatizuotas potenciometrinis titravimas

A

B

C

4.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos optimizavimas

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos optimizavimas ir pradinių sąlygų pasirinkimas atliktas remiantis moksliniame literatūros šaltinyje aprašyta metodika ir Europos Farmakopėjos 01/2008:0821 straipsnio rekomendacijomis [35]. Atliekant metodikos optimizavimą pakeista: kolonelė, gradientinė sistema, injekavimo tūris, detektorius. Naudota 150 mm ilgio, 4,6 mm pločio ir 3 μg dalelių dydţio ACE 18 kolonėlė. Judri fazė: fosforo rūgšties-acetonitrilo tirpalo pH 2,5(eliuentas A) ir 99,9 proc. Acetonitrilas (eliuentas B). Optimizuotas injekcijos tūris - 10 μl. Naudotas diodų matricos detektorius, kurio pagalba uţrašytas junginių UV absorbciniai spektrai ir sulaikymo laikas, pagal juos atliktas junginių identifikavimas ir pagrįstas metodo specifiškumas.

4.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija

Metodikos validacija atlikta pagal pasirinktus validacijos parametrus:  Specifiškumas

 Glaudumas

 Metodo aptikimo riba  Metodo nustatymo riba  Tiesiškumas

4.3.1. Specifiškumas

Chromatografinės smailės atitinka atskirus junginius. Vertinant specifiškumą lygintos analičių ir etaloninių tirpalų chromatogramos, chromatografinių smailių sulaikymo laikai. Sutapus analičių ir standartų specifiškumo parametrams, metodas vertintas kaip specifiškas.

Vertinant šios metodikos galimybes tirti ibuprofeną ir ketoprofeną kaip vaistų mišinį, pateikiama tiriamojo mėginio chromatograma, pagalbinių medţiagų chromatograma ir tirpiklio chromatograma (12-15 pav.).

12 pav. Tiriamojo mėginio, pagalbinių medžiagų ir tirpiklio chromatograma 1-ketoprofenas, 2-ibuprofenas.

Chromatogramoje matyti, kad mėginių paruošimui naudotas tirpiklis ir tabletėse esančios pagalbinės medţiagos veikliųjų medţiagų chromatogramos būvimo vietoje atsako nesukelia, todėl jos neturi įtakos analizuojamų veikliųjų medţiagų nustatymui. Tai patvirtina pasirinkto metodo specifiškumą.

AU 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 Minutes 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00

13 pav. Etaloninio junginio chromatograma (ketoprofenas) (λ=270 nm)

AU 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 Minutes 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

15 pav. Ketoprofeno ir ibuprofeno analičių chromatograma (λ=270 nm) 1 – ketoprofenas, 2 – ibuprofenas

Chromatogramose matome, kad pagal sulaikymo laiką, tiriamojo mėginio smailės sutampa su etaloninio tirpalo smailėmis, todėl galima teigti, kad jos yra tapačios. Taip pat matyti, kad mėginių paruošimui naudotas tirpiklis ir tablečių sudetyje esančios pagalbinės medţiagos tiriamąjame spektre atsako nesukelia. Galima teigti, kad pagalbinės medţiagos ir tirpiklis veikliųjų medţiagų nustatymui įtakos neturi.

16 pav. Ketoprofeno UV spektrų palyginimas (A – tyrimo metu gautas

17 pav. Ibuprofeno UV spektrų palyginimas (A – tyrimo metu gautas

ibuprofeno spektras, B – mokslinės literatūros šaltinyje [30] pateiktas ibuprofeno spektras

Tyrimo metu gauti ketoprofeno (16 pav.) ir ibuprofeno (17 pav.) spektrai palyginti su moksliniuose straipsniuose pateiktais spektrais. Gautame ketoprofeno spektre maksimumas matomas prie 254 nm bangos ilgio, lyginamąjame ketoprofeno spektre maksimumas matomas prie 260 nm bangos ilgio. Gautame ibuprofeno spektre maksimumas matomas prie 258 nm bangos ilgio, lyginamąjame ibuprofeno spektre maksimumas matomas prie 257 nm bangos ilgio.

Įvertinus chromatogramų ir spektrų sutapimus galima daryti išvadą, kad metodas yra specifiškas.

