MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
MEDICINOS FAKULTETAS
FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS
GYTĖ MALCIŪTĖ
REZISTENTIŠKŲ RADIOTERAPIJAI NAVIKŲ ATSAKO Į
GYDYMO MODULIACIJĄ BETA – GLIUKANU VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Dr. Dalia Akramienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
MEDICINOS FAKULTETAS
FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis Data
REZISTENTIŠKŲ RADIOTERAPIJAI NAVIKŲ ATSAKO Į
GYDYMO MODULIACIJĄ BETA – GLIUKANU VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas ... ... Data Darbo vadovas Dr. Dalia Akramienė Data Darbą atliko Magistrantė Gytė Malciūtė Data KAUNAS, 2015
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
PADĖKA ... 9
SANTRUMPOS ... 10
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Vėžys ... 13
1.1.1. Vėžio paplitimas ... 13
1.1.2. Vėžys ir vėžio genomai ... 13
1.1.3. Genetinės mutacijos ... 14
1.1.4. TGF – beta ir p53 signaliniai keliai ... 15
1.1.5. Rezistentiškumas radioterapijai ... 16 1.2. Radioterapija ... 16 1.3. Beta – gliukanai ... 18 1.3.1. Struktūra ir šaltiniai ... 18 1.3.2. Veikimo mechanizmas ... 20 1.3.3. Antiinfekcinis poveikis ... 21 1.3.4. Priešvėžinis poveikis ... 22 2.TYRIMO METODIKA ... 24 2.1. Tyrimo objektas ... 24 2.2. Eksperimento eiga ... 24 2.3. Beta – gliukanai ... 27 2.4.Radioterapija ... 27
2.5.Realaus laiko polimerazės grandininė reakcija ... 28
2.6. Statistinė duomenų analizė ... 28
3.TYRIMŲ REZULTATAI ... 28
3.1.1. Eksperimentas gydant vienkartine radioterapija ... 28
3.1.2. Eksperimentas gydant frakcionuota radioterapija ... 30
3.1.4. Pelių, sergančių Luiso plaučių karcinoma, gyvenimo trukmė po gydymo radiacine spinduliuote, beta –
gliukanu ar jų deriniu. ... 34
3.2.1. Genų raiškos pokyčiai 2D, 3D ląstelių kultūrose ar navikuose po vienkartinės ar frakcionuotos dozės radiacinės spinduliuotės poveikio ... 35
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
5. IŠVADOS ... 38
6. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 39
SANTRAUKA
REZISTENTIŠKŲ RADIOTERAPIJAI NAVIKŲ ATSAKO Į GYDYMO
MODULIACIJĄ BETA – GLIUKANU VERTINIMAS
Gytės Malciūtės magistro baigiamasis darbas. Mokslinė vadovė – Dr. Dalia Akramienė. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Fiziologijos ir farmakologijos institutas.
Darbo tikslas: Įvertinti radioterapijai rezistentiškų navikų atsaką į moduliaciją beta – gliukanu. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti LLC naviko augimo pokyčius taikant gydymą radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu.
2. Įvertinti gyvūnų, sergančių plaučių Luiso karcinoma gyvenimo trukmę po gydymo radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu.
3. Nustatyti genų, įtakojančių rezistentiškumo radiacinei spinduliuotei vystymąsi, raiškos pokyčius gydant radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu plaučių Luiso karcinomos navikuose.
Darbo metodai: Buvo naudojamos linijinės C57BL/6 moteriškos lyties pelės (išaugintos Imunologijos institute, Vilniuje, Lietuva) 8-10 savaičių amžiaus, 19-22 g svorio. Joms, į dešinę kirkšnį buvo suleista 0,2 ml plaučių Luiso karcinomos masės. Navikas augo septynias dienas. Po to pradėtas gydymas. Vyko du eksperimentai – gydant vienkartine ir frakcionuota radioterapija. Gyvūnai suskirstyti į grupes: I – kontrolės, gydymas netaikytas; II – radioterapijos, taikytas gydymas viekartine arba frakcionuota 10 Gy radioterapijos doze; III – beta – gliukano, kuris skirtas 8 dienas per os, 400 μg/ pelei per dieną; IV – kombinuoto gydymo (radioterapijos ir beta – gliukano) grupė. Matuotas navikų tūris, gyvunų gyvenimo trukmė. Genų ekspresija navikuose nustatyta tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu.
Tyrimo rezultatai: 1. Gydant frakcionuota radioterapija kartu su beta-gliukanu navikai buvo mažesni nei gydant tik radiacine spinduliuote (0,206±0,046 vs 0,259±0,039, (p < 0,05). Navikų dydis gydant tik beta – gliukanu buvo statistiškai reikšmingai (p < 0,05) mažesnis lyginant su navikais, kuomet taikytas kombinuotas gydymas (0,378±0,022 vs 0.460±0,083).
Gydant vienkartine radioterapija navikų dydis statistiškai reikšmingai (p < 0,05) skyrėsi radioterapijos ir beta – gliukano grupėse (0,542±0,138 vs 0,400±0,168). Kombinuoto gydymo tūrių vidurkis statistiškai reikšmingai (p < 0,05) skyrėsi tik nuo kontrolės grupės (0,431±0,329 vs 0,513±0,178).
2. Geriausias išgyvenamumas buvo pelių grupėje, kurios buvo gydytos tik beta – gliukanu. Eksperimente su frakcionuota radioterapijos doze, pelės, gydytos beta – gliukanu vidutiniškai gyveno 24,08 ± 2,24 dienas nuo gydymo pradžios. Eksperimente su vienkartine radiacine spinduliuote pelės, gydytos beta – gliukanu vidutiniškai gyveno 18,11±1,63 dienas.
3. Pasirinktų genų raiška navikuose kito nežymiai.
Išvados: 1. Naviko augimas labiausiai buvo slopinamas gydant beta – gliukanu. Kombinuotas gydymas naviko augimą slopino labiau nei tik radiacinė spinduliuotė, tačiau statistinis reikšmingumas buvo pastebėtas tik gydant frakcionuota radiacine spinduliuote.
2. Statistiškai reikšmingo išgyvenamumo skirtumo tarp pelių, gydytų radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu nebuvo. Geriausias išgyvenamumas pastebėtas pelių grupėse, gydytose tik beta – gliukanu.
SUMMARY
ASSESSMENT OF THE RADIO-RESISTANT TUMORS RESPONSE TO THE
TREATMENT MODULATION BY BETA-GLUCAN
Master theses of Gytė Malciūtė. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Fisiology and Pharmacology Institute. Supervisor Dalia Akramienė, Ph. D. (Biomedical sciences).
Aim of experiment: Assess radiation therapy resistance tumor response in the modulation of beta – glucan.
Experiment tasks: 1. Identify LLC tumor growth changes by giving radiation and / or beta – glucan treatment.
2. Assess survival of LLC tumor bearing mice, treated by radiation therapy or / and beta – glucan.
3. Identify the genes that influence the development of radiation therapy resistance, expression changes in the treatment of radiation therapy and / or beta-glucan in LLC tumors.
Methods: C57BL / 6 female mice (produced at the Institute of Immunology, Vilnius, Lithuania), 8-10 weeks old, 19-22 g weight were used. Mice were injected with 0.2 ml of a LLC tumor mass in the right groin. The tumor has grown for seven days. There were two experiments – the treatment of single and fractionated dose radiotherapy. Animals were divided into groups: I – control treatment; II – radiation therapy, treatments with single and fractioned 10 Gy radiotherapy dose; III – beta – glucan, which was given for 8 days orally 400 µg / mouse per day; IV – combined treatment (radiation therapy and beta - glucan) group. Tumor volume and mice survival during experiment was measured. Gene expression in tumors was made with real-time polymerase chain reaction method.
Results: Treatment with fractionated radiotherapy in combination with beta-glucan tumors were smaller than in the single dose radiation (0.206 ± 0.046 vs 0.259 ± 0.039, (p <0.05). The size of tumors only in the treatment of beta – glucan was statistically significant (p <0.05) lower compared to the tumors, in the combination therapy group (0.378 ± 0.022 vs 0.460 ± 0.083).
In the treatment with single dose radiotherapy tumor size was statistically significant (p <0.05) between radiotherapy and beta – glucan group (0.542 ± 0.138 vs 0.400 ± 0.168). Combined treatment tumors volume was statistically significant lower (p < 0.05) comparing to the control group (0,431±0,329 vs 0,513±0,178).
2. The best survival was in the group of mice that were treated with beta – glucan. In the experiment with fractionated radiotherapy dose, mice treated with beta – glucan average lived 24.08 ± 2.24 days. In the experiment with single dose of radiotherapy mice treated with beta – glucan lived an average of 18.11 ± 1.63 days.
3. The expression of selected genes in tumors changed just slightly.
Conclusions: 1. Tumor growth was inhibited the most in the treatment with beta – glucan. Combination treatment inhibited tumor growth more than just radiotherapy, but statistical significance was noticed just in the treatment of fractionated radiotherapy
2. There were no statistically significant survival difference between mice treated with radiotherapy and / or beta – glucan. The best survival was noticed in groups of mice treated with only beta – glucan.
PADĖKA
Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems atlikti mokslinius tyrimus ir rengti magistro darbą. Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovei dr. Daliai Akramienei už visokeriopą pagalbą, patarimus ir konsultancijas. Dėkoju Nacionalinio vėžio instituto biomedicininės fizikos laboratorijos vyr. specialistei Danutei Bulotienei už pagalbą atliekant eksperimentinius tyrimus. Taip pat noriu padėkoti dr. Kęstučiui Sužiedeliui už galimybę atlikti eksperimentus Nacionalinio vėžio instituto mokslinių tyrimų laboratorijos padalinyje.
