MATERIALI E METODI
1. Prodotti utilizzati
Le sostanze utilizzate sono tutte di provenienza commerciale.
2. Modello sperimentale
2.1 Animali
Per il nostro studio sono stati impiegati 6 suini maschi castrati (ibridi commerciali Large White), del peso di 20-30 kg e di circa 2 mesi di età, provenienti da tre lotti distinti ottenuti dalla ditta Azienda Agricola Zavatta (Poggio Berni, Rimini).
I suini sono stati stabulati presso il Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Patologia Animale dell’Università di Bologna, a temperatura di 22 ± 3°C, sincronizzati con un ciclo luce-buio di 12 ore ed alimentati con circa 1,5 kg/die/animale di mangime, fornendo acqua ad libitum.
2.2 Trattamento
Dopo un periodo di ambientamento di 10 giorni, gli animali sono stati suddividisi in 2 gruppi. Un gruppo di 3 animali è stato utilizzato come controllo mentre l’altro di altri 3 animali è stato trattato intra-peritonealmente (i.p.) per 4 giorni consecutivi con 40 mg/kg di Rifampicina (RIF), in una soluzione 40 mM di NaOH.
Gli animali sono stati sacrificati per dissanguamento, 24 ore dopo l’ultima somministrazione.
Subito dopo il sacrificio, da ogni animale è stato rapidamente prelevato il cervello dal quale sono state accuratamente rimosse le meningi (utilizzate poi per gli esperimenti successivi) ed eliminati i grandi vasi cerebrali sottostanti. Il cervello, posto su una piastra Petri raffreddata con ghiaccio, è stato dissezionato per il prelievo, in condizioni di sterilità, delle aree cerebrali di interesse (corteccia, cervelletto, mesencefalo, ippocampo). Da ogni animale è stato prelevato il fegato, utilizzato come controllo positivo
per verificare l’efficacia del trattamento. I tessuti così ottenuti sono stati posti immediatamente in azoto liquido e conservati a -80°C fino al loro utilizzo per la preparazione delle frazioni cellulari o per l’estrazione dell’RNA. Una porzione di circa 10 g di corteccia frontale (appena prelevata e non congelata) è stata utilizzata per la preparazione dei capillari cerebrali.
3. Isolamento dei capillari dalla corteccia cerebrale di suino
I capillari sono stati isolati dalla corteccia frontale di suino come descritto da Mršulja e collaboratori (1976). La procedura prevede le seguenti fasi, eseguite a 4°C ed in condizioni di sterilità:
- Omogenizzazione a bassa velocità della porzione di corteccia appena prelevata (circa 10 g) in 20 volumi di soluzione di Ringer fredda a pH 7,4 contenente 1% di albumina bovina sierica (Ringer-SBA) e Hepes 10 mM
- Centrifugazione dell’omogenato a 1.500 g per 15 min
- Risospensione del pellet in 1-2 ml di soluzione di Ringer-SBA 1% - Centrifugazione a 1.500 g per 10 min
- Risospensione del pellet in 10 ml di saccarosio freddo 0,25 M, pH 7,0
- Stratificazione del pellet così risospeso sopra un gradiente di saccarosio 1,0 e 1,5 M (12 ml ciascuno) preparato almeno 90 min prima dell’inizio dell’esperimento
- Centrifugazione a 58.000 g per 30 min
- Risospensione del pellet così ottenuto, contenente la frazione isolata di capillari, in 1-2 ml di Ringer-SBA 1%.
I capillari ottenuti (circa 100 mg) sono stati immediatamente aliquotati in eppendorf da 1,5 ml, congelati in azoto liquido e conservati a –80°C fino al momento dell’uso.
Come conferma della validità del metodo, abbiamo osservato il preparato al microscopio ottico.
4. Preparazione delle frazioni subcellulari
4.1 Preparazione delle frazioni microsomiale e citosolica dal fegato di suino
Il tessuto epatico, conservato a -80°C, è stato lavato con KCl 1,15% (p/v) e pesato. Successivamente è stato omogenizzato, utilizzando un potter Elvehjiem, in 4 volumi di tampone di omogenizzazione (KP 100 mM pH 7,4 + KCl 1,15% (p/v) + EDTA 1 mM). L’omogenato ottenuto è stato centrifugato per 1 min a 1.000 g e per 25 min a 10.000 g in una centrifuga refrigerata, in modo da precipitare i nuclei e i mitocondri.
