1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA
LIUCIJA MOMKUTĖ
APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 ALELIŲ SĄSAJOS SU REGOS NERVO NEURITO PASIREIŠKIMU Magistro studijų programos „Medicina“ baigiamasis darbas
Mokslinio darbo vadovė: doc. dr. Rasa Liutkevičienė
KAUNAS 2020
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3
ABSTRACT ... 4
PADĖKA.INTERESŲ KONFLIKTAS.ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
7.1 Optinis neuritas ... 9
7.2 Išsetinė sklerozė ... 9
7.3 ON ir IS diagnostika ir gydymas ... 10
7.4 Apolipoproteinas E ... 10
7.5 Atlikti tyrimai su APOE ... 12
7.6 APOE sąsajos su ON ... 13
7.7 APOE sąsajos su amžiumi ir lytimi ... 13
DARBO METODIKA ... 15
8.1 Tyrimo planavimas ... 15
8.2 Tiriamųjų atranka ... 15
8.3 DNR išskyrimas ... 16
8.4 DNR išskyrimas naudojant silikagelio kolonėles ... 16
8.5 DNR koncentracijos matavimas spektofotometru ... 17
8.6 Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko PGR metodu ... 17
8.7 Statistinė analizė ... 19
REZULTATAI ... 20
9.1 APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse ... 20
9.2 APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių ... 21
9.3 APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį ... 22
9.4 APOE genotipų ir alelių dažnis ON pacientams sergant ir nesergant išsėtine skleroze ... 24
REZULTATŲ APTARIMAS ... 26
IŠVADOS ... 28
3
SANTRAUKA
Liucija Momkutė. APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių sąsajos su regos nervo neurito pasireiškimu. Magistro baigiamasis darbas. Mokslinio darbo vadovė - doc. dr. Rasa Liutkevičienė. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, Neuromokslų institutas, Oftalmologijos laboratorija. Kaunas, 2020; puslapių skaičius – 34
Darbo tikslas ir uždaviniai.
Darbo tikslas buvo išsiaiškinti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių sąsajas su regos nervo neurito pasireiškimu. Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių dažnius pacientams, sergantiems regos nervo neuritu ir kontrolinės grupės asmenims bei įvertinti šių alelių įtaką regos nervo neurito pasireiškimui; 2. Nustatyti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių sąsajas su regos nervo neurito pasireiškimu atsižvelgiant į
amžių bei lytį;
3. Nustatyti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių sąsajas su regos nervo neurito pasireiškimu kartu su išsėtine skleroze ir be išsėtinės sklerozės.
Metodai ir dalyviai.
Tyrime dalyvavo 80 pacientai, sergantys ON, kontrolinę grupę sudarė 68 sveiki tiriamieji. DNR buvo išskirta naudojant komercinius DNR skyrimo rinkinius, APOE geno rs429358 ir rs7412 vieno nukleotido polimorfizmų (VNP) genotipavimas atliktas naudojant tikro laiko polimerazės grandininę reakciją (TL-PGR) metodą. Rezultatai analizuoti naudojant „IBM SPSS Statistics 20.0“ statistinės analizės kompiuterinėmis programomis. Rezultatai statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
Rezultatai.
Išanalizavus APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmus nustatyta, kad APOE ɛ3/ɛ3 genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei kontrolinės grupės vyrams (53,6 proc. vs. 82,6 proc., p=0,028), taip pat ε3 alelis statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei sveikiems vyrams (75 proc. vs. 91,3 proc., p=0,038). APOE ɛ3/ɛ3 genotipas mažina ON pasireiškimo galimybę vyrams 76 proc. (GS=0,243; PI: 0,066-0,900; p=0,034).
APOE genotipų pasiskirstymas tarp pacientų, sergančių ON su IS ir sergančių ON be IS buvo statistiškai nereikšmingas.
Išvados.
Rezultatai parodė, kad APOE ɛ3/ɛ3 genotipas vyrams pasireiškia rečiau, todėl mažina ON pasireiškimo galimybę.
4
ABSTRACT
Liucija Momkutė. Optic neuritis and its association with APOE ɛ2, ɛ3 and ɛ4 alleles. Master‘s thesis. Supervisor – assoc.prof. dr. Rasa Liutkevičienė. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Medicine, Institute of Neurosciences, Laboratory of Ophthalmology. Kaunas, 2020; 34 pages.
Aim and tasks.
The aim of the study was to evaluate the association of optic neuritis with APOE ɛ2, ɛ3 and ɛ4 alleles. Tasks of the study:
1. To determine the frequencies of APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alleles in patients with ON and control group and to evaluate the influence of these alleles on the development of ON;
2. To determine the associations of APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alleles with occurrence of ON in terms of age and gender;
3. To determine the associations of APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alleles with occurrence of ON with and without multiple sclerosis (MS).
Methodology and participants. Study group included 80 patients with ON and 68 control group of healthy people. ON patients were divided into 2 subgroups: ON without MS and ON with MS. Single nucleotide polymorphisms (SNP) rs429358 and rs7412 in APOE gene was genotyped using the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) method fo all study subjects. Statistical analysis was performed using „IBM SPSS Statistics 20.0“ statistic software packages. Statistical significance was accepted at p<0,05.
Results. Genotyping of APOE rs429358 and rs7412 polymorphisms revealed that APOE ɛ3/ɛ3 genotype was statistical significantly less frequent in males with ON than males in control group (53.6% vs. 82.6%, p=0.028), as well as ε3 allele was statistical significantly less frequent in males with ON than males in control group (75% vs. 91.3%, p=0.038). APOE ɛ3/ɛ3 genotype reduces the possibility of ON manifestation in males 76% (OR=0.243; CI: 0.066-0.900; p=0.034).
APOE genotypes was not statisticly significant between those who were diagnosed with ON without MS and those with ON with MS.
Conclusions. Study revealed that APOE ɛ3/ɛ3 genotype is less frequent in males and reduces the possibility of ON manifestation in them.
5
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju baigiamojo magistro darbo vadovei doc. dr. Rasai Liutkevičienei už pagalbą, kantrybę, vertingas pastabas, patarimus rašant baigiamąjį darbą. Taip pat už pagalbą laboratorijoje, konsultacijas, bendradarbiavimą dėkoju LSMU KK Oftalmologijos laboratorijos laborantėms Alvitai Vilkevičiūtei ir Gretai Gedvilaitei.
INTERESŲ KONFLIKTAS
Darbo metu interesų konflikto nebuvo.ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
6
SANTRUMPOS
RNN – regos nervo neuritas
ON – optinis neuritas/optic neuritis IS – išsėtinė sklerozė
MS – multiple sclerosis CNS – centrinė nervų sistema APOE – apolipoproteinas E MTL – mažo tankio lipoproteinai
LMTL – labai mažo tankio lipoproteinai DNR – deoksiribonukleininė rūgštis AR – aminorūgštys
AL – Alzheimerio liga
VNP – vieno nukleotido polimorfizmas SNP – single nucleotide polymorphisms
TL – PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija RT-PCR – real-time polymerase chain reaction RT-PCR OKT – optinė koherentinė tomografija
SP – sukeltieji potencialai IV – intraveninis
7
ĮVADAS
Optinis neuritas (ON) arba regos nervo neuritas (RNN) yra dažna suaugusiųjų ūmaus optinio nervo pažeidimo priežastis [1]. ON pasireiškimas dažniau nustatomas jaunesniame amžiuje, ypač 18-45 metų amžiaus moterims [2]. ON apibūdinamas kaip skausmingas, dažniausiai vienpusis regos praradimas, pasireiškiantis akipločio pokyčiais ir sumažėjusiu spalviniu kontrastiniu jautrumu (mėlyna – geltona - ūmiame periode ir raudona – žalia - poūmiame periode). ON glaudžiai susijęs su išsėtine skleroze (IS) ir dviems trečdaliams pacientų, kuriems diagnozuota IS, gali išsivystyti ON [3]. ON susijęs su aksonų netekimu, nervinio impulso blokada ar gangliono žūtimi. Sutrikęs nervinis impulsas sukelia uždegiminį procesą, o tai veda link uždelstos IV tipo hiperalerginės reakcijos. Aktyvuoti periferiniai T limfocitai išskiria citokinus ir kitus uždegiminius mediatorius, kurie praeina kraujo-likvoro apsauginį barjerą ir sukelia mielino irimą, neuronų žūtį ir aksonų degeneraciją. Pažeistas apsauginis kraujo-likvoro barjeras leidžia T limfocitams ir uždegiminiams mediatoriams pasiekti centrinę nervų sistemą (CNS) ir skatina ON ligos pasireiškimą. Tikslios ON priežastys nėra žinomos. Tikėtina, kad ON sąlygoja genetinių ir aplinkos veiksnių derinys. Tipinis ON dažnai susijęs su IS ir sukelia aksonų netekimą. Atipinį ON galbūt sukelia bakterinės, grybelinės ar virusinės kilmės infekcijos arba kitos uždegiminės ar autoimuninės ligos. Genetiniai ir uždegiminiai veiksniai galimai prisideda prie ON išsivystymo [4].
Apolipoproteinas E (APOE) – tai kraujo serumo baltymas, kuris dalyvauja riebalų molekulių pernešime, kurį vykdo mažo tankio lipoproteinai (MTL) ir labai mažo tankio lipoproteinai (LMTL). Žmogaus APOE genas sudarytas iš 299 amino rūgščių (AR). Jo genas koduojamas 19q13 chromosomoje, esančioje 4 egzone. APOE gene egzistuoja 3 izoformos (APOE2, APOE3 ir APOE4). Tai yra 3 alelių (ɛ2, ɛ3 ir ɛ4) produktai vieno geno lokuse. Pastebėta, kad esant Alzheimerio ligai (AL) ɛ4 alelio dažnis yra didesnis. Taip pat atlikti tyrimai parodė, kad APOE genas atlieka didelį vaidmenį dalyvaujant gijimo procesuose CNS ir ši funkcija būna sutrikusi, kai baltymas egzistuoja E4 izoformoje, kurį koduoja ɛ4 alelis, lyginant su normalia E3 izoforma [5-9].