SANTRUMPOS
CP – gyslainės rezginys (angl. Choroid plexus)
CR3 – komplementinis receptorius 3 (angl. complement receptor 3) DNR – Deoksiribonukleorūgštis
Gy – Grėjus
HER2 – žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptorius 2 (angl. human epidermal growth factor receptor 2)
IL-1 – Interliaukinas
LLC – Luiso plaučių karcinoma (angl. Lewis lung carcinoma) LPS – lipopolisacharidai
PAMP – patogenais susijęs molekulinis modelis (angl. pathogen – associated molecular patterns) PET – pozitronų emisijos tomografija
PGR – polimerazės grandininė reakcija
PRR – atpažinimo receptorius (angl. pattern recognition receptor)
PTEN – fosfotazės ir angiotenzino homologas (angl. Phosphatase and tensin homolog) RT – radioterapija
SD – standartinis nuokrypis (angl. standart deviation) TH1 – limfocitai (angl. T helper)
TLR – „Toll-like“ tauriniai receptoriai (angl. Toll-like receptor) βG – beta – gliukanas
ĮVADAS
Vėžys – tai liga, kuriai būdingas nekontroliuojamas ląstelių dalijimasis. Yra daugiau nei 100 skirtingų vėžio tipų. Vėžys kenkia organizmui, kai nekontroliuojamai besidalindamos ląstelės suformuoja gabalėlius ar audinių mases, vadinamus navikais. Navikai gali augti ir trukdyti tinkamai funkcionuoti virškinimo, nervų, kraujotakos sistemoms [6].
Vėžys sudaro 13 proc. visų pasaulyje esančių mirčių atvejų [53,78]. Vėžį sukelia genetiniai defektai [79, 80]. Genetiniai pokyčiai, susiję su vėžio išsivystimu, paveikia tris pagrindinius genus – onkogenus, naviko slopinimo genus ir DNR pažaidų atstatymo genus [102].
Yra žinomas beta – gliukanų imuninę sistemą stimuliuojantis ir priešnavikinis poveikis. Pastaruoju metu skiriamas didelis dėmesys imuninės sistemos vaidmeniui vėžio gydyme. Tai gelėtų pagreitinti ir sustiprini navikinių ląstelių, kurios buvo paveiktos chemoterapijos arba radioterapijos, žūtį [45,62, 86, 87].
Radioterapija yra vienas iš pagrindinių vėžio gydymo metodų. Optimali radioterapijos dozė ir jos deriniai yra pritaikomi priklausomai nuo vėžio dydžio ir gydymo pobūdžio. Tačiau aktuali problema taikant radiacinę spinduliuotę yra navikinių ląstelių rezistentiškumo spinduliuotei išsivystymas.
Tyrinėdami rezistentiškumo radiacinei spinduliuotei išsivystymo mechanizmus, Nacionaliniame vėžio institute Lietuvoje, mokslininkai nustatė, kad apšvitinus didele radiacinės spinduliuotės doze plaučių Luiso karcinomos ląsteles in vitro, labiausiai didėjo signalinio kelio p53 genų (Bbc3, P21, Ccng1) ir TGF-beta genų ( ID1, Dcn, THBS2) raiška. (K. Sužiedelis ir kt. nepublikuoti duomenys). Manoma, kad šių genų raiškos pokyčiai gelėtų turėti įtakos rezistentiškumo radiacinei spinduliuotei išsivystymui.
Magistrinis darbas buvo pristatytas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Studentų mokslinės draugijos 67-joje „Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje 2015“ (žr. Priedą). Farmacijos sekcijoje užėmė pirmąją vietą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Įvertinti radioterapijai rezistentiškų navikų atsaką į moduliaciją beta – gliukanu. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti LLC naviko augimo pokyčius taikant gydymą radiacine
spinduliuote ir/ar beta – gliukanu.
2. Įvertinti gyvūnų, sergančių plaučių Luiso karcinoma gyvenimo trukmę po gydymo radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu.
3. Nustatyti genų, įtakojančių rezistentiškumą radiacinei spinduliuotei vystymąsi, raiškos pokyčius gydant radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu plaučių Luiso karcinomos navikuose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Vėžys
Vėžys – tai genetinė liga, kuri gali paveikti bet kurią kūno dalį. Vienas iš vėžio bruožų yra greitas ir nekontroliuojamas pakitusių ląstelių augimas, kurios auga didesnės nei įprastai. Pagrindinė mirties nuo vėžio priežastis – metastazės – pakitusių ląstelių plitimas į kitus audinius arba organus. Vėžio augimas yra nekontroliuojamas. Vėžio galima išvengti apsisaugant nuo tam tikrų rizikos veiksnių, pavyzdžiui, tabako dūmų. Daugelį vėžio atvejų galima išgydyti chirurginiu būdu, radioterapija ar chemoterapija. Šie būdai yra ypač veiksmingi, jei vėžys yra nustatytas anksti [64].
1.1.1. Vėžio paplitimas
2008 metais buvo nustatyta 12,7 milijono vėžio atvejų, tarp jų – 7,6 milijonų mirties atvejų. Moterims dažniausiai buvo nustatytas krūtų vėžys, vyrams – plaučių. Šie du vėžio tipai yra labiausiai paplitę gerai ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse. Prostatos vėžiu yra labiausiai sergama ne taip gerai ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse.
Sergamumas vėžiu yra beveik dvigubai didesnis gerai ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse nei ne taip gerai ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse. Prostatos, storosios žarnos ir moterims krūties vėžys yra iki 5 kartų dažnesnis gerai ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse, nei ne taip gerai išsivysčiusiose šalyse. Taip pat vėžys yra diagnozuojamas vėliau ne taip gerai ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse, palyginti su gerai ekonomiškai išsivysčiusiomis šalimis [69].
1.1.2. Vėžys ir vėžio genomai
Visi vėžinių ląstelių genai yra žinomi kaip vėžio genomai. Daugelis šių genų yra tokie patys kaip ir sveikose ląstelėse, tačiau keli genai turi specifines mutacijas, kurie yra atsakingi už sveikų ląstelių virtimą į vėžines ląsteles.
Mokslininkai nustatė, kad navikai turi skirtingas mutacijas, net jei vėžys prasidėjo tame pačiame organe. Taip pat yra ištirta, kad pasikartojantis vėžys turi skirtingas mutacijas nei pirminis vėžys [10].
1.1.3. Genetinės mutacijos
Yra du pagrindiniai genetinių mutacijų tipai: įgytos ir įgimtos. Įgytos mutacijos yra dažniausia vėžio priežastis. Šios mutacijos atsiranda, kai genai yra paveikiami aplinkos veiksnių (pavyzdžiui: tabako dūmų, UV spinduliuotės, virusų). Šios mutacijos nėra genetiškai paveldimos.
Pasitaiko, kad mutacijos atsiranda žmogaus organizme nuo gimimo. Šios mutacijos sudaro 5-10 proc. visų vėžio atvejų.
Žmogaus organizme mutacijos vyksta dažnai ir paprastai dauguma pakeitimų yra ištaisoma. Priklausomai nuo geno pokyčio, mutacija gali būti naudinga, žalinga arba neturėti jokios reikšmės. Tad, kad iš vienos mutacijos išsivystis vėžys – tikimybė yra labai maža. Paprastai turi įvykti keletas mutacijų per visą gyvenimą, kad atsirastų vėžys. Todėl vėžys dažniau pasireiškia vyresnio amžiaus žmonėms [91].
Kategorijos, į kurias patenka genai, prisidedantys prie vėžio išsivystymo:
Onkogenai. Jie paverčia sveiką ląstelę į kancerogeninę ląstelę. HER2 – specializuotas baltymas, kuris kontroliuoja vėžio augimą ir plitimą, rastas ant kai kurių vėžinių ląstelių, tokių kaip krūties ar kiaušidžių ląstelių [83]. Taip pat RAS genai, kurie baltymus įtraukia į transportavimo kelius, reguliuoja ląstelės augimą ir ląstelės mirtį. Šių genų mutacijos yra beveik visada įgytos.
DNR pažaidų atstatymo genai nustato klaidas DNR replikacijos metu. Jei žmogus turi pakitimą DNR atstatymo gene – šie pakitimai nėra ištaisomi. Bėgant laikui jie tampa mutacijomis, kurios gali sukelti vėžį. Mutacijos DNR atstatymo genuose gali būti įgimtos arba įgytos.
Auglio slopinimo genai yra genai, kurie slopina ląstelių augimą. Kai naviko slopinimo genas mutuoja (dėl paveldimumo ar aplinkos veiksnių) – ląstelės auga nekontroliuojamai ir galiausiai susidaro masė, vadinama naviku. BRCA1, BRCA2 ir p53 yra vieni iš pagrindinių auglio slopinimo genų. Įgimtos mutacijos [72,73,92] BRCA1 arba BRCA2 genuose padidina riziką moterims susirgti krūties ar kiaušidžių vėžiu. Dažniausiai mutuojantis genas pacientams, kuriems nustatytas vėžys, yra p53. Daugiau nei 50 proc. visų vėžio atvejo pasaulyje yra dėl p53 geno pakitimų. p53 mutacijos gali būti paveldėtos ir įgytos [67].
Mutacijos BRCA1 ir BRCA2 genuose padidina kelių rūšių vėžio riziką. BRCA1 geno mutacijos gali padidinti riziką moterims susirgti kiaušintakių ar kiaušidžių vėžiu [19, 24,34]. Vyrai su BRCA1 arba BRCA2 genų mutcijomis turi didesnę riziką susirgti prostatos vėžiu [60]. Mutavus BRCA1 arba BRCA2 genams, tiek vyrams, tiek moterims padidėja rizika susirgti kasos vėžiu [33].
Yra daug priežasčių kodėl atsiranda genetinis nestabilumas. Tai apima DNR pažaidų atstatymo genus ar genus, atsakingus už chromosomų stabilumą [37,65,76]. Taip pat įtakos genų nestabilumui gali turėti ir aplinkos poveikis (tabako dūmai, UV spinduliuotė, radiacija) [13,70], epigenetiniai mechanizmai [57].
Naujausi duomenys rodo, kad onkogeno aktyvacija gali tiesiogiai sukelti genomo nestabilumą padidinus reaktyvaus deguonies gamybą [16]. Skirtingų tipų genetinis nestabilumas paveikia vėžio genomus ir jų gebėjimą skatinti genetinį heterogeniškumą ir gydymo atsaką [18].
Esant genetiniam vėžinių ląstelių nestabilumui – atsiranda rezistentiškumas gydymui. Taip pat ir radioterapijai.
1.1.4. TGF – beta ir p53 signaliniai keliai
TGF – beta baltymas padeda kontroliuoti ląstelių augimą ir dalijimąsi. Šio proceso metu ląstelės subręsta atlikti specifines funkcijas – kontroliuoti ląstelės judėjimą ir ląstelės apoptozę. TGF – beta baltymas yra randamas visame organizme ir atlieka svarbią funkciją prieš kūdikiui gimstant – jis suformuoja kraujagysles raumenų audiniuose, skatina žmogaus riebalų vystimąsi ir žaizdų gijimą bei reguliuoja imuninę sistemą. TGF – beta baltymo yra ypač gausu audiniuose, kurie reguliuoja kaulų augimą. Ląstelėse šis baltymas būna neveiksnus, kol negauna signalo tapti aktyviu [38].
Kai kurios TGF – beta signalinio kelio genų mutacijos yra įgyjamos per visą žmogaus gyvenimą ir pasireiškia tik tam tikrose ląstelėse. Šie pokyčiai yra vadinami somatinėmis mutacijomis. Somatinės mutacijos, sukėlusios pakitimus genuose, gali lemti kai kurias vėžio formas [41]. Pakitusi baltymų ekspresija gali sukelti keletą su vėžiu susijusių pokyčių. Tai gali būti nekontroliuojamas ląstelės dalijimasis, angiogenezė. TGF – beta genas yra labai aktyvus kai kuriuose prostatos vėžio atvejuose. Šio geno pakitimai buvo rasti krūties vėžyje, gaubtinės žarnos, plaučių ir šlapimo pūslės vėžio formose [38].
Genas p53 dar yra žinomas kaip TP53 arba naviko baltymų genas. Jis koduoja baltymą, kuris reguliuoja ląstelės ciklą ir taip veikia naviką slopinančiai. p53 buvo apibūdintas kaip „genomo globėjas”, todėl kad jis išsaugo stabilumą apsaugant genomą nuo mutacijos
.
Normaliose ląstelėse, p53 baltymo koncentracija yra nedidelė. DNR pažeidimai gali sužadinti p53 baltymų dauginimąsi, kurie turi tris pagrindines funkcijas: augimo sustabdymą, DNR atstatymą ir apoptozę. Augimo sustabdymas stabdo ląstelių ciklo progresavimą, užkerta kelią daugintintis pažeistoms DNR. Per augimo sustabdymą p53 gali suaktyvinti baltymus, dalyvaujančius DNR atstatymo transkripcijoje.
p53 ląstelių koncentracija turi būti griežtai reguliuojama. Didelės p53 koncentracijos per greitai vykdo apoptozę, todėl greitėja senėjimo procesas. Pagrindinis p53 reguliatorius – Mdm2 gali sukelti p53 degradaciją [89].
1.1.5. Rezistentiškumas radioterapijai
Ląstelės augdamos ir besidalindamos pereina kelis etapus. Organizmas kontroliuoja kiekvieną etapą ar ląstelė yra pakankamai sveika toliau augti ir dalintis. Jei ne – pavyzdžiui: jei yra padaryta žala genetinei medžiagai – signalai iš „kontrolės punktų” turėtų tai perduoti ląstelei ir laukti kol ląstelė bus sutvarkyta arba kol bus sukelta apoptozė. Jei „kontrolės punktai” veikia, bet ląstelė turi pažeistą DNR atstatymo sistemą – ląstelė bus jautri radioterapijai. Bet jei „kontrolės punktai“ neveikia – ląstelė gali apeiti DNR atstatymą ir toliau augti bei dalintis, o tai sukelia rezistentiškumą radioterapijai.
PTEN genas gamina baltymą, kurį galima rasti beveik visuose organizmo audiniuose. Šis baltymas slopina naviką, užkertant per greitai besidalijančių ląstelių kelią. PTEN mutacijos dažnai nustatomos esant prostatos vėžiui, melanomai ir tam tikriems agresyviems smegenų augliams. Buvo pastebėta, kad navikai su PTEN mutacijomis yra dažnai atsparūs radioterapijai [40].
1.2. Radioterapija
Radioterapija – tai įvairių formų radiacijos naudojimas saugiam ir veiksmingam vėžio bei kitų ligų gydymui. Švitinant radiacine spinduliuote yra padaromi smulkūs įtrūkimai ląstelės DNR. Šie
įtrūkimai stabdo vėžines ląsteles nuo augimo ir dalijimosi bei dažnai sukelia ląstelių mirtį. Normalios ląstelės taip pat gali būti paveiktos radiacijos, bet daugiausia jų atsistato ir funkcionuoja kaip ir seniau.
Skirtingai nuo chemoterapijos, kuri po visą kūną paskleidžia priešvėžinius vaistus – radioterapija paprastai yra vietinio veikimo. Ji paveikia tiktai gydymo vietą. Pagrindinis radioterapijos tikslas yra pažeisti vėžines ląsteles kiek įmanoma mažiau žalos padarant sveikiems audiniams. Didžioji dalis radioaktyviųjų medžiagų susirenka naviko srityje, todėl kitiems audiniams poveikis yra mažas [7].
Buvo iškeltas klausimas ar vienkartinė radioterapijos dozė yra tokia pati veiksminga kaip ir frakcionuota dozė. Vienkartinės dozės radioterapija yra patogesnė pacientui ir pigesnė lyginant su frakcionuota radioterapija. Dažniausiai gydymas vienkartine radioterapija yra trumpesnis, lyginant su frakcionuota radioterapija. Skausmo atsakas gali būti taip pat mažesnis [52,77]. Tačiau vienkartinė radioterapija gali būti ne tokia efektyvi kaip frakcionuota radioterapija.
Radioterapija gali būti naudojama:
Sunaikinti auglius, kurie išplito į kitas kūno vietas;
Sumažinti riziką, kad vėžys sugrįš po operacijos ar chemoterapijos, naikinant mažus vėžio kiekius, kurie gali sugrįžti;
Sumažinti vėžį prieš operciją [8].
Tyrime buvo apibrėžta klinikinė situacija, kurioje radioterapija buvo rekomenduota kaip gydymas pacientams ir lyginama su alternatyviais gydymo metodais (įskaitant ir ne gydymą). Buvo tikrinami paciento sveikatos būklės rodikliai ir negalavimų buvimas ar nebuvimas. Radioterapijos pranašumas gali būti dėl geresnio išgyvenamumo, kontrolės ar mažesnio toksiškumo. Tyrimas buvo atliekamas su visais pacientais, kuriems buvo nustatytas vėžys. Tyrime nebuvo žiūrima į nepiktybines melanomas ir nepiktybinius navikus [31].
Pacientai, kuriems reikėjo radioterapijos buvo skaičiuojami tik vieną kartą, net jei jie turėjo keletą radioterapijos indikacijų, įvairiose ligos stadijose.
Iš 1000 vėžio atvejų, 523 pacientai buvo švitinami radioterapija. Šiame tyrime tai apima 52,3 proc. visų rezultatų. Dar 120 pacientų, iš minėtų 523 pacientų, reikėjo antrinio gydymo. Tai apima 23 proc.
Kitame tyrime buvo manoma, kad radioterapija sukelia visišką patologinį atsaką prieš operuojant stemplės vėžį. Mokslininkai nusprendė atlikti nerandomizuotą tyrimą, kuriame lygino retrospektyvą vien tik chirurginiu būdu išoperuotą vėžį su prieš – operacine radioterapija, po kurios vėžys buvo operuojamas. Radiacijos dozės svyravo tarp 20-60 Gy. Buvo keletas pranešimų apie išgyvenamumo pagerėjimą tiems pacientams, kurie buvo gydomi ir radioterapija, ir chirurginiu būdu [44,46,47,58]. Išgyvenamumo
rezultatai, remiantis trimis tyrimais, buvo geresni su radioterapija prieš chirurginiu būdu pašalinant vėžį [1,48] ir du tyrimai parodė geresnius rezultatus pašalinant vėžį vien tik chirurginiu būdu. [12]. Nei vienas iš šių rezultatų nepasiekė statistinio reikšmingumo. Dėl šių tyrimų rezultatų radioterapija yra retai naudojama kaip vienintelis gydymo būdas prieš chirurginę intervenciją [11]. Ši peržiūra įtraukė kitus randomizuotus tyrimus, lyginančius vien tik chirurginę intervenciją su prieš – operacine radioterapija.
Per pastarąjį dešimtmetį radioterapijos technologijos smarkiai patobulėjo. Šios technologijos leido onkologams tiekti didėles radiacijos dozes, kurios buvo tiksliau nukreiptos į naviką. Tuo pačiu metu apsaugoti greta esančius audinius ir organus. Radioterapija taip pat gali padėti atidėti operaciją. Šiuo metu operaciją galima atidėti nuo 4-8 savaičių iki 10-12 savaičių. Tokiu būdu kai kuriems pacientams galima padėti išvengti operacijos, kur buvo pasiektas teigiamas endoskopinis ir PET tyrimas. Šis būdas yra vis labiau priimtinas ten, kur yra naudojama chemoradioterapija. Tai padeda sumažinti gydymo išlaidas ir pagerina pacientų gyvenimo kokybę [21].
