KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
Vilma Armoškaitė
Žaliosios arbatos ištraukų kokybės analizė ir
antioksidacinio aktyvumo tyrimas
(Magistrinis baigiamasis darbas)
Darbo vadovai:
prof. V. Briedis
doc. K. Ramanauskienė
Padėka
Uţ suteiktas kokybiško darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą „Ţaliosios arbatos ištraukų kokybės analizė ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas“ dėkoju Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedros vedėjui prof. A. Savickui ir visam kolektyvui.
Uţ pagalbą dėkoju:
• KMU Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedros lektorei G. Kasparavičienei uţ konsultacijas, rengiant bei tobulinant spektrofotometrinių tyrimų metodiką;
TURINYS
ĮVADAS ... 5
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 8
1.1 Arbatos, jų rūšys bei ţaliosios arbatos kaip gėrimo paplitimas pasaulyje. Arbata –Europos farmakopėjos (Eur. Ph.) straipsnių objektas ... 8
1.2. Arbatmedis. Jo paplitimo arealai ... 8
1.3. Camellia sinensis L. ţaliavos cheminė sudėtis ... 9
1.4. Ţaliosios arbatos gydomosios savybės. Camellia sinensis L. ţaliavos aktualumas medicininiuose tyrimuose ... 9
1.5. Arbatos ţaliavos pramoninė paruoša ir paruoša vaistinėje ... 11
1.6. Arbatos standartiniai gamybos būdai (uţpilai ir nuovirai) ir jų palyginimas su buitiniu arbatos ruošimo metodu ... 12
1.7. Pagrindiniai ekstrakcijos dėsniai bei ypatumai, jų svarba buitinių ištraukų, uţpilų ir nuovirų gamybos technologijoje ... 13
1.8. Fenoliniai junginiai, jų poklasis – flavonoidai. Fenolinių junginių ir flavonoidų struktūra, panaudojimas, analizės metodai ... 15
1.9. Laisvieji radikalai ir jų poveikis organizmui. Aktyviosios deguonies formos ... 17
1.10. Antioksidaciniai procesai bei medţiagos. Antioksidantai ţaliojoje arbatoje ... 19
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 21
2.1.Medţiagos ir metodai ... 21
2.1.1. Medţiagos ir tirpikliai ... 21
2.1.2. Ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų paruošimas ... 22
2.1.3. Ţaliosios arbatos metanolinių ekstraktų paruošimas ... 22
2.1.4. Nuodţiūvio nustatymas (pagal Eur. Ph. 01/2002, 2.2.32) ... 23
2.1.5. Fenolinių junginių kiekio nustatymas, pritaikant spektrofotometrinį metodą ... 23
2.1.6. Bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymas, atliekamas, naudojant DPPH* radikalo ir ABTS* radikalo surišimo testą ... 24
2.1.7. Ţaliosios arbatos kokybinės sudėties nustatymas ESC metodu ... 26
2.2. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas ... 28
2.2.1. Ţaliosios arbatos ţaliavos vandeninių buitiniu metodu paruoštų ištraukų sauso likučio, fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatų aptarimas. ... 28
2.2.2. Uţpilų ir nuovirų kokybės, priklausomos nuo technologinių parametrų, tyrimas ... 30
2.2.3 Ţaliosios arbatos ţaliavų veikliųjų medţiagų kokybės ir kiekybės tyrimas, pritaikant ESC metodą ... 33
2.2.4. Ţaliosios arbatos kietojo preparato, ţaliosios arbatos ekstrakto kapsulių ,,Sanitas“, kokybės tyrimas ... 37
IŠVADOS ... 39
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40
SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS
AGA – Amerikos Gastroenterologų asociacija BAM – biologiškai aktyvios medţiagos DAD – diodų matrica
DC – dujų chromatografija
DNR – deoksiribonukleino rūgštis ECG – epigalokatechinai
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija Eur. Ph. – Europos farmakopėja
GC – galokatechinai KFE - kietafazė ekstrakcija MTL – maţo tankio lipoproteinai MS – masių spektroskopinis
PBS - phosphate buffered saline/fosforo ir druskos buferinis tirpalas r. - rūgštis
SC – skysčių chromatografija UG - ultragarsas
ĮVADAS
Problemos aktualumas ir naujumas
Lietuvoje ir visame pasaulyje šiuo metu ţalioji arbata yra vienas populiariausių gėrimų, tačiau jos kokybės bei kiekybės tyrimų nėra gausu.
Ţalioji arbata yra svarbi tiek kasdieninio vartojimo, tiek mokslinių tyrimų poţiūriu. Iš vienos pusės - tai vienas populiariausių gėrimų pasaulyje, iš kitos – tai svarbus ir populiarus mokslinių tyrimų objektas.
Šiuo metu mokslininkai itin susidomėję ţaliosios arbatos poveikiu sveikatai. Keletas naujų tyrimų atskleidė įdomių ir informatyvių faktų apie arbatos gydomąsias savybes. Atlikti tyrimai rodo, kad arbata turi teigiamą poveikį kepenų, inkstų, krūtų vėţio prevencijai, padeda atsikratyti antsvorio, maţina maţo tankio lipoproteinų (MTL) kiekius kraujyje, gerina kraujotaką, tonizuoja bei gerina kasdieninę savijautą [1].
Aktualumas
Esant labai dideliam ţaliųjų arbatų asortimentui, sunku tokioje įvairovėje atsirinkti, kuri arbata yra kokybiška. Todėl šio tyrimo metu buvo siekiama ištirti keturias ţaliosios arbatos ţaliavas, pasirinktas iš gausaus jų asortimento rinkoje, įvertinti jų kokybę ir kiekybinę sudėtį, nustatyti ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų ruošimo būdą, garantuojantį optimalų ţaliosios arbatos veikliųjų komponentų išsiekstrahavimą.
Moksliniu poţiūriu aktualu tai, kad ţalioji arbata pasiţymi antioksidacinėmis, tonizuojančiomis, sutraukiančiomis savybėmis. Šios savybės gali būti ir yra panaudojamos įvairių ligų prevencijai ir gydymui.
Tyrimo problema - ţaliosios arbatos ištraukų paruošimo technologijos, siekiant išgauti kuo didesnius veikliųjų medţiagų kiekius, ţaliosios arbatos ţaliavų veikliųjų medţiagų kokybinė sudėties ir kiekybinio jų įvertinimo tyrimų trūkumas Lietuvoje.
Tyrimo tikslas - ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų fenolinių junginių kokybinė bei kiekybinė analizė ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas
Tyrimo objektas – ţaliosios arbatos vandeninės ištraukos. Tyrimui įgyvendinti pasirinktos keturios ţaliosios arbatos ţaliavų rūšys (1 pav):
Tyrimo uždaviniai:
1) Buitiniu metodu pagaminti ţaliosios arbatos vandenines ištraukas, atlikti ekstrahavimo laiko ir ţaliavos rūšies įtakos ištraukų kokybei tyrimą, t.y. ištirti:
a) Sausą likutį (gravimetriniu metodu);
b) Bendrą fenolinių junginių kiekį (spektrofotometrijos metodu); b) Antioksidacinį aktyvumą (spektrofotometrijos metodu).
2) Pagaminti vandenines ţaliosios arbatos ištraukas standartiniu gamybos metodu (uţpilus ir nuovirus). Įvertinti ţaliavos rūšies ir infundavimo įrangos įtaką ţaliosios arbatos uţpilų ir nuovirų kokybei.
3) Palyginti buitiniu metodu ruošiamų vandeninių ištraukų ir standartiniu gamybos būdu (uţpilai ir nuovirai) paruoštų vandeninių ištraukų kokybę pagal bendrą fenolinių junginių kiekį ir sausą likutį.
4) Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (ESC) identifikuoti veikliuosius ţaliosios arbatos ţaliavų junginius, priskirti antioksidacines savybes atskiriems junginiams.
1) 2)
3)
1 pav. Tyrimo objektai. 1 - Arbata „Banča“, 2 - Arbata „Maxima“, 3 – Arbata „Majski“, 4 – Arbata „Dilmah“, 5 – Ţaliosios arbatos ekstrakto „Sanitas“ kapsulės
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Arbatos, jų rūšys bei žaliosios arbatos kaip gėrimo paplitimas pasaulyje. Arbata – Europos farmakopėjos (Eur. Ph.) straipsnių objektas
Arbata – tai gėrimas, ruošiamas dţiovintus maţalapio kininio arbatmedţio (Camellia sinensis sinensis), didţialapio analogo (Camellia assamica) ir jų hibridų lapus ir pumpurus kelioms minutėms uţpylus karštu vandeniu. Arbata taip pat vadinami perdirbti ir išdţiovinti kininio arbatmedţio lapai (arbatţolės) [1]. Tai antras pagal populiarumą gėrimas pasaulyje po gryno vandens [2].
Augalinių arbatų (Plantae ad ptisanam) sudėtyje yra vienas ar daugiau ţolinių komponentų. Augalinės arbatos įvardijamos kaip natūralūs vaistiniai preparatai, vartojami į vidų vandeninių ištraukų forma, pagaminta maceracijos, infuzijos ar nuovirų gamybos metodu. Uţpilai, nuovirai ir maceratai gaminami prieš pat vartojimą (ex tempore) [35].
Išskiriamos dvi arbatos rūšys:
1) Juodoji arbata ruošiama renkant nuo jaunų ūglių lapelius, juos vytinant. Vytinimo metu arbatos lapeliai nepilnai dţiovinami, juose sumaţėja vandens kiekis. Suvytinti lapai sukami (talpinami tarp dviejų būgnų, kurie lapus suspaudţia ir ţaliava netenka dar daugiau vandens). Vanduo ar sultys nusėda ant lapelių, vyksta oksidacijos procesai. Fermentavimo proceso metu lapeliai laikomi drėgnai ir vėsiai, atsiranda juoda spalva ir aromatas. Galutinėje stadijoje tokia lapų masę dţiovinama karštu oru.
2) Ţalioji arbata gaminama be fermentacijos stadijos. Dţiovinant karštu oru, inaktyvuojami fermentai, aromatingųjų medţiagų lieka maţiau, lapeliai lieka ţalios spalvos.