Il sovranatante, contenente la frazione microsomiale e il citosol, è stato prelevato ed ulteriormente centrifugato per 70 min a 100.000 g, utilizzando un’ultracentrifuga Beckman Spinco L2-65B con rotore 60Ti. Il sovranatante così ottenuto, contenente il citosol, è stato prelevato e conservato a -80°C in aliquote da 0,5 ml per lo studio dell’attività della GST e degli enzimi ad azione antiossidante.
Il pellet, contenente i microsomi, è stato di nuovo omogenizzato con tampone di omogenizzazione e centrifugato, nelle stesse condizioni della centrifugata precedente, in modo da eliminare le proteine contaminanti non microsomiali.
Il precipitato, derivante da questo passaggio, è stato risospeso in un volume di tampone di risospensione (KP 100 mM pH 7,4+ EDTA 0,1 mM) doppio rispetto al peso iniziale del tessuto epatico utilizzato. La sospensione così ottenuta è stata suddivisa in aliquote da 0.5-1 ml rapidamente congelate in azoto liquido e conservate a –80°C fino al loro utilizzo. Tutte le operazioni sono state condotte a 4°C.
4.2 Preparazione delle frazioni microsomiali e mitocondriali dai comparti cerebrali di suino
Questa preparazione è stata eseguita, come descritto da Sims (1990), utilizzando un gradiente di percoll (un composto colloidale di silice coperto
da polivinilpirrolidone) che permette di separare la frazione mitocondriale da quella microsomiale.
Tutte le operazioni sono state condotte a 4°C.
Le varie aliquote di tessuto cerebrale, conservate a -80°C, sono state lavate con tampone di omogenizzazione (Tris-HCl 0,1 M pH 7,4, DTT 0,1 mM, EDTA 0,2 mM, KCl 1,15%, glicerolo 20% e PMSF 0,1 mM) e pesate. Il tessuto è stato omogenizzato, utilizzando un potter Elvehjiem, in tampone di omogenizzazione con un rapporto 1:9 p/v. L’omogenato così ottenuto è stato centrifugato a 1.330 g per 5 min in una centrifuga refrigerata. Il sovranatante, contenente microsomi e mitocondri, è stato recuperato e posto in ghiaccio; il pellet è stato di nuovo lavato, omogeneizzato nel tampone di omogenizzazione in un rapporto, rispetto al tessuto originario, di 1:4 v/v e centrifugato come nel passaggio precedente.
Il sovranatante così ottenuto, unito a quello recuperato dalla prima centrifugazione, è stato centrifugato a 21.200 g per 10 min in una centrifuga refrigerata in modo da far precipitare i mitocondri.
Il sovranatante, contenente la frazione microsomiale e citosolica, è stato recuperato per la preparazione dei microsomi e del citosol, eseguita come descritto per il fegato nel paragrafo precedente, utilizzando per la risospensione finale tampone di risospensione (identico al tampone di omogenizzazione ma privo di PMSF e con glicerolo al 10%) in rapporto 1:1 p/v.
Purificazione dei mitocondri:
Il pellet contenente i mitocondri è stato risospeso con un rapporto 1:10 p/v in una soluzione al 15% di percoll in tampone di omogenizzazione.
6-7 ml della risospensione così ottenuta sono stati caricati su un gradiente di percoll, composto da 7 ml di percoll al 40% in tampone di omogenizzazione sul quale sono stati precedentemente stratificati 7 ml di percoll al 23% in tampone di omogenizzazione.
Il gradiente ottenuto è stato centrifugato a 30.700 g per 15 min con accelerazione e decelerazione lenta. Al termine della centrifugazione sul gradiente erano visibili tre bande; di queste è stata recuperata la banda localizzata sul fondo della provetta, contenente la frazione mitocondriale.
Il volume recuperato dal passaggio precedente, contenente i mitocondri, è stato misurato, diluito 1:4 p/v con tampone di omogenizzazione e centrifugato a 16.700 g per 10 min. Il pellet così ottenuto è stato risospeso in tampone di omogenizzazione privo di PMSF, in una proporzione di 3 ml per grammo di tessuto iniziale, con l’aggiunta di 5 mg di albumina per grammo di tessuto iniziale; la sospensione ottenuta è stata centrifugata a 6.900 g per 10 min.