1.3. Beta – gliukanai
Beta – gliukanai yra heterogeninė natūralių polisacharidų grupė [88]. Beta – gliukanų teigiamas poveikis imunitetui pastebėtas žmonėse, bestuburiuose gyvūnuose bei graužikuose [2]. Tyrimai parodė, kad beta – gliukanai turi hepatoprotektinį, antidiabetinį ir cholesterolį mažinantį ir priešnavikinį poveikius. Taip pat padeda sumažinti kūno svorį [98,103].
1.3.1. Struktūra ir šaltiniai
Tradicinėje kinų medicinoje beta – gliukanas buvo vartojamas imuninei sistemai stiprinti. Daugiausia beta – gliukanų randama Shiitake (Lentinus edotes) grybuose Japonijoje ar Lingzhi (Ganoderma lucidum) grybuose Kinijoje. Beta – gliukanų tyrinėjimai prasidėjo praėjusio amžiaus viduryje [5]. Buvo tiriamas imunomoduliacinis netirpių mielių poveikis. Vėliau buvo pastebėta, kad imunologinį efektą turi beta-(1,3)-D-gliukano konformacija. Daugiausia dabartinių žinių apie beta – gliukanų naudą ir veikimą buvo atrasta per pastaruosius 20 metų [8,9]. Beta – gliukanų molekulių yra randama mielių sienelėse, grybuose, dumbliuose ir grūduose [99].
Beta – gliukanai yra sudaryti iš D-gliukozės monomerų, sujungtų (1,3) linijinėmis jungtimis, beta-(1,4) arba beta-(1,6) šoninėmis grandinėmis [23].
Mielių beta – gliukanai yra sudaryti iš beta-(1,3)-D-gliukozės radikalo. Prie jo yra prisijungusios beta-(1,6) šoninės grandinės (1 pav.) [82]. Grybų beta – gliukanai turi trumpas beta-(1,6) šakas, prisijungusias prie beta-(1,3) grandinės. Avižų ir miežių beta – gliukanams būdinga beta-(1,3)(1,4) struktūra [4].
Kuo yra didesnė molekulinė masė – tuo beta – gliukanai turi daugiau imunomoduliacinių ir priešvėžinių savybių [68]. Didesnė molekulinę masę turintys beta – gliukanai gali tiesiogiai aktyvuoti leukocitus, stimuliuodami jų citotoksinį ir antimikrobinį aktyvumą. Mažos molekulinės masės beta – gliukanai turi mažesnį biologinį aktyvumą in vivo. Labai mažos molekulinės masės beta – gliukanai (molekulinis svoris < 5000 – 10 000) yra beveik neaktyvūs.
1 pav. Mielių beta – gliukanų cheminė struktūra.
Mielių beta gliukanai yra sudaryti iš beta-(1,3)-D-gliukozės radikalo. Prie jo yra prisijungusios beta - (1,6) šoninės grandinės. Šaltinis: Samuelsen et al.,J Mol. Nutr. Food Res 2014.
Beta – gliukanų struktūrą galima išsiaiškinti pagal įvairius metodus. Keli iš jų yra chromatografija – masių spektrometrija [3], efektyvioji skysčių chromatografija [17], rečiau taikoma rentgeno kristalografija [59]. Kiti, paprastesni būdai, nustatant beta – gliukanų sudėtį yra fenolio – sieros rūgšties angliavandenių testas, anilino testas ir ELISA metodas. Kadangi cheminė modifikacija visada gali pakeisti natūralų pavidalą, dauguma šių metodų gali neparodyti tikrų ryšių tarp struktūros ir biologinio aktyvumo.
1.3.2. Veikimo mechanizmas
Bakterijų sienelėje yra beta – gliukanų, todėl imuninė sistema juos atpažįsta. Įgimtas imuninės sistemos atsakas „atakuoja“ patogenus per PRR, kuriuos paprastai išskiria imuninės ląstelės. PRR atpažįsta mikrobų struktūras – PAMP [71,32]. Svarbiausias PRR beta – gliukanams yra dektino-1 receptorius, CR3 ir TLR, kurie yra randami įvairiose imuninėse ląstelėse, tokiose kaip monocitai, magrofagai, dendritinės ląstelės, neutrofilai, eozinofilai, natūralios žudikės ir epitelinės ląstelės [20,22,28,29,55,81,97]. Beta – gliukanų susirišimas su dektino-1 receptoriumi lemia įgimtą ir įgytą imuninę sistemą. In vitro tyrimai parodė, kad mielių beta – gliukanas yra stiprus makrofagų stimuliatorius [85] ir žiurkėms aktyvina T limfocitus, kurie sukelia imunostimuliuojamąjį poveikį [84].
Tikslus mechanizmas kaip beta – gliukanai paveiks imuninę sistemą, iš dalies priklauso nuo vartojimo būdo. Vartojant per os, daroma prielaida, kad pirmiausia beta – gliukanai ir M ląstelės sąveikauja plonajame žarnyne [90].
Beta – gliukano įsisavinimas buvo tirtas su pelėmis, su tirpiu bei netirpiu beta - (1,3) - (1,6)-gliukanu. Abu beta – gliukano tipai buvo apsupti virškinimo makrofagų ir perdirbtų formų buvo pernešami į limfmazgius, blužnį ir kaulų čiulpus.
Geriamieji beta – gliukanai pelėms sukėlė fagocitinį aktyvumą, oksidacinį protrūkį ir IL-1 gamybą. Didesnis neutrofilų ir monocitų fagocitinis aktyvumas bei oksidacinis metabolizmas žiurkėse, parodė imuninį atsaką ir aktyvumą vartojant mielių beta – gliukaną [101].
Per os vartojami beta – gliukanai paveikia gleivinės imunitetą, tai parodė intraepitelinis limfocitų padidėjimas pelių žarnyne [95]. Žiurkėse, tirpaus beta – gliukano absorbcija translokavosi iš gastrointestinalinio trakto į sisteminę kraujotaką. Absorbcija padidino imuninės sistemos atsaką ir pasipriešinimą infekcijai.
Kitas svarbus aspektas, į kurį reikia atsižvelgti yra beta – gliukanų tirpumas. Netirpūs beta – gliukanai, išskirti iš mielių stimuliuoja imuninę sistemą per skirtingus kelius [80].
In vivo ir in vitro tyrimai parodė, kad netirpūs beta – gliukanai buvo fagocituoti dendritinių ląstelių ir makrofagų per dektino-1 receptoriaus kelią. Nors netirpūs beta – gliukanai gali taip pat būti fagocituoti per dendritines ląsteles, nuo dektino-1 receptoriaus nepriklausomu mechanizmu. Dektino-1 receptoriaus kelias yra būtinas dendritinių ląstelių aktyvacijai, kurios sužadina T ląstelių atsaką ir citokinų išsiskyrimą [80].
Netirpūs beta – gliukanai skatina fagocitozės procesą, todėl atakuoja mikrobus, prisijungdami dektino-1 receptorius [15]. Netirpus beta – gliukanas skatina T limfocitų diferenciaciją į TH1 ląsteles ir
padidina citotoksinį T limfocitų aktyvumą dektino-1 receptoriaus keliu. Tirpūs beta – gliukanai prisijungia CR3 receptorių. CR3 aktyvinamas, tarpininkaujant imuninei sistemai, yra palaikomas specifinių antikūnių [15].
Skirtingos beta – gliukanų dalelės paveikia imuninę sistemą skirtingais keliais. Netirpus beta – gliukanas gali paveikti tiek įgimtą, tiek įgytą imuninį atsaką, o tirpus beta – gliukanas aktyviausiai veikia per komplemento sistemą, kuriai reikia specifinių antikūnių [28].
1.3.3. Antiinfekcinis poveikis
Antibiotikų ir priešvirusinių vaistų atsparumo problema vis didėja, daugelis antivirusinių vaistų tampa neefektyviais. Beta – gliukanai stimuliuoja įgimtas imunines ląsteles (pvz.: monocitus ir makrofagus) per TLR2 receptorius taip sukeldami antiinfekcinį poveikį [36].
Buvo įrodyta, kad vartojant beta-(1,3),(1,6)-gliukaną, gali padidėti atsparumas bakterijoms ir virusams vėžiagyviuose, žuvyse, paukštienoje, jūrų kiaulytėse, kiaulėse ir žmonėse [35,56,75,96]. Tolesni tyrimai parodė, kad beta – gliukanas kai kuriais atvejais po chirurginių procedūrų infekciją sumažina 5 proc. Gripo atveju buvo įrodyta, kad beta – gliukanas padidina atsparumą virusui pelėse [79] ir kiaulėse.
Placebu kontroliuojamame, dvigubai aklame, atsitiktinių imčių tyrime dalyvavo 167 sveiki pacientai su pasikartojančiomis infekcijomis. Jiems kiekvieną dieną buvo duodama 900 mg placebo arba tiek pat mielių beta-(1,3),(1,6)-D-gliukano. Tai buvo daroma 16 savaičių. Tiriamieji turėjo aprašyti kiekvieną pasireiškiantį peršalimo epizodą, įvertinant simptomus taškais. Tyrimo dalyviai buvo egzaminuojami per kiekvieną peršalimo epizodą, per 5-ąją peršalimo dieną.
Išnagrinėjus dienoraščius, buvo matoma, kad netirpus mielių (1,3)-(1,6)-beta-gliukanas sumažino simptominio peršalimo infekcijų skaičių 25 proc., lyginant su placebu. Vidutis pasireiškusių simptomų rodiklis vartojant beta – gliukaną buvo 15 proc. mažesnis nei vartojant placebą. Beta – gliukanas taip pat labai pagerino miego sutrikimus, kuriuos sukėlė peršalimas. Apibendrinant galima sakyti, kad mielių beta – gliukanas padidino atsparumą prieš patologinius mikroorganizmus [51].
Tyrimai, atlikti su gyvūnais parodė profilaktinį mielių beta – gliukano poveikį prieš bakterijų ir LPS sukeltas infekcijas. Po profilaktinių didelių (150 arba 300 mg/kg) beta – gliukano dozių, pelių išgyvenamumas padidėjo 30-40 proc. Profilaktinis gydymas buvo taikomas 10 dienų prieš suleidžiant Listeria monocytogenes infekciją į pilvaplėvę. Mielių beta – gliukanas buvo normalizuotas kaulų čiulpuose ir blužnies granuliocitų makrofagų kamieniniuose lygiuose raumenyse [30,93].
Buvo įrodyta, kad mielių beta – gliukanai (0,2 ir 20 mg/kg) apsaugo peles nuo juodligės (Bacillus anthracis) infekcijos. Apsauginis poveikis taip pat buvo pastebėtas žiurkėse, kurios gavo 20 mg/kg 2 savaites prieš intraveninę E. coli injekciją. Mažesnės beta – gliukano dozės (0,1-10 mg/kg) parodė reikšmingą poveikį žiurkėms, kurioms buvo sukeltas mastitas [104].
Per os vartojamo beta – gliukano poveikis buvo pastebėtas virškinamojo trakto gleivinėje. Pelės, kurios gavo 25 mg per dieną beta – gliukano, buvo pastebėtas intraepitelinis limfocitų skaičiaus padidėjimas žarnyne [94].
1.3.4. Priešvėžinis poveikis
Priešvėžiniai vaistai, kartu vartojami su beta – gliukanu padidina vaistų veiksmingumą, nesukeldami papildomo toksiškumo. Plačios ikiklinikinių tyrimų studijos su gyvūnais parodė, kad peroralinis beta – gliukano vartojimas kartu su priešvėžine terapija skatina naviko regresiją ir ilgalaikį išgyvenamumą [49,100].
Beta – gliukanai dalyvauja metabolizmo ir detoksikacijos atstatymo procesuose. Jie paveikia viso organizmo imuninę sistemą, neutralizuoja patologines sąlygas, reaktyviosios deguonies ir azoto procesus, kuriose jie dalyvauja. ROS ir RNS atlieka svarbų vaidmenį ligų patogenezėje. ROS gamyba yra aerobinių ląstelių metabolizmo neatsiejama dalis. ROS fiziologinės koncentracijos yra svarbios tinkamai ląstelių veiklai, o jų per didelė gamyba įvyksta dėl sukelto oksidacinio streso [54].
I fazės klinikiniame tyrime, buvo vertinamas tirpaus beta – gliukano saugumas ir toleravimas. Jis buvo vartojamas per os. Skirtingos beta – gliukano dozės (100 mg / per dieną, 200 mg / per dieną, arba 400 mg / per dieną) buvo duodamos pacientams keturias dienas iš eilės. Nebuvo pastebėta jokių su vaistais susijusių nepageidaujamų poveikių.
Gyvūnų per os vartojamas mielių beta – gliukanas pasižymėjo priešvėžiniu aktyvumu. Kasdienė netirpaus ir tirpaus mielių beta – gliukano dozė – 400 μ/g [14,74] sustiprino monokloninių antikūnių imunoterapijos aktyvumą prieš pelių krūtų vėžį. Gydymui vartojamas tirpus mielių beta – gliukanas kartu su chemoterapiniu alkilinimo agentu ciklofosfamidu uždelsė auglio plitimą [27,43]. Panašus poveikis buvo nustatytas, kai mielių beta – gliukanas buvo duodamas kartu su peptidų vakcinomis, apsaugant nuo B ląstelių limfomos [42]. Tirpus beta – gliukanas tokio paties poveikio [42] neparodė nei netirpus mielių beta – gliukanas. Netirpus beta – gliukanas sustabdė naviko augimą [74,61].
Kitame tyrime, Maitake MD frakcija pelėms buvo duodama per os. Rezultatai parodė, kad skiriama peroraliai Maitake MD frakcija, slopina auglio augimą, skatindama sisteminio naviko antigeno, T ląstelių atsaką per dektino-1 receptorių, išlaikomo aktyvių dendritinių ląstelių. Tai didina aktyvių T ląstelių infiltraciją į naviką ir sumažina su naviku susijusios imunosupresinius elementus. Šie ikiklinikiniai tyrimai parodė, kad Maitake MD frakcija gali būti vartojama pacientams, sergantiems vėžiu. [63,66]
2.TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Buvo naudojamos linijinės C57BL/6 moteriškos lyties pelės (išaugintos Imunologijos institute, Vilniuje, Lietuva) 8-10 savaičių amžiaus, 19-22 g svorio. Laboratoriniai gyvūnai viso eksperimento metu buvo laikomi specialiuose narvuose, suskirstyti į grupes, esant pastoviai patalpos temperatūrai (21.0±2.5°C) ir pastoviai santykinei oro drėgmei (50–55 proc.). Gyvūnų adaptacijos periodas narvuose prieš eksperimentą truko dvi paras.
Pelėms į dešinę kirkšnį buvo suleista 0,2 ml plaučių Luiso karcinomos masės. Navikas augo septynias dienas. Po to pelės buvo pradėtos gydyti. Taikyta dviejų tipų radioterapija – vienkartinis švitinimas 10 Gy doze ir frakcionuotas švitinimas 2 Gy doze penkis kartus (suminė dozė 10 Gy). Su skirtingo tipo radioterapija atliktas atskiras eksperimentas. Kiekvieno eksperimento metu pelės buvo skirstomos į 4 grupes (10 pelių grupėje).
2.2. Eksperimento eiga
Eksperimentas su vienkartine radioterapijos doze: I grupė – kontrolinė grupė. Pelėms netaikytas gydymas.
II grupė – radioterapijos grupė. Radioterapija buvo atliekama 10-ą dieną po naviko įskiepijimo. Suminė radioterapijos dozė – 10 Gy. (2 pav.)
III – grupė – beta – gliukano grupė. Gydymas beta – gliukanu taikytas 8 dienas per os, 400 μg/ pelei per dieną. Pirmas tris dienas beta – gliukanas buvo duodamas tam, kad pelės jį geriau pasisavintų. (2 pav. a dalis)
IV grupė – beta – gliukano ir radioterapijos grupė. Taikytas kombinuotas gydymas radioterapija ir beta – gliukanu. (2 pav. b dalis)
Naviko tūris buvo matuojamas 3 kartus per savaitę. Navikas buvo paimtas 10-ą ir 14-ą dieną nuo naviko įskiepijimo. (3 pav.)
2 pav. Eksperimento modelis gydant vienkartine radioterapija
Navikas negydomas augo septynias dienas, βG buvo duodamas aštuonias dienas iš eilės po 400 µg pelei per dieną. RT taikyta 10-ą dieną po naviko įskiepijimo. βG+RT taikyta penkias dienas iš
eilės.(βG – beta – gliukanas, RT – radioterapija)
3 pav. Eksperimento modelis gydant vienkartine radioterapija
Navikas buvo matuojamas 3 kartus per savaitę. Navikas paimtas 10 ir 14 dieną nuo įskiepijimo.
Eksperimentas gydant frakcionuota radioterapija: I grupė – kontrolinė grupė. Pelėms netaikytas gydymas.
II grupė – radioterapijos grupė. Frakcionuota radioterapija buvo pradėta 10-ą dieną po naviko įskiepijimo ir taikyta 5 dienas. Suminė radioterapijos dozė – 10 Gy (2 Gy x 5). (4 pav.)
III grupė – beta – gliukano grupė. Gydymas Beta – gliukanu taikytas 8 dienas per os, 400 μg/ pelei per dieną. Pirmas tris dienas beta – gliukanas buvo duodamas tam, kad pelės jį geriau pasisavintų. (4 pav. a dalis)
IV grupė – beta – gliukano ir radioterapijos grupė. Taikytas kombinuotas gydymas radioterapija ir beta-gliukanu. (4 pav. b dalis)
4 pav. Eksperimento modelis su frakcionuota radioterapija
Navikas negydomas augo septynias dienas, βG buvo duodamas aštuonias dienas iš eilės po 400 µg pelei per dieną. RT taikyta 5 dienas iš eilės (2 Gy x 5). Suminė dozė 10 Gy. βG+RT taikyta penkias dienas iš eilės. (βG – beta –
gliukanas, RT – radioterapija)
5 pav. Eksperimento modelis gydant frakcionuota radioterapija
Navikas buvo matuojamas 3 kartus per savaitę. Navikas paimtas 10 ir 14 dieną nuo įskiepijimo.
Naviko tūris (V) buvo nustatomas slankmačiu, matuojant naviko ilgį (L), ploti (W) ir aukštį (H). Jis buvo apskaičiuojamas pagal formulę: L x W x H x π/6. Naviko tūris buvo matuojamas tris kartus per savaitę. Eksperimentai su gyvūnais buvo atliekami pagal Lietuvos gyvūnų globos komisijos rekomendacijas. Gautas Lietuvos veterinarinės tarnybos leidimas atlikti eksperimentus (leidimo Nr. 0190).
1 lentelė. Ekperimentinės grupės.
Eksperimentinės grupės I eksperimentas II eksperimentas
I grupė. Kontrolės n=10 n=10 II grupė. RT n=10 Vienkartinė RT taikyta 10-ą dieną nuo LLC įskiepijimo (10 Gy). n=10 Frakcionuota RT pradėta 10-ą dieną nuo LLC įskiepijimo. Taikyta 2 Gy/d 5 dienas III grupė. βG n=10 400 μg βG pelei per dieną, 8 dienas. n=10 400 μg βG pelei per dieną, 8 dienas. IV grupė. RT+βG n=10 Kombinuotas gydymas (RT+βG) n=10 Kombinuotas gydymas (RT+βG)
2.3. Beta – gliukanai
Naudotas beta – gliukanas buvo iš kepimo miltelių (Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija). Tai (1,3),(1,6) – beta – gliukanas, su dideliu kiekiu beta-(1,6) atšakų. Beta – gliukanas buvo ištirpintas NaCl 0,9 proc. tirpale, skiriama po 400 μg/d vienai pelei per os zonduojant stemplę. Beta – gliukanas buvo duodamas kiekvieną dieną, 8 dienas iš eilės.
2.4.Radioterapija
Vienkartinė spinduliuotės dozė buvo 10 Gy, frakcionuotos radioterapijos dozė buvo po 2 Gy penkis kartus. Suminė dozė 10 Gy.
Narkozei prieš radiacinę spinduliuotę buvo naudojamas ketamino tirpalas (50 mg/10ml). 1 mililitras ketamino buvo sumaišomas su 4 mililitrais fiziologinio tirpalo ir leidžiama į pelių raumenis po 0,3 ml.
2.5.Realaus laiko polimerazės grandininė reakcija
RT-PGR reakcijos buvo atliekamos, naudojant fluorochromą SybrGreen I ir termociklerį „Mastercycler epgradient S“ (Eppendorf, Vokietija). 25 µl reakcijos mišinio kiekvienai reakcijai paruošti buvo naudota 2 µl cDNR, po 1,25 µl tiesioginio ir atvirkštinio pradmens (10µM) (Biolegio, Olandija), 12,5 µl 2x KAPA PROBE FAST (KapaBioSystems, JAV), ir 8 µl DEPC vandens. Reakcijos buvo vykdomos 96 šulinėlių plokštelėse. Amplifikacija buvo registruojama pagal fluorescencinio dažo – SybrGreen fluorescenciją.
Santykinis genų raiškos pokytis palyginus su kontrole buvo apskaičiuotas šiuo metodu: genų raiškos pokytis: 2Ct, kur
t
C
= (Ct tiriamojo geno - Ct naminio geno) po poveikio - (Ct tiriamojo geno - Ct naminio geno) kontrolė (Applied Biosystems Inc.).
2.6. Statistinė duomenų analizė
Aprašomoji ir lyginamoji statistinė duomenų analizė atlikta statistiniu paketu SPSS Statistics 17 (SPSS Inc., Čikaga, JAV). Apskaičiuotas vidurkis ir standartinis nuokrypis (SD). Taikyta vienfaktorinė ANOVA, naudotas Tukey Post Hoc kriterijus. Gyvūnų išgyvenamumui įvertinti naudotas Kaplan – Meier metodas. Rezultatai laikyti statistiškai patikimais kai patikimumo koeficientas p < 0,05.
Grafiniam gautų rezultatų išreiškimui naudota MS Excel (Microsoft, JAV) programa.
3.TYRIMŲ REZULTATAI
3.1.1. Eksperimentas gydant vienkartine radioterapija
Eksperimente, su vienkartine radiacinės spinduliuotės doze, nustatyta, kad navikų tūriai negydytoje pelių grupėje (kontrolės grupėje), buvo didesni lyginant su gydytomis grupėmis.
Vienkartinės radiacinės spinduliuotės grupės tūrių vidurkiai buvo statistiškai reikšmingai (p < 0,05) mažesni lyginant su kontrolės grupe. Radiacinės spinduliuotės grupės tūrių vidurkiai neturėjo statistiškai reikšmingo (p > 0,05) skirtumo lyginant su kombinuoto gydymo grupe (6 pav.).
Gydymas tik beta – gliukanu reikšmingai (p < 0,05) sumažino tūrius, palyginus su negydytų pelių tūriais ir radiacinės spinduliuotės pelių grupės tūriais. Gydant beta – gliukanu navikų tūriai buvo mažiausi, lyginant su negydytomis pelėmis, radioterapijos grupe ir kombinuoto gydymo (beta – gliukanas kartu su radiacine spinduliuote) grupe.
Kombinuoto gydymo tūrių vidurkis statistiškai reikšmingai (p < 0,05) skyrėsi tik nuo kontrolės grupės. Gydant beta – gliukanu kartu su radiacine spinduliuote, tūrių vidurkiai buvo mažesni palyginus su negydytomis pelėmis ir vienkartinės radiacinės spinduliuotės doze (6 pav.).
6 pav. LLC naviko augimo pokyčiai taikant gydymą vienkartine radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu. βG buvo duodamas aštuonias dienas iš eilės po 400 µg palei/d. RT taikyta 10-ą dieną
nuo naviko įskiepijimo (suminė dozė 10 Gy). βG+RT taikyta aštuonias dienas iš eilės. * p < 0,05 lyginant su kontrolės grupe. ^ p < 0,05 lyginant su kombinuoto gydymo grupe.
3 lentelė. Eksperimentinių grupių vidurkiai ir jų SD
3.1.2. Eksperimentas gydant frakcionuota radioterapija
Radiacine spinduliuote gydytoje grupėje navikų tūris buvo reikšmingai (p < 0,05) mažesnis lyginant su kontrolės grupe. Nebuvo pastebėtas statistiškai reikšmingas (p > 0,05) skirtumas tarp pelių gydytų beta – gliukanu ir vien tik radiacine spinduliuote. Gydant tik frakcionuota radiacine spinduliuote navikų tūriai buvo didesni nei visų kitų grupių (kontrolės, beta – gliukano ir beta – gliukano kartu su radiacine spinduliuote) (7 pav.).
Beta – gliukanas reikšmingai (p < 0,05) slopino naviko augimą, palyginus su pelėmis, kurioms nebuvo taikytas joks gydymas. Taip pat pelių navikai, gydyti tik beta – gliukanu buvo statistiškai reikšmingai (p < 0,05) mažesni palyginus su grupe, kurioje buvo taikytas kombinuotas (beta – gliukano ir radiacinės spinduliuotės) gydymas.
Pelių navikai gydyti beta – gliukanu kartu su radioterapija buvo reikšmingai (p < 0,05) mažesni lyginant su kontrolės ir radiacinės spinduliuotės grupėmis.
Dienos nuo naviko įleidimo
10 12 14 17 19 21 G rupė Kontrolė 0,121±0,069 0,431±0,329 0,579±0,263 1,448±0,761 2,104±0,038 3,448±0,631 Radioterapija 0,194±0,089 0,393±0,118 0,542±0,138 1,234±0,338 1,684±0,823 2,713±0,987 Beta-gliukanas 0,101±0.003 0,282±0.050 0,378±0.022 0,666±0.045 1,118±0.217 1,968±0.372 Radioterapija+ beta-gliukanas 0,173±0,088 0,513±0,178 0,586±0,280 0,750±0,242 1,626±1,007 1,988±0,829
7 pav. LLC naviko augimo pokyčiai taikant gydymą frakcionuota radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu. βG buvo duodamas aštuonias dienas iš eilės po 400 µg pelei per dieną. RT taikyta 5
dienas iš eilės (2 Gy x 5). Suminė dozė 10 Gy. βG+RT taikyta aštuonias dienas iš eilės. * p < 0,05 lyginant su kontrolės grupe. ^ p < 0,05 lyginant su kombinuoto gydymo grupe.
# p < 0,05 lyginant su radioterapija. • p < 0,05 lyginant su beta – gliukano grupe.
2 lentelė. Eksperimentinių grupių vidurkiai ir jų SD
3.1.3. Eksperimentų gydant frakcionuota ir vienkartine radioterapija grupių
palyginimas
Palyginome dviejų eksperimentų frakcionuotos radioterapijos, vienkartinės radioterapios ir kontrolės grupes. Statistiškai reikšmingo (p > 0,05) skirtumo tarp grupių nebuvo. Gydymas su
Dienos nuo naviko įleidimo
10 13 15 17 20 22 Grup ė Kontrolė 0,121±0,069 0,431±0,329 0,579±0,263 1,448±0,761 2,104±0,038 3,448±0,631 Radioterapija 0.123±0,048 0.206±0,046 0.429±0,085 0.806±0,125 1.752±0,300 3.059±0,322 Beta – gliukanas 0,101±0.003 0,282±0.050 0,378±0.022 0,666±0.045 1,118±0.217 1,968±0.372 Radioterapija+ beta-gliukanas 0.153±0,018 0.259±0,039 0.460±0,083 0.643±0,062 1.627±0,328 2.877±0,492
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 10 13 15 17 20 22 N av iko t ū ri s (c m 3)
Dienos nuo naviko įleidimo
Kontrolė Frakcionuota RT Vienkartinė RT
frakcionuota radioterapija sumažino navikų tūrius, lyginant su vienkartine radioterapija ar kontrolės grupe (8 pav.)
8 pav. LLC naviko augimo pokyčiai taikant gydymą frakcionuota ir vienkartine radioterapija. Vienkartinė RT dozė buvo duota 10-ą dieną nuo naviko įskiepijimo, frakcionuota radioterapija buvo atliekama penkias dienas iš eilės pradedant nuo 10-os dienos nuo naviko įskiepijimo Buvo švitinama
2Gy x 5. Suminė doze 10 Gy. (RT – radioterapija)
4 lentelė. Eksperimentinių grupių vidurkiai ir jų SD
Taip pat palyginome dviejų eksperimentų beta – gliukano ir kombinuoto gydymo grupes tarpusavyje. Šios grupės statistiškai reikšmingo (p > 0,05) skirtumo tarpusavyje neturėjo, tačiau iš navikų tūrių augimo dinamikos pastebėta, kad efektyviausias gydymas buvo vien tik beta – gliukanu. Mažiausiai efektyvus buvo kombinuotas gydymas, vienkartinės radioterapijos eksperimento metu (9 pav.).
Dienos nuo naviko įleidimo
10 13 15 17 20 22 Grup ė K 0,121±0,069 0,431±0,329 0,579±0,263 1,448±0,761 2,104±0,038 3,448±0,631 Vienkartinė RT 0,194±0,089 0,393±0,118 0,542±0,138 1,234±0,338 1,684±0,823 2,713±0,987 Frakcionuota RT 0.123±0,048 0.206±0,046 0.429±0,085 0.806±0,125 1.752±0,300 3.059±0,322
9 pav . LLC naviko augimo pokyčiai taikant kombinuotą (βG+RT) gydymą ir gydymą beta – gliukanu. βG buvo duodamas aštuonias dienas iš eilės po 400 µg pelei per dieną. βG+RT taikyta penkias dienas iš eilės. RT – radioterapija, βG – beta – gliukanas. RT + βG – kombinuotas gydymas
radioterapija ir beta – gliukanu
5 lentelė. Eksperimentinių grupių vidurkiai ir jų SD
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 10 13 15 17 20 22 N av iko t u ri s (c m 3)
Dienos nuo naviko įleidimo
Beta - gliukanas
RT vienkartinė+ βG
RT frakcionuota+ βG
Dienos nuo naviko įleidimo
10 13 15 17 20 22 Grup ė βG 0,101±0.003 0,282±0.050 0,378±0.022 0,666±0.045 1,118±0.217 1,968±0.372 RT vienkartinė+ βG 0,173±0,088 0,513±0,178 0,586±0,280 0,750±0,242 1,626±1,007 1,988±0,829 RT frakcionuota+ βG 0.153±0,018 0.259±0,039 0.460±0,083 0.643±0,062 1.627±0,328 2.877±0,492
3.1.4. Pelių, sergančių Luiso plaučių karcinoma, gyvenimo trukmė po
gydymo radiacine spinduliuote, beta – gliukanu ar jų deriniu.
Nebuvo pastebėtas statistinis reikšmingumas (p > 0,05) pelių išgyvenamumui tarp naviko gydymo grupių, atliekant eksperimentą su frakcionuota radiacine spinduliuote.
Ilgiausiai pelės išgyveno tik beta – gliukanu gydytoje grupėje (10 pav.). Vidutinis jų išgyvenamumas buvo 24,08 ±2,24 (95% CI 19,69 – 28,48) dienos. Trumpiausiai gyveno negydytos pelės (kontrolės grupėje). Jų vidutinis išgyvenamumas buvo 22,50±2,30 (95% CI 18,09 – 26,997) dienas. Pelės, gydytos vien tik radioterapija vidutiniškai gyveno 23,69±2,00 (95% CI 19,930 – 27,454) dienas, o pelės, gydytos beta – gliukanu kartu su radiacine spinduliuote vidutiniškai išgyveno 22,77 ±1,89 (95% CI 19,068 – 26,471) dienas.
10 pav. Pelių, sergančių LLC išgyvenamumas negydant, po gydymo frakcionuota radioterapija, beta – gliukanu ar jų deriniu. K – kontrolės grupė, RT – radioterapija, βG – beta – gliukanas. RT + βG –
kombinuotas gydymas radioterapija ir beta – gliukanu.
Eksperimente su vienkartine radiacinės spinduliuotės doze statistinio reikšmingumo (p > 0,05) tarp grupių išgyvenamumo nebuvo. Ilgiausiai išgyveno pelės, kurios buvo gydytos tik beta – gliukanu (11 pav). Jų vidutinis išyvenamumas buvo 18,11±1,630 (95% CI 14,920 – 21,303) dienų. Trumpiausiai išgyveno negydytos pelės (kontrolės grupėje). Jų vidutinis išgyvenamumas buvo 17,50±2,72 (95% CI 12,162 – 22,838) dienų. Pelės, gydytos radiacine spinduliuote vidutiniškai išgyveno 17,60±1,24 (95% CI
15,069 – 19,931) dienų. Pelės, gydytos beta – gliukanu kartu su radiacine spinduliuote vidutiniškai išgyveno 17,72 ± 1,34 (95% CI 15,044 – 20,411) dienų.
11 pav. Pelių, kurioms įskiepyta LLC išgyvenamumas negydant, po gydymo vienkartine radioterapija, beta – gliukanu ar jų deriniu. K – kontrolės grupė, RT – radioterapija, βG – beta – gliukanas. RT + βG – kombinuotas gydymas radioterapija ir beta – gliukanu.
3.2.1. Genų raiškos pokyčiai 2D, 3D ląstelių kultūrose ar navikuose po
vienkartinės ar frakcionuotos dozės radiacinės spinduliuotės poveikio
Dižiausi genų raiškos pokyčiai eksperimentuose su vienkartine ir frakcionuota radioterapija buvo 2 D ląstelių kultūrose. Mažiausi genų raiškos pokyčiai buvo naviko ląstelėse.
Eksperimente su vienkartine radioterapijos doze (6 lentelė) didžiausias genų raiškos pokytis buvo pastebėtas 2 D ląstelių kultūroje THBS 2 gene (14.2±1.4), mažiausias genų raiškos pokytis buvo pastebėtas naviko ląstelėse, kai pelė buvo gydyta tik beta – gliukanu P21 gene (1.2±0.4).
6 lentelė. Genų raiškos pokyčiai gydant peles vienkartine radioterapija ir/ar beta – gliukanu* Eilės Nr. Geno simbolis Raiškos pokytis po vienkartinės RT dozės 2D ląstelių kultūroje Raiškos pokytis po vienkartinės RT dozės 3D ląstelių kultūroje Raiškos pokytis po vienkartinės RT dozės poveikio naviko ląstelėse Raiškos pokytis po vienkartinės RT dozės naviko ląstelėse, kai gyvūnas maitintas beta – gliukanu Raiškos pokytis naviko ląstelėse, kai gyvūnas maitintas tik beta – gliukanu 1. Bbc3 5.4 ±0.6 2.6±0.4 2.5±0.6 1.8±0.5 1.6±0.4 2. P21 8.5±0.5 3.1±1.3 2.7±0.5 2.5±1.2 1.2±0.4 3. Ccng1 4.3±0.4 2.2±1.1 2.3±0.6 2.5±0.7 1.5±0.4 4. ID1 12.5±0.5 6.7±0.6 2.5±0.5 1.9±0.8 1.7±0.8 5. Dcn 9.7±1.3 7.8±1.6 3.4±1.1 3.6±0.9 1.4±0.5 6. THBS2 14.2±1.4 7.6±0.7 2.6±1.2 3.2±0.5 1.8±0.6
Eksperimente su frakcionuota radioterapijos doze (7 lentelė) didžiausias genų raiškos pokytis buvo pastebėtas 2 D ląstelių kultūroje ID1 gene (10.9±1.4), mažiausias genų raiškos pokytis buvo pastebėtas naviko ląstelėse po frakcionuotos radioterapijos dozės P21 gene (1.4±0.5).
7 lentelė. Genų raiškos pokyčiai gydant peles frakcionuota radioterapija ir/ar beta – gliukanu* Eilės Nr. Geno simbolis Raiškos pokytis po
frakcionuotos RT dozės 2D ląstelių kultūroje Raiškos pokytis po frakcionuotos RT dozės 3D ląstelių kultūroje Raiškos pokytis po frakcionuotos RT dozės naviko ląstelėse Raiškos pokytis po frakcionuotos RT dozės
naviko ląstelėse, kai gyvūnas maitintas beta
– gliukanu 1. Bbc3 3.5±0.3 1.8±0.6 1.6±0.4 1.8±0.5 2. P21 6.7±0.2 1.5±0.7 1.4±0.5 1.5±0.7 3. Ccng1 3.6±0.4 1.7±0.5 1.6±0.3 1.7±0.5 4. ID1 10.9±1.4 1.7±1.1 1.8±1.1 2.5±1.3 5. Dcn 10.5±1.7 1.8±0.4 2.3±1.2 2.6±1.4 6. THBS2 9.6±1.2 2.1±0.7 2.3±0.8 2.5±1.1
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Eksperimentuose, kuriuose buvo taikoma frakcionuota arba vienkartinė radioterapija, išsiaiškinta, kad naviko augimo dinamika priklauso nuo gydymo būdo. Mažiausi navikai buvo tik beta – gliukanu gydytoje grupėje (eksperimentuose taikant vienkartinę arba frakcionuotą radioterapiją). Taikant vien tik radioterapiją, gydymo pradžioje navikas buvo mažesnis nei gydant vien tik beta – gliukanu ar kombinuotu gydymu. Tačiau baigus gydymą – navikas pradėjo sparčiai augti ir tapo didesnis už pelių, gydytų beta – gliukanu bei kombinuotu gydymu. Tokius rezultatus galėjo lemti susidaręs uždegimas aplink naviką radioterapijos metu.
Nagrinėtoje literatūroje teigiama, kad grupė, kuriai buvo skirta tik radioterapija – turėjo reikšmingą (p < 0,05) naviko slopinimą, lyginant su kontrolės grupe. Grupėje, kurios gyvūnai buvo šeriami beta – gliukanu, buvo reikšmingai sumažėjęs navikas, lyginant su kontrolės grupe [38]. Įvairių studijų metu išsiaiškinta, kad radioterapija efektyviai gydo vėžį kombinacijoje su antinavikiniais vaistais ar chemoterapija [44,39,47].