1.2. Arbatmedis. Jo paplitimo arealai Klasifikacija:
Karalystė – augalų (Plantae), eilė – erikinių (Ericaceae), šeima – arbatmedinių (Theaceae), gentis – arbatmedinių (Camellia), rūšis – kininis arbatmedis (Camellia sinensis L.).
XVI a. Augalinė ţaliava (AŢ)– lapai. Paruošos renkamos nuo trimečių augalų. Skinami viršutiniai 2-3 lapeliai [33].
1.3. Camellia sinensis L. žaliavos cheminė sudėtis
1) Purino grupės alkaloidai 4 proc. Pagrindinis iš jų – kofeinas (iki 4 proc.), teobrominas (0,2 proc.), teofilinas (0,4 proc.);
2) Fenoliniai junginiai 2,5 – 5 proc. Jiems priskiriami flavonoidai, fenolinės rūgštys, katechinai;
a) Flavonoidai (iš jų gausiausia katechinų grupė):
1) galokatechinai (GC); 2) epigalokatechinai (ECG); 3) epigalokatechin-3-galatai; 4) galokatechingalatai; 5)epikatechingalatai [11].
b) Fenolinės rūgštys (galo r. (rūgštis), chlorogeninė r., kavos r.) ; 3) Aminorūgštys 1 proc.;
4) Eteriniai aliejai iki 0,02 proc.;
5) Mineralinės medţiagos (kalio jonai, chloridai);
6) Rauginės medţiagos 10 – 20 proc. (suteikia sutraukiantį skonį) [34].
1.4. Žaliosios arbatos gydomosios savybės. Camellia sinensis L. žaliavos aktualumas medicininiuose tyrimuose
Ţalioji arbata paskutiniu metu tapo didelio susidomėjimo bei intensyvių mokslinių tyrimų objektu. Pagrindinės suinteresuotumo ja prieţastys - poveikių organizmui gausa ir įvairovė.
Arbatos poveikiai organizmui:
1) dėl kofeino pasiţymi tonizuojančiu, suţadinančiu poveikiu, gerina širdies darbą, teobrominas ir teofilinas skatina diurezę;
2) dėl flavonoidų šie junginiai dalyvauja oksidacijos - redukcijos reakcijose, maţina kapiliarų pralaidumą, didina jų elastingumą, apsaugo askorbo rūgštį nuo oksidacijos;
3) dėl fluoridų apsaugo dantis nuo karieso;
4) rauginės medţiagos pasiţymi sutraukiančiu poveikiu, todėl stabdo viduriavimą.
Medicininio pobūdžio moksliniai tyrimai, atliekami su žaliosios arbatos augaline žaliava
Alabamos universiteto mokslininkas dr. Santosh K. Katiyar kartu su bendradarbiais, atlikdami tyrimus mėgintuvėlyje ir su pelėmis, nustatė, kad arbatoje esantys fenoliniai junginiai turi savybę slopinti krūties vėţio ląstelių augimą ir lėtinti metastazių išplitimą į kitus organus. Nustatyta, kad veikiant metastazavusias krūties vėţio ląsteles ţaliosios arbatos fenoliniais junginiais, galima jas net sunaikinti. Maitinant peles ţaliosios arbatos kiekiais, perskaičiuotais pagal ţmogaus suvartojamos arbatos kiekį, buvo nuslopintas vėţio išplitimas plaučiuose, o pelių išgyvenamumas padidėjo [24].
Medicinos mokslų dr. Constance E. Ruhl ir dr. James E. Everhart atlikto tyrimo publikacija atspausdinta Amerikos gastroenterologų asociacijos (AGA) ţurnale „Gastroenterologija“. Joje teigiama, kad ţmonės, turintys didesnę riziką sirgti kepenų ligomis, gali ţymiai sumaţinti šią riziką, išgerdami per dieną daugiau nei du puodelius kavos ar arbatos. Šis profilaktinis efektas pasireiškia tik ţmonėms, turintiems didesnę riziką sirgti kepenų ligomis dėl daţno alkoholio vartojimo, antsvorio ar diabeto. Tyrime dalyvavo 9849 dalyviai. Tiriamieji suvartojo nuo 0 iki 16 puodelių per dieną, vidutiniškai - po du puodelius per dieną. Nustatyta, kad tiems, kurie išgerdavo daugiau nei du puodelius kavos ar arbatos kasdien, lėtinės kepenų ligos išsivystė perpus rečiau, negu tiems, kurie išgerdavo maţiau nei vieną puodelį per dieną. Per pastaruosius keletą metų vis stiprėjo prielaida, kad kava ir arbata maţina cirozės ir kepenų vėţio riziką. Šis tyrimas patvirtina galimą kavos bei arbatos profilaktinį efektą lėtinėms kepenų ligoms ir cirozei. Ţaliosios arbatos tegiamas poveikis kepenims grindţiamas kofeino poveikiu, tačiau galutinis veikimo mechanizmas nėra aiškus [24].
Nustatyta, kad ţalioji arbata apsaugo širdį, išlaikydama vainikines arterijas lankstesnes bei atsipalaidavusias, dėl to jos gali lengviau atlaikyti kraujo spaudimo pokyčius. Ultragarsu (UG) nustatyta, kad 14 ţaliąją arbatą gėrusių tiriamųjų širdies kraujagyslės po 30 minučių buvo labiau išsiplėtusios nei gėrusiųjų kofeiną arba karštą vandenį. Tai paaiškinama ţaliosios arbatos poveikiu kraujagysles sudarančioms ląstelėms, kurios išskiria specialias kraujagysles atpalaiduojančias ir jų spindį plečiančias medţiagas. Arbatoje esantys flavonoidai veikia kaip antioksidantai, apsaugantys organizmą nuo uţdegimo ir krešulių formavimosi (pirminės širdies priepuolių prieţasties) [27].
vieną puodelį per dieną [14]. Išgeriantiems vieną puodelį arbatos per dieną širdies infarkto rizika sumaţėja 44 proc. palyginti su tais, kurie arbatos visai negeria.
Arbatţolių flavonoidai maţina cholesterolio koncentraciją kraujo plazmoje. Norvegijoje ištirta, kad išgeriant per dieną vieną puodelį arbatos cholesterolio kiekis sumaţėjo 6 proc., išgeriant vieną arba du puodelius - 12 proc., išgeriant 3-7 puodelius - 19 proc., lyginant su visiškai negeriančiais arbatos [15]. Nustatyta, kad arbata sumaţina cholesterolio koncentraciją ne tik tų ţmonių, kurių kraujo plazmoje cholesterolio per daug, bet ir tų, kurių koncentracija normali.
Analizuojant duomenis apie arbatos įtaką įvairios lokalizacijos piktybinių ligų rizikai maţinti, inkstų akmenligei gydyti, matyti, kad 2-3 puodeliai arbatos per dieną sumaţina inkstų akmenligės riziką apie 30 proc. Ţaliosios arbatos veikliosioms medţiagoms būdingos antimutageninės ir antikancerogeninės savybės [36].
Vertinant ţaliąją arbatą kokybinės sudėties atţvilgiu, svarbiausios jos veikliosios medţiagos - katechinai – jų sausose ţaliosios arbatos arbatţolėse būna iki 30 proc., o viename jos puodelyje - iki 200 miligramų [11].
1.5. Arbatos žaliavos pramoninė paruoša ir paruoša vaistinėje
Vaistaţolių mišinys - tai kelių susmulkintų vaistaţolių ar vieno vaistinio augalo ţaliavos mišinys, kartais su eterinių aliejų, druskų ir kitais priedais. Būna išimčių, kai vaistaţolės vartojamos nesusmulkintos. Vaistaţolių smulkinimas priklauso nuo mišinio paskirties. Kiekviena ţaliavos rūšis smulkinama atskirai (smulkinama visa AŢ, nieko neišmetant). Lapai, ţolės, ţievės karpomi arba pjaustomi specialiomis mašinomis. Smulkumo laipsnis priklauso nuo mišinio paskirties [22].
AŢ mišiniai, skirti uţpilams bei nuovirams gaminti, ruošiami pagal farmakopėjos straipsnio "Infusa et decocta" reikalavimus. Susmulkinus ţaliavą, nuo jos visada sijojamos dulkės (sieto angelių diametras 0,2 mm). Susmulkintos ir per sietus išsijotos ţaliavos sumaišomos tarpusavyje plačioje grūstuvėje, dubenyje ar ant popieriaus lapo. Maišoma šaukštu, lopetėle ar kitais tinkamais įrankiais. Pirmiausia sveriama ţaliava, kurios mišinio sudėtyje yra daugiausia. Paruošto mišinio negalima kratyti, nes jis gali išsisluoksniuoti (dalelės skiriasi savo tankiu ir dydţiu). Dţiovinant temperatūra turi būti ne didesnė kaip 60° C [3]. Vaistinėje tikrinant vaistaţolių mišinių kokybę, nustatoma bendra vaistaţolių išvaizda, spalva, kvapas, kurie turi būti būdingi pavartotiems ingredientams .
Analizei imamas nuo 1 iki 10 g vidutinis mėginys (priklausomai nuo mišinio smulkumo bei lengvumo), identifikuojamos jo sudėtinės dalys. Vaistaţolių smulkinimo kokybė nustatoma mišinį nusijojus per atitinkamus sietus.
1.6. Arbatos standartiniai gamybos būdai (užpilai ir nuovirai) ir jų palyginimas su buitiniu arbatos ruošimo metodu
Uţpilai ir nuovirai - tai vandeninės vaistaţolių ištraukos arba specialių, tam tikslui skirtų ekstraktų vandeniniai tirpalai, skirti gerti ir vartoti iš išorės. Į vandenines ištraukas gali būti dedamos medţiagos, turinčios skirtingų fizinių ir cheminių savybių.