4.3.2. Rezultatų glaudumas

Rezultatų glaudumas nustatytas įvertinus metodikos pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą.

Pakartojamumas įrodytas nustatytomis sąlygomis, atlikus šešis to pačio mėginio matavimus, naudojant identifikuotų smailių sulaikymo laikus, smailių plotų vidurkius ir standartinį nuokripį, skaičiuojant santykinį standartinį nuokrypį (SSN) (angl. RSD proc. arba CV proc.) (4 lentelė, 18 pav.). 4 lentelė. Analičių variacijos koeficientai (proc.) sulaikymo laikui ir smailės plotui

Analitė SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.)

Ketoprofenas 0,16 0,1

18pav. Ketoprofeno(1) ir ibuprofeno(2) glaudumo rezultatai

Iš lentelėje pateiktų duomenų matyti, kad santykinis standartinis nuokrypis, tiek sulaikymo laikui tiek smailės plotui, neviršija minimalių 5 proc. reikalavimų, taip įrodomas metodo pakartojamumas.

Tarpinis preciziškumas įrodytas nustatytomis sąlygomis, atlikant analizę dvi dienas iš eilės naudojant tą patį mėginį. Tyrimo rezultatai pateikti 5 lentelėje.

5 lentelė. Analičių variacijos koeficientai (proc.) sulaikymo laikui ir smailės plotui

Analitė SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.)

Ketoprofenas 1,9 0,2

Ibuprofenas 2,7 1,1

Iš lentelėje pateiktų duomenų matome, kad santykinis standartinis nuokrypis, tiek sulaikymo laikui tiek smailės plotui, neviršija 5 proc.

Įvertinus ESC metodo pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo santykinio standartinio nuokrypio reikšmes matome, kad metodas atitinka minimalius glaudumo reikalavimus ir todėl yra tinkamas kiekybiniam ibuprofeno ir ketoprofeno nustatymui.

3.2.3 Aptikimo ir nustatymo ribos

ESC metodo validacijos metu nustatyta tiriamųjų medţiagų – ibuprofeno ir ketoprofeno analičių aptikimo ir nustatymo ribos (6 lentelė.). Aptikimo riba tai maţiausias kiekis veikliosios medţiagos, kuris gali būti aptinkamas mėginyje. Remiantis ICH gairėmis, aptikimo ribos teigiamas įvertinimas pasiekiamas kai analitės smailė viršija triukšmo lygį bent du kartus. Nustatymo riba tai maţiausias veikliosios medţiagos kiekis, kuris gali būti nustatomas kiekybiškai mėginyje.[42]

6 lentelė. Ketoprofeno ir ibuprofeno aptikimo ir nustatymo ribos

Aptikimo riba (μg/ml) Nustatymo riba (μg/ml)

Ketoprofenas 0,11 0,37

Ibuprofenas 0,921 3,07

Ibuprofeno ir ketoprofeno aptikimo ribos atitiko keliamus reikalavimus, nes analitės smailė viršijo triukšmo lygį bent du kartus.

4.3.4. Tiesiškumas

Tiesiškumui įvertinti sudarytas gradavimo grafikas. Gradavimo grafikams sudaryti buvo naudojami tiriamieji tirpalai, kurie pagaminti iš susmulkintos tablečių masės. Kalibracinė kreivė nubrėţta iš penkių skirtingos koncentracijos taškų. Ibuprofeno ir ketoprofeno kalibracinės kreivės sudarytos iš penkių taškų (19 ir 20 pav.).

Iš gauto ketoprofeno kalibracinės kreivės matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale.

20 pav. Ibuprofeno gradavimo grafikas

Iš gauto ibuprofeno kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos taip pat yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale.

Analizuojama medţiaga Sulaikymo laikas (min) Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml) Ketoprofenas 8,029 0.9983 Y=3.36×107 x-7.47×105 0.0156-1 Ibuprofenas 18,787 0.9978 Y=2.42×107 x-6.44×105 0.0198-1 7 lentelė. Analičių kalibracinių kreivių charakteristikos

Analizuojamų junginių gradavimo grafikų koreliacijos koeficientai didesni nei 0.99. Remiantis šiuo rodikliu, galima teigti, kad metodas atitinka tiesiškumo parametrus.