Il precipitato risultante, contenente i mitocondri, è stato risospeso in un volume minimo (circa 2 ml) di tampone di risospensione. Sono state preparate aliquote da 0,3-0,4 ml, congelate immediatamente in azoto liquido e conservate a -80°C fino al momento dell’uso.
Dai capillari di corteccia frontale, a causa della esiguità di materiale recuperato, non sono stati preparati i mitocondri ma solo i microsomi secondo il protocollo appena descritto.
4.3 Determinazione del contenuto proteico
Le proteine microsomiali, mitocondriali e citosoliche sono state determinate come descritto da Lowry (Lowry et al., 1951), utilizzando come standard interno l’albumina sierica di bovino.
4.4 Determinazione del contenuto di citocromo P450
Il contenuto di citocromo P450 presente nei microsomi epatici è stato determinato secondo il metodo di Omura e Sato (1964), che consiste nella misura spettrofotometrica della variazione di assorbenza del citocromo ridotto e complessato col monossido di carbonio tra 400 e 500 nm (il coefficiente di estinzione molare (ε) del complesso “citocromo P450 ridotto-CO” è pari a 0.091 μM-1 cm-1). Nel caso dei microsomi preparati dalla corteccia di suino il contenuto di citocromo P450 è stato determinato previa solubilizzazione delle membrane microsomiali con sodio colato allo 0,6% per 30 min a 4°C. Il prodotto della solubilizzazione è stato centrifugato a 100.000 g in modo da eliminare i microsomi non solubilizzati. Il sovranatante così ottenuto è stato concentrato per ultrafiltrazione circa 15
volte (in modo da raggiungere un volume finale di 2,5-3 ml) ed utilizzato per determinare il contenuto di citocromo P450. Questa serie di passaggi è stata necessaria per poter effettuare il dosaggio, a causa del contenuto molto basso di citocromo P450 nei microsomi di campioni cerebrali e dell’interferenza nella lettura spettrofotometrica dei lipidi e delle proteine insolubili.
5. Saggi di attività enzimatica
Quando possibile, sono state privilegiate, perché più sensibili, attività con substrati il cui prodotto di reazione è rilevabile fluorimetricamente.
Per i saggi condotti sulle frazioni subcellulari delle aree cerebrali analizzate sono stati utilizzati tempi di incubazione maggiori rispetto a quelli per i campioni epatici. In genere, per le attività eseguite sui microsomi, mitocondri e citosol di suino, sia a livello epatico che extraepatico, è stato necessario aumentare i tempi di incubazione, rispetto a quelli comunemente usati per le frazioni cellulari di roditori, data la più bassa capacità catalitica in questa specie.
5.1 Benzilossichinolina debenzilasi (BQD)
La reazione di debenzilazione del substrato, mediata dal P4503A, produce la 7-idrossichinolina che viene quantificata fluorimetricamente (EX: 410 nm, EM: 538 nm) (Marini et al., 2003). Sono determinabili valori di attività maggiori di 0,2 pmol/mg prot./min.
5.2 Antraldeide ossidasi (AhOx)
Questa attività si basa sulla determinazione fluorimetrica (EX: 255 nm, EM: 458 nm) dell’acido carbossilico, che si forma a seguito dell’ossidazione della 9-antraldeide da parte principalmente del CYP2B. L’acido carbossilico formato può essere quantificato fluorimetricamente solo dopo essere stato separato dal composto parentale attraverso un’estrazione con acetato di etile in ambiente alcalino, seguita da una riestrazione con lo stesso solvente in
ambiente neutro (Watanabe et al., 1991). Con questo metodo sono determinabili valori di attività superiori a 0,1 pmol/mg prot./min.