Uţpilų ir nuovirų gamybos stadijos: vaistinės augalinės ţaliavos smulkinimas, dulkių nusijojimas, ekstrahavimas (kaitinant ir aušinant), košimas, pagamintos ištraukos tūrio patikslinimas, įpakavimas ir apipavidalinimas. Lapai ir ţolė smulkinami ne didesnėmis kaip 5 mm dalelėmis. Šaknys, šakniastiebiai, stiebai ir ţievė smulkinami ne didesnėmis kaip 3 mm dalelėmis, o vaisiai ir sėklos - ne didesnėmis kaip 0,5 mm. Jei ţaliavos smulkumas pageidautinas kitoks - tai turėtų būti nurodyta norminiuose dokumentuose [34]. Susmulkinta AŢ sijojama nuo dulkių ir sveriama. Jeigu vaistinės augalinės ţaliavos kiekis nenurodomas recepte, ištrauka gaminama santykiu 1:10. Jei augalinėje ţaliavoje veikliųjų medţiagų yra daugiau kaip standartinėje, ţaliavos kiekis apskaičiuojamas vartojant formulę:
X= A•V/B (1 formulė)
X - nestandartinės ţaliavos kiekis, gramais,
A - recepte išrašytos standartinės ţaliavos kiekis, gramais, V - veikliosios medţiagos kiekis 1 grame standartinės ţaliavos,
B - faktinis veikliosios medţiagos kiekis 1 grame nestandartinės ţaliavos.
Vandens kiekis, reikalingas pagaminti uţpilą ar nuovirą, apskaičiuojamas vartojant sugerties koeficientą Ks. Tai tiek vandens mililitrų, kiek negrįţtamai sugeria 1 g vaistinės augalinės ţaliavos. Ks apskaičiuoti daugeliui vaistinių augalinių ţaliavų:
X = V + M•Ks (2 formulė)
X - vandens kiekis, reikalingas ištraukai gaminti ml, M - augalinės ţaliavos masė (g),
V - recepte išrašytas uţpilo ar nuoviro tūris, Ks - sugerties koeficientas.
Gaminant augalines ištraukas karštuoju būdu, svarbi kaitinimo ir aušinimo trukmė. Uţpilai kaitinami 15 min., aušinami - 45 min., nuovirai kaitinami 30 min., aušinami 10 min [23, 25].
1.7. Pagrindiniai ekstrakcijos dėsniai bei ypatumai, jų svarba buitinių ištraukų, užpilų ir nuovirų gamybos technologijoje
Gaminant uţpilus ir nuovirus, remiamasi ekstrahavimo teoriniais pagrindais. Ekstrahavimo procesas prasideda nuo ekstrahuojamos augalinės ţaliavos suvilgymo ekstrahentu – vandeniu. Uţpilų ir nuovirų gamyboje naudojama išdţiovinta AŢ.
Ekstrahavimo proceso stadijos: 1. Brinkinimas; 2. Desorbcija; 3. Išplovimas; 4. Dializė; 5. Difuzija; 6. Osmosas.
Sausa AŢ, uţpilta vandeniu, išbrinksta. Vanduo ekstrahuojamas medţiagas pirmiausia išplauna iš išorėje esančių ir paţeistų ląstelių. Vėliau vanduo patenka per poras į ląstelių sieneles ir ląstelių sienelių vidų, ištirpina ir desorbuoja čia esančias biologiškai aktyvias medţiagas (BAM). Ląstelių viduje susidaro koncentruotas tirpalas ir didelis osmosinis slėgis. Atsiranda skirtingos koncentracijos ląsteles viduje ir išorėje - dėl to įvyksta difuzijos procesas. Šiuo atveju vyksta molekulinė difuzija - molekulės skverbiasi iš ląsteles į ekstrahentą [9]. Molekulinė difuzija apibūdinama Fiko lygtimi:
S=D•F•(C –c) /x•t (3 formulė) S - difundavusios medţiagos kiekis kg;
C-c - koncentracijos skirtumas ląstelėje ir ekstrahente; F - fazių susilietimo paviršius, m2;
D - difuzijos koeficientas, m2/s; t - difuzijos laikas, s.
Ekstrahavimo procesas skirstomas į 3 stadijas:
1. Vidinė molekulinė difuzija iš ląstelės per apvalkalėlį į ribinį sluoksnį; 2. Molekulinė difuzija ribiniame sluoksnyje;
3. Konvekcinė difuzija ekstrahento sraute.
Veiksniai, darantys įtaką ekstrahavimo procesui: 1) Ţaliavos kokybės faktoriai;
2) Masės pernašą ţaliavos dalelių viduje ir ekstrahente veikiantys faktoriai. Ţaliavos kokybės faktoriai
Ţaliavos smulkumas stipriai daro įtaką veikliųjų medţiagų išplovimui iš augalinės ţaliavos, nes padidėja susilietimo paviršius su ekstrahentu, todėl difuzija greitėja. Per daug susmulkinus ţaliavą, ekstrahavimo procesas lėtėja dėl per daug suardytų ţaliavos ląstelių, iš kurių išplaunamos medţiagos, lėtinančios ekstrahavimo procesą. Į ištrauką patenka daug smulkių, netirpių dalelių, kurias sunku nusodinti. Per daug susmulkinus ţaliavą, kuri kaupia gleives, gali susidaryti geliai, ir ekstrakcijos procesas taip pat nevyks. Kai AŢ per stambiai susmulkinta, sulėtėja ekstrahavimo procesas, nes tirpikliui sunku prasiskverbti į ląsteles ir išplaunama maţai veikliųjų medţiagų. Susmulkinta AŢ turi būti atskiriama nuo dulkių [29].
Smulkinimo būdas. 1969 m. Buvo nustatyta nustatė, kad, ekstrahuojant saldyšaknės ţaliavą, supjaustytą skersai, išsiplauna daugiau veikliųjų medţiagų nei ekstrahuojant išilgai supjaustytą ţaliavą.
Kadangi malimo būdu labiau suardomos ląstelės, todėl BAM greičiau išsiskiria iš ţaliavos. Padidėjus ţaliavos paviršiaus plotui lengviau sugeriamas ekstrahentas, pagreitėja difuzija, todėl didesnė koncentracija veikliųjų medţiagų pereina į ištrauką.
Drėgmės kiekis. Ţaliavoje esantis per didelis drėgmės kiekis maţina veikliųjų medţiagų kiekį, ir išsiekstrahuoja maţiau veikliųjų medţiagų. Didėjant drėgmei, blogėja ţaliavos kokybė.
Faktoriai, darantys įtaka masės pernašai ţaliavos dalelių viduje bei ekstrahente
Hidrodinaminės sąlygos. Difuzija vyksta dėl koncentracijų skirtumo, todėl ekstrahavimo proceso metu būtina palaikyti kuo didesnį koncentracijų gradientą. Maišymo metu fazių sąlyčio vietoje galima palaikyti didelį koncentracijų skirtumą. Tada daleles skalauja maţesnės koncentracijos tirpalas ir sudaromos sąlygos vykti molekulinei difuzijai iš ţaliavos dalelių į ekstrahentą. Pačiame ekstrahente vyksta konvekcinė difuzija.
Temperatūra. Esant aukštesnei temperatūrai, ekstrahavimas vyksta greičiau. Pagerėja medţiagų tirpumas, intensyviau vyksta molekulinė difuzija. Tačiau atsiranda pavojus suirti termolabilioms medţiagoms, gali išgaruoti eteriniai aliejai, kristalizuotis krakmolas, koagulioti baltymai. Ištirta, kad ekstrahavimas vyksta greičiau, jei prieš tai AŢ buvo uţšaldyta. Ledo kristalai suardo audinio struktūrą, ir tirpiklis lengviau prasiskverbia į ląstelių sieneles - susidaro geresnės sąlygos difuzijai.
Žaliavos ir ekstrahento santykis. Identifikuojamas parametras - ţaliavos sugėrimo koeficientas. Gaminat uţpilus ir nuovirus, būtina skaičiuoti tirpiklio kiekį, kurį sugers AŢ. Sugėrimo koeficientas priklauso nuo ţaliavos smulkumo laipsnio. Sugėrimo koeficientai yra nurodyti lentelėse arba naudojami atskiroms augalo morfologinės dalims (lapams, ţievei ir t.t.).
Ekstrahento pH. Remiantis veikliųjų medţiagų sudėtimi, reikia atsiţvelgti į tai, kokioje pH terpėje ekstrahuojamos medţiagos geriausiai tirpsta. Terpės pH gali būti koreguojama (pridedama organinių rūgščių arba šarmų) [30].
1.8. Fenoliniai junginiai, jų poklasis – flavonoidai. Fenolinių junginių ir flavonoidų struktūra, panaudojimas, analizės metodai
Flavonoidai ir fenolinės rūgštys – tai augalinės kilmės antriniai metabolitai, sudarantys itin gausią junginių grupę, aptinkamą beveik visuose induočiuose augaluose [13]. Fenolinių rūgščių grupei priskiriami hidroksibenzoatai ir hidroksicinamatai (fenilpropanoidai). Hidroksibenzoatams būdinga C6-C1 struktūra. Atskirų hidroksibenzoatų skirtumus nulemia aromatinio ţiedo metilinimas bei hidroksilinimas. Fenilpropanoidams charakteringa C6-C3 struktūra. Augaluose randama chlorogeno, ferulo, kavos rūgštys [26].
Flavonoidai (lot. „flavus“ – geltonas) – tai fenolio junginiai, daţnai pigmentai, aptinkami augaluose. Daugelio augalų geltona ar oranţinė spalva priklauso nuo flavonoidų, todėl pastebėjus jų geltoną spalvą, šie junginiai buvo pavadinti atitinkamu lotynišku pavadinimu [20]. Cheminiu – struktūriniu poţiūriu – tai 2 – fenil – benzo – γ pirono dariniai su C6 - C3 - C6 anglies atomų struktūros dariniai. Aglikonui būdinga dviejų aromatinių benzeno ţiedų (A ir B) struktūra. Šie ţiedai sujungiami trijų anglies atomų grandine, kuri per deguonies atomą suformuoja heterociklą, įvardijamą ţiedu C.
Flavonoidai skirstomi į atskiras klases pagal C ţiedo modifikacijas į:
1) 2-fenilbenzopiranai (antocianidinai, flavonai, flavonoliai, flavan-3-oliai (katechinai), flavanonai);
2) 3-benzopiranai (izoflavonai).
A ir B ţieduose modifikuojant pakaitus (t.y. prijungiant prie hidroksigrupių cukrus, gliukuronidus, jas metilinant, acetilinant, sulfatuojant), atsiranda skirtingos flavonoidų klasės.
Gamtoje flavanoidai randami O- ir C- glikozidų pavidalu (tokia forma yra atsparesnė laisvųjų radikalų poveikiui bei dėl pagerėjusių hidrofilinių savybių – labiau tirpi vandenyje). Cukrinė dalis daţniausiai sudaryta iš heksozių (gliukozė, galaktozė, ksilozė, arabinozė) arba disacharidų (rutinozė) [32].