5. REZULTATŲ APTARIMAS

Taikant potenciometrinio titravimo, tiesioginio titravimo naudojant indikatorius ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus, įvertintus ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinius parametrus nustatyta, kad taikyti potenciometrinio titravimo metodą kiekybinei analizei yra tikslinga, nes analizės procesas neuţtrunka ilgai, gaunami rezultatai yra tikslūs, procesas yra automatizuotas todėl sumaţėja klaidų tikimybė. Atlikenat kiekybinę ibuprofeno analizę, taikant potenciometrinį titravimą, nustatyta, kad veikliosios medţiagos kiekis svyravo nuo 1 proc. iki 2 proc. nuo pradinės koncentracijos. 2012 metais buvo atliktas panašus mokslinis tyrimas, jo metu potenciometriniu metodu kiekybiškai tirtas ibuprofenas vaistuose ir geriamąjame vandenyje. Mėginys buvo paruošiamas imant 0,2283 g ibuprofeno reagento, patalpinant jį į 100 ml kolbą ir praskiedţiant iki ribos. Atlikus tyrimą, nustatytas medţiagos kiekis svyravo nuo 3 proc. iki 5 proc. nuo pradinės koncentracijos [39].

Kokybiškai įvertinti naudojama optimizuota ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, kuri pasiţymi tikslumu, jautrumu, gaunami rezultatai yra patikimi ir atkartojami. Chromatografavimo sąlygos: kolonėlės parametrai –3 µm 150 mm×4,6 mm, injekcijos tūris - 10 µL, detektorius – fotodiodų matricos Waters 996. Atliekant kokybinę ibuprofeno ir ketoprofeno analizę, nustatyti medţiagų chromatografiniai smailiai ir jų sulaikymo laikas: ibuprofeno sulaikymo laikas 18,025 min, ketoprofeno sulaikymo laikas 8.029min.

2014 metais atliktas mokslinis tyrimas, kuriame efektyviosios skysčių chromatografijos pagalba nustatinėjama ibuprofeno koncentracija geriamojo vandens mėginiuose. Analizuojamieji tirpalai gauti iš septynių skirtingose vietose paimtų geriamojo vandens mėginių. Palyginamieji tirpalai gaminti iš ibuprofeno standarų - 1000 µg mL−ibuprofeno tirpinama fosfatiniame buferyje iki pH 7. Chromatografavimo sąlygos: kolonėlės parametrai - 5 µm, 250 mm×4,6 mm, injekcijos tūris - 20 µL, detektorius UV 730D. Palyginant su tirpalais iš standarų, mėginių chromatogramose matyti daugiau medţiagų pikų, bet ibuprofeno pikas aiškiai matomas prie 10.25min sulaikymo laiko [16].

6. IŠVADOS

1. Atlikus ibuprofeno kiekybinį įvertinimą, nustatyta, kad tiriant Europos farmakopėjoje aprašytu tiesioginiu titravimu taikant indikatorius gaunami rezultatai: tiriamojo tirpalo 440,6 mg, standartinio tirpalo 440,3 mg. Tiriant Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje aprašytu potenciometrinio titravimo metodu gaunami rezultatai: tiramojo tirpalo 447,13 mg, standartinio tirpalo 448,13 mg.

2. Atlikus ketoprofeno kiekybinius tyrimus nustatyta, kad tiriant Europos farmakopėjoje aprašytu potenciometrinio titravimo metodu gaunami rezultatai: tiriamojo tirpalo 190,75 mg, standartinio tirpalo 188,75 mg. Tiriant Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje aprašytu tiesioginiu titravimu taikant indikatorius gaunami rezultatai: tiriamojo tirpalo 185,5 mg, standartinio tirpalo 184,025mg.

3. Remiantis literatūros apţvalga optimizuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ibuprofeno ir ketoprofeno mišiniui atskirti ir įvertinti kiekybiškai. Taikant šią metodiką, pastebėtos praktinės galimybės efektyviai nustatyti ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinę sudėtį. 4. Optimizuota ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, atskirti ibuprofeno

ir ketoprofeno mišiniui ir nustatyti jų kiekybinėi sudėčiai. Validacijos metu pagrįstos metodikos specifiškumas, glaudumas, metodo aptikimo riba, metodo nustatymo riba, tiesiškumas. Visi validaciniai parametrai atitiko jiems keliamus reikalavimus.