Dauguma atliktų tyrimų buvo apie tai, kaip APOE aleliai yra arba nėra susiję su IS, o atliktų tyrimų, kaip šie aleliai susiję su ON nėra, todėl šiame darbe buvo siekama išsiaiškinti APOE geno polimorfizmų sąsajas su ON drauge su arba be išsėtinės sklerozės.
8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas
Išsiaiškinti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių sąsajas su regos nervo neurito pasireiškimu.
Uždaviniai
1. Nustatyti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių dažnius pacientams, sergantiems regos nervo neuritu ir kontrolinės grupės asmenims bei įvertinti šių alelių įtaką regos nervo neurito pasireiškimui; 2. Nustatyti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių sąsajas su regos nervo neurito pasireiškimu atsižvelgiant į
amžių bei lytį;
3. Nustatyti APOE ɛ2, ɛ3 ir ɛ4 alelių sąsajas su regos nervo neurito pasireiškimu kartu su išsėtine skleroze ir be išsėtinės sklerozės.
9
LITERATŪROS APŽVALGA
7.1 Optinis neuritas
Optinis neuritas (ON) arba regos nervo neuritas (RNN) yra dažna suaugusiųjų ūmaus optinio nervo pažeidimo priežastis [1]. ON pasireiškimas dažniau stebimas jaunesniame amžiuje, ypač 18-45 metų amžiaus moterims, taip pat dažniau serga baltaodžiai nei tamsiaodžiai [2,10-12]. ON gali pasireikšti kaip pirminė izoliuota liga arba gali būti susijęa su kitomis neurologinėmis ligomis. ON apibūdinamas kaip skausmingas, dažniausiai vienpusis regos praradimas, pasireiškiantis akipločio pokyčiais ir sumažėjusiu spalviniu kontrastiniu jautrumu (mėlyna – geltona - ūmiame periode ir raudona – žalia - poūmiame periode), taip pat galimi “šviesos žybsniai” judinant akį, vadinamosios fotopsijos. Regos atsistatymo metu, pacientai gali skųstis trumpalaikiu regos pablogėjimu kuomet kūno temperatūra pakyla, pavyzdžiui, po karšto dušo ar mankštos – tai vadinama Uhthoff's simptomu, kartu gali pasireikšti Pulfrich's fenomenas, kai sutrinka gylio pojūtis judantiems objektams. Beveik visiems pacientams su abipusiu ON diagnozuojamas aferentinis vyzdžio defektas. Oftalmoskopuojant gali būti stebimas regos nervo disko paburkimas. Tinklainė dažniausiai būna nepakitusi, išskyrus atsiradusį periflebitinį apvalkalą, kuris siejamas su padidėjusia išsėtinės sklerozės rizika [13-23]. ON glaudžiai susijęs su išsėtine skleroze (IS) ir dviems trečdaliams pacientų, kuriems diagnozuota IS, gali išsivystyti ON [3]. IS diagnozė dažniausia nustatoma jaunesniame amžiuje, moterims dažniau nei vyrams, santykiu 2:1 [24,25]. Taip pat kaip ir ON dažniau nustatomas jaunesniame amžiuje 18-45 metų, moterims ir vyrams santykiu 3:1. ON susijęs su aksonų netekimu, nervinio impulso blokada ar gangliono žūtimi. Sutrikęs nervinis impulsas sukelia uždegiminį procesą, o tai veda link uždelstos IV tipo hiperalerginės reakcijos. Aktyvuoti periferiniai T limfocitai išskiria citokinus ir kitus uždegiminius mediatorius, kurie praeina kraujo-likvoro apsauginį barjerą ir sukelia mielino įrimą, neuronų žūtį ir aksonų degeneraciją. Pažeistas apsauginis kraujo-likvoro barjeras leidža T limfocitams ir uždegiminiams mediatoriams pasiekti centrinę nervų sistemą (CNS) ir skatina ON pasireiškimą. ON priežastys nėra pilnai žinomos. Tikėtina, kad ON sąlygoja genetinių ir aplinkos veiksnių derinys. Tipinis ON dažnai susijęs su IS ir sukelia aksonų netekimą. Atipinį ON galbūt sukelia bakterinės, grybelinės ar virusinės kilmės infekcijos arba kitos uždegiminės ar autoimuninės ligos. Genetiniai ir uždegiminiai veiksniai galimai prisideda prie ON išsivystymo [4,26-29].
7.2 Išsėtinė sklerozė
IS – tai lėtinė, imuninė, neurodegeneracinė liga, kuri apibūdinama kaip uždegiminis galvos ir nugaros smegenų nervų mielino pažeidimas, dėl kurio pasireiškia aksonų netekimas ir neurodegeneracija. Tikslus trigeris, sukeliantis IS, kol kas nėra identifikuotas, tačiau yra žinomi keli rizikos veiksniai, tokie kaip: Epstein-Barr virusas, maža vitamino D koncentracija organizme, nutukimas ankstyvame amžiuje ir rūkymas. Nors IS nėra paveldima klasikiniu Mendelian paveldėjimo būdu, tačiau
10 daugiau nei 200 genetinių variantų buvo susieti su IS pasireiškimu, daugiausia su HLA-DRB1*15:01 lokusu [30,31]. IS sukelia fizinius, kognityvinius ir miego sutrikimus. Atliktuose keliuose tyrimuose pastebėta, kad pacientams, kuriems diagnozuota IS ir kuriems ON pasireiškė kaip pirmasis demielinizuojantis procesas, pasireiškė lengvesni IS simptomai. Tam įtakos gali turėti sumažėjusi adipocitokinų, tokių kaip adiponektinas, leptinas ir rezistinas, produkcija. Optinio nervo uždegimas ir aksonų pažeidimas ankstyvose IS stadijose gali daryti įtaką sumažėjusiam sisteminiam uždegimui, o tai reiškia sumažinti simptomų progresavimą [32,33].
7.3 ON ir IS diagnostika ir gydymas
Tipinį ON diagnozuoti dažniausia galima vien tik iš klinikinių simptomų, tačiau atipiniam ON diagnozuoti reikia kitų tyrimo metodų. Magnetinio rezonanso tyrimas (MRT) gali padėti diferencinėje diagnostikoje greičiau nustatant ON diagnozę, nes leidžia aptikti regos nervo uždegimą, todėl MRT laikomas standartu vertinant demielinizuojančias būkles. Taip pat šiuo diagnostikos metodu galima nuspėti IS išsivystymo riziką [34]. Optinė koherentinė tomografija (OKT) – tai neinvazinis tyrimo būdas oftalmologijoje naudojamas vizualizuoti tinklainės sluoksnius. Šis tyrimas leidžia pamatyti demielinizuotus CNS aksonus tinklainėje – tinklainės nervinių skaidulų sluoksnį - bei išmatuoti jo storį. Šis tyrimas kaip neinvazinis biomarkeris pasitelkiamas nustatant neurodegeneracijas ir aksonų pažeidimus esant IS. [35-37] Sukeltųjų potencialų (SP) tyrimas taip pat gali būti naudojamas optinio nervo aksono pažeidimui išsiaiškinti. Tačiau kartu naudojant OKT ir SP padidėja ON hiperdiagnostikos tikimybė [38,39]. S.Modvig su bendraautoriais atliko tyrimą ir padarė išvadą, kad smegenų skysčio lengvųjų grandinių neurofilamentai gali būti naudojami kaip diagnostiniai biomarkeriai tiriant ankstyvos stadijos IS ar prognozuojant regos nervo pažeidimą. Lengvųjų grandinių neurofilamentai – tai aksono citoskeleto sudedamoji dalis, kurio koncentracija padidėja esant aksono pažeidimui, pavyzdžiui, esant ON ir IS [40-42].
Esant ON rekomenduojama gydymui skirti intraveninius (IV) gliukokortikoidus, pavyzdžiui, Metilprednizoloną 500-1000mg/d 3-7 dienas. Atliktuose tyrimuose padaryta išvada, kad IV steroidai greitina regos atsistatymą bei sumažina IS išsivystymo riziką [43-46].