2 pav. Bendra struktūrinė flavanoidų formulė: du benzeno ţiedai (vadinami „A“ ir „B“), sujungti trijų anglies atomų grandine (paţymėta 1, 2, 3). Ši grandinė ţiede „A“gali jungtis su hidroksilo grupe, taip formuodama ţiedą „C“.
Dabar yra ţinoma daugiau kaip 4000 flavonoidų, priklausančių 12 poklasių [33].
3 pav. Arbatos svarbiausi flavonoidai – katechinai, jų struktūra ir įvairovė.
Flavonoidų išskyrimas iš AŢ yra sudėtingas ir daug laiko reikalaujantis procesas. Daţniausiai flavonoidai iš augalinės ţaliavos ekstrahuojami metanoliu, etanoliu, vandeniu ar šių tirpiklių mišiniais. Organinėmis rūgštimis reguliuojamas tokių tirpiklių arba jų mišinių pH [28].
chlorofilas. Priemaišinėms medţiagoms pašalinti naudojama savo paprastumu ir plačiu pritaikymu garsėjanti kietafazė ekstrakcija (KFE).
Kiekybiniam fenolinių junginių kiekiui augalinėje ţaliavoje nustatyti yra sukurta nemaţai spektrofotometrinių metodų. Spektrofotometrinės analizės yra pagrįstos spinduliuotės sugerties principais ir yra taikomos įvairių struktūrinių junginių grupių nustatymui fenoliniuose mišiniuose [21].
Pagrindiniai chromatografiniai metodai, naudojami flavonoidų aptikimui ir nustatymui yra šie: skysčių chromatografija (SC), dujų chromatorgafija (DC), plonasluoksnė chromatografija (PC) ir ESC [4]. ESC - plačiausiai naudojama tiek kiekybinei, tiek kokybinei fenolinių junginių ir flavonoidų analizei. ESC pasiţymi palyginus trumpa analizės trukme, sudėtingų mišinių skirstymo, sistemos automatizavimo ir sudėtinių analitės dalių keitimo galimybėmis.
Populiariausių naudojamų judrios fazės sudėčių kombinacijos sudaromos iš acetonitrilo (ACN) – vandens, metanolio – vandens.
Šios sistemos rūgštinamos, siekiant nuslopinti hidroksilinių grupių jonizaciją; gauti simetriškesnes smailes su maţu dreifu. Itin svarbu identifikuoti, kokiu pavidalu tiriamajame objekte esti flavonoidai (aglikonų ar glikozidų) pavidalu, kadangi pagal tai parenkami eliuentai ir sudaromas gradientas (organinių/neorganinių tirpiklių santykis) [8].
Biologiniuose skysčiuose (serume, plazmoje ir šlapime) flavonoidai egzistuoja glukuronidų ir sulfatų pavidalu. Medicinoje, maisto produktuose, augaluose, arbatose jie egzistuoja kompleksinių juginių pavidalu. Pagal tai parenkama atitinkama tirpiklių sistema bei pritaikoma analizavimui aparatūra [7].
1.9. Laisvieji radikalai ir jų poveikis organizmui. Aktyviosios deguonies formos
Laisvieji radikalai - aktyviosios molekulės, atakuojančios ląstelių membranas, DNR (genetinę ląstelių informaciją), sukeliančios vėţines bei degeneracines ligas, skatinančios aterosklerozę ir širdies ligas [5]. Laisvieji radikalai ir aktyvios deguonies formos įvardijami kaip daugelio chroninių ligų pavojingiausi ir svarbiausi veiksniai. Radikalai ir aktyvios deguonies formos yra tarpininkai tarp lėtinių, uţdegiminių ir imuninių ligų, cukrinio diabeto, kraujagyslių, kataraktos, artrito, įvairialypės sklerozės, miokardo, išemijos paţeidimų, smegenų disfunkcijos bei senėjimo procesų.
Laisvųjų radikalų kiekis sveikame organizme turi būti minimalus – toks, kad sukeltų teigiamą poveikį, padėtų kovoti su mikroorganizmais. Molekulės ir jų dalys, kurios susidaro organizme dėl išorinio kenksmingų medţiagų poveikio, pvz., UV (ultravioletinės spinduliuotės), nikotino, oro teršalų ar sunkiųjų metalų, ksenobiotikų tampa labai aktyviais ir itin kenksmingais radikalais.
Antioksidacinės sistemos sutrikimai, nepalankios aplinkos sąlygos sukelia nevaldomą aktyvių deguonies formų kiekio ląstelėje didėjimą. D. Harmanas (Harman) dar 1972 m. pasiūlė mintį, kad svarbiausi senėjimą lemiantys veiksniai yra ląstelėje nuolat generuojamos reaktyvios deguonies formos, kurių didţioji dalis susidaro mitochondrijose.
Aktyvios deguonies formos
Deguoniui suţadinti (pereiti iš tripletinės būsenos į singulentinę) reikia energijos, o tolesnės reakcijos yra egzoterminės prigimties. Organizme susidaro įvairios aktyvios deguonies formos, pernešant H nuo donoro (reduktoriaus) O2 molekulei.
1 lentelė. Aktyvių deguonies formų gausa ir įvairovė.
Aktyvi deguonies forma Formulė
Tripletinis deguonis .O-O.
Singuletinis deguonis 1O2 O-O:
Superoksido anijonradikalas O2*- .O-O: Hidroksilas arba perhidroksilo radikalas .O-O:H
Vandenilio peroksidas H:O-O:H
Hidroksiradikalas H:O.
Biologiškai pavojingiausi yra: 1) singulentinis deguonis (jo formos gali susidaryti, veikiant UV); 2) superoksidas 3) vandenilio peroksidas; 4) hidroksiradikalas; 5) azoto monoksido ir peroksinitrilo radikalai. Šios aktyvios deguonies rūšys lemia nuodingumą ir vadinamos oksidantais.
Oksidacinis stresas – tai būsena, kurios metu antioksidacinės sistemos nepajėgia kovoti aktyviomos deguonies formomis, todėl jų sukeltos grandininės reakcijos sutrikdo organizmo veiklą [6].
Aktyvių deguonies rūšių dalyvavimas ligų patogenezėje: 1. MTL pakitimai dėl oksidacijos, kurią sukelia laisvieji radikalai; 2. Aktyviai dalyvauja kancerogeniniuose procesuose;
3. Cukriniu diabetu suserga pacientai dėl padidėjusio oksidacinio streso – atokoferolio, bendro glutationo, vitamino C kiekio plazmoje sumaţėja (antioksidacinių sistemų sumaţėjimas nulemia jų nepajėgumą kovoti su laisvaisiais radikalais).
4. Dalyvauja akių ligų patogenezėje – kataraktos vystymesi;
6. Miokardo išemijos – reoksigenacijos metu aktyvios deguonies formos ţalingai veikia audinius;
7. Sąnarių ligos – reumatoidinio artrito vystymasis;
8. CNS jautrumas: neuronų ląstelių membranos lipidai turi didelį kiekį polinesočių riebiųjų rūgščių, kurios yra pagrindinis laisvųjų radikalų substratas, tuo tarpu albumino, kuris gali veikti kaip antioksidantas koncentracija cerebraliniame skystyje labai maţa. Taigi smegenys yra itin jautrios laisvųjų radikalų poveikiui.
9. Alzheimer„io liga, amiopatinė lateralinė sklerozė, Parkinsono liga, degeneracinių ligų atsiradimas (vėţys ir širdies ligos).
Molekuliniu lygmeniu laisvieji radikalai vykdo tokias neigiamas reakcijas. 2 lentelė. Laisvųjų radikalų poveikis ląstelės struktūroms.
Makromolekulė Poveikis makromolekulei Baltymai 1. Greitas irimas;
2. Sumaţėjęs fermentų aktyvumas; 3. Membranos paţeidimas.
Lipidai 1. Membranos paţeidimas; 2. MTL oksidacija;
3. Antrinių produktų (aldehidų) susidarymas.
DNR 1. Mutacijos.
Angliavandeniai 1. Receptorių pokyčiai.
Visi makromolekuliniai pokyčiai nulemia pokyčius ląsteliniame, dėl to vyksta membranų paţeidimai, dėl DNR pokyčių sutrinka visas baltymų apykaitos ciklas, pakinta genetinė informacija, sudarydama galimybą atsirasti mutacijoms [14].
1.10. Antioksidaciniai procesai bei medžiagos. Antioksidantai žaliojoje arbatoje
Antioksidantai – tai medţiagos, saugančios nuo ţalingo oksidacinių reakcijų poveikio, galinčios sumaţinti laisvųjų radikalų veikimą ir stabdyti jų susidarymą. Lėtina senėjimo procesus, sumaţina riziką sirgti lėtinėmis ligomis, išlaiko ląstelių strutūrą ir vientisumą. Juos galima sugrupuoti į 3 grupes:
1. Junginiai, prijungiantys laisvuosius radikalus (karotinoidai, flavonoidai); 2. Fermentai, ardantys aktyviąsias deguonies formas – antioksidaciniai fermentai; 3. Antioksidaciniai vitaminai (vitaminai C ir E) [5].
regeneruoti. Odoje dėl pagreitinto odos senėjimo anksti atsiranda raukšlių, oda tampa suglebusi ir pavargusi. Fermentai antioksidantai: superoksido dismutazė superoksidą paverčia vandenilio peroksidu, kurio suirimą katalizuoja katalazė, glutationo peroksidazė – pagrindinis fermentas, neutralizuojantis peroksido radikalinį poveikį. Taip pat yra grupė antioksidantų, kurie nutraukia grandinines radikalines reakcijas (veikia nefermentiniu būdu). Tai yra maţos molekulės, kurios gali priimti elektroną iš radikalo, taip jį nukenksmindamos.
Antioksidantai, tokie kaip vitaminai C ir E, yra pagrindinės gynybos priemonės prieš aktyvias deguonies formas, tačiau vaisiuose bei darţovėse didţiausią antioksidantų aktyvumą lemia fenolinės rūgštys ir flavonoidai, maţiau – vitaminai C, E ir β-karotinai.
Lipidinės terpės antioksidantai, stabdantys laisvųjų radikalų susidarymą arba šalinatys juos membranose, lipoproteinų dalelėse, taip pat apsaugo lipidus po peroksidacijos (vitaminas E, redukuotas koenzimas Q10, flavonoidai, antocianinai) [6].
Antioksidantai, nutraukiantys grandinines laisvųjų radikalų susidarymo reakcijas vandeninėje terpėje (vitaminas C, plazmoje esantys baltymai su tiolio grupe – albuminas, transferinas).
Flavonoidai – pagrindiniai junginiai augalinėje ţaliavoje, pasiţymintys antioksidaciniu poveikiu. Veikdami kaip antioksidantai, jie neutralizuoja laisvųjų radikalų perteklių, kuris ţmogaus organizme susidaro medţiagų apykaitos metu.
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1.Medžiagos ir metodai
2.1.1. Medžiagos ir tirpikliai Tirpikliai:
1) Bidistiliuotas vanduo (Vytauto Didţiojo Universiteto laboratorija, ruošiamas vandens valymo sistema Firstreem Cyclo, Anglija );
2) CH3OH – metanolis, 99,5% (BARTA a CIHLAR, spol. s r. o. Čekija); 3) C2H5OH – etanolis, 96 % (UAB „Stumbras“ Lietuva);
4) Acetonas (Lachema, Čekija). Rūgštys:
1) TFR – trifluoracto rūgštis, 98% (Merck, Vokietija); 2) H3PO4 – fosrofo rūgštis, 85% (Reachim, Rusija). Reagentai:
1) Folin – Ciocalteau fenolinis reagentas (Sigma, Šveicarija);
2) DPPH* – 2,2- difenil-1-pikrilhidrazil hidratas (Sigma-Aldrich, JAV);
3) ABTS* - 2,2„-azino-bis-(3-etilenbenztiazolin-6-sulfono rūgštis (Sigma-Adrich, JAV); 5) KH2PO4 – kalio dihidrofosfatas (Carl Roth GmbH Co. Lauersruhe, Vokietija); 6) KCl – kalio chloridas (BDH Laboratory Suplies Poole, Didţioji Britanija); 7) K2S2O8 – kalio persulfatas (Merck, Vokietija);
8) Na2SO4 – natrio sulfatas (Reachim, Rusja);
9) NaCl – natrio chloridas (Carl Roth GmbH Co. Lauersruhe, Vokietija); 10) Na2CO3 – natrio karbonatas (Merck, Vokietija).
Medţiagos standartams:
1) Kofeinas 3 mg/25 ml tirpinta metanolyje (Sigma, Vokietija); 2) Galo rūgštis 2 mg/25 ml tirpinta metanolyje (Sigma, Vokietija); 3) Rutinas 2 mg/25 ml tirpinta metanolyje (Sigma, Vokietija); 4) Epigalokatechinas 3 mg/25 ml metanolyje (Sigma, Vokietija).
2.1.2. Žaliosios arbatos vandeninių ištraukų paruošimas Ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų gamybos metodai:
1) Buitinis ţaliosios arbatos paruošimo metodas. Tokia vandeninė ištrauka ruošiama santykiu 1:10, atsiţvelgiant į ţaliosios arbatos lapų sugerties koeficientą 2. Gamybos technologija: smulkinti arbatos lapeliai (kurių diametras ne didesnis nei 5 mm, pagal straipsnį FS-B22:2002 ir Eur.Ph.01/2002,2.1.4) uţpilami verdančiu 100oC temperatūros vandeniu. Aušinama, ir atskiras arbatos porcijos paimamos po 10, 20, 30 minučių nuo arbatţolių uţpylimo vandeniu momento.
2) Uţpilo gamyba. Pagal straipsnį FS-B23:2002 uţpilas ruošiamas atitinkamais santykiais (kaip ir buitiniu metodu), atsiţvelgiant į ţaliavos sugerties koeficientą. AŢ dedama į infundirę, kurioje yra įpiltas atitinkamas kiekis vandens (taip pat apskaičiuojamas pagal ţaliavos kiekį, atsiţvelgiant į sugerties koeficientą). Uţpilas kaitinamas 15 min., aušinamas 45 min.
3) Nuoviro gamyba. Pagal straipsnį FS-B23:2002. Gamybos technologija analogiška uţpilų gamybai. Skiriasi kaitinimo (30 min.) ir aušinimo (15 min.) laikai.
Uţpilų bei nuovirų gamybai naudojamos infundirės, besiskiriančios krepšelio tinklelio porų diametru.
3 pav. Infundirės, naudojamos uţpilų bei nuovirų gamyboje, jų technologiniai skirtumai.
2.1.3. Žaliosios arbatos metanolinių ekstraktų paruošimas
Kietafazė ekstrakcija
Kietafazės ekstrakcijos metodas skirtas išvalyti analizuojamiems junginiams, sukoncentruoti juos bei suformuoti atitinkamą analizuojamos ištraukos tūrį [13].
Kietafazė metanolinių ţaliosios arbatos ekstraktų analizė atlika naudojant kietafazės ekstrakcijos vakuuminį kolektorių „Supelco Visiprep“ (JAV) ir 1 ml tūrio 0,1 g sorbento KFE šerdeles „LiChlorut RP - 18“ (Merck, Vokietija). Pradinės analizės sąlygos buvo paimtos iš gamintojo katalogo ir pavaizduotos 3 lentelėje:
3 lentelė. Kietafazės ekstrakcijos sąlygos.
KFE ţingsniai KFE sąlygos
Šerdelės kondicionavimas 1 ml 75 % CH3OH
Šerdelės kondicionavimas 3 ml H2O pH 2 (privesta su TFR) Bandinio išplovimas Ţaliosios arbatos vandeninė ištrauka 1:10 (1 g sausos medţiagos/10 ml vandens) Priemaišų plovimas 3 ml H2O pH=2 (privesta su TFR)
Švirkšto dţiovinimas 5 min. vakuumuojama
Analičių reabsorbcija 1 ml 75 % CH3OH
2.1.4. Nuodžiūvio nustatymas (pagal Eur. Ph. 01/2002, 2.2.32)
Į 105oC iškaitintą porcelianinę lėkštelę pilama 2 ml atitinkamos arbatos vandeninės ištraukos ir tokia lėkštelė su arbata kaitinama 105oC temperatūroje 2 valandas. Nuodţiūvis apskaičiuojamas, iš iškaitintos lėkštelės su arbata masės atimant tik iškaitintos lėkštelės (be arbatos) masę [18].
2.1.5. Fenolinių junginių kiekio nustatymas, pritaikant spektrofotometrinį metodą Pastaruoju metu fenolinių junginių analizei skiriamas didelis dėmesys dėl plataus jų
panaudojimo masto vaistų, kosmetikos, maisto pramonėse [2].
Būtina paminėti, kad flavonoidų ir fenolinių junginių analizei augaliniuose ekstraktuose reikalingi efektyvūs, jautrūs ir atrankūs metodai, leidţiantys aptikti ne tik kokybinę, bet ir tikslią kiekybinę informaciją, kuri yra pakankamai informatyvi atskirų fenolinių junginių, jų poklasio - flavonoidų ir jų glikozidų kiekių įvairovei ţaliavos ėminiuose įvertinti.
Spektrofotometrinė analizė pagrįsta elektromagnetinio srauto absorbcija analizuojamosios medţiagos molekulėmis, jonais ar kompleksais UV, regimajame ir infraraudonajame spektre. Šio 4 pav. Spektrofotometras „Unicam
analizės metodo pranašumas yra tas, kad tiriamoji medţiaga nesuardoma, o tyrimo metodikos lengvai modifikuojamos ir automatizuojamos. Spektrine analize galima nustatyti nedidelius medţiagų kiekius netgi pakankamai sudėtingose sistemose.
Suminiai fenolinių junginių kiekiai nustatyti spektrofotometrijos metodu, naudojant „Unicam Helios alfa“ (Unicam, Cambridge, UK) spektrofotometrą. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas ekstraktą veikiant Folin – Ciocalteau ir natrio karbonato tirpalais. Duomenys įvertinti pagal galo rūgšties etaloninio tirpalo gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį. Galo rūgštis pasirenkama dėl literatūros šaltiniuose nurodytos jos svarbos ţaliosios arbatos sudėtyje bei galimybės nustatyti ją kiekybiškai [12]. Fenolinių junginių kiekis nustatomas su Folin – Ciocalteau reagentu, kai standartas – galo rūgštis. Folin - Ciocalteau reagentas skiedţiamas vandeniu santykiu 1:10 ir 5 ml šio skiedinio pilama į 1 ml tiriamosios vandeninės ištraukos. Melsva spalva išgaunama, pridėjus 4 ml 7,5 proc. Na2SO4 tirpalo distiliuotame vandenyje. Spektrofotometrija vykdoma po 30 min., esant 765 nm bangos ilgiui.
2.1.6. Bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymas, atliekamas, naudojant DPPH* radikalo ir ABTS* radikalo surišimo testą
Fenoliniams junginiams būdingas antioksidacinis aktyvumas dėl jų gebėjimo deaktyvuoti laisvuosius radikalus. Laisvajam radikalui atiduodamas vandenilio atomas arba elektronas. Antioksidaciniam aktyvumui įvertinti taikomas spektrofotometrinis DPPH* radikalų deaktyvinimo nustatymo metodas. Šio metodo privalumai - nesudėtingas, nebrangus, greitas ir tikslus. Antioksidantas atiduoda vandenilio atomą ir taip neutralizuoja pavojingą laisvųjų radikalų poveikį (R•). Paveikti DPPH*, radikalai virsta stabiliais DPPH – H tipo junginiais [16] (5 pav.).
DPPH* turi išskirtinį pranašumą tarp kitų radikalų testų, kadangi jie yra labai paprasti, greiti, atkuriami ir jų veikimo mechanizmas yra ţinomas. Tačiau DPPH* testo trūkumas, kaip ir visų kitų metodų, naudojant dirbtinius radikalus, yra tiesioginės koreliacijos trūkumas tarp pripaţinto antioksidantinio aktyvumo ir jo apsauginių savybių tikrame tyrimo objekte - ţaliojoje arbatoje.
Be laisvųjų radikalų surišimo testų, kurie naudoja dirbtinius radikalus, yra ir kitų sisteminių testų, kurie naudoja natūralių rūšių radikalus, tokius kaip O2* (generuojama fermentinės sistemos), OH* ir kt.
Skirtingai nuo DPPH* (nustatomas tiesiogiai be paruošimo), ABTS* turi būti generuojamas fermentiškai (peroksidazė, mioglobinas) arba cheminėmis (mangano dioksidas, kalio persulfatas) reakcijomis. Kitas svarbus skirtumas tarp šių dviejų tipų radikalų, kad DPPH* gali būti ištirpintas tik organiniuose tirpikliuose (ypač tinka alkoholiai), tuo tarpu ABTS*
gali būti tirpinamas ir vandeniniuose, ir organiniuose tirpikliuose [17].
Antioksidacinis aktyvumas nustatomas pagal DPPH* radikalo sujungimą [14]. DPPH* tirpalo paruošimas: 0,01183 g DPPH*
tirpalo ir 0,5 ml tiriamos ţaliosios abatos vandeninės ištraukos. Po 16 min spektrofotometru, esant bangos ilgiui 515 nm, matuojama absorbcija, kai palyginamasis tirpalas - 96% etanolis.
Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas inaktyvuoto DPPH*
radikalo kiekio procentais (DPPH* inaktyv. proc.).
Suminis antioksidacinio aktyvumo nustatymas AŢ apskaičiuojamas naudojantis formule:
.)% . ( % 100 DPPH inaktproc A A A B A B
(4 formulė)
Čia:AB – palyginamojo (tuščiojo) tirpalo absorbcijos dydis AA – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis
ABTS* radikalas gaunamas reaguojant ABTS* su kalio persulfatu. Radikalas gaminamas laikant ABTS* ir K2S2O8 mišinį tamsoje 16 valandų. Gamybos technologija: gaminami 2 tipų tirpalai: 1) 0,0549 g ABTS* reagento tirpinama 50 ml PBS (phosphate buffered saline) tirpalo; 2) 0,0038 g K2S2O8 tirpinama 0,2 ml vandens. Šių tirpalų mišinys, išlaikytas 15 - 16 valandų kambario temperatūroje, naudojamas kaip reagentas antioksidaciniam aktyvumui ištirti. Katijoninė radikalo forma stabili išlieka 2 paras. Antioksidaciniam aktyvumui įvertinti ABTS*
praskiedţiamas fosforo ir druskos buferiniu tiepalu (PBS). Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas ABTS* inaktyvinimo procentais ir apskaičiuojamas pagal tą pačią formulę kaip ir taikant DPPH*
radikalo sujungimo metodą.
ABTS* metodikai būtina pagaminti PBS (pH 7,4 – fosfatinis druskos buferis). PBS gamybos technologija – 8,18 g NaCl, 0,27 g KH2PO4, 1,42 g Na2HPO4 ir 0,15 g KCl ištirpiama 1 litre ultra švaraus vandens. Jei tirpalo pH maţesnis uţ 7,4, pilama koncentruoto NaOH tirpalo iki reikalingos pH reikšmės. ABTS +e- -e -S-O 3+NH4 N S N C2H5 S N N C2H5 H4N +O3-S O S . + S-O 3+NH4 N S N C2H5 S N N C2H5 H4N + 3 -S O N S N C2H5 H4N + 3 -S-O 3+NH4 S N N C2H5 + +ROH ABTS.+ + RO. N N NO2 NO 2 O2N
.
..
.
.
+ AH N NH NO2 NO2 O2N + A.
2.1.7. Žaliosios arbatos kokybinės sudėties nustatymas ESC metodu
Plačiausiai fenolinių junginių kiekybinei ir kokybinei analizei naudojama ESC, susieta su diodų matricos (DAD), UV ir masių spektroskopiniu (MS) detektoriais.
ESC pasirinktas kaip patikimas daugiakomponenčių mišinių tyrimo metodas. Šis analizės metodas leidţia kokybiškai ir kiekybiškai analizuoti tam tikrų gamtinių junginių augalinių ištraukų sudedamąsias dalis. Atsiţvelgiant į ekstrahuotų komponentų sulaikymo laiką kolonėlėje, smailių plotus, bei tam tikrų smailių plotų santykius, o taip pat pagal rezultatus, gautus lyginant smailes su flavonoidų ir kitų fenolinių etalonų ESC smailėmis, galima daryti išvadas apie arbatų kokybinius bei kiekybinius parametrus. Nors ESC metodas literatūroje aprašomas kaip tinkamesnis, pigesnis ir paprastesnis metodas fenolinių junginių analizei, tačiau šio metodo trūkumai yra ilgas analizės laikas, didelės tirpalų sąnaudos bei maţa skiriamoji geba. Nustatant fenolinius junginius tiriamajame tirpale ESC metodu, daţnai naudojamas gradientinis skirstymas. Atvirkščių fazių chromatografijai tinka C8 arba C18 kolonėlės. Eliuavimui naudojamas vanduo ir metanolis. Atskyrimui tinkamiausias pH palaikomas į eliuentus pridedant skruzdţių rūgšties, acto rūgšties, TFA (trifluoracto rūgštis) ar fosfatinių buferių [11]. Pastaruoju atveju, atsiţvelgiant į straipsnius, pasirenkamas H3PO4 parūgštintas H2O pH privedamas iki 3).
6 pav. ESC sistema su reakcijos detektoriumi.
Detalesnė ESC įrangos apţvalga:
1) Švirkštinis periodinio veikimo siurblys „Phoenic 20 CU“ (Carlo Ebra instruments, Italija); degazatorius „Series 1100“ (Hewlett Packard, Japonija);
2) Nuolatinio veikimo siurblys „Series 1100“ (Hewlett Packart, Japonija); 3) Autoinjektorius „Series 200“ (Prekin Elmer, JAV);
4) UV detektorius „Spectra 200“ (Spectra Physics, JAV);
5) Kolonėlė C18, uţplikdyta silikageliniu sorbentu su oktadecilsilanolinėmis grupėmis. Parametrai: ilgis 250 mm, skersmuo 3mm, įkrovos dalelių skersmuo 5 μm (Knauer, Vokietija);
2.2. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas
2.2.1. Žaliosios arbatos žaliavos vandeninių buitiniu metodu paruoštų ištraukų sauso likučio, fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatų aptarimas.
Spektrofotometrijos metodu nustatyti suminiai fenolinių junginių kiekiai, antioksidacinis aktyvumas, gravimetriniu metodu nustatytas ţaliosios arbatos skirtingų rūšių nuodţiūvis (sausas likutis). Sausas likutis parodo bendrą iš arbatos ţaliavos išsiekstrahavusių medţiagų kiekį. Jį tikslinga tirti, norint suţinoti, koks yra veikliųjų medţiagų (šiuo atveju - fenoliniai junginiai) santykis su visomis išsiekstrahuojančiomis medţiagomis.
Tyrimo rezultatai parodė, kad didţiausias fenolinių junginių kiekis būdingas arbatai „Majski“ (60 mg/g), atitinkamai fenolinių junginių kiekis maţėja arbatose „Banča“ (29,41 mg/g), „Dilmah“ ir „Maxima“ (kiekiai labai panašūs, atitinkamai 25,73 ir 25 mg/g).
Sausas likutis didţiausas arbatoje „Majski“ (221,67 mg/g), atitinkamai maţiausias arbatos „Maxima“ buitiniu metodu po 30 min. ekstrahavimo pagamintoje ištraukoje (146,67 mg/g). Antioksidacinis aktyvumas didţiausias arbatos „Banča“ (73,44 proc. pagal DPPH* ir 74,25 proc. pagal ABTS* radikalus), atitinkamai maţėja arbatose „Majski“, „Dilmah“, „Maxima“.
0 50 100 150 200 250 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30
B anč a Max ima Majs ki Dilmah
Arba tos K o n c e n tr a c ij a , m g /g 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% A n ti o k s id a c in is a k ty v u m a s bendras fenolinių junginių kiekis mg/g s aus as likutis mg/g DPPH (% )
Sauso likučio ir fenolinių junginių kiekiai tiesiogiai proporcingi (7 pav., 4 lentelė). Kuo daugiau išsiekstrahuoja bendrai įvairių medţiagų, tuo daugiau išsiekstrahuoja ir vienos iš tų medţiagų frakcijų – fenolinių junginių.
Ekstrahavimo laiko ir fenolinių junginių bei sauso likučio kiekio sąryšis tiesioginis (kuo ilgiau vyksta ekstrahavimas (jis baigiamas po 30 min.), tuo didesni sauso likučio bei fenolinių junginių kiekiai). Tuo tarpu ekstrahavimo laikas ir antioksidacinis aktyvumas ne visada yra tiesiogiai proporcingi (arbatose ,,Maxima“ bei ,,Dilmah“, ilgėjant ekstrakcijos laikui, antioksidacinis aktyvumas maţėja). Taigi galima daryti išvadą, kad fenolinių junginių kiekis ne visada tiesiogiai susijęs su jų kokybe. Dėl to tikslinga atlikti detalesnius kokybinius bei kiekybinius buitinių arbatų ištraukų tyrimus.
4 lentelė. Ţaliosios arbatos ištraukų bendro fenolinių junginių, antioksidacinio aktyvumo ir sauso likučio tyrimo rezultai skaitine išraiška.
Pagal tyrimo rezultatus, galima spręsti, kad sauso likučio kiekis didėja, ilgėjant ekstrahavimosi laikui. Sauso likučio kiekis priklauso ir nuo laiko, ir nuo arbatos rūšies (didţiausias kiekis – 221,67 mg/g yra arbatoje „Majski“ po 30 min. ekstrahavimosi). Bendras fenolinių junginių kiekis tiesiogiai koreliuoja su sauso likučio kiekiu – kuo didesnis sauso likučio kiekis, tuo didesnis fenolinių junginių kiekis („Majski“ arbatos atveju šie parametrai atitinkamai yra 60,00 mg/g ir 221,67 mg/g (po 30 min. ekstrakcijos)).