7. Praktinės rekomendacijos

Atlikus ibuprofeno ir ketoprofeno kiekybinius tyrimus taikant Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjose aprašytas metodikas nustatyta, kad naudojant automatizuotą potenciometrinį titravimo metodą gaunami rezultatai yra patikimesni palyginus su gaunamais rezultatais naudojant tiesioginį titravima su indikatoriais. Tiriant ibuprofeną ir ketoprofeną kiekybiškai rekomenduojama naudoti potenciometrinį titravimo metodą.

Optimizuota ir validuota jautri, atranki, tiksli efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, kuri gali būti taikoma ibuprofeno ir ketoprofeno kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui vaistinėje formoje.

Literatūros sąrašas

1. Andrejaitienė J. Pooperacinio skausmo malšinimo aktualijos širdies chirurgijoje. Lietuvos chirurgija 8.1 2014. [ţiūrėta 2015 03 07]. Available from internet:

<http://www.vu.lt/leidyba/dokumentai/zurnalai/LIETUVOS%20CHIRURGIJA/Lietuvos%20chirurgi ja%20%202010%20Nr.%201%208/pooperacinio_skausmo_malsinimo_sirdies_chirurgijoje.pdf> 2. Baublienė J. Skausmo farmakoterapija [interaktyvus]. [cituota 2014 01 14]. Prieiga per internetą:

<http://www.news.lt/Upload/200410/Skausmo%20farmakoterapija_Baubliene%20J.pdf>.

3. Doc. Jonaitis L, Gyd. Patašiūtė I: Krono ligos ir NVNU sukelto kolito diferencinė diagnostika. Lietuvos gydytojo ţurnalas [interaktyvus]. 2005, lapkritis [ţiūrėta 2015 01 12]. Prieiga per internetą <http://elibrary.lt/resursai/Ziniasklaida/Medicine/Gydymo_menas/GM_2005_11_%28123%29.pdf#p age=72>.

4. Maruška A, Kornyšova O, Machtejevas E. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai. Kaunas, 2005.

5. NVNU vieta gydant skausmą. Lietuvos gydytojo ţurnalas [interaktyvus] 2011, kovas [ţiūrėta 2014 11

03]. Prieiga per internetą

<http://www.emedicina.lt/lt/zurnalai//lietuvos_gydytojo_zurnalas_2011/3/nvnu_vieta_gydant_skaus ma.html>

6. Parengta vaistų suvartojimo ataskaita [interaktyvus]. [cituota 2014 04 09]. Prieiga per internetą: <http://www.vvkt.lt/lit/Parengta-vaistu-suvartojimo-ataskaita/988>.

7. Andrejaitienė J. Pooperacinio skausmo malšinimo aktualijos širdies chirurgijoje. Lietuvos chirurgija 8.1 2014. [ţiūrėta 2015 03 07]. Available from internet:

<http://www.vu.lt/leidyba/dokumentai/zurnalai/LIETUVOS%20CHIRURGIJA/Lietuvos%20chirurgi ja%20%202010%20Nr.%201%208/pooperacinio_skausmo_malsinimo_sirdies_chirurgijoje.pdf> 8. ATC/DDD Index [online]. [ţiūrėta 2015 02 05]. Avaible from Internet:

<http://www.whocc.no/atc_ddd_index/?code=M01A>

9. Bakker E, Pretsch E. Modern potentiometry. Angewandte Chemie International Edition 46. 2007: 5660-5668.[ţiūrėta 2014 03 03]. Available from internet:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2515866>

10. Asadollah B, Pourghazi K, Mitra A D. Mixed supramolecular hemimicelles aggregates and magnetic carrier technology for solid phase extraction of ibuprofen in environmental samples prior to its HPLC-UV determination. Chemical Engineering Science 2014: 103-110.[ţiūrėta 2014 03 03]. Available from internet:

<http://www.sciencedirect.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/science/article/pii/S000925091400002 5?np=y>

11. Boparai M K, Grodzicki B K. Prescribing for older adults. Mount Sinai Journal of Medicine: A Journal of Translational and Personalized Medicine 78. 2011: 613-626. [ţiūrėta 2015 03 07]. Available from internet: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21748749>