7.4 Apolipoproteinas E
Apolipoproteinas E (APOE) – tai kraujo serumo baltymas, kuris dalyvauja riebalų molekulių pernešime, kurį vykdo mažo tankio lipoproteinai (MTL) ir labai mažo tankio lipoproteinai (LMTL). Žmogaus APOE genas sudarytas iš 299 aminorūgščių (AR). Jo genas koduojamas 19q13,2 chromosomoje, esančioje 4 egzone. APOE genas yra polimorfinis dviem nukleotidams (rs429358 ir rs7414), todėl egzistuoja 3 skirtingos izoformos (APOE ɛ2, APOE ɛ3 ir APOE ɛ4). Šios izoformos turi skirtingas AR 112(rs 429358) ir 158(rs7412) pozicijose: APOE2 turi cisteiną abiejose pozicijose, APOE3 – cisteiną 112 ir argininą 158 pozicijose bei APOE4 – argininą abiejose pozicijose. Tai yra 3
11 alelių (ɛ2, ɛ3 ir ɛ4) produktai vieno geno lokuse. Bendrojoje populiacijoje egzistuoja 6 genotipai: 3 homozigotiniai (APOE ɛ2/ ɛ2, APOE ɛ3/ ɛ3 ir APOE ɛ4/ ɛ4) ir 3 heterozigotiniai (APOE ɛ2/ ɛ3, APOE ɛ2/ ɛ4 ir APOE ɛ3/ ɛ4). Alelis ɛ3 yra dažniausiai pasireiškiantis ir yra randamas 77% bendrosios populiacijos. Tuo tarpu ɛ2 alelis 8% ir ɛ4 - 15% bendrosios populiacijos. Vis gi APOE alelių dažnis skiriasi tarp skirtingų etninių grupių. APOE perneša cholesterolį ir atlieka svarbų vaidmenį lipidų homeostazėje tiek periferijoje, tiek smegenyse. Periferijoje APOE sintezuoja kepenys ir makrofagai, o smegenyse – astrocitai, kurie per mažo tankio lipoproteinų (MTL) receptorius yra perduodami neuronams. Pastebėta, kad APOE2 jungiasi su MTL silpniau negu APOE3 ir APOE4. To pasekoje APOE2 perneša lipidus ne taip efektingai ir ɛ2 homozigotai pasižymi padidėjusia rizika sirgti III tipo hiperlipoproteinemija. APOE4 jungiasi prie lipoproteininių dalelių, todėl labiau siejasi su padidėjusia hipercholesterolemijos ir aterosklerozės rizika, spartesniu ŽIV infekcijos progresavimu ir pagreitėjusiu telomerų trumpėjimu. Įrodyta, kad ɛ4 alelis yra stiprus genetinis rizikos veiksnys vėlyvai Alzheimerio ligai (AL), taip pat kitoms neurodegeneracinėms ligoms, tokioms kaip: smegenų amiloido angiopatija, Lewy kūnelių demencija ir IS. Taip pat atlikti tyrimai parodė, kad APOE genas atlieka didelį vaidmenį dalyvaujant gijimo procesuose CNS ir ši funkcija būna sutrikusi, kai baltymas egzistuoja APOE4 izoformoje, kurį koduoja ɛ4 alelis, lyginant su normalia APOE3 izoforma. APOE2 siejasi su padidėjusiu
12 galvos smegenų baltosios medžiagos nykimu, taip pat su galvos smegenų potrauminiu gijimu bei hemoraginiu ir išeminiu insultu [5-9,47,48] .
7.5 Atlikti tyrimai su APOE
Anksčiau APOE buvo domimasi dėl lipoproteinuose esančio baltymo, kuris savyje turi daug arginino AR, tačiau dabar tai vienas iš 10 labiausiai tyrinėjamų genų. Įžvalgos apie APOE ne tik paaiškina lipoproteinų metabolizmą ir kardiovaskulines ligas, bet taip pat yra svarbios neurologinei funkcijai bei neurologinių būklių gydymui [49].
J.J.Martinez-Magana su bendraautoriais atliko tyrimą apie APOE polimorfizmų sąsają su lipidais. Tyrime dalyvavo 1997 tiriamieji iš skirtingų Meksikos etninių grupių. Visiems tiriamiesiems atlikti antropometriniai ir laboratoriniai tyrimai (gliukozė nevalgius, trigliceridai, MTL, DTL) bei TaqMan® APOE genotipavimas. Atlikus tyrimą mokslininkai nustatė, kad tiriamieji, kuriems nustatytas ɛ2 alelis- turėjo didesnę DTL koncentraciją kraujyje, kiek mažiau tiriamiesiems, turintiems ɛ3, o mažiausia DTL koncetracija buvo nustatyta tiriamiesiems, kuriems nustatyta ɛ4 (ɛ2˃ ɛ3˃ ɛ4). Pagal šį santykį buvo nuspręsta, kad MTL koncetracija yra atvirkščiai proporcinga (ɛ2˂ ɛ3˂ ɛ4). Mokslininkai padarė išvadą, kad APOE genas atlieką svarbų vaidmenį lipidų metabolizme [50].
Buvo atlikta nemažai tyrimų apie tai, kaip APOE yra susijęs su IS. Viename tokiame tyrime S.Schmidt su bendraautoriais tyrinėjo 398 baltųjų rasės šeimas, kuriose buvo vienas ar daugiau individų,
1 pav. https://www.researchgate.net/publication/290221413_A_rapid_and_cost-effective_method_for_genotyping_apolipoprotein_E_gene_polymorphism
13 sergančių IS. Jie atliko genotipavimą, gautus duomenis susistemino ir gavo rezultatus, kad APOE ɛ2 nešiotojai yra labiau linkę sirgti lengvos formos IS (GS 1,54, 95% PI 0,77–3,08, , P = 0,22). Tuo tarpu APOE ɛ4 nešiotojai labiau linkę sirgti sunkesnės formos IS (GS 0,79, 95% PI 0,42–1,49, P = 0,47) [51]. M.Pinholt su bendraautoriais atliko metaanalizę. Jie atrinko 37 straipsnius, kuriuose buvo tirta APOE ir IS sąsajos. Straipsniai atrinkti pagal turimą bent vieną iš 3 kriterijų: 1) genetinis APOE palyginimas tarp IS pacientų ir kontrolinės grupės; 2) APOE sąsajos su skirtingomis IS grupėmis, amžiumi, lytimi ir ligos atkryčiu; 3) apoE sąsajos su IS progresavimu atsižvelgiant į klinikinį ištyrimą ar MRT. Rezultatai parodė, kad APOE ɛ4 gali būti predisponuojantis faktorius sparčiam IS progresavimui [52].
Kitame tyrime, kurį atliko Mj.Sedano su bendraautoriais rezultatai buvo priešingi. Jie atliko tyrimus su 133 baltosios rasės pacientais, sergančiais IS ir gavo rezultatus, kad tarp jų pacientų APOE ɛ4 alelių dažnis nebuvo ženkliai didesnis nei kitose pietų Europos populiacijose ir padarė išvadą, kad APOE ɛ4 polimorfizmai neturi įtakos IS klinikinei eigai [53].
Ispanijoje buvo atliktas tyrimas, norint išsiaiškinti, ar APOE polimorfizmai daro įtaką IS gydymui β interferonu. Klinikiniai tyrimai rodo, kad β interferonas mažina ligos atkryčius. Nepaisant to, ne visiems pacientams šis gydymo metodas veikia ir tam įtakos gali turėti genetiniai veiksniai, teigia A.L. Guerrero su bendraautoriais. Įrodyta, kad APOE genas neįtakoja IS progresavimo, tačiau kai kurios geno variacijos veikia cholinesterazės inhibitorių mechanizmą AL gydyme bei statinų mechanizmą hipercholesterolemijos gydyme, todėl autoriai padarė prielaidą, kad šis genas gali daryti įtaką IS gydymui. Gavus rezultatus hipotezė buvo paneigta, tačiau rekomenduota atlikti didesnės apimties tyrimus [54].
AL.Guerrero su bendraautoriais atliko tyrimą tam, kad išsiaiškintų APOE geno įtaką IS sunkumui. Jie tyrė 82 pacientus, sergančius IS nemažiau nei 2 metus. Rezultatai neparodė jokio APOE efekto IS ligos sunkumui [55].
7.6 APOE sąsajos su ON
Dauguma atliktų tyrimų analizavo ar APOE aleliai susiję su IS. M.Pinholt ir bendraautorių 2005 metais atliktame tyrime dalyvavo 475 pacientai su IS diagnoze, iš jų 90 su ON. Iš kraujo tyrėjai išskyrė DNR ir atliko APOE genotipavimą. Gautus rezultatus palygino su kontroline grupe ir padarė išvadą, kad APOE genotipai nedaro įtakos IS ir ON išsivystymui, tačiau ɛ4 alelio nešiotojams IS gali progresuoti sparčiau [56].
7.7 APOE sąsajos su amžiumi ir lytimi
E.Ferri su bendraautoriais tyrė APOE geno sąsajas su fiziologiniu ir patologiniu senėjimu. Tyrime dalyvavo 106 pacientai, kuriems daugiau nei 100 metų, 294 pacientai, kuriems 80-89 metai ir kuriems diagnozuota Alzheimerio liga, bei 351 tiriamijei kaip kontrolinė grupė. Iš gautų rezultatų tyrėjai padarė
14 išvadą, kad ɛ4 alelis buvo stipriai susijęs su AL, APOE žymiai veikia AL riziką, bet neturi įtakos ilgaamžiškumui [57].
Kitame tyrime Chang Kyun Choi su bendraautoriais tyrė kaip APOE polimorfizmai susiję su mirtingumu korėjiečių populiacijoje. APOE genotipai buvo suskirstyti į grupes: ɛ2 (ɛ2/ ɛ2 ir ɛ2/ ɛ3), ɛ3 (ɛ3/ ɛ3) ir ɛ4 (ɛ3/ ɛ4 ir ɛ4/ ɛ4). Gavus rodmenis padaryta išvada, kad ɛ2 alelis siejasi su mažesne mirtingumo rizika lyginant su ɛ3 aleliu, tuo tarpu ɛ4 alelis nebuvo susijęs su mirtingumu korėjiečių populiacijoje [58].
JI Vélez su bendraautoriais tyrinėjo presenilin-1 PSEN1 mutaciją (p.Glu280Ala, E280A) ir jos sąsajas su AL ankstyvu pasireiškimu. Jie atrado, kad APOE ɛ2 alelis lėtina AL pasireiškimą [59], todėl tikėtina, kad ɛ2 alelis yra susijęs su ilgaamžiškumu.
Japonų mokslininkas T.Sasaki su bendraautoriais atliko tyrimą ir išsiaiškino, kad vyrai, APOE ɛ4 nešiotojai turi žymiai didesnę mirtingumo riziką nei vyrai, neturintys šio geno, ar moterys [60].
Duomenų apie tiesioginius tyrimus, siekiant išsiaiškinti sąsajas tarp APOE alelių ir ON, prieinamose duomenų bazėse pavyko rasti pakankamai nedaug. Iš rastos informacijos pastebėta, kad yra daug dėmesio skiriama genams ir jų polimorfizmams, atsakingiems už cholesterolio apykaitą, jų įtaką širdies ir kraujagyslių sistemai, CNS. Todėl šiame darbe tiriame APOE ɛ2, ɛ3ir ɛ4 polimorfizmus kaip galimai naują optinio neurito patogenezės mechanizmo veiksnį.
15
DARBO METODIKA
8.1 Tyrimo planavimas
Baigiamojo magistro darbo tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Oftalmologijos laboratorijoje, o pacientai buvo tiriami LSMUL KK Akių ligų klinikoje. Planuojant baigiamojo magistro darbo tyrimą, pirmiausia buvo išsiaiškintas temos aktualumas, ieškoma informacijos duomenų bazėse apie APOE genų polimorfizmų sąsajas su optiniu neuritu. Išanalizavus ankščiau atliktus mokslinius tyrimus išsiaiškinta, kad APOE dalyvauja cholesterolio apykaitoje, daro įtaką širdies ir kraujagyslių sistemai, dalyvauja CNS regeneracijoje bei pastebėtas APOE ɛ4 ryšys su Alzheimerio liga bei išsėtine skleroze. Šio geno sąsajos su ON vis dar nėra aiškios, todėl šiuo tyrimu bandysime nustatyti APOE polimorfizmo sąsajas su ON pasireiškimu.
Darbo metu buvo ištirti APOE polimorfizmai pacientams, sergantiems optiniu neuritu su ir be išsėtinės sklerozės bei sveikiems tiriamiesiems.
8.2 Tiriamųjų atranka
Gavus Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (protokolas Nr. BE–2–102) buvo pradėtas tyrimas. Tiriamieji buvo supažindinti su vykdomu tyrimu ir pasirašė asmens sutikimo formą. Tyrimo metu jie buvo suskirstyti į 2 grupes:
I grupė: pacientai, kuriems diagnozuotas optinis neuritas su/be išsėtinės sklerozės (n=80). II grupė: sveiki asmenys, neturintys oftalmologinių ar kitų sutrikimų (n=68).
ON grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai:
1. Visi asmenys pasirašė informuotą asmens sutikimo formą; 2. Optinio neurito diagnozė buvo patvirtinta gydytojo oftalmologo;
3. Atliktas neurologinis ištyrimas dėl išsėtinės sklerozės diagnozės nustatymo bei patvirtinimo. ON grupės neįtraukimo į tyrimą kriterijai:
1. Kitos akių ligos (keratitai, ragenos drumstys, lęšiuko drumstys, didelio laipsnio refrakcijos ydos, glaukoma, amžinė geltonosios dėmės degeneracija);
2. Sisteminės ligos (sisteminės jungiamojo audinio ligos, cukrinis diabetas, lėtinės infekcinės ligos, onkologinės ligos, būklės po audinių ar organų transplantacijos), išskyrus išsėtinė sklerozė.
Kontrolinės grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai:
1. Visi asmenys pasirašė informuotą asmens sutikimo formą; 2. Oftalmologinių sutrikimų neturintys tiriamieji;
3. Tiriamieji, nesergantys ūminėmis ir lėtinėmis infekcinėmis ir neinfekcinėmis ligomis. Kontrolinės grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai:
16 1. Kitos akių ligos (keratitai, ragenos drumstys, lęšiuko drumstys, didelio laipsnio refrakcijos
ydos, glaukoma, amžinė geltonosios dėmės degeneracija);
2. Asmenys, vartojantys psichomotoriką slopinančius bei epilepsijai gydyti skirtus vaistus. Kontrolinę grupę sudarė sveiki asmenys, kurie kreipėsi į LSMU KK Akių ligų kliniką dėl profilaktinio akių ištyrimo ir kurie atitiko amžiaus ir lyties pasiskirstymą ON grupėje. 8.3 DNR išskyrimas
Tiriamųjų kraujas buvo surinktas į vakuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatu), kad nesusidarytų mikrokrešuliai. DNR naudojama tyrime buvo išskirta iš periferinio kraujo leukocitų, naudojant „Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit“.
8.4 DNR išskyrimas naudojant silikagelio kolonėles
DNR iš periferinio kraujo leukocitų buvo išskirta naudojant silikagelio kolonėles, naudojant „Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit“. Šiuo rinkiniu galima greitai ir efektyviai išskirti DNR, kuri yra aukštos kokybės ir tinkama naudoti tolimesniems TL – PGR tyrimams.
Rinkinio sudėtinės dalys:
Skaidymo tirpalas (Digestion solution) Lizavimo tirpalas (Lysis solution) Plovimo buferis I (Wash buffer I) Plovimo buferis II (Wash buffer II) Eliucijos buferis (Elution buffer) Proteinazės K tirpalas
Silikagelio kolonėlės
DNR išskyrimo etapai: Ląstelių lizavimas
Į sterilų, 2 ml tūrio mėgintuvėlį įpilama 200 µl preiferinio veninio kraujo su 400 µl lizavimo tirpalo bei 20 µl proteinazės K tirpalo. Mėginys sumaišomas ir inkubuojamas 56 ºC temperatūroje 10 min. Lizavimo tirpale esančios medžiagos suardo išorinę ląstelių membraną, o proteinazė K - ląstelės baltymus, taip pat branduolio membraną bei inaktyvuoja nukleazes, kurios ardo DNR.
DNR nusodinimas silikagelio kolonėlėje
Vėliau į ląstelių lizatą buvo įpilta 200 µl 96 proc. etanolio ir mėginys sumaišytas. Sąveikaujant su etanoliu, DNR precipituoja ir nepereina per kolonėlės membraną, todėl lieka nusėdusi ant jos. Kolonėlė įstatoma į surenkamąjį mėgintuvėlį ir centrifuguojama 1 min. 6000 aps./min. greičiu. Centrifuguojant, prie kolonėlės membranos prisitvirtina DNR.
17 DNR valymui naudojami du buferiai: įpylus 500 µl plovimo buferio I, mėginys centrifuguojamas 1 min. 8000 aps./min. greičiu, tuomet įpilama 500 µl buferio II ir vėl centrifuguojama 3 min. 12000 aps./min. greičiu. Po kiekvieno centrifugavimo supernatantas nupilamas.
DNR išplovimas iš kolonėlės
Nukleorūgšties išskyrimas kolonėlėje pagrįstas adsorbcija ant kieto paviršiaus. Lizuojamos biologinio objekto ląstelės prisitvirtina ant filtrų dėl aukštos joninės jėgos tirpalų, o nuo filtro nuplaunamos specialiu eliucijos buferiu. Sąveika tarp DNR ir eliucijos buferio priklauso nuo pH ir druskų, esančių eliucijos buferyje. DNR išplovimui naudojama 75 µl eliucijos buferio ir inkubuojama 2 min. kambario temperatūroje bei centrifuguojama 1 min. 8000 aps./min. greičiu.
8.5 DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru
Norint tiksliai atlikti TL-PGR tyrimą, reikia išmatuoti ir parengti vienodos koncentracijos DNR tirpalus. DNR koncentracijos matavimui buvo naudojamas spektrofotometras „Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis“. DNR koncentracija nustatoma, matuojant tirpalo absorbciją (optinį tankį) ultravioletinių bangų ilgyje. Nukleino rūgščių nustatymas vykdomas naudojant 260 nm bangos ilgio spindulius. DNR tirpale esančios baltyminės priemaišos įvertinamos apskaičiuojant optinių tankių santykį 260 nm/280 nm, kuris rodo DNR tirpalų švarumą. Jis turi būti lygus arba didesnis už 1,8. 8.6 Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko PGR metodu
APOE geno polimorfizmų nustatymui (rs429358 ir rs7412) buvo atlikta tikro laiko polimerazės grandinės reakcija (TL-PGR).
TL – PGR etapai:
1. DNR denatūracija - šis etapas vyksta 94 – 95ºC temperatūroje. Jo metu, nutrūksta vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių ir DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.
2. Pradmenų hibridizacija – ji vykdoma 40 - 60ºC temperatūroje. Pradmenys šio etapo metu vandenilinėmis jungtimis jungiasi prie jiems komplementarių dauginamos DNR sričių.
3. Elongacija - ji vyksta 72ºC temperatūroje, reakciją katalizuoja fermentas Taq polimerazė. Šio etapo metu polimerazė sintetina komplementarią matricinei DNR grandinę.
Grandinė sintetinama iš mononukleotidų, kurie yra mišinio sudėtyje. DNR kiekis didėja eksponentiškai, kartojant denatūraciją, hibridizaciją ir elongaciją.
PGR principas
148 mėginių genotipų nustatymą atlikome tikro laiko PGR gausintuvu „StepOnePlus“. Kiekvienai reakcijai naudojome po 1 µl matricinės DNR (~10 ng) ir 9 µl PGR reakcijos mišinio, kurio sudedamosios dalys pateiktos 1 lentelėje. TL-PGR reakcija buvo vykdyta pagal 2 lentelėje nurodytas sąlygas.
18 1 lentelė. Realaus laiko PGR mišinio paruošimas
Reagentai 1 pvz., µl 96 pvz., µl
TaqMan Universal Master Mix II („Applied Biosystems“,
Lietuva)
5 µl 480 µl
H2O be nukleazių („Thermo
Fisher Scientific“, Lietuva) 3,5 µl 336 µl
„Applied Biosystems“
genotipavimo rinkinys 0,5 µl 48 µl
Viso (PGR mišinio) 9 µl 864 µl
DNR 1 µl
Viso 10 µl
2 lentelė. Optimalios genotipavimo reakcijos sąlygos nustatant rs429358 ir rs7412 genotipus tikro laiko PGR gausintuvu „StepOnePlus“
Genotipai Genotipavimo
rinkinys
PGR sąlygų
protokolai Produkto dydis
rs429358 ir rs7412 „Applied Biosystem“ patentas 95ºC 10 min 50 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 90s Nenurodyta Metodas:
1. PGR mišinys paruošiamas 96 mėginiams.
2. Mišinys išpilstomas po 9 µl į plokštelę su 0,1 ml tūrio 96 šulinėliais.
3. Į 95 mėgintuvėlius įpilama po 1 µl DNR, o į 96-ą mėgintuvėlį įpilamas vanduo be nukleazių, kuris naudojamas kaip neigiama kontrolė.
4. Plokštelė uždengiama lipnia optine plėvele ir centrifuguojama.
5. Genotipavimui nustatoma programa vieno iš polimorfizmų nustatymui, naudojant „Alelių nustatymo” programą (angl. „Allelic Discrimination“). Programa nustato individų genotipus pagal skirtingų detektorių fluorescensijos intensyvumo santykį. Gauti rezultatai naudojami tolimesniems statistiniams skaičiavimams.
19 8.7 Statistinė analizė
Statistinę duomenų analizę atlikome naudodami statistinės analizės programą „IBM SPSS Statistics 20.0“. Kokybiniai tiriamųjų požymiai išreiškiami absoliučiais skaičiais ir procentais skliausteliuose. Hipotezė apie matuojamų požymių reikšmių normalųjį skirstinį tikrinta taikant Kolmogorov-Smirnov ir Šapiro Vilko testus. Tiriamiesiems požymiams, kurie netenkino normaliojo skirstinio kriterijų, buvo taikomos šios aprašomosios statistikos charakteristikos: mediana, tarpkvartilinis plotis (IQR).
Vertinant tiriamųjų amžių ir tiriamosioms grupėms netenkinant normaliojo skirstinio kriterijaus, skirtumui tarp dviejų nepriklausomų grupių įvertinti buvo naudotas Mano-Vitnio U testas.
APOE genotipų ir alelių pasiskirstymai sergantiems ON ir kontrolinėje grupėse vertinti taikant χ² ir Fisher vienpusio kriterijų skaičiavimus bei Hardžio-Veinbergo dėsnis (HWE) buvo atliktas kontrolinėje grupėje.
Vertinant APOE genotipų ir alelių pasiskirstymus pagal amžių, tiriamieji suskirstyti į dvi grupes (≤35m. ir >35m.) atsižvelgiant į visų tiriamųjų amžiaus medianą (3 lentelė).
Dvinarė logistinė regresija buvo naudota įvertinti genotipų įtaką ON vystymuisi, nurodant GS su 95 proc. pasikliautinuoju intervalu (PI). Skirtumai vertinti kaip statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
20
REZULTATAI
Tyrimo metu tiriamieji buvo suskirstyti į 2 grupes. Pirmąją grupę sudarė 80 asmenys, sergantys optiniu neuritu su/be išsėtinės sklerozės. Iš jų 28 vyrai ir 52 moterys, tiriamųjų amžiaus vidurkis – 33,5 metai. Antrąją grupę – kontrolę – sudarė 68 asmenys. Iš jų 23 vyrai ir 45 moterys, jų amžiaus vidurkis – 34,5 metai. Tiriamųjų charakteristikos pateiktos 3 lentelėje. HWE buvo atliktas kontrolinėje grupėje (N = 68). APOE rs429358 ir rs7412 genotipų pasiskirstymai atitiko HWE dėsnį (p=0,168 ir 0,365, atitinkamai).
3 lentelė. Tiriamųjų demografinės charakteristikos
Charakterisitika Grupė p vertė ON (n=80) N (proc.) Kontrolinė grupė (n=68) N (proc.) Vyrai 28 (35,0) 23 (33,8) 0,510* Moterys 52 (65,0) 45 (66,2)
Amžius, mediana (tarpkvartilinis plotis) 33,5 (17) 34,5 (11) 0,292**
Išsėtinė sklerozė Yra Nėra Nenustatyta 29 (36,25) 47 (58,75) 4 (5) - -
*Pirsono Chi kvadratu testas **Mann–Whitney U testas
9.1 APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse
Buvo ištirti APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmai, kurie vėliau palyginti su kontrolinės grupės duomenimis. Abiejų polimorfizmų genotipų ir alelių skirtumai, lyginant sergančius tiriamuosius su kontroline grupe, statistiškai nereikšmingi. Rezultatai 4 lentelėje.
4 lentelė. APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, kurie serga ON, ir kontrolinėje grupėje Genotipas, alelis ON (n=80) Kontrolinė grupė (n=68) p vertė*
APOE ε2/ε2, n (proc.) 0 (0) 1 (1,5) 0,459
APOE ε2/ε3, n (proc.) 13 (16,2) 9 (13,2) 0,391
21 APOE ε3/ε3, n (proc.) 56 (70) 50 (73,5) 0,386 APOE ε3/ε4, n (proc.) 10 (12,5) 7 (10,3) 0,439 APOE ε4/ε4, n (proc.) 0 (0) 1 (1,5) 0,459 ε2 alelis, n (proc.) 14 (8,75) 11 (8,1) 1 ε3 alelis, n (proc.) 135 (84,375) 116 (85,3) 0,872 ε4 alelis, n (proc.) 11 (6,875) 9 (6,6) 1
*reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
Dvinarė logistinė regresinė analizė buvo atlikta tiriamųjų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, norint įvertinti atitinkamų genotipų įtaką ON pasireiškimo galimybei, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo. Rezultatai pateikti 5 lentelėje.
5 lentelė. APOE genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė
Genotipas GS (95 proc. PI) p vertė*
APOE ε2/ε2 - - APOE ε2/ε3 1,272 (0,507-3,189) 0,608 APOE ε2/ε4 - - APOE ε3/ε3 0,840 (0,409-1,726) 0,635 APOE ε3/ε4 1,245 (0,447-3,470) 0,675 APOE ε4/ε4 - -
*reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
9.2 APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių
Antras tyrimo uždavinys buvo įvertinti APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmus, sergantiems ON ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių. Statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo nustatyta. Rezultatai 6 lentelėje.
6 lentelė. APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių
Genotipas, alelis ≤35 m. p vertė * >35 m. p vertė* ON (n=44) Kontrolinė grupė (n=37) ON (n=36) Kontrolinė grupė (n=31)
22 APOE ε2/ε2, n (proc.) 0 (0) 0 (0) - 0 (0) 1 (3,2) 0,463 APOE ε2/ε3, n (proc.) 6 (13,6) 5 (13,5) 0,623 7 (19,4) 4 (12,9) 0,351 APOE ε2/ε4, n (proc.) 0 (0) 0 (0) - 1 (2,8) 0 (0) 0,537 APOE ε3/ε3, n (proc.) 31 (70,5) 29 (78,4) 0,290 25 (69,4) 21 (67,7) 0,544 APOE ε3/ε4, n (proc.) 7 (15,9) 3 (8,1) 0,237 3 (8,3) 4 (12,9) 0,415 APOE ε4/ε4, n (proc.) 0 (0) 0 (0) - 0 (0) 1 (3,2) 0,463 ε2 alelis, n (proc.) 6 (6,8) 5 (6,75) 1 8 (11,1) 6 (9,7) 1 ε3 alelis, n (proc.) 75 (85,2) 66 (89,2) 0,491 60 (83,25) 50 (80,6) 0,822 ε4 alelis, n (proc.) 7 (8,0) 3 (4,05) 0,347 4 (5,65) 6 (9,7) 0,513
*reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
Taip pat buvo atlikta dvinarė logistinė regresinė analizė tiriamųjų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, norint įvertinti atitinkamų genotipų įtaką ON pasireiškimo galimybei atsižvelgiant į amžių, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo. Rezultatai pateikti 7 lentelėje.
7 lentelė. APOE genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių
Grupė Genotipas GS (95 proc. PI) p vertė*
≤35 m. APOE ε2/ε2 - APOE ε2/ε3 1,011 (0,282-3,622) 0,987 APOE ε2/ε4 - - APOE ε3/ε3 0,658 (0,238-1,817) 0,419 APOE ε3/ε4 2,144 (0,513-8,963) 0,296 APOE ε4/ε4 - - >35 m. APOE ε2/ε2 - - APOE ε2/ε3 1,629 (0,428-6,195) 0,474 APOE ε2/ε4 - - APOE ε3/ε3 1,082 (0,385-3,045) 0,881 APOE ε3/ε4 0,614 (0,126-2,982) 0,545 APOE ε4/ε4 - -
*reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
9.3 APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Kitas tyrimo uždavinys buvo įvertinti APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmus, sergantiems ON ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį. APOE ε3/ε3 genotipas buvo
23 statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei kontrolinės grupės vyrams (53,6 proc. vs. 82,6 proc., p=0,028), taip pat ε3 alelis statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei sveikiems vyrams (75 proc. vs. 91,3 proc., p=0,038). Rezultatai pateikti 8 lentelėje
8 lentelė. APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Genotipas, alelis Vyrai p vertė * Moterys p vertė* ON (n=28) Kontrolinė grupė (n=23) ON (n=52) Kontrolinė grupė (n=45) APOE ε2/ε2, n (proc.) 0 (0) 0 (0) - 0 (0) 1 (2,2) 0,464 APOE ε2/ε3, n (proc.) 6 (21,4) 3 (13,0) 0,344 7 (13,5) 6 (13,3) 0,612 APOE ε2/ε4, n (proc.) 1 (3,6) 0 (0) 0,549 0 (0) 0 (0) - APOE ε3/ε3, n (proc.) 15 (53,6) 19 (82,6) 0,028 41 (78,8) 31 (68,9) 0,188 APOE ε3/ε4, n (proc.) 6 (21,4) 1 (4,3) 0,085 4 (7,7) 6 (13,3) 0,282 APOE ε4/ε4, n (proc.) 0 (0) 0 (0) - 0 (0) 1 (2,2) 0,464 ε2 alelis, n (proc.) 7 (12,5) 3 (6,5) 0,505 7 (6,75) 8 (8,9) 0,601 ε3 alelis, n (proc.) 42 (75,0) 42 (91,3) 0,038 93 (89,4) 74 (82,2) 0,212 ε4 alelis, n (proc.) 7 (12,5) 1 (2,2) 0,070 4 (3,85) 8 (8,9) 0,231
*reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
Dvinarė logistinė regresinė analizė atlikta tiriamųjų, sergančių ON, ir kontrolinėje grupėse, norint įvertinti atitinkamų genotipų įtaką ON pasireiškimo galimybei atsižvelgiant į tiriamųjų lytį. Nustatėme, jog APOE ε3/ε3 genotipas mažina ON pasireiškimo galimybę vyrams 76 proc. (GS=0,243; PI: 0,066-0,900; p=0,034). Rezultatai pateikti 9 lentelėje.
9 lentelė. ApoE genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Grupė Genotipas GS (95 proc. PI) p vertė*
Vyrai APOE ε2/ε2 - APOE ε2/ε3 1,818 (0,401-8,250) 0,438 APOE ε2/ε4 - - APOE ε3/ε3 0,243 (0,066-0,900) 0,034 APOE ε3/ε4 6,000 (0,666-54,038) 0,110 APOE ε4/ε4 - - Moterys APOE ε2/ε2 - -
24 APOE ε2/ε3 1,011 (0,313-3,263) 0,985 APOE ε2/ε4 - - APOE ε3/ε3 1,683 (0,673-4,212) 0,266 APOE ε3/ε4 0,542 (0,143-2,056) 0,368 APOE ε4/ε4 - -
*reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
9.4 APOE genotipų ir alelių dažnis ON pacientams sergant ir nesergant išsėtine skleroze
Tolimesnis tyrimo uždavinys buvo palyginti APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmų genotipų ir alelių dažnius skirtingose ON pacientų grupėse: ON be išsėtinės sklerozės ir ON su išsėtine skleroze, bei su kontrolinės grupės rezultatais. Statistiškai reikšmingų skirtumų nei vienoje grupėje nustatyta nebuvo. Rezultatai pateikti 10 lentelėje.
10 lentelė. APOE genotipų ir alelių dažnis pacientų, sergančių ON be išsėtinės sklerozės ir su išsėtine skleroze, grupėse ir kontrolinėje grupėje
Genotipas, alelis ON be IS (n=47) Kontrolinė grupė (n=68) p vertė* ON su IS (n=29) Kontrolinė grupė (n=68) p vertė* APOE ε2/ε2, n (proc.) 0 (0) 1 (1,5) 0,591 0 (0) 1 (1,5) 0,701 APOE ε2/ε3, n (proc.) 7 (14,9) 9 (13,2) 0,504 4 (13,8) 9 (13,2) 0,586 APOE ε2/ε4, n (proc.) 1 (2,1) 0 (0) 0,409 0 (0) 0 (0) - APOE ε3/ε3, n (proc.) 33 (70,2) 50 (73,5) 0,427 21 (72,4) 50 (73,5) 0,548 APOE ε3/ε4, n (proc.) 6 (12,8) 7 (10,3) 0,450 4 (13,8) 7 (10,3) 0,427 APOE ε4/ε4, n (proc.) 0 (0) 1 (1,5) 0,591 0 (0) 1 (1,5) 0,701 ε2 alelis, n (proc.) 8 (8,51) 11 (8,1) 1 4 (6,9) 11 (8,1) 1 ε3 alelis, n (proc.) 79 (84,04) 116 (85,3) 0,853 50 (86,2) 116 (85,3) 1 ε4 alelis, n (proc.) 7 (7,45) 9 (6,6) 0,799 4 (6,9) 9 (6,6) 1
*reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
Atlikta dvinarė logistinė regresijos analizė pacientams, sergantiems ON be IS ir ON su IS. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp sergančiųjų ON be IS ir ON su IS nebuvo nustatyta. Rezultatai 11 lentelėje.
11 lentelė. APOE genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė ON su IS ir ON be IS grupėms
25 ON be IS APOE ε2/ε2 - APOE ε2/ε3 0,872 (0,300-2,532) 0,801 APOE ε2/ε4 - - APOE ε3/ε3 1,178 (0,516-2,690) 0,697 APOE ε3/ε4 0,784 (0,246-2,501) 0,681 APOE ε4/ε4 - - ON su IS APOE ε2/ε2 - - APOE ε2/ε3 0,953 (0,268-3,386) 0,941 APOE ε2/ε4 - - APOE ε3/ε3 1,058 (0,399-2,809) 0,910 APOE ε3/ε4 0,717 (0,193-2,668) 0,620 APOE ε4/ε4 - -
26
REZULTATŲ APTARIMAS
Mūsų atliktame tyrime tyrėme APOE geno rs429358 ir rs7412 vieno nukleotido polimorfizmus 80 pacientų, sergantiems ON, ir 68 sveikiems tiriamiesiems. HWE buvo atliktas kontrolinėje grupėje (N = 68). APOE rs429358 ir rs7412 genotipų pasiskirstymai atitiko HWE dėsnį (p=0,168 ir 0,365, atitinkamai). Atlikus APOE genotipavimą ir išanalizavus polimorfizmų dažnį, sergantiems ON ir kontrolinėje gupėje, statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo nustatyta. Tolimesnė analizė APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmų sąsajos su ON sergančiųjų ir kontrolinės grupių atsižvelgiant į amžių statistiškai reikšmingų skirtumų neparodė, tuo tarpu atsižvelgiant į lytį skirtumas buvo statistiškai reikšmingas vyrų grupėje (p<0,05). Genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei kontrolinės grupės vyrams (53,6 proc. vs. 82,6 proc., p=0,028), taip pat ε3 alelis statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei sveikiems vyrams (75 proc. vs. 91,3 proc., p=0,038).
Atliktas tik vienas tyrimas, kuriame analizuotas APOE geno polimorfizmų sąsajos su optiniu neuritu ir išsėtine skleroze. Moksliniame tyrime buvo padaryta išvada, kad APOE genas nedaro įtakos nei ON, nei IS išsivystymui [56]. Šių tyrėjų atliktame tyrime buvo ieškoma sąsajų tarp APOE geno ε4 alelio ir ON bei IS. Tiriamųjų grupę sudarė 475 žmonės, iš kurių 385 sergantys IS ir 90 sergantys ON bei 361 sveiki asmenys. Priešingai nei mūsų tyrime, nebuvo nustatytas jokių alelių statistiškai reikšmingas skirtumas tarp lyčių. Taip pat ɛ4 alelio pasiskirstymas IS, ON ir kontrolinėje grupėse buvo panašus. Taip pat, kaip ir mūsų tyrime. Mokslininkai išanalizavę savo ir kitų tyrėjų gautus rezultatus padarė išvadą, kad grupėje, kurioje yra ɛ4 alelis IS progresavimas spartesnis nei grupėje, kurioje ɛ4 alelio nėra (p=0,009) [56].
APOE geno polimorfizmų sąsajos su Alzheimerio liga bei kardiovaskulinėmis ligomis tirtos gana plačiai ir yra mokslinių įrodymų, kad šio geno ε4 alelis dalyvauja patogeneziniame mechanizme ir daro įtaką minėtų ligų atsiradimui [5-9,47,48]. A.M.Kulminski su bendraautoriais atliktame tyrime, kuriame dalyvavo 649 tiriamieji, sergantys AL, išsiaiškino, kad APOE genas kartu su dar kitais 5 genų polimorfizmais daro įtaką AL patogenezei [80].
Tuo tarpu atlikta nemažai tyrimų su APOE ir kaip šis genas dalyvauja IS patogenezėje. Didžioji dalis mokslininkų nerado jokių įrodymų, jog APOE genas darytų įtaką IS ligos atsiradimui [61-66]. Vis dėlto, buvo keletas tyrimų, kurie parodė, kad pacientai, ε4 alelio nešiotojai, gali turėti sumažėjusį neuronų atsinaujinimą, o tai gali sąlygoti spartesnį IS progresavimą [67-73]. Taip pat R.L.Oliveri ir bendraautorių atliktame tyrime išsiaiškinta, kad APOE geno -491 A/T polimorfizmas yra susijęs su sunkiais kognityviniais sutrikimais pacientams, segantiems IS ir turintiems homozigotinį AA genotipą [74,75]. L.J.Julian su bendraautoriais atliko tyrimą siekdami išsiaiškinti APOE geno ryšį su depresija, kuri dažnai pasireiškia su IS. Gavus rezultatus jie padarė išvadą, kad APOE ε2 alelis veikia kaip apsauginis mechanizmas, nes sumažina depresinių susirgimų dažnį [76,77]. Kitų mokslininkų tyrime
27 išsiaiškinta, jog APOE ε4 nešiotojai yra labiau linkę sirgti sunkesne IS forma, tuo tarpu APOE ε2 nešiotojams pasireiškia lengvesnė IS forma [78,79].
Apibendrinant, nustatėme, kad APOE E3/E3 genotipas rečiau pasireiškia vyrams ir mažina ON pasireiškimo galimybę vyrams 76 proc. (GS=0,243; PI: 0,066-0,900; p=0,034). Taip pat statistiškai reikšmingų sąsajų tarp APOE ir IS bei ON nebuvo nustatyta, bet reikalingi tolimesni didesnės apimties tyrimai tam, kad galutinai galėtume įvertinti APOE polimorfizmų sąsajas su ON ir IS.
28
IŠVADOS
1. Tiriant APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmus pacientams, sergantiems ON ir kontrolinėje grupėje statistiškai reikšmingu skirtumų nebuvo nustatyta;
2. Tiriant APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmus pacientams, sergantiems ON, ir kontrolinėje grupėje genotipų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes statistiškai nesiskyrė. Tuo tarpu APOE ɛ3/ɛ3 genotipo pasiskirstymas pagal lytį buvo statistiškai reikšmingas vyrų grupėje (p<0,05). Genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei kontrolinės grupės vyrams (53,6 proc. vs. 82,6 proc., p=0,028), taip pat ε3 alelis statistiškai reikšmingai retesnis ON sergantiems vyrams nei sveikiems vyrams (75 proc. vs. 91,3 proc., p=0,038). APOE ɛ3/ɛ3 genotipas mažina ON pasireiškimo galimybę vyrams 76 proc. (GS=0,243; PI: 0,066-0,900; p=0,034);
3. Tiriant APOE rs429358 ir rs7412 polimorfizmus pacientams, sergantiems ON su IS ir sergantiems ON be IS, genotipų pasiskirstymas buvo statistiškai nereikšmingas.
29
LITERATŪROS SĄRAŠAS
[1]Bennett JL. Optic Neuritis. Continuum (Minneap Minn) 2019 Oct;25(5):1236-1264.
[2]Gedvilaite G, Vilkeviciute A, Kriauciuniene L, Asmoniene V, Liutkeviciene R. Does CETP rs5882, rs708272, SIRT1 rs12778366, FGFR2 rs2981582, STAT3 rs744166, VEGFA rs833068, IL6
rs1800795 polymorphisms play a role in optic neuritis development? Ophthalmic Genet 2019 Jun;40(3):219-226.
[3]Liutkeviciene R, Vilkeviciute A, Banevicus M, Miezyte R, Kriauciuniene L. Association of MMP-2 ((-)1306 C/T) Gene Polymorphism with Predisposition to Optic Neuritis and Optic Neuritis Together with Multiple Sclerosis. Medicina (Kaunas) 2018 May 7;54(2):10.3390/medicina54020029.
[4]Banevicius M, Vilkeviciute A, Glebauskiene B, Kriauciuniene L, Liutkeviciene R. Association of Optic Neuritis with CYP4F2 Gene Single Nucleotide Polymorphism and IL-17A Concentration. J Ophthalmol 2018 Mar 15;2018:1686297.
[5]Diptiranjan S, Harshitha SM, Sibin MK, Arati S, Chetan GK, Bhat DI. Role of APOE and IL18RAP gene polymorphisms in cervical spondylotic myelopathy in Indian population. J Clin Neurosci 2019 Aug;66:83-86.
[6]Sidaraite A, Vilkeviciute A, Glebauskiene B, Kriauciuniene L, Zaliuniene D, Liutkeviciene R. Association of ApoE haplotype with clinical evidence of pituitary adenoma. Gene 2019 Jul 20;706:154-161.
[7]Ghebranious N, Ivacic L, Mallum J, Dokken C. Detection of ApoE E2, E3 and E4 alleles using MALDI-TOF mass spectrometry and the homogeneous mass-extend technology. Nucleic Acids Res 2005 Oct 4;33(17):e149.
[8]A Armstrong R. Risk factors for Alzheimer's disease. Folia Neuropathol 2019;57(2):87-105. [9]Iacono D, Feltis GC. Impact of Apolipoprotein E gene polymorphism during normal and
pathological conditions of the brain across the lifespan. Aging (Albany NY) 2019 Jan 24;11(2):787-816.
[10]Rodriguez M, Siva A, Cross SA, O'Brien PC, Kurland LT. Optic neuritis: a population-based study in Olmsted County, Minnesota. Neurology 1995 Feb;45(2):244-250.
[11]Sorensen TL, Frederiksen JL, Bronnum-Hansen H, Petersen HC. Optic neuritis as onset manifestation of multiple sclerosis: a nationwide, long-term survey. Neurology 1999 Aug 11;53(3):473-478.
[12]Phillips PH, Newman NJ, Lynn MJ. Optic neuritis in African Americans. Arch Neurol 1998 Feb;55(2):186-192.
[13]Schneck ME, Haegerstrom-Portnoy G. Color vision defect type and spatial vision in the optic neuritis treatment trial. Invest Ophthalmol Vis Sci 1997 Oct;38(11):2278-2289.
[14]Slagsvold JE. Pulfrich pendulum phenomenon in patients with a history of acute optic neuritis. Acta Ophthalmol (Copenh) 1978 Oct;56(5):817-826.
30 [15]Keltner JL, Johnson CA, Spurr JO, Beck RW. Comparison of central and peripheral visual field properties in the optic neuritis treatment trial. Am J Ophthalmol 1999 Nov;128(5):543-553.
[16]Keltner JL, Johnson CA, Spurr JO, Beck RW. Baseline visual field profile of optic neuritis. The experience of the optic neuritis treatment trial. Optic Neuritis Study Group. Arch Ophthalmol 1993 Feb;111(2):231-234.
[17]Beck RW, Kupersmith MJ, Cleary PA, Katz B. Fellow eye abnormalities in acute unilateral optic neuritis. Experience of the optic neuritis treatment trial. Ophthalmology 1993 May;100(5):691-7; discussion 697-8.
[18]Lightman S, McDonald WI, Bird AC, Francis DA, Hoskins A, Batchelor JR, et al. Retinal venous sheathing in optic neuritis. Its significance for the pathogenesis of multiple sclerosis. Brain 1987 Apr;110 ( Pt 2)(Pt 2):405-414.
[19]Optic Neuritis Study Group. Visual function 15 years after optic neuritis: a final follow-up report from the Optic Neuritis Treatment Trial. Ophthalmology 2008 Jun;115(6):1079-1082.e5.
[20]Beck RW, Smith CH, Gal RL, Xing D, Bhatti MT, Brodsky MC, et al. Neurologic impairment 10 years after optic neuritis. Arch Neurol 2004 Sep;61(9):1386-1389.
[21]Beck RW, Gal RL, Bhatti MT, Brodsky MC, Buckley EG, Chrousos GA, et al. Visual function more than 10 years after optic neuritis: experience of the optic neuritis treatment trial. Am J
Ophthalmol 2004 Jan;137(1):77-83.
[22]Beck RW, Trobe JD, Moke PS, Gal RL, Xing D, Bhatti MT, et al. High- and low-risk profiles for the development of multiple sclerosis within 10 years after optic neuritis: experience of the optic neuritis treatment trial. Arch Ophthalmol 2003 Jul;121(7):944-949.
[23]Trobe JD, Beck RW, Moke PS, Cleary PA. Contrast sensitivity and other vision tests in the optic neuritis treatment trial. Am J Ophthalmol 1996 May;121(5):547-553.
[24]Ascherio A, Munger KL. Environmental risk factors for multiple sclerosis. Part II: Noninfectious factors. Ann Neurol 2007 Jun;61(6):504-513.
[25]Jin YP, de Pedro-Cuesta J, Soderstrom M, Stawiarz L, Link H. Incidence of optic neuritis in Stockholm, Sweden 1990-1995: I. Age, sex, birth and ethnic-group related patterns. J Neurol Sci 1998 Jul 15;159(1):107-114.
[26]Cikes N, Bosnic D, Sentic M. Non-MS autoimmune demyelination. Clin Neurol Neurosurg 2008 Nov;110(9):905-912.
[27]Ruprecht K, Klinker E, Dintelmann T, Rieckmann P, Gold R. Plasma exchange for severe optic neuritis: treatment of 10 patients. Neurology 2004 Sep 28;63(6):1081-1083.
[28]Voss E, Raab P, Trebst C, Stangel M. Clinical approach to optic neuritis: pitfalls, red flags and differential diagnosis. Ther Adv Neurol Disord 2011 Mar;4(2):123-134.
[29]Petzold A. Isolated, relapsing and progressive demyelinating diseases of the central nervous system. J Neurol 2008 Dec;255 Suppl 6:69-76.
31 [30]Rosenthal JF, Hoffman BM, Tyor WR. CNS inflammatory demyelinating disorders: MS, NMOSD and MOG antibody associated disease. J Investig Med 2019 Oct 3.
[31]Yang W, Zhou W, Zhang BK, Kong LS, Zhu XX, Wang RX, et al. Association between CD24 Ala/Val polymorphism and multiple sclerosis risk: A meta analysis. Medicine (Baltimore) 2020 Apr;99(15):e19530.
[32]Turkoglu R, Benbir G, Ozyurt S, Arsoy E, Akbayir E, Turan S, et al. Sleep disturbance and cognitive decline in multiple sclerosis patients with isolated optic neuritis as the first demyelinating event. Int Ophthalmol 2019 Aug 20.
[33]Birkeldh U, Manouchehrinia A, Hietala MA, Hillert J, Olsson T, Piehl F, et al. Retinal nerve fiber layer thickness associates with cognitive impairment and physical disability in multiple sclerosis. Mult Scler Relat Disord 2019 Sep 26;36:101414.
[34]Sarbu N, Lolli V, Smirniotopoulos JG. Magnetic resonance imaging in myelopathy: a pictorial review. Clin Imaging 2019 Sep - Oct;57:56-68.
[35]Cellina M, Floridi C, Rosti C, Orsi M, Panzeri M, Pirovano M, et al. MRI of acute optic neuritis (ON) at the first episode: Can we predict the visual outcome and the development of multiple sclerosis (MS)? Radiol Med 2019 Dec;124(12):1296-1303.
[36]Koraysha NA, Kishk N, Hassan A, Samy El Gendy NM, Shehata HS, Al-Azayem SA, et al. Evaluating optic nerve diameter as a possible biomarker for disability in patients with multiple sclerosis. Neuropsychiatr Dis Treat 2019 Sep 6;15:2571-2578.
[37]Hu H, Jiang H, Gameiro GR, Hernandez J, Delgado S, Wang J. Focal Thickness Reduction of the Ganglion Cell-Inner Plexiform Layer Best Discriminates Prior Optic Neuritis in Patients With Multiple Sclerosis. Invest Ophthalmol Vis Sci 2019 Oct 1;60(13):4257-4269.
[38]Pastare D, Kire I, Erts R, Laganovska G, Millers A. Evaluation of axonal optic nerve damage using visual evoked potentials and optical coherence tomography in patients with multiple sclerosis. Medicina (Kaunas) 2013;49(11):474-478.
[39]Sand T, Kvaloy MB, Wader T, Hovdal H. Evoked potential tests in clinical diagnosis. Tidsskr Nor Laegeforen 2013 May 7;133(9):960-965.
[40]Mollgaard M, Degn M, Sellebjerg F, Frederiksen JL, Modvig S. Cerebrospinal fluid chitinase-3-like 2 and chitotriosidase are potential prognostic biomarkers in early multiple sclerosis. Eur J Neurol 2016 May;23(5):898-905.
[41]Modvig S, Degn M, Sander B, Horwitz H, Wanscher B, Sellebjerg F, et al. Cerebrospinal fluid neurofilament light chain levels predict visual outcome after optic neuritis. Mult Scler 2016
Apr;22(5):590-598.
[42]Olesen MN, Soelberg K, Debrabant B, Nilsson AC, Lillevang ST, Grauslund J, et al.
Cerebrospinal fluid biomarkers for predicting development of multiple sclerosis in acute optic neuritis: a population-based prospective cohort study. J Neuroinflammation 2019 Mar 11;16(1):59-019-1440-5. [43]Meer E, Shindler KS, Yu Y, VanderBeek BL. Adherence to Clinical Trial Supported Evaluation of Optic Neuritis. Ophthalmic Epidemiol 2019 Oct;26(5):321-328.
32 [44]Abel A, McClelland C, Lee MS. Critical review: Typical and atypical optic neuritis. Surv
Ophthalmol 2019 Nov - Dec;64(6):770-779.
[45]Bakaeva T, Prasad S. For Massachusetts Eye and Ear Special Issue: Updates on Therapies for Multiple Sclerosis for the Ophthalmologist. Semin Ophthalmol 2019;34(4):270-278.
[46]Siuko M, Kivela TT, Setala K, Tienari PJ. The clinical spectrum and prognosis of idiopathic acute optic neuritis: A longitudinal study in Southern Finland. Mult Scler Relat Disord 2019 Oct;35:215-220.
[47]Chapleau RR, Martin CA, Hughes SR, Baldwin JC, Sladky J, Sherman PM, et al. Apolipoprotein E promoter genotypes are not associated with white matter hyperintensity development in high-altitude careers. BMC Res Notes 2019 Sep 24;12(1):630-019-4654-9.
[48]Zhong L, Xie YZ, Cao TT, Wang Z, Wang T, Li X, et al. A rapid and cost-effective method for genotyping apolipoprotein E gene polymorphism. Mol Neurodegener 2016 Jan 12;11:2-016-0069-4. [49]Marais AD. Apolipoprotein E in lipoprotein metabolism, health and cardiovascular disease. Pathology 2019 Feb;51(2):165-176.
[50]Martinez-Magana JJ, Genis-Mendoza AD, Tovilla-Zarate CA, Gonzalez-Castro TB, Juarez-Rojop IE, Hernandez-Diaz Y, et al. Association between APOE polymorphisms and lipid profile in Mexican Amerindian population. Mol Genet Genomic Med 2019 Sep 26:e958.
[51]Schmidt S, Barcellos LF, DeSombre K, Rimmler JB, Lincoln RR, Bucher P, et al. Association of Polymorphisms in the Apolipoprotein E Region with Susceptibility to and Progression of Multiple Sclerosis. The American Journal of Human Genetics 2002 March 2002;70(3):708-717.
[52]Pinholt M, Frederiksen JL, Christiansen M. The association between apolipoprotein E and multiple sclerosis. European Journal of Neurology 2006 06/01; 2019/10;13(6):573-580.
[53]Sedano MI, Calmarza P, Perez L, Trejo JM. No association of apolipoprotein E epsilon4 genotype with faster progression or less recovery of relapses in a Spanish cohort of multiple sclerosis. Mult Scler 2006 Feb;12(1):13-18.
[54]Guerrero AL, Tejero MA, Gutierrez F, Martin-Polo J, Iglesias F, Laherran E, et al. Influence of APOE gene polymorphisms on interferon-beta treatment response in multiple sclerosis. Neurologia 2011 Apr;26(3):137-142.
[55]Guerrero AL, Laherrán E, Gutiérrez F, Martín-Polo J, Iglesias F, Alcázar C, et al. Apolipoprotein E genotype does not associate with disease severity measured by Multiple Sclerosis Severity Score. Acta Neurol Scand 2008 01/01; 2019/10;117(1):21-25.
[56]Pinholt M, Frederiksen JL, Andersen PS, Christiansen M. Apo E in multiple sclerosis and optic neuritis: the Apo E-o4 allele is associated with progression of multiple sclerosis. Mult Scler 2005 10/01; 2019/09;11(5):511-515.
[57]Ferri E, Gussago C, Casati M, Mari D, Rossi PD, Ciccone S, et al. Apolipoprotein E gene in physiological and pathological aging. Mech Ageing Dev 2019 Mar;178:41-45.
33 [58]Choi CK, Kweon SS, Lee YH, Nam HS, Park KS, Ryu SY, et al. The Association between the Apolipoprotein E Gene Polymorphism and All-cause Mortality in the Korean Population. J Korean Med Sci 2019 Oct 21;34(40):e269.
[59]Velez JI, Lopera F, Sepulveda-Falla D, Patel HR, Johar AS, Chuah A, et al. APOE*E2 allele delays age of onset in PSEN1 E280A Alzheimer's disease. Mol Psychiatry 2016 Jul;21(7):916-924. [60]Sasaki T, Nishimoto Y, Abe Y, Takayama M, Hirose N, Okano H, et al. Sex-specific effects of apolipoprotein epsilon4 allele on mortality in very old and centenarian Japanese men. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2019 Oct 11.
[61]Burwick RM, Ramsay PP, Haines JL, Hauser SL, Oksenberg JR, Pericak-Vance MA, et al. APOE epsilon variation in multiple sclerosis susceptibility and disease severity: some answers. Neurology 2006 May 9;66(9):1373-1383.
[62]Lill CM, Liu T, Schjeide BM, Roehr JT, Akkad DA, Damotte V, et al. Closing the case of APOE in multiple sclerosis: no association with disease risk in over 29 000 subjects. J Med Genet 2012 Sep;49(9):558-562.
[63]Weatherby SJ, Mann CL, Davies MB, Carthy D, Fryer AA, Boggild MD, et al. Polymorphisms of apolipoprotein E; outcome and susceptibility in multiple sclerosis. Mult Scler 2000 Feb;6(1):32-36. [64]Pirttila T, Haanpaa M, Mehta PD, Lehtimaki T. Apolipoprotein E (APOE) phenotype and APOE concentrations in multiple sclerosis and acute herpes zoster. Acta Neurol Scand 2000 Aug;102(2):94-98.
[65]Weatherby SJ, Mann CL, Fryer AA, Strange RC, Hawkins CP, Stevenson VL, et al. No
association between the APOE epsilon4 allele and outcome and susceptibility in primary progressive multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000 Apr;68(4):532.
[66]Ghaffar O, Reis M, Pennell N, O'Connor P, Feinstein A. APOE epsilon4 and the cognitive genetics of multiple sclerosis. Neurology 2010 May 18;74(20):1611-1618.
[67]Evangelou N, Jackson M, Beeson D, Palace J. Association of the APOE epsilon4 allele with disease activity in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1999 Aug;67(2):203-205. [68]Chapman J, Sylantiev C, Nisipeanu P, Korczyn AD. Preliminary observations on APOE epsilon4 allele and progression of disability in multiple sclerosis. Arch Neurol 1999 Dec;56(12):1484-1487. [69]Masterman T, Zhang Z, Hellgren D, Salter H, Anvret M, Lilius L, et al. APOE genotypes and disease severity in multiple sclerosis. Mult Scler 2002 Apr;8(2):98-103.
[70]Fazekas F, Strasser-Fuchs S, Schmidt H, Enzinger C, Ropele S, Lechner A, et al. Apolipoprotein E genotype related differences in brain lesions of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000 Jul;69(1):25-28.
[71]Hogh P, Oturai A, Schreiber K, Blinkenberg M, Jorgensen OS, Ryder L, et al. Apoliprotein E and multiple sclerosis: impact of the epsilon-4 allele on susceptibility, clinical type and progression rate. Mult Scler 2000 Aug;6(4):226-230.
34 [72]Santos M, Costa MC, Edite Rio M, Jose Sa M, Monteiro M, Valenca A, et al. Genotypes at the APOE and SCA2 loci do not predict the course of multiple sclerosis in patients of Portuguese origin. Mult Scler 2004 Apr;10(2):153-157.
[73]Zhang HL, Wu J, Zhu J. The immune-modulatory role of apolipoprotein E with emphasis on multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Dev Immunol
2010;2010:186813.
[74]Oliveri RL, Cittadella R, Sibilia G, Manna I, Valentino P, Gambardella A, et al. APOE and risk of cognitive impairment in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand 1999 Nov;100(5):290-295.
[75]Parmenter BA, Denney DR, Lynch SG, Middleton LS, Harlan LM. Cognitive impairment in patients with multiple sclerosis: association with the APOE gene and promoter polymorphisms. Mult Scler 2007 Jan;13(1):25-32.
[76]Julian LJ, Vella L, Frankel D, Minden SL, Oksenberg JR, Mohr DC. ApoE alleles, depression and positive affect in multiple sclerosis. Mult Scler 2009 Mar;15(3):311-315.
[77]Carlin C, Murray L, Graham D, Doyle D, Nicoll J. Involvement of apolipoprotein E in multiple sclerosis: absence of remyelination associated with possession of the APOE epsilon2 allele. J Neuropathol Exp Neurol 2000 May;59(5):361-367.
[78]Schmidt S, Barcellos LF, DeSombre K, Rimmler JB, Lincoln RR, Bucher P, et al. Association of polymorphisms in the apolipoprotein E region with susceptibility to and progression of multiple sclerosis. Am J Hum Genet 2002 Mar;70(3):708-717.
[79]Fazekas F, Strasser-Fuchs S, Kollegger H, Berger T, Kristoferitsch W, Schmidt H, et al.
Apolipoprotein E epsilon 4 is associated with rapid progression of multiple sclerosis. Neurology 2001 Sep 11;57(5):853-857.
[80]Kulminski AM, Shu L, Loika Y, He L, Nazarian A, Arbeev K, et al. Genetic and regulatory architecture of Alzheimer's disease in the APOE region. Alzheimers Dement (Amst) 2020 Feb 6;12(1):e12008.