5.3 Testosterone idrossilasi
Questo saggio consiste nella separazione e nel rilevamento mediante HPLC con colonna Supelco LC-18 (25 cm x 4,6 mm) (Platt et al., 1989) dei metaboliti che si formano a seguito dell’idrossilazione del testosterone. Poichè diverse isoforme di P450 ossidano il testosterone in maniera regio- e stereo-selettiva (Fig. 1), questo saggio viene frequentemente utilizzato per caratterizzare e distinguere contemporaneamente la presenza e/o l’induzione di più isoforme. 17 P450 2B1, 2B2, 2C 16α -OH P450 2B1, 2B2, 2C7, 2C11, 2C13 16β -OH P450 2B1, 2B2 15α -OH P450 2C12, 2C 15β -OH P450 3A1 7α -OH P450 2A1
6β -OH P450 1A1, 1A2, 2C11, 2C13, 3A1 6α -OH P450 2A1
2α -OH P450 2C11 2β -OH P450 1A1, 3A1
18-OH P450 3A1 OH CH3 CH3 O 3 1 10 9 8 7 6 5 4 2 11 12 13 14 15 16 17 18 O
Fig. 1: Molecola del testosterone con i P450 di ratto responsabili dell’idrossilazione regio- e stereo- selettiva
Negli esperimenti di questo lavoro l’identificazione e la misurazione del quantitativo di ciascun metabolica nel campione sono state effettuate prendendo come riferimento quantità note dei metaboliti di sintesi. Il corticosterone è stato utilizzato come standard interno per valutare l’efficienza di estrazione di ogni campione. La sensibilità del saggio permette di calcolare concentrazioni di metaboliti non inferiori a 20 pmol/mg prot.
Nella Figura 2 è rappresentato un cromatogramma tipico ottenuto nel ratto e sopra ogni picco è riportato il tempo di ritenzione ed il metabolita corrispondente.
Fig. 2: Cromatogramma del testosterone
5.4 Glutatione S-transferasi (GST)
Questo saggio enzimatico è stato eseguito secondo il metodo di Habig W.H. et al. (1974), utilizzando come substrato l’1-cloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) che viene coniugato dall’enzima con il GSH. La reazione deve essere seguita spettrofotometricamente a 340 nm poiché a questa lunghezza d’onda si ha la massima variazione di assorbanza dovuta alla coniugazione del substrato con GSH. L’attività è stata calcolata utilizzando un coefficiente di estinzione molare uguale a 9,6 mM-1cm-1 ed è espressa come nmoli di CDNB ridotte per min per milligrammo di proteine cellulari.
5.5 Catalasi (CAT)
Il metodo di Aebi H. (1984) è stato usato per misurare l’attività della catalasi., seguendo spettrofotometricamente a 240 nm la decomposizione di H2O2 ad opera dell’enzima. L’attività è stata calcolata considerando il coefficiente di estinzione molare di 43,6 M-1cm-1 ed è espressa come μmoli di H2O2 consumate per min per milligrammo di proteine cellulari.
5.6 Superossido dismutasi (SOD)
Questo saggio enzimatico è stato determinato con il metodo di Marklund S.L. e Marklund G. (1974), misurando a 420 nm l’inibizione da parte della superossido dismutasi dell’autoossidazione del pirogallolo. Per il calcolo dell’attività totale della SOD, espressa in unità enzimatiche/mg proteine citosoliche, è necessario riferirsi ad una curva standard costruita mediante l’utilizzo di SOD commerciale a varie concentrazioni.
5.7 Glutatione reduttasi (GSSG-Red)
L’attività della glutatione reduttasi è stata misurata a 37°C seguendo a 340 nm il consumo di NADPH, considerando che il NADPH agisce come donatore di equivalenti riducenti in rapporto 1:1 con il glutatione che viene
ridotto (Wheeler et al., 1990). Il calcolo dell’attività è stato eseguito considerando il coefficiente di estinzione molare 6,22 mM-1cm-1 ed è espresso come nmoli di NADPH consumate per minuto per milligrammo di proteine cellulari.
5.8 Glutatione perossidasi (GSH-Perox)
Questa attività è stata dosata a 37°C seguendo il metodo di Flohe e Gunzler (1984) che prevede il monitoraggio a 340 nm del consumo di NADPH in una miscela di reazione contenente, oltre al citosol e al NADPH, il glutatione ridotto, il t-butilidroperossido e l’enzima GSSG-Reduttasi. L’attività della GSH-Px si calcola usando il coefficiente d’estinzione molare (ε) di 6,22mM-1cm-1, ed è espressa come nmoli di NADPH consumate per min per milligrammo di proteine cellulari.