12. Czaplicki S. Chromatography in Bioactivity Analysis of Compounds. INTECH 2013[ţiūrėta 2015 03 10]. Available from internet: <http://www.intechopen.com/books/column-chromatography/chromatography-in-bioactivity-analysis-of-compounds>

13. Delisa J A, Bruce M G, Nicholas E W. Physical medicine and rehabilitation: principles and practice. Vol. 1. Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

14. Desai N C, Senta R D. Simultaneous Rp-HPLC determination of salicylamide, salicylic acid and deferasirox in the bulk API dosages forms. Journal of Taibah University for Science 2014. [ţiūrėta

2015 02 20]. Available from internet:

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1658365514001265>

15. Donato M G, et al. Capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic capillary chromatography of some nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs). Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 11No.3 2013: 197-201. [ţiūrėta 2015 02 20]. Available from internet:

<http://www.sciencedirect.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/science/article/pii/0731708593801968 ?np=y>

16. Dvořák J, et al. Simultaneous HPLC determination of ketoprofen and its degradation products in the presence of preservatives in pharmaceuticals. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 36. 2004: 625-629.[ţiūrėta 2014 03 03]. Available from internet:

<http://www.sciencedirect.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/science/article/pii/S073170850400321 8?np=y>

17. European Pharmacopoeia [online]. [ţiūrėta 2014 10 23]. Avaible from Internet: <http://lib.njutcm.edu.cn/yaodian/ep/EP5.0/16_monographs/monographs_d-k/Ibuprofen.pdf>

18. European Pharmacopoeia [online]. [ţiūrėta 2014 10 23]. Avaible from Internet: <http://lib.njutcm.edu.cn/yaodian/ep/EP5.0/16_monographs/monographs_d-k/Ketoprofen.pdf>

19. Farré M P M B D, Petrovic M, Barceló D. Recently developed GC/MS and LC/MS methods for determining NSAIDs in water samples. Analytical and bioanalytical chemistry 387No.4 2007: 1203-1214. [ţiūrėta 2015 02 20]. Available from internet:

<http://link.springer.com/article/10.1007/s00216-006-0936-x#page-1>

20. Forrest J B, et al. Ketorolac, diclofenac, and ketoprofen are equally safe for pain relief after major surgery. British journal of anaesthesia 88No.2 [online]. 2002: 227-233. [ţiūrėta 2015 02 20]. Available from internet:

<http://bja.oxfordjournals.org/content/88/2/227.full>

21. Guidance for the Validation of Analytical Methodology and Calibration of Equipment used for Testing of Illicit Drugs in Seized Materials and Biological Specimens [online]. [ţiūrėta 2015 03 08] Available from internet: <http://www.unodc.org/documents/scientific/validation_E.pdf>

22. Guideline, ICH Harmonized Tripartite. Q2B validation of analytical procedures: methodology. Fed.

Regist 62[ţiūrėta 2014 10 09] Available from internet:

<http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm073 384.pdf>

23. Hapse S A, et al. Difference spectrophotometric estimation and validation of Ibuprofen from bulk and tablet dosage form [online]. 2011; 3 (5): 260-265 [ţiūrėta 2015 02 05]. Available from internet: <http://scholarsresearchlibrary.com/dpl-vol3-iss5/DPL-2011-3-5-260-265.pdf>

24. Hippisley C J,Coupland C. Risk of myocardial infarction in patients taking cyclo-oxygenase-2 inhibitors or conventional non-steroidal anti-inflammatory drugs: population based nested case-control analysis [online]. 2005; 1366. [ţiūrėta 2015 02 05]. Available from internet:

<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC558288/>

25. Indian ETD Repository [online]. [ţiūrėta 2014 07 05]

<http://shodhganga.inflibnet.ac.in:8080/jspui/bitstream/10603/6931/8/08_chapter%204.pdf>

26. Jan A, Heath E. Determination of NSAIDs in river sediment samples. Analytical and bioanalytical chemistry 387No.4 2007: 1337-1342. [ţiūrėta 2015 02 20]. Available from internet:

<http://link.springer.com/article/10.1007/s00216-006-0947-7#page-1>

27. Jasvinder A, et al. Update of the 2008 American College of Rheumatology recommendations for the use of disease‐modifying antirheumatic drugs and biologic agents in the treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis care & research 64 No.5 [online]. 2012: 625-639 [ţiūrėta 2015 02 05]. Available from internet: