2.1 Sintesi di poliuretani e poliuretani-uree
Polimerizzazione in due stadi in DCE
Una soluzione del segmento soft (PCL diolo 1250 o 2000, COP 50/50 o COP 65/35) in circa 70 mL di DCE è stata anidrificata per reflusso in Soxhlet su setacci molecolari. Durante questa operazione la soluzione è stata concentrata a circa 10 mL.
Alla soluzione è stato aggiunto il diisocianato (LDI, HDI o BDI) in rapporto molare 2:1 con il segmento soft. La miscela di reazione è stata mantenuta in agitazione a 85°C per 150 min. Alla miscela di reazione, raffreddata a temperatura ambiente, sono stati aggiunti il catalizzatore (dibutil Sn dilaurato) e una soluzione dell’estensore (CDM o Phe di estere o etil 2,6-diaminoesanoato) in DCE, anidrificata anch’ essa per reflusso in Soxhlet su setacci molecolari. Nel caso in cui, come estensore di catena, siano utilizzati peptidi o derivati di amminoacidi, questi sono invece aggiunti direttamente, a freddo, al solvente anidrificato, perché queste specie potrebbero risultare termolabili. Lo stadio di estensione di catena ha richiesto un periodo di circa 18 h, alla fine del quale un analisi IR ha confermato la scomparsa del picco relativo ai gruppi isocianato presenti nel prepolimero. La reazione è stata interrotta aggiungendo 5 mL di metanolo.
Il polimero è stato precipitato in etere di petrolio, filtrato e seccato. Successivamente è stato sciolto in DMF o cloroformio e precipitato in metanolo: questa procedura permette di purificare il polimero dalle impurezze costituite dai monomeri non reagiti.
2.2 Caratterizzazione dei poliuretani
2.2.1 Prove tensili
Le prove sono state compiute mediante Instron 5550R, ad una velocità di 10 mm/min. I film, ottenuti per casting, risultano avere uno spessore di 50-110 μm.
2.2.2 Analisi dinamico-meccanica (DMTA)
Le analisi di poliuretani selezionati sono state compiute mediante Triton 2000 DMA. I campioni, in forma di polvere, sono stati inseriti in apposite tasche; le misure sono state effettuate alla frequenza di 1 Hz e la temperatura è stata variata tra -100°C e 60°C, con un incremento di temperatura di 5°C al minuto.
2.2.3 Spettroscopia infrarossa
Gli spettri IR sono stati effettuati con uno strumento Perkin Elmer
Spectrum-One FT-IR Spectrometer. Le mappe sono state effettuate con
uno strumento Perkin Elmer FT-IR Imaging System.
2.2.4 Analisi Viscosimetrica
Come strumento per le prove viscosimetriche è stato utilizzato un viscosimetro a diluizione di Ubbelohde.
Il viscosimetro viene immerso in un bagno termostatato (± 0.1°C) per garantire una temperatura costante durante la durata dell’analisi. La regolazione della temperatura è stata effettuata utilizzando un termostato MGW LAUDA MS. Sono state determinate le viscosità relative di soluzioni di polimeri in esame a varie concentrazioni, ottenute per diluizioni successive partendo da soluzioni iniziali a concentrazione nota e usando come solvente cloroformio. Dai valori di viscosità relativa sono state calcolate le viscosità inerenti. L’estrapolazione della viscosità inerente a zero fornisce il valore della viscosità intrinseca.
I tempi di deflusso del solvente puro e delle soluzioni polimeriche sono stati misurati mediante un dispositivo automatico digitale munito di due fotocellule SCOTT GERATE AVS 310.
2.2.5 Cromatografia ad esclusione molecolare (SEC)
I pesi molecolari medi e la distribuzione dei pesi molecolari è stata condotta tramite cromatografia ad esclusione molecolare usando una colonna PL Gel Mixed-C column, polistirene standard, e cloroformio come eluente.
2.2.6 Calorimetria a scansione differenziale (DSC)
L’analisi è stata effettuata mediante un calorimetro a scansione differenziale Perkin Elmer DSC Pyris Diamond collegato ad un computer per l’elaborazione dei dati. L’intervallo di temperatura esaminato è stato -65°C / 100°C e la velocità di raffreddamento 10°C/min
Le analisi sono state realizzate su 5-7 mg di sostanza pesata all’interno di apposite capsule di alluminio.