Vėlesnėse tyrimo stadijose buvo lyginamas antioksidacinių vandeninių ţaliosios arbatos ištraukų tyrimo efektyvumas ir, esant kurio nors metodo netobulumui, jis buvo optimizuojamas. Tyrimo objektas DPPH (%) Bendras fenolinių junginių kiekis mg/g Sausas likutis mg/g
8 pav. Buitiniu metodu paruoštų ţaliosios arbatos ištraukų bendro antioksidacinio aktyvumo tyrimo palyginimas, tiriant skirtingais radikalų surišimo testais (DPPH*
ir ABTS*).
Bendras antioksidacinio aktyvumo testas reikšmingas, nes nusako tiriamųjų objektų gebėjimą surišti laisvuosius radikalus organizme (pagrindinius vėţinių susirgimų, mutagenezės iniciatorius). Tiriant abejais metodais, pastebėti panašūs dėsningumai atitinkamose arbatose. Prieš tai optimizuotas tyrimas ABTS* radikalu, kadangi arbatose esantys veiklieji junginiai dideliu procentingumu sureaguodavo su radikalo tirpalu. Kad to išvengti ir tyrimą padaryti efektyviu, arbatų buitiniu metodu paruoštos ištraukos buvo skiedţiamos 2 kartus ir tik po to veikiamos laisvojo radikalo ABTS* tirpalu. Iš gautų duomenų, įvertinus praskiedimą, buvo apskaičiuojamas antioksidacinis aktyvumas. Abejais tyrimų atvejais akivaizdu, kad didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi arbata „Banča“. Antioksidacinis aktyvumas atitinkamai maţėja arbatose „Majski“, „Dilmah“, „Maxima“. Ekstrahavimo laiko ir antioksidacinio aktyvumo sąryšis priklauso nuo arbatos rūšies. Arbatose „Banča“ ir „Majski“ antioksidacinis aktyvumas didėja, ilgėjant ekstrahavimo laikui, tuo tarpu arbatose „Maxima“ ir „Dilmah“ antioksidacinis aktyvumas maţėja, ilgėjant ekstrahavimo laikui.
procese itin aktualūs difuzijos/ekstrahavimo parametrai (13-15 psl.). Tuo tarpu naudojant infundires su didenio porų diametro tinkleliu, sauso likučio kiekis uţpiluose bei nuoviruose buvo maţesnis uţ buitiniu metodu ruoštų vandeninių ištraukų bei uţpilų ir nuovirų, ruoštų infundirėse su didesnio angelių diametro tinkleliu atitinkamas charakteristikas. Fenolinių junginių tyrimui pasirinkta uţpilus bei nuovirus gaminti infundirėje su didesnio angelių diametro tinkleliu, kadangi, tiriant arbatų uţpilus bei nuovirus, nustatyta, kad infundirėje su tokiu tinkleliu išsiekstrahuoja daugiau medţiagų. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad technologinis parametras, infundavimo krepšelio tinklelio porų skersmuo, daro įtaką ţaliosios arbatos nuovirų bei uţpilų kokybei (9 pav). 9 paveiksle matyti, kad uţpilus bei nuovirus gaminant infundirėje su krepšeliu, kurio tinklelio porų diametras maţesnis, išsiekstrahavusių medţiagų kiekis sumaţėja 45 – 55 proc.
0 50 100 150 200 250
Banča Maxima Majski Dilmah
m g /g užpilai nuovirai 0 50 100 150 200 250
Banča Maxima Majski Dilmah
m
g
/g užpilai
nuovirai
9 pav. Ţaliosios arbatos ţaliavos uţpilų bei nuovirų sauso likučio kiekio priklausomybė nuo infundirės krepšelio tinklelių tipo.
Skaitine išraiška pastebimi ţenkliai skirtingi rezultatai, lyginant sauso likučio kiekį, gautą iš skirtingų infundirių. Vertinant rūšinį ţaliosios arbatos ţaliavų sauso likučio kiekių skirtumą, atrandami sutapimai su buitiniu metodu ruošiamomis ištraukomis (t.y. sauso likučio kiekio pasiskirstymas yra panašus tiek buitiniu metodu ruošiamose arbatose, tiek uţpiluose, tiek nuoviruose). Dėl to galima daryti išvadą, kad bendras išsiekstrahavusių medţiagų sumaţėjimas, ruošiant uţpilus bei nuovirus infundirėje su tankesniu ţaliavos krepšelio tinkleliu, yra tiesiogiai susijęs su įrangos technologiniais parametrais.
5 lentelė. Sauso likučio skirtingose ţaliosios arbatos ţaliavų uţpiluose bei nuoviruose, naudojant skirtingas infundires, palyginimas.
Infundirė su didesniu tinkelio porų diametru
Gavus sauso likčio kiekio rezultatus, tiriant uţpilus bei nuovirus, pagamintus su skirtingomis infundirėmis, galima daryti išvadą, kad technologiniai parametrai itin aktualūs uţpilų bei nuovirų kokybei. Infundirėje su didesnio porų diametro tinkleliu pagamintuose uţpiluose ir nuoviruose buvo atitinkamai vidutiniškai 2,13 daugiau bendrų išsisekstrahavusių medţiagų negu infundirėje, kurios krepšelio tinklelio poros turėjo maţesnį skersmenį.
Ţaliosios arbatos ţaliavos uţpilų bei nuovirų bendras fenolinių junginių kiekis buvo tiriamas, siekiant įvertinti atskirų ţaliųjų arbatų rūšių kokybę ir ją palyginti su buitiniu metodu paruoštomis vandeninėmis ištraukomis.
0 10 20 30 40 50 60 70
Banča Maxima Majski Dilmah
m
g
/g užpilai
nuovirai
10 pav. Fenolinių junginių kiekis ţaliosios arbatos uţpiluose bei nuoviruose.
Kaip matyti iš 10 paveiksle pateiktų tyrimo rezultatų, ţaliosios arbatos uţpilų ir nuovirų fenolinių junginių kiekis priklauso ne tik nuo paruošiamos ištraukos formos (t.y. uţpilų ar nuovirų), bet ir nuo ţaliavos rūšies. Didţiausias kiekis fenolinių junginių nustatytas arbatoje „Majski“ tiek uţpilų, tiek nuovirų atveju (atitinkamai 65.71 ir 66,22 mg/g fenolinių junginių). Rūšiniu atţvilgiu, duomenys atitinka buitiniu metodu paruoštų arbatų tyrimo rezultatus. Lyginant uţpilus bei nuovirus kaip vaistinę formą su buitiniu metodu paruoštomis arbatomis, gaunamos aukštesnės kokybės (ji apibūdinama fenolinių junginių kiekiu) ištraukos. Nuovirų pranašumas uţpilų atţvilgiu aiškinamas ilgesne virimo trukme (30 min.). Nuovirų ir uţpilų pranašumas buitiniu metodu gautų ištaukų atţvilgiu aiškinamas geriau šiam procesui pritaikyta aparatūra bei virimo/aušinimo optimaliu santykiu.
Infundirė su krepšeliu ţaliavai, kai tinklelio porų diametras didesnis Uţpilas (mg/g) Nuoviras (mg/g)
Banča 159,25 165,35
Maxima 169,3 175,4
Majski 235,95 245,37
Dilmah 153,23 154,6
Infundirė su krepšeliu ţaliavai, kai tinklelio porų diametras maţesnis Uţpilas (mg/g) Nuoviras (mg/g)
Banča 75,45 76,25
Maxima 82,27 83,56
Majski 105,3 110,47
2.2.3 Žaliosios arbatos žaliavų veikliųjų medžiagų kokybės ir kiekybės tyrimas, pritaikant ESC metodą
Kokybiškai junginiai identifikuojami ESC metodu, kuris pagrįstas etalono sulaikymo trukmės atitikimu su analitės sulaikymo trukme. Tam, kad būtų atlikas kokybinis tyrimas, reikia optimizuoti literatūroje rastas ESC sąlygas pagal esamą aparatūrą. Turi būti koreguojami šie parametrai – tyrimo bendras laikas, tiriamosios ištraukos skiedimas, gradientas (organinio/neorganinio tirpiklio procentinė sudėtis), detekcijai naudojamos bangos ilgis (nm). Optimizuojant tyrimo sąlygas, padidinamas atskirų komponentų atskiriamumas, padedantis geriau identifikuoti junginius (11 pav.).
11 pav. Ţaliosios arbatos „Banča“ vandeninės ištraukos po 10 min. veikliųjų medţiagų identifikavimo ESC metodu rezultatai.
Literatūroje rastos sąlygos netenkina, kadangi medţiagų atskiriamumo kriterijus yra labai maţas, taip pat meţiagos pradeda per vėlai išeiti (t.y. galima daryti išvadą, kad parinktos netinkamos pradinės sąlygos, netinkama pradinė eliuentų mišinio sudėtis).
Po optimizavimo, pakeičiami šie parametrai :
1) Gradientas - jį koreguojant, pasiekiama geresnis medţiagų atsiskyrimas ir greitesnis junginių išėjimo laikas iš kolonėlės;
2) Injekcijos tūris – maţinamas, taupant analitę;
3) Tėkmės greitis – maţinamas dėl kolonėlės uţsikimšimo ir susidarančio per didelio slėgio;
4) Bangos ilgis nekeičiamas, kadangi literatūroje jis įvardijamas kaip optimalus bangos ilgis katechinams aptikti (6 lentelė).
Veiklieji junginiai tiriamuosiuose objektuose identifikuojami, naudojant išorinius standartus. Pasirinkti 2 flavonoidai (epigalokatechinas, rutinas), 1 fenolinė rūgštis (galo rūgštis) ir 1 metilksantinas – kofeinas. Flavonoidai bei fenolinė rūgštis priskirtini fenolinių junginių grupei. Junginiai identifikuojami, nustačius identiškus tiriamuosiuose objektuose esančių junginių ir standartų sulaikymo laikus.
0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Abso b ci ja , mV Laikas, min. kofeinas 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 Abso rci ja , mV Laikas, min. galo r. 0 10 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 Ab so rb ci ja , mV Laikas, min. epigalokatechinas 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 Ab so rb ci ja , mV Laikas, min. rutinas
12 pav. Junginių identifikavimas ESC metodu, naudojant išorinius standartus ţaliosios arbatos „Banča“ vandeninėje buitiniu metodu paruoštoje ištraukoje po 30 min.
Kaip pavaizduota 12 pav., identifikuoti 4 junginiai, kadangi tiriamajame objekte esančių 4 smailių išėjimo laikai atitinka standartų išėjimo laikus.