6. Elettroforesi su gel di poliacrilammide e western blotting
L’elettroforesi è una tecnica che, mediante corsa su gel di poliacrilammide, permette di separare le proteine in base al loro peso molecolare.
Il metodo seguito è quello descritto da Laemmli (1970), utilizzando per la corsa un gel di poliacrilammide al 7,5% contenente sodio dodecilsolfato, posizionato nell’apparato “Mini Protean II” (Bio-Rad). La corsa elettoforetica è stata eseguita ad un voltaggio costante di 200 V per circa 45 min. Le proteine, separate in base al loro peso molecolare, sono state trasferite dal gel alla membrana di nitrocellulosa tramite blotting (Towbin et al., 1979) in corrente costante (250 mA) per 105 minuti. La nitrocellulosa è stata trattata con tampone TBS allo 0,2% di tween, contenente albumina sierica al 5%, per circa 4 ore. Al termine sono stati aggiunti gli anticorpi primari e successivamente gli anticorpi secondari che si sono legati al complesso antigene-anticorpo. L’anticorpo secondario era coniugato alla perossidasi che, con opportuni substrati permette di rilevare il segnale di presenza della proteina.
Tale procedura è stata effettuata per i citocromi P450 3A e 2J. Di seguito sono riportate le condizioni utilizzate per ogni isoforma.
CYP3A:
Sul gel sono stati caricati 30 μg di proteine microsomiali di corteccia, cervelletto, ippocampo, mesencefalo e meningi e 5 μg di proteine microsomiali di fegato. Gli anticorpi primari policlonali anti-CYP3A4 umano ottenuti nel coniglio sono stati diluiti 1:1000 in TBS allo 0,2% di tween, contenente albumina bovina sierica al 1%, e lasciati in incubazione per tutta la notte sulla membrana a 4°C. Gli anticorpi secondari anti-coniglio sono stati diluiti 1:2000 in TBS allo 0,2% di tween, contenente albumina bovina sierica al 1%, ed incubati 90 min. Le proteine sono state visualizzate tramite impressione su lastra utilizzando il KIT “SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate” (Pierce).
CYP2J:
Sul gel sono stati caricati 30 μg di proteine microsomiali di corteccia, cervelletto, ippocampo mesencefalo e meningi e 30 μg di proteine microsomiali di fegato. Gli anticorpi primari policlonali anti-CYP2J2 umano ottenuti nel coniglio sono stati diluiti 1:1000 in TBS allo 0,2% di tween, contenente albumina bovina sierica al 1%, e lasciati in incubazione per tutta la notte sulla membrana a 4°C. Gli anticorpi secondari anti-coniglio sono stati diluiti 1:4000 in TBS allo 0,2% di tween, contenente albumina bovina sierica al 1%, ed incubati 90 min. Le proteine sono state visualizzate tramite impressione su lastra utilizzando il KIT “SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate” (Pierce).
7. Estrazione dell’RNA e preparazione del cDNA
7.1 Estrazione dell’RNA
I tessuti utilizzati per l’estrazione dell’RNA sono stati prelevati in condizioni di sterilità e conservati a -80°C. Tutto il materiale necessario per la manipolazione e la conservazione dell’RNA è stato acquistato o trattato in modo da essere sterile ed RNasi-free.
L’estrazione dell’RNA di tutti i campioni di interesse (fatta eccezione per le meningi) è stata eseguita utilizzando il kit commerciale RNeasy® Midi Kit (QIAGEN), partendo da 20-80 mg di tessuto di partenza a seconda della disponibilità. Per i capillari, per i quali le quantità a disposizione erano molto scarse, è stato possibile fare una sola estrazione.
Il seguente protocollo per l’estrazione dell’RNA è stato messo appunto per 50-100 mg di tessuto iniziale:
• Tagliare tramite bisturi il tessuto ancora congelato se conservato a – 80°C o scongelato se conservato in RNAlater, fino ad ottenere una quantità vicina a quella sopraindicata.
• Omogeneizzare il tessuto in un potter Elvehjem con 2ml di tampone “RLT” addizionato di 1/100 del suo volume con β-mercaptoetanolo • Trasferire in falcon da centrifuga da 15ml e centrifugare per 10
minuti a 3000-5000g alla temperatura di circa 20°C (ad eccezione della durata, queste condizioni sono le stesse per ogni centrifugata). • Trasferire il sovranatante in un nuovo falcon da centrifuga e
aggiungere uno stesso volume di etanolo 70%, agitando vigorosamente per mescolare le due fasi.