2.2.7 CARATTERIZZAZIONE SUPERFICIALE
Le più comuni tecniche di caratterizzazione superficiale per i polimeri sono: misure di angolo di contatto, ATR-FTIR, tecniche di spettroscopia superficiale quali XPS (ESCA) e SIMS. Altre tecniche quali SEM e AFM sono spesso utilizzate per studiare la morfologia della superficie e come essa sia modificata da trattamenti e modifiche superficiali.
2.2.7.1 Microscopia elettronica a scansione (SEM)
Cambiamenti morfologici dei film di poliuretani a seguito di differenti trattamenti sono stati monitorati mediante microscopia elettronica a scansione, utilizzando uno strumento Jeol JSM-5600 e lavorando a 12 kV effettuata dopo metallazione dei campioni con oro.
2.2.7.2 Microscopia a forza atomica (AFM)
L’analisi morfologica è stata eseguita mediante uno strumento Autoprobe CP system (Park ScientificInstruments PSI, Sunnyvale, CA) operando in modalità contatto. Le immagini topografiche di quadrati di area 5 μm × 5 μm sono state acquisite con microcantilever in nitruro di silicio con una costante elastica di 0.01 N/m, e con una raggio nominale di 40nm.
L’ analisi AFM è stata utilizzata anche per ottenere informazioni di tipo qualitativo riguardo le proprietà meccaniche dei poliuretani. Queste informazioni sono state ottenute facendo uso della tecnica FMM (Force Modulation Microscopy). FMM opera in modalità contatto ed è usata per determinare le variazioni nelle proprietà meccaniche superficiali quali elasticità, adesione o frizione.
L’ analisi AFM è stata inoltre utilizzata per investigare la forza di adesione tra una punta coperta con fosfolipide ed i campioni attraverso la tecnica standard della curva forza-distanza in soluzione acquosa (pH=7).
2.2.7.3 Spettroscopia di emissione fotoelettronica a raggi X
(XPS)
Le misure sono state effettuate con uno spettrometro Ultra AxisTM (strumento: Kratos Analytical, Manchester UK). I campioni sono stati irradiati con una radiazione monoenergetica Al Kα 1.2 (1486.6 eV) e gli spettri sono ottenuti con
una potenza di 144W (12 kV x 12 mA). La concetrazione elementare è data in percentuale atomica; si deve però considerare che questo metodo può determinare tutti gli elementi ad eccezione di idrogeno ed elio, per cui la determinazione della composizione non può considerare questi elementi.
2.2.7.4 TENSIONE SUPERFICIALE
La valutazione degli angoli di contatto è stata effettuata tramite l’utilizzo dello strumento CAM200 KSV INSTRUMENT. Lo strumento è dotato di una videocamera per l’ acquisizione dell’ immagine e di una sorgente luminosa. Il film polimerico viene posto su un piano posto tra la sorgente luminosa e videocamera. La deposizione della goccia avviene tramite una microsiringa. L’immagine viene acquisita su un supporto informatico che sfrutta il profilo della goccia per il calcolo dell’ angolo di contatto.
2.3 Modifica della massa
2.3.1 Sintesi di Dioli funzionalizzati
I dioli funzionalizzati sono stati sintetizzati a partire da due molecole.
La prima è una molecola commerciale, il serinolo o 2-ammino propandiolo. La funzionalità amminica di questo glicol viene fatta reagire con il gruppo carbossilico di un aminoacido.
L’altro diolo utilizzato è invece un prodotto di sintesi il 2-(6-aminoesil)propan-1,3-diolo, una molecola recante gli stessi gruppi funzionali del serinolo, ma che possiede una catena alifatica più lunga. Proprio questa catena alifatica viene sfruttata come spaziatore. Analogamente al caso precedente il gruppo amminico della molecola viene successivamente coinvolto nella formazione di un legame ammidico con amminoacidi o peptidi.
Sintesi N-Fmoc-2-aminopropano-1,3-diolo
In un pallone da 250ml sono stati introdotti 150 ml di cloruro di metilene a 0ºC, 0.63 mmol di Fmoc-Gly-OH, 0.63 mmol di HOBT , 0.63 mmol di HBTU e 1.26 mmol di DIPEA (N,N-Diisopropiletillammina). A parte il 2-aminopropan-1,3-diolo (0.57 mmol) è stato solubilizzato in 5 ml di DMF. La seconda soluzione è stata aggiunta a freddo e gradatamente alla prima soluzione sotto agitazione; la temperatura è stata portata a temperatura ambiente e quindi la reazione è stata fatta proseguire per tutta la notte Il solvente e la DMF residua, sono stati allontanati a pressione ridotta e il residuo è stato ripreso con etile acetato. Le fasi organiche sono state anidrificate e il grezzo purificato via cromatografia Flash (Eluente: CHCl3/MeOH : 95/5).
Il prodotto è stato caratterizzato mediante HPLC-massa. Il relativo cromatogramma è riportato in appendice
Sintesi di N-Fmoc-Glicinil-1 ossi, 2 metilossi 7 ammino eptano
Sintesi di dietil 2-(5-cianopentil)malonato
In un pallone da 250 mL, munito di agitatore meccanico, sono stati inseriti 25,3 mmoli di 6-bromocapronitrile, 25,3 mmoli di dietilmalonato, 26,6 mmoli di carbonato di potassio,mmoli di 18-corona-6.
La reazione è stata condotta a 80°C in 100 ml di toluene.
L’andamento della reazione è stato seguito tramite GC- massa ed è stata fatta terminare dopo 7 ore e 20 minuti; la fase organica e il crown sono stati poi separati tramite estrazioni con H2O e CH2Cl2. Una successiva distillazione a
pressione ridotta (T=140°C, P=1000 mtorr) ha permesso di separare il prodotto dai reagenti. Il residuo è costituito dal prodotto di reazione e appare come un liquido viscoso giallo.
Il prodotto è stato caratterizzato mediante analisi elementare, GC-massa, 1 H-NMR, FT-IR. (vedere appendice, figure: A3-6)
Resa: 71%
Analisi Elementare: Teorica: C: 61,18% ; N: 5,4% ; H: 8,23% ; O: 25,10% Sperimentale:C: 60.6% ; N: 5,29% ; H: 8,41% ; O: 25,7%
GC-Massa: M+1: 256, 25.7 min
FT–IR: 2939 cm-1(ν C-H); 2250 cm-1 (ν C≡N); 1726 cm-1 (ν C=O); 1465 cm-1 (δ
1
H-NMR: 600 MHz, CDCl3 : 1,18-1,2 (t, 6H); 1,3 (m, 2H); 1,42 (m, 2H); 1,6
(m, 2H); 1,82 (m, 2H); 2,28 (t, 2H); 3,24 (t, 1H); 4,12 (q, 4H)
Sintesi di 2-(6-aminoesil)propan-1,3-diolo
In una prova tipica, in un pallone a tre colli da 250 mL, munito di agitatore meccanico e refrigerante a bolle, sono stati introdotti sotto flusso di azoto, 70 mL di THF anidro, 14,63 mmoli di dietil 2-(5-cianopentil)malonato, goccia a goccia, e 43,89 mmoli di LiAlH4. Le aggiunte sono state effettuate alla temperatura di
0°C e dopo circa 30 minuti la temperatura è stata dapprima riportata a temperatura ambiente, quindi la miscela di reazione è stata scaldata a reflusso del solvente per 24 ore, sempre sotto agitazione.
Dopo 1 giorno la reazione è stata spenta aggiungendo 15g di Na2SO4 idrato. La
miscela di reazione è stata filtrata e lavata con THF. I sali sono stati recuperati ed estratti su soxhlet usando come solvente THF. La soluzione estratta è stata
aggiunta alla precedente ed il solvente è stato allontanato a pressione ridotta. Il residuo opalescente è stato purificato per trattamento con metanolo e
centrifugazione: il precipitato formatosi è stato separato e il solvente allontanato a pressione ridotta. Il prodotto appare come un liquido ambrato altamente
viscoso ed è stato caratterizzato mediante HPL-massa, analisi elementare e FT– IR (vedere appendice, fig. A7,A8)
Resa: 60%
Analisi Elementare: Teorica: C: 61.36 % ; O: 18.18 % ; N: 7,95 %; H: 11,93 % Sperimentale: C: 60.32 % ; O: 18.58 % ; N: 8.45 %; H: 12,65 %
HPL-massa: (H2O/actonitrile/acido formico); 18,2 min; M+1 = 176,16
FT–IR: 3400 cm-1(ν N-H); 3290 cm-1 (ν Ο−Η); 2923 cm-1- 2854 cm-1 (ν C-H);
1600 cm-1 (δ N-H); 1463 cm-1 (δ C-H); 1372 cm-1(δ O-H); 1040 (ν C-O).