1) 2)
Atitinkamai chromatogramoje paţymimos identifikuotos medţiagos (tų medţiagų smailės). 13 pav. pavaizduota „Banča“ vandeninės, buitiniu metodu paruoštos ištraukos chromatograma su joje atpaţintais veikliaisiais ţaliosios arbatos komponentais.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 Ab so rb ci ja , mV Laikas, min. 1 2 3 4
13 pav. ESC metodu ţaliosios arbatos „Banča“ vandeninėje buitiniu metodu paruoštoje ištraukoje (po 30 min.) identifikuoti junginiai: 1 - galo r., 2 - epigalokatechinas, 3 – kofeinas, 4 – rutinas.
Galo r. – 15,793 min.
Epigalokatechinas – 18,953 min. Kofeinas – 24, 324 min.
Rutinas – 42, 523 min.
14 pav. Ţaliosios arbatos „Banča“ vandeninės ištraukos ESC antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Antioksidacinis aktyvumas uţrašomas galo rūgščiai ir epigalokatechinui. Kofeinui toks aktyvumas nenustatytas. Taigi pasitvirtina literatūros duomenys, kad šie junginiai – vieni svarbiausių ţaliosios arbatos antioksidantų.
Tiriant ESC metodu kiekybę, pasirenkamas vienas iš identifikuotų junginių (galo rūgštis), siekiant nustatyti jos koncentraciją ţaliavoje. Suintegravus arbatų chromatogramas, nustatomi galo rūgšties uţimamų smailių plotai ir, sudarius kalibracinį grafiką (priedas Nr.1), apskaičiuojama galo rūgšties koncentracija ţaliavoje.
15 pav. Suintegruota arbatos „Banča“ vandeninės ištraukos ESC chromatograma.
15 pav. ties 18,082 min. išėjimo laiku identifikuojama galo rūgšties smailė. Pasinaudojant ChromStar 3.25S programa, integravimo būdu, suţinomas šios smailės plotas. Atitinkamai galo rūgšties smailių plotai išmatuojami ir kitų arbatų vandenininėse ištraukose. Pagal šių plotų ir galo rūgšties (standarto) plotų santykį, galima suţinoti galo rūgšties kiekį tiriamuosiuose objektuose (7 lentelė). Skaičiuojant galo rūgštis koncentraciją bandiniuose, įvertinamas jų praskiedimas ir injekuojamo bandinio kiekis.
7 lentelė. Galo rūgšties koncentracija ţaliosios arbatos ţaliavoje, tiriant vandenines ištraukas po 30 min.
arbata smailių plotas koncentracija, μg/g
Banča po 30 min. 1156380000 132,09
Maxima po 30 min. 581840000 62,44
Majski po 30 min. 848170000 94.73
Iš 7 lentelės duomenų akivaizdu, kad didţiausia galo rūgšties koncentracija yra vandeninėse arbatos „Banča“ ištraukose. Atitinkamai šio junginio kiekis maţėja arbatose „Majski“, „Dilmah“, „Maxima“. Taigi išlaikomos pagrindinės tendencijos, atrastos spektrofotometriniame fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrime, t.y. kuo didesnis fenolinių junginių kiekis bei antioksidacinis aktyvumas, tuo didesnis vieno iš fenolinių junginių komponentų – galo rūgšties, kiekis ţaliavoje. Lyginant bendrą fenolinių junginių koncentraciją, nustatytą spektrofotometriškai (Folin – Ciocalteu metodu, kai gradavimo grafikas sudaromas pagal galo r.) su galo rūgšties koncentracija, gauta ESC, nustatomas ţymus koncentracijų skirtumas – galo rūgštis sudaro 0,16 – 0,45 proc. visų fenolinių junginių kiekio.
2.2.4. Žaliosios arbatos kietojo preparato, žaliosios arbatos ekstrakto kapsulių ,,Sanitas“, kokybės tyrimas
Lietuvos rinkoje pateikiamas vienintelis lietuviškas ţaliosios arbatos kietas preparatas (kapsulės), kurių kokybė įvertinta tuo pačiu kokybės parametru (fenolinių junginių kiekiu) kaip ir ţaliosios arbatos vandeninės ištraukos. Įdomumo dėlei buvo tiriama, koks fenolinių junginių kiekis yra vienoje kapsulėje ir kiek viena kapsulė atitinka ţaliosios arbatos ţaliavos gramų, vertinant išsiekstrahavusius fenolinius junginius.
16 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio vandeninėse ţaliosios arbatos ţaliavų ištraukose ir vienoje „Sanitas“ kapsulėje palyginimas.
Kapsulių ,,Sanitas“ pakuotės lapelyje teigiama, kad kiekvienoje kapsulėje yra 200 mg ţaliosios arbatos ekstrakto, standartizuoto pagal fenolinius junginius. Vartojant po 1 kapsulę organizmas gauna 150 mg fenolinių. Tai atitinka 2-3 puodelius ţaliosios arbatos [19]. Pagal atliktus tyrimus, pastebėta, kad vienoje ţaliosios arbatos kapsulėje nustaytas 2,5 karto maţesnis fenolinių junginių kiekis (apie 87 mg). Vis dėlto palyginus pakuotės lapelyje įvardintus ir realiai kapsulės vienete rastus kiekius, vienareikšmiškai tvirtinti, kad kapsulės „Sanitas“ nėra kokybiškos nereikėtų,
29,41 25 60 25,73 86,68 0 20 40 60 80 100
Banča 1 g Maxima 1 g Majski 1 g Dilmah 1 g Kapsulė, 1 vnt.
IŠVADOS
1. Pagamintos ţaliosios arbatos vandeninės ištraukos ir vertinta jų kokybė. Ištyrus buitiniu metodu pagamintas ţaliosios arbatos ţaliavos vandenines ištraukas, nustatyta, kad didţiausias sausas likutis bei fenolinių junginių kiekis būdingas arbatai „Majski” (atitinkamai 221,67 mg/g ir 65 mg/g), o antioksidacinis aktyvumas – arbatai „Banča” (73,44 proc. pagal DPPH* ir 74,25 proc. pagal ABTS*), nors joje fenolinių junginių kiekis yra dvigubai maţesnis negu arbatoje ,,Majski“. Taigi remiantis tyrimo rezultatais, tikslinga atlikti išsamesnę veikliųjų medţiagų analizę, siekiant nustatyti atskirų junginių antioksidacinį aktyvumą.
2. Ilgėjant ekstrahavimo laikui, buitiniu metodu paruoštose vandeninėsė ţaliosios arbatos ištraukose, išsiekstrahavusių medţiagų kiekis didėja (ištraukos vertintos po 10, 20, 30 min.). Didţiausias medţiagų kiekis išsiekstrahuoja po 10 minučių, po to medţiagų išsiskyrimas lėtėja ir 20 minučių laikotarpyje ekstraktyvinių medţiagų kiekis padidėja 25-40 proc.
3. Pagaminus uţpilus bei nuovirus, ištirta, kad išsiekstrahavusių medţiagų kiekis priklauso nuo infundirių krepšelio ţaliavai sudėti tipo. Kuo didesnis infundirės tinklelio porų diametras, tuo uţpilų bei nuovirų sauso likučio bei fenolinių junginių kiekiai didesni.
4. Tyrimo rezultatų duomenimis standartiniai gamybos būdai (uţpilų, nuovirų gamyba) yra pranašesni uţ buitinį arbatos gamybos būdą.
5. Nuovirų fenolinių junginių ir sauso likučio kiekis buvo didesni nei uţpiluose. Taigi nuovirai – kokybiškiausia vandeninių ištraukų forma. Vertinant sausą likutį ir fenolinių junginių kiekį nuovirai 7-10 proc. efektyvesnė forma uţ buitiniu būdu paruoštas arbatas ir 1-5 proc. uţ uţpilus.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Chochlačiovas V. Viskas apie arbatą. Vilnius: Mokslas; 1992. p. 10-11.
2. Cheng TO. All teas are not created equal. The Chinese Green tea and cardiovascular health. International Journal of Cardiology 2006; 108: 301-8.
3. Ragaţinskienė O, Rimkienė S, Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas: Lutute; 2005. p.16-17.
4. Briedis V, Kasparavičienė G. Kai kurie antioksidantų veikimo aspektai, maţinant neigiamą laisvųjų radikalų poveikį. Biomedicina 2002; 2: 187-9.
5. Mildaţienė V, Jarmalaitė S, Daugelavičius R. Ląstelės biologija. Kaunas: Vytauto Didţiojo universiteto leidykla; 2004. p. 171-8, 293-312, 318-321.
6. Praškevičius A, Ivanovienė L, Stasiūnienė N, Burneckienė J, Rodovičius H. Biochemija: bendrasis vadovėlis. Kaunas: Vitae Litera; 2006. p. 274-9.
7. Rijke E, Out P. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography 2006; 1112: 31-63.
8. Maruška A, Kornyšova O, Machtejevas E. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai: vadovėlis. Kaunas: Vytauto Didţiojo universiteto leidykla; 2005.
9. Leskauskas BJ, Savickas A, Švambaris LK, Valančius Z. Vaistų technologija (trečias tomas). Kaunas: Kauno medicinos universiteto leidykla; 2002. p. 188-195.
10. Ramanauskienė K, Savickas A, Masteikova R, Muselik A, Chalupova Z. Evaluation of quality of capsules with dry green tea extract and the investigation of their antioxidant activity (stendinis pranešimas); 2004.
11. Bonoli M, Pelillo M, Toschi TG, Lercker G. Analysis of green tea catechins: comparative study between HPLC and HPCE. Food Chemistry 2003; 8: 631-8.
12. Povilaitytė V, Cuvelier M-E, Berset C. Antioxidant properties of Moldavian dragonhead (Dracocephalum moldavica L.). Journal of Food Lipids 2001; 8 (1): 45-64.
13. Zgorka G, Hojnas A. The application of solid phase extraction and reversed phase high-performance liquid chromatography for simultaneous isolation and determination of flavonoids and phenolic acids. Chromatographia 2003; Suppl.57: S80.
14. Coyle CH, Phillips BJ, Morrisroe SN. Antioxidant effect of green tea and it„s polyphenols on bladder cells. Life Sciences 2008; 83: 12-8.