Didžiausias pelių išgyvenamumas buvo grupėje, gydytoje tik beta – gliukanu. Eksperimente kuriame buvo taikoma frakcionuota radioterapija pelės, gydytos tik beta – gliukanu išgyveno iki 34 dienų. O eksperimente, kuriame buvo taikoma vienkartinė radioterapijos dozė, pelės, gydytos tik beta – gliukanu išgyveno iki 22 dienų. Jau atliktų tyrimų rezultatai parodė didesnį nei vidutinis išgyvenamumas toje grupėje, kuri gavo beta – gliukaną ir buvo švitinta radioterapija ( pelės išgyveno iki 35 dienų) [25,26,50].
Palyginus frakcionuotą radioterapiją su vienkartine buvo pastebėta, kad gydymo eigoje navikų tūris buvo mažesnis frakcionuotos radioterapijos grupėje.
Palyginus dviejų eksperimentų kombinuotų gydymų grupes ir gydymą vien tik beta – gliukanu – pastebėta, kad gydymo eigoje mažiausiai efektyvus buvo kombinuotas gydymas eksperimente, kuriame buvo taikoma vienkartinė radioterapija. Efektyviausias gydymas buvo vien tik beta – gliukanu. Beta – gliukanas slopino naviką gydymo metu, o po gydymo navikai buvo mažesni palyginus su kombinuotu gydymu vienkartinės ir frakcionuotos radioterapijos eksperimentuose.
Didžiausias genų raiškos pokytis buvo pastebėtas 2D ląstelių kultūroje (eksperimentuose, taikant frakcionuotą ir vienkartinę radioterapiją). Mažiausias genų raiškos pokytis buvo pastebėtas naviko ląstelėse (eksperimentuose, taikant frakcionuotą ir vienkartinę radioterapiją). Pastebėjus tokius kitimus, galime daryti prielaidą, kad ląstelių struktūra, esanti artimesnė naviko struktūrai – turi mažesnius genų raiškos pokyčius.
5. IŠVADOS
1. Naviko augimas labiausiai buvo slopinamas gydant beta – gliukanu. Kombinuotas gydymas naviko augimą slopino labiau nei tik radiacinė spinduliuotė, tačiau statistinis reikšmingumas buvo pastebėtas gydant frakcionuota radiacine spinduliuote.
2. Statistiškai reikšmingo išgyvenamumo skirtumo tarp pelių, gydytų radiacine spinduliuote ir/ar beta – gliukanu nebuvo. Geriausias išgyvenamumas pastebėtas pelių grupėse, gydytose tik beta – gliukanu.
6. LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Auinger A, Riede L, Bothe G, Busch R, Gruenwald J. Yeast (1,3)-(1,6)-beta-glucan helps to maintain the body’s defence against pathogens: a double-blind, randomized, placebo- controlled, multicentric study in healthy subjects.
2. Abastado J P. The next challenge in cancer immunotherapy: controlling T-cell traffic to the tumor. Cancer Res. 2012; 72: 2159-61.
3. Aimanianda V , Clavaud C, Simenel C, Fontaine T et al. Cell wall beta-(1,6)-glucan of Saccharomyces cerevisiae. Structural characterization and in situ synthesis. J. Biol. Chem. 2009, 284, 13401–13412.
4. Akramienė D, Kondrotas A, Didžiapetrienė J, Kėvelaitis E. Effects of β-glucans on the immune system. Medicina (Kaunas). 2007; 43 (8).
5. Allendorf DJ, Yan J, Ross GD, Hansen RD, Baran JT, Subbarao K, Wang L, Haribabu B. C5a-Mediated LeukotrieneB -Amplified Neutrophil Chemotaxis Is Essential in Tumor Immunotherapy Facilitated by Anti-Tumor Monoclonal Antibody and �-Glucan. The Journal of Immunology, 2005,174:7050–7056.
6. American Cancer Society. [Žiūrėta 2015-04-27] Prieiga per internetą: http://www.medicalnewstoday.com/info/cancer-oncology/
7. American Cancer society. Understanding Radiation Therapy: A Guide for Patients and
Families. [Žiūrėta 2015-04-15]
http://www.cancer.org/acs/groups/cid/documents/webcontent/003028-pdf.pdf 8. American Society for Radiation Oncology. [Žiūrėta 2015-03-15] ]Prieiga per internetą:
http://www.rtanswers.org/treatmentinformation/treatmenttypes/howradiationtherapyworks.a spx
9. American Society of Clinical Oncology (ASCO) informacija. Prieiga per internetą: http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/cancer-basics/genetics/genetics-cancer
10. American Society of Clinical Oncology (ASCO) informacija. Prieiga per internetą: http://www.cancer.net/research-and advocacy/introduction-cancer-research/explaining-cancer-genome-research
Rousell A, Spilopoulos G, Stewart G, Tierney JF, Wang M, Rhugang Z. Preoperative radiotherapy for esophageal carcinoma. Cochrane Database Syst Rev 2005; (4): CD001799 [PMID: 16235286]
12. Arnott SJ, Duncan W, Kerr GR, Walbaum PR, Cameron E, Jack WJ, Mackillop WJ. Low dose preoperative radiotherapy for carcinoma of the oesophagus: results of a randomized clinical trial. Radiother Oncol 1992; 24: 108-113 [PMID: 1496141 DOI: 10.1016/0167-8140(92)90287-5].
13. Ausubel FM. Are innate immune signaling pathways in plants and animals conserved? Nat Immunol 2005, 6:973–979.
14. Baran J, Allendorf DJ, Hong F, Ross GD. Oral betaglucan adjuvant therapy converts nonprotective Th2 response to protective Th1 cell-mediated immune response in mammary tumor-bearing mice. Folia. Histochem. Cytobiol. 2007, 45, 107–114.
15. Bartkova J, Horejsi Z, Koed K, et al. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 2005; 434: 864–70.
16. Bartkova J, Rezaei N, Liontos M, et al. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature 2006; 444: 633–37 17. Ben-Josef E, Shamsa F, Williams AO, Porter AT. Radiotherapeutic management of
osseous metastases: a survey of current patterns of care. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics 1998;40(4):915–21.
18. Berzofsky J A, Terabe M, Wood L V. Strategies to use immune modulators in therapeutic vaccines against cancer. Semin. Oncol. 2012; 39: 348-57.
19. Brose MS, Rebbeck TR, Calzone KA, et al. Cancer risk estimates for BRCA1 mutation carriers identified in a risk evaluation program. Journal of the National Cancer Institute 2002; 94(18):1365–1372.
20. Brown GD, Herre J, Williams DL, Willment JA, Marshall AS, Gordon S. Dectin-1 mediates the biological effects of beta-glucans. J Exp Med 2003, 197:1119–1124.
21. Burmeister BH. Role of radiotherapy in the pre-operative management of carcinoma of the esophagus
22. Chan GC, Chan WK, Sze DM. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. J Hematol Oncol 2009, 2:25.
23. Chen 1, Seviour R. Medicinal importance of fungal beta-( 1-->3), (1-->6)-glucans. Mycol. Res. 2007; Ill:635-52.
24. Chen J. Multiple signal pathways in obesity-associated cancer. Obes. Rev., 2011; 12: 1063-70.
25. Chen SN, Chang CS, Hung MH, Chen S, Wang W, Tai CH, Lu1 CL. The Effect of Mushroom Beta-Glucans from Solid Culture of Ganoderma lucidum on Inhibition of the Primary Tumor Metastasis.
26. Cheung NK, Modak S, Vickers A, Knuckles B. 2002. Orally administered
ß-glucans enhance anti-tumor effects of monoclonal antibodies.
CancerImmunol.Immunother.51: 557–564.
27. Cheung, NK, Modak S. 2002. Oral (133),(134)-�-D-glucan synergizes with antiganglioside GD2 monoclonal antibody 3F8 in the therapy of neuroblastoma. Clin.CancerRes.8: 1217–1223.
28. Christian D A, Hunter C A. Particle-mediated delivery of cytokines for immunotherapy. Immunotherapy. 2012; 4: 425-41.
29. Cruz L J, Tacken PJ, Rueda F, Domingo J C, Albericio F, Figdor C G. Targeting nanoparticles to dendritic cells for immunotherapy. Methods Enzymol. 2012; 509: 143-63.
30. Curiel T J. Immunotherapy: A useful strategy to help combat multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 2012; 15: I 06-13.
31. Delaney G M.B.B.S M.D, Jacob S M.B.B.S M.D M.H.A, Featherstone C M.B.Ch.B, Barton M M.B.B.S. The Role of Radiotherapy in Cancer Treatment Estimating Optimal Utilization from a Review of Evidence-Based Clinical Guidelines.
32. Didierlaurent A, Simonet M, Sirard JC. Innate and acquired plasticity of the intestinal immune system. Cell Mol Life Sci 2005, 62:1285–1287.
33. Ferrone CR, Levine DA, Tang LH, et al. BRCA germline mutations in Jewish patients with pancreatic adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology 2009; 27(3):433– 438.
34. Finch A, Beiner M, Lubinski J, et al. Salpingo-oophorectomy and the risk of ovarian, fallopian tube, and peritoneal cancers in women with a BRCA1 or BRCA2 mutation. JAMA 2006; 296(2):185–192.
35. Fleischer LG, Gerber G, Liezenga RW, Lippert E, Scholl MA, Westphal G. Blood cells and plasma proteins of chickens fed a diet supplemented with (1-->3),(1-->6)-beta-D-glucan and enrofloxacin. Arch Tierernahr. 53(1):59-73, 2000