Sintesi di N-Fmoc-Glicinil-1 ossi, 2 metilossi 7 ammino eptano
In una prova tipica, in pallone da 100ml sono stati introdotti 10 ml di acetonitrile a 0ºC, 0.63 mmol di Fmoc-Gly-OH, 0.63 mmol di HOBT, 239 , 0.63 mmol di HBTU e 1.26 mmol di DIPEA (N,N-Diisopropiletillammina). A parte l’1 ossi, 2 metilossi, 7 ammino eptano (0.57 mmol) è stato solubilizzato in 5 ml di DMF. La seconda soluzione è stata aggiunta a freddo e gradatamente alla prima soluzione sotto agitazione; la temperatura è stata portata a temperatura ambiente e quindi la reazione è stata fatta proseguire per tutta la notte.
Il solvente e la DMF residua, sono stati allontanati a pressione ridotta e il residuo è stato ripreso con etile acetato. Sono state eseguite nell’ordine: una estrazione
neutra (acqua), una acida (KHSO4 5%), un’altra neutra (acqua), una basica
(NaHCO3 10%) e infine 3 neutre (acqua). Le fasi organiche sono state
anidrificante e il grezzo purificato via cromatografia Flash (Eluente: etere di petrolio b.b./etile acetato: 8/2).
Il prodotto è stato caratterizzato mediante HPLC-massa, analisi elementare e 1H– NMR (vedere appendice, fig. A9, A10)
Resa : 60%
Analisi Elementare: Teorica: C: 68,64 % ; O: 17,60 % ; N: 6.16 %; H: 7,54 % ; Sperimentale: C: 69.55% ; O: 16,81 % ; N: 6.33%; H: 7.31%
HPLC- massa: (H2O/actonitrile/acido formico); min.: 22,3
NMR: 400 MHz; δ CDCl3 : 7.78-7.76 (d, 2H); 7.60-7.58 (d,2H); 7.42-7.39 (t,
2H); 7.34-7.30 (t, 2H); 6.00 (b, 1 N-H);5.5 (b, 1 N-H); 4.46-4.44 (d, 2H); 4.24-4.21(t, 1H); 3.85 (s, 2H); 3.81-3.77(dd, 2H); 3.66-3.46(dd, 2H); 3.27-3.26 (dd, 2H); 1.90(m, 1H); 1.80 (dd, 2H); 1.75 (m, 8H).
2.3.2 Sintesi di diammine funzionalzzate
Questi estensori sono stati sintetizzati sfruttando le due funzionalità amminiche presenti nella lisina. Il gruppo carbossilico di questo amminoacido viene poi coinvolto nella formazione di legami ammidici con un aminoacido, un peptide o con una molecola utilizzata come spaziatore.
2.3.2.1 SINTESI Peptide sRGD
(LysAmcGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBuGlyOMe)
La sintesi è stata realizzata secondo i protocolli standard per la sintesi peptidica in fase solida, seguendo la strategia Fmoc.
Il coupling degli aminoacidi è stato condotto, secondo quanto riportato nello schema 2.3.2.a, con un eccesso di reattivi pari a 3 equivalenti rispetto alla resina in ambiente basico di DIPEA. Il sistema di reattivi adottato è stato HOBt e HBTU, per aumentare l’efficienza del coupling (L. Carpino). La verifica del coupling è stata effettuata tramite Kaiser Test (test qualitativo per la presenza di gruppi amminici). La rimozione dello Fmoc è stata fatta in una soluzione di piperidina al 20% in DMF per 1h. La rimozione della resina Super Acid Sensitive, è stata effettuata mediante esafluoroisopropanolo (HFIP). La reazione di metilazione è stata condotta con il sistema EDC/HOBt in presenza di DIPEA con un forte eccesso di metanolo. Una volta metilato il peptide èstato purificato via Flash Chromatography, eluente etere di petrolio e etile acetato.
Il carbobenzossicarbonile, gruppo protettivo.della funzionalità amminica terminale è stato rimosso via Pd/C in CH2Cl2. Dopo filtrazione su celite si
precipita il peptide con etere.
Il prodotto è statocaratterizzato mediante HPLC-MS (eluente H2O/actonitrile/acido formico, m/z = 512.7; strumento: Biosystem Mariner
System 5220). Il relativo cromatogramma viene riportato in appendice (vedere appendice, fig. A1, A2).
1- pip 20% in DMF
2- FmocAsp(OtBu)OH; HOBt; HBTU; DIPEA (3 eq)
FmocGly
FmocAsp(OtBu)Gly
1- pip 20% in DMF
2- FmocGlyOH; HOBt; HBTU; DIPEA (3 eq)
FmocGlyAsp(OtBu)Gly
1- pip 20% in DMF
2- FmocArg(Pbf); HOBt; HBTU; DIPEA (3 eq)
FmocArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)Gly
1- pip 20% in DMF
2- FmocGlyOH; HOBt; HBTU; DIPEA (3 eq)
FmocGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)Gly
1- pip 20% in DMF
2- FmocAmcOH; HOBt; HBTU; DIPEA (3eq)
3- pip 20% in DMF
4- ZLys(Z)OH; HOBt; HBTU; DIPEA (3 eq)
ZLys(Z)AmcGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)Gly
ZLys(Z)AmcGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)GlyOH
Doppio ciclo di sblocco con HFIP/DCM R R R R R R
ZLys(Z)AmcGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)GlyOH ZLys(Z)AmcGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)GlyOMe ZLys(Z)AmcGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)GlyOMe HLysAmcGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBu)GlyOMe EDC; HOBT; DIPEA MeOH Pd/C DCM
Schema 2.3.2.a : Sintesi del peptide RGDspacer
2.3.2.2 SINTESI Peptide RGD
(LysGlyArg(Pbf)GlyAsp(OtBuGlyOMe)
La sintesi di questo peptide è stata effettuata secondo la stessa procedura
riportata nel precedente paragrafo. L’unica differenza consiste nell’assenza di un residuo, l’acido esaminopropanoico, usato come spaziatore nell’altra sequenza peptidica.
Il prodotto è statocaratterizzato mediante HPLC-MS (eluente H2O/actonitrile/acido formico, m/z = 456,2; strumento: Biosystem Mariner
System 5220). Il relativo cromatogrammaviene riportato in appendice (figura).
2.3.3 Sintesi Poliuretani-uree funzionalizzate
La sintesidi questi polimeri è stata realizzata come descritto nel paragrafo 2.1, utilizzando come estensoridi catena, le sequenze peptidiche RGD e RGD spacer di sintesi. Al termine della polimerizzazione, le protezioni presenti sulle catene laterali dei peptidi, sono state rimosse mediante trattamento con TFA e TIS.
2.4 Modifica superficiale mediante trattamento
al plasma
Film di poliuretani sono stati realizzati per casting da soluzioni al 3% in cloroformio. Sui film è stata realizzata una deposizione di acido poliacrilico attraverso una polimerizzazione effettuata in un reattore al plasma ad Argon
(Plasma System Junior SN 001/072, Europlasma, Belgium) I film sono stati inizialmente introdotti nel reattore per 60 secondi, P = 200 mTorr, ad una potenza di 200 W al fine di creare radicali perossidici sulla superficie.
Successivamente sui film è stato nebulizzato acido acrilico e quindi nuovamente trattato al plasma per 60 secondi, P = 500 mTorr, ad una potenza di 200 W.
Al termine i film sono stati lavati ed è stata verificata la presenza di gruppi carbossilici sulla superficie tramite analisi ATR.
Sono state condotte due differenti procedure peril coupling con biopolimeri. Nel primo studio il film polimerico aggraffato con acido acrilico è stato immerso in una soluzione tampone a pH 5 al 5% in peso di EDAC per circa 20 ore.
Il film così trattato è stato poi immerso per una notte in una soluzione all’1% in peso di proteina, infine lavato, provocando così l’immobilizzazione della macromolecola sulla superficie del materiale. In questo stadio si è operato in soluzione tampone a pH 8 in un caso e pH 9 nell’altro.
Nel secondo studio le condizioni sono state analoghe alle precedenti ma nella fase di attivazione, oltre alla EDAC è stata utilizzata anche la NHS (soluzione al 5% in peso di EDAC, soluzione al 0.1% in peso di NHS, rapporto EDAC: NHS ~ 3:1).
Come biopolimeri sono stati utilizzati gelatina di tipo A e poli-L-lisina. L’avvenuta immobilizzazione di gelatina e polilisina è stata verificata da analisi ATR, AFM, XPS e SEM.
2.5 Microfabbricazioni
Nel nostro studio sono state realizzate strutture tramite il sistema PAM (Pressure Activated Microsyringe) messo a punto presso il Centro interdipartimentale di Ricerca “E. Piaggio”.
Tale sistema è costituito da una siringa a controllo numerico che si può muovere lungo i tre assi cartesiani. Il supporto di deposizione è costituito da un normale vetrino per microscopio. Il polimero da deporre, una volta sciolto nell’opportuno solvente (nel nostro caso cloroformio) viene estruso attraverso un piccolissimo ago in vetro (diametro interno della punta compreso tra 5 e 20 μm) assicurato ad un recipiente cilindrico in acciaio disposto lungo l’asse z e contenente la soluzione polimerica al 3%. Il sistema può essere assimilato ad una siringa in grado di estrudere il polimero in essa contenuto mediante un meccanismo pneumatico a pressione controllata. A monte del sistema vi è infatti una valvola elettronica interfacciata al PC in grado di regolare la pressione in uscita dell’aria compressa in un range compreso tra 0 e 300 cBar, con una precisione di 1 cBar e una costante di tempo di circa 1 secondo. Il computer controlla non soltanto la pressione applicata, ma anche il
posizionamento della siringa. Il dispositivo dispone inoltre di un CAD appositamente sviluppato che permette di disegnare la struttura strato per strato. La realizzazione dello scaffold è ottenuta facendo muovere il substrato di deposizione lungo gli assi x e y. Una volta deposto uno strato, questo viene ricoperto con un film di un polimero solubile in un solvente diverso da quello del polimero utilizzato; la siringa viene quindi alzata di un tratto dz e il sistema ricomincia la deposizione di un nuovo strato.
Nel nostro caso sono state realizzate tre tipi di strutture: quadrata, esagonale e ottagonale. Sono state scelte queste strutture a titolo esemplificativo: la struttura quadrata in quanto la più semplice struttura realizzabile; quella esagonale mima la struttura elementare della cornea; lo scaffold a geometria ottagonale è invece rappresentativo delle strutture poligonali che si ritrovano abitualmente nei tessuti animali.
2.6 Test di citotossicità
Sono stati eseguiti test di citotossicità sui poliuretani prchè essendo polimeri di sintesi, necessitano di una preliminare verifica della loro idoneità per applicazioni biomediche. Il test consiste nel valutare la presenza di rilasci tossici da parte dei materiali, quando questi sono immersi in terreno di coltura. I test sono stati effettuati su film per casting con dimensioni 1.5×1.5 cm2 e, per ciascun
materiale, si sono adoperati tre campioni per ogni tempo di prova.
I campioni sono stati inizialmente sterilizzati tramite una soluzione al 70 % (v/v) di etanolo (Aldrich) in acqua sterile e poi sottoposti ai raggi UV per 15 min per lato. Successivamente sono stati immersi in 2 ml di terreno di coltura all’interno dei pozzetti di piastre di coltura da 24 celle. Si è adoperato il mezzo di coltura DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Cambrex ) con un’alta quantità di glucosio, il 10 % di siero fetale bovino(Cambrex), l’1 % di glutammina (Cambrex), penicillina (200 U/ml; Cambrex), e streptomicina (200 μg/ml; Cambrex).
I campioni sono stati mantenuti alla temperatura di 4 °C per vari tempi: 1,2, 3, 7, 10, 15 giorni. Ad ogni tempo, il terreno di coltura è stato sostituito con terreno fresco, mentre sul terreno prelevato sono stati eseguiti test di adesione cellulare. Precisamente, il test di adesione cellulare è stato condotto su ciascun mezzo di coltura a 4, 24 e 48 h, adoperando fibroblasti di topo NIH-3T3.