• Trasferire la miscela nella colonna del Kit posta all’interno di un falcon da centrifuga analogo a quelli usati precedentemente e chiudere delicatamente.
• Centrifugare per 5 minuti.
• Gettare l’eluito e aggiungere 4 ml di tampone “RW1”, poi centrifugare 5 minuti.
• Gettare l’eluito e aggiungere 2,5 ml di tampone “RPE” con etanolo assoluto (1:4 v/v).
• Centrifugare 2 minuti e aggiungere altri 2,5 ml di tampone “RPE”. • Centrifugare 5 minuti per seccare la membrana della colonna.
• Rimuovere attentamente la colonna dal tubo senza toccare le pareti e trasferire in un nuovo falcon.
• Aggiungere 150 μl di acqua “RNAsi free” sulla membrana della colonna, chiudere delicatamente e aspettare 1 minuto, dopodiché centrifugare per 3 minuti (questa operazione va ripetuta due volte).
Per le meningi, membrane di consistenza molto fibrosa, è stato necessario omogeneizzare il campione utilizzando il “tissue lyser” (QIAGEN), uno strumento che distrugge ed omogenizza meccanicamente i tessuti in 1 ml di una soluzione monobasica di fenolo e guanidina tiocianato (TriPure, Roche). L’omogenato così ottenuto viene centrifugato a 12000 rpm per 10 minuti a 4°C, in questa fase precipitano membrane extracellulari, polisaccaridi e DNA ad alto peso molecolare, mentre i lipidi si stratificano sopra il sovranatante. Si trasferisce in una nuova eppendorf il sovranatante contenente RNA, DNA e proteine.
Al sovranatante si aggiungono 200 μl di cloroformio per ogni ml di soluzione TriPure usata inizialmente, si agita con il vortex per 15 secondi e si lascia a temperatura ambiente per 2-15 minuti. Le tre fasi contenenti proteine, DNA e RNA vengono poi separate mediante centrifugazione a 12000 rpm per 15 minuti a 4°C, la fase acquosa incolore soprastante contiene l’RNA.
La fase acquosa incolore è trasferita in una nuova eppendorf alla quale si aggiungono 500 μl di isopropanolo (per ogni ml di soluzione TriPure). Dopo aver agitato manualmente si lascia il campione a temperatura ambiente per 5-10 minuti, dopodiché si centrifuga a 12000 rpm per 10 minuti.
Il pellet ottenuto contenente l’RNA, viene lavato e risospeso con 1 ml di etanolo al 75% e successivamente centrifugato per 5 minuti a 4°C a 7500 rpm.
Il pellet viene completamente essiccato e risospeso in 20-30 μl di acqua DEPC.
7.2 Controllo dell’RNA
I campioni di RNA ottenuti sono stati esaminati con un nanospettrofotometro (NanoDrop, ND-1000 Celbio) al fine di:
• ricavare la concentrazione di RNA estratto (calcolata a partire dall’assorbimento a 260 nm)
• valutare indicativamente il grado di purezza della preparazione: un rapporto di assorbimento a 260/280 nm maggiore di 1,7 indica un buon contenuto di acidi nucleici (principalmente RNA) rispetto al contenuto di proteine.
Successivamente è stata verificata l’integrità dell’RNA con una corsa elettroforetica in condizioni denaturanti su gel di agarosio all’1% con formaldeide al 16%.
Il gel è stato preparato nel seguente modo:
• 0.3g di agarosio sono stati disciolti al calore in 30ml di RNA buffer costituito da HEPES 50mM, EDTA 1mM, Sodio acetato 5mM e NaOH 10mM.
• formaldeide al 16% aggiunta prima della polimerizzazione del gel che avviene a temperatura ambiente.
L’elettroforesi è stata effettuata in apparati orizzontali con un voltaggio costante di 80V usando RNA buffer come tampone di corsa.
I campioni da sottoporre ad elettroforesi sono stati preparati aggiungendo : • una quantità in μl pari a 0.5-2μg di RNA (in base alla quantità
estratta)
• loading-buffer per gel contenente formaldeide (50% di glicerolo, 1mM EDTA pH 8, 0.25% blu di bromofenolo, 0.25% xilene cyanolo)
• RNA loading-buffer (formaldeide 66%, formammide 20%, 1μl di bromuro di etidio 10 X, fino a volume con MOPS)
• acqua DEPC per portare a volume (12μl)
Il gel viene visualizzato dopo la corsa su transilluminatore UV.
I campioni di RNA sono stati poi aliquotati in eppendorf sterili da 30-40 μg alle quali sono stati aggiunti 1/10 di volume di sodio acetato 3 M e 2,5 volumi di etanolo assoluto freddo per ottenere una migliore conservazione dell’RNA stesso, dopodichè sono stati conservati a –80°C.
Conservando i campioni in questo modo, prima di poter procedere alla retrotrascrizione dell’RNA è necessario precipitare l’RNA e risospenderlo in acqua, ciò viene fatto eseguendo le seguenti operazioni:
• Centrifugare la eppendorf per 10 minuti a 15000 rpm.
• Eliminare il sovranatante e lavare il pellet con etanolo 70%.
• Centrifugare per 5 minuti a 15000 rpm ed eliminare il sovranante fino a far seccare il pellet.
• Risospendere in acqua (il volume dipende dalla concentrazione iniziale di RNA).
A questo punto è necessario ricontrollare la concentrazione la purezza e l’eventuale stato di degradazione dell’RNA.
7.3 RT-PCR (Reverse-Trascription PCR)
L’RNA isolato con le metodiche sopra descritte è stato retrotrascritto in vitro in cDNA, mediante l’utilizzo del Kit “QuantiTect Reverse Transcription” (QIAGEN), e successivamente amplificato mediante PCR utilizzando il Kit “PCR Master Mix” (Promega).
7.3.1 Retrotrascrizione
Questo Kit a differenza di altri metodi prevede l’eliminazione della contaminazione del DNA genomico (di solito ottenuta mediante la DNAsi), questa viene eseguita aggiungendo ad 1μg di RNA (la quantità che si retrotrascrive per ogni campione), 2μl di uno specifico tampone (gDNA Wipeout Buffer 7X) e acqua fino a raggiungere un volume totale di 14μl. Dopodiché è necessario incubare per 2 minuti a 42°C.
A questo punto l’RNA è pronto per essere retrotrascritto perciò si prepara una master mix contenente:
• 1μl Quantiscript Reverse Transcriptase
• 4μl Quantiscript RT Buffer, 5X (concentrazione finale 1X) • 1μl RT Primer Mix
A questi componenti vanno poi aggiunti i 14μl della reazione precedente fino ad ottenere un volume finale di 20μl. Si incuba per 30 minuti a 42°C e successivamente per 3 minuti a 95°C per inattivare l’enzima (Quantiscript Reverse Transcriptase) .
Tutte le operazioni sono state eseguite in ghiaccio e il cDNA è stato conservato a –20°C fino al momento del suo impiego per l’amplificazione.
7.3.2 Amplificazione
La miscela di amplificazione per ogni campione era costituita da :
• 2 μl di cDNA ottenuto dalla reazione di retrotrascrizione (1μl nella riamplificazione)
• 12,5 μl Master Mix
• 1-1,2 μl di ciascun primers (senso ed antisenso) 10μM • acqua fino a un volume di 25 μl
Tipico programma di amplificazione:
1 ciclo: 94 °C 2’ (linearizzazione della molecola di cDNA)
94 °C 30’’ (fase di denaturazione) 30-40 cicli: Ta 30’’ - 45’’ (fase di appaiamento)
72°C 30’’- 2’ (fase di attività polimerasica dell’enzima)
1 ciclo: 72°C 5’ - 10’ (allungamento dei frammenti incompleti)
Il numero dei cicli dipende dall’espressione del gene in considerazione; per il gene housekeeping gliceraldeide fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono stati utilizzati 30 cicli, per gli altri geni considerati 35 o 40 cicli.
Ta indica la temperatura di “annealing”, è specifica per ogni coppia di primer ed è calcolata con il metodo:
(2 °C per ogni A/T + 4 °C per ogni G/C) – 5 °C
In genere si cerca di disegnare primer in modo che abbiano Ta simili fra di loro, utilizzando nell’amplificazione una Ta intermedia. La Ta utilizzata per ogni amplificazione è indicata in Tabella 1.