Successivamente, dopo 4, 24 e 48 h, le cellule sono state fissate con una soluzione al 4 % (v/v) di formaldeide (Sigma; Italy) in tampone fosfato (PBS, Sigma), e colorate con una soluzione di blue di Coomassie (Fluka, Italy). Si sono usati come controllo i fibroblasti coltivati in un mezzo di coltura nel quale non sono stati immersi i campioni di poliuretani o di poliuretani-uree. I vari pozzetti sono stati analizzati al microscopio ottico (Olympus AX70), e il rapporto tra il
numero delle cellule nei mezzi che contenevano i film di poliuretani o di poliuretani-uree e il numero delle cellule nel mezzo di controllo è stato assunto come indice della non-citotossicità dei mezzi di coltura e, quindi, dei corrispondenti campioni con i quali i mezzi di coltura sono stati in contatto. Precisamente, un elevato valore di tale rapporto indica che i campioni sono biocompatibili, viceversa un basso valore del rapporto è indice della citotossicità dei campioni.
2.7 Test di adesione e prolifererazione
I film polimerici sono stati preparati per le culture cellulari, in accordo con la seguente procedura. I campioni asciutti, sono stati sterilizzati per lavaggio con una soluzione sterile di etanolo al 70%, seguita da esposizione ai raggi UV per 15 minnuti da ogni lato. I film sono stati immersi per un’ora in una soluzione acquosa all’1% di gelatina (selezionata come controllo positivo). Fibroblasti di topo del tipo NIH-3T3 sono stati mantenuti in un terreno DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium ; Cambrex, Italy) con un’elevata concentrazione di glucosio (4.5 g/L), 10% di siero bovino fetale (Cambrex, Italy), 1% glutamina (Cambrex, Italy), penicillina (200 U/ml) (Cambrex, Italy) e streptomicina (200 µg/ml) (Cambrex, Italy). Le culture sono state mantenute in un incubatore
bilanciato con il 5% di CO2 a 37°C . I film di poliuretano sono stati seminati con
una sospensione di 100.000 cellule/mL. Dopo tempi di cultura corrispondenti rispettivamente a 4, 24, 48 h, sono stati fissati con una soluzione al 4% in
volume di formaldeide (Sigma, Italy) in tampone fosfato (PBS, Sigma) e colorati con soluzione di Coomassie blue (Fluka, Italy). I campioni sono stati analizzati con microscopio ottico (Olympus AX70) e il rapporto tra il numero di cellule sul film di poliuretano e l’area totale del substrato polimerico, è stato calcolato come indice di densità cellulare.
2.8 PROVE in vivo
Per le prove (effettuate presso i laboratori biologici del CNR, Pisa), sono stati utilizzati quattro topi, dopo avere verificato il loro perfetto stato di salute. L’intervento chirurgico è stato condotto in anestesia totale. I topi sono stati fissati su un piano in posizione supina, e sono state individuate tre posizioni nella zona lombare del topo, dove effettuare l’impianto sottocutaneo (tra derma ed epidermide) delle tre strutture selezionate. Per ogni topo, la posizione relativa degli scaffolds impiantati è stata cambiata, per verificare la dipendenza dei risultati dal sito d’impianto. Il quarto topo è stato operato per avere un margine
di sicurezza, nel caso si potesse verificare qualche inconveniente per i tre topi necessari per la prova. Le tre incisioni sulla zona lombare del topo sono state poi richiuse con tre punti di sutura, di cui solo uno non bioassorbibile, per permettere l’individuazione precisa della zona operata. L’esame istologico delle varie strutture è stato effettuato su ciascun topo dopo 1, 3 e 6 mesi. Precisamente, in corrispondenza dei siti d’impianto, la struttura è stata prelevata effettuando un’incisione tramite un apposito bisturi circolare, detto punch.
Poi i campioni sono stati fissati con una soluzione di formaldeide al 4 % w/v in tampone fosfato (PBS), lavati con una soluzione di PBS e fissati con una soluzione di tetrossido di osmio (Aldrich) al 4 % w/v per 2 h. Dopo i campioni sono stati disidratati con soluzioni ad acetone (Aldrich) a concentrazioni crescenti e, poi, inseriti all’interno della resina epossidica Spurr. A questo punto si sono ricavate tramite microtomo sezioni sottili di 1 μm di spessore, che sono state colorate tramite blu di toluidina (Fluka) nel caso dello scaffold in PU4-H e con ematossilina-eosina (Fluka) nel caso del film di PU4-H e della struttura in PLGA. Infine, i campioni sono stati esaminati al microscopio ottico (Olympus AX70, Italia) per l’esame istologico.