Il tempo nella fase di polimerizzazione dipende dalla lunghezza dell’amplificato che si ottiene; in genere si utilizza 1 min ogni 1.000 pb, non
si va comunque al di sotto di 30 sec anche per frammenti di poche centinaia di paia basi.
Al termine degli esperimenti, i prodotti di PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio all’1% contenente bromuro di etidio.
Per l’analisi di RT-PCR sono stati usati indifferentemente due termociclatori: “Olly 96” della Explera e “Gene Cycler” della Bio-RAD.
7.3.3 Primer utilizzati
I primer per i geni (CYP2B22, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CAR, PXR) sono stati disegnati sulle sequenze specifiche presenti in banca dati oppure derivati dalla letteratura.
I primer sono stati disegnati come descritto di seguito:
• È stata scaricata dalla banca dati (GenBank) la sequenza nucleotidica per i geni d’interesse
• Le sequenze (principalmente di uomo, ratto, topo e toro) sono state allineate e sono state individuate le regioni altamente conservate utilizzando il software CLUSTAL v1.61.
• Sulla base delle sequenze specifiche o delle regioni conservate sono state scelte le sequenze dei primer della lunghezza di circa 20 nucleotidi tramite il software OLIGO, disponibile in rete, seguendo i seguenti criteri:
• Mantenere un contenuto di guanina e citosina ≥ 50% • Evitare sequenze che formano strutture stabili (loops) al 3’ • Evitare sequenze simili fra i primer che possano formare
dimeri e così ridurre l’efficienza di amplificazione
Per il CYP 2J, invece, i primer sono stati disegnati sulla base della sequenza del gene recentemente clonata nel nostro laboratorio.
Tab. 1: Primer, dimensioni dell’amplificato e temperatura di annealing (Ta) utilizzati per le analisi di RT-PCR
Ta rg et Prim e r sen so (5 ’- 3 ’) Prim e r a n tisen so (5 ’-3 ’) Lu n g h e zza
fra m m e n to (p b ) Ta (°C )
C Y P 2 B 2 2 C AT C AT C T G C T C C AT T G T AG G AT G G T G G T G AAG AA 830 47
C Y P 3 A 2 2 AAT AC CG T AAG G G CAT G T G G G G AG C T T C C T G G C AT AT T G T 476 54
C Y P 3 A 2 9 G T T T C T T C AG T C C AT T AT T T C AC T C G G C G C T T T T G T T G AT C T G 165 47
C Y P 3 A 4 6 CTTCAG TCCATTATTTCTCT G CACAACCTTCAG AACAATG 873 49
C Y P 2 J C C C T C AN T T C AAG AT C AAC A G CAG AT G AG G T T T T C T T CAT 374 48
C A R AAG G AG C AG AAAG C G T T AG T AG T C G C C G AAG T G T C T T AT G 430 55
P X R T G AAG AG C AG C G G AC AA T AG G AC AG C C G AC C AC A 490 56
7.4 Elettroforesi su gel di agarosio
I prodotti della PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio all’1%. Il gel viene preparato come segue: 0.5g di agarosio vengono disciolti al calore in 50ml di TBE 1X (costituito da Tris borato 89mM, acido borico 8,9mM, EDTA 0,2mM); prima della polimerizzazione del gel, che avviene a temperatura ambiente, vengono aggiunti 3 μl di bromuro di etidio 10X in 50ml di TBE 1X.
Gli esperimenti sono stati effettuati in apparati orizzontali con un voltaggio costante di 80V usando TBE 1X come tampone di corsa.
I campioni da sottoporre ad elettroforesi sono stati preparati aggiungendo un loading-buffer per DNA (costituito da 0.25% di blu di bromofenolo, 0.25% di xilene cyanolo, 30% di glicerolo in acqua) pari ad un volume di 1/6 di quello del campione stesso.
Per ogni corsa elettroforetica sono stati caricati oltre ai campioni, 5μl di “DNA Ladder 100-1500 bp” (Invitrogen), come marcatore del peso molecolare.
Il gel viene visualizzato dopo la corsa su transilluminatore UV.
7.5 Eluizione degli amplificati di PCR da gel
La banda contenente il frammento di DNA delle dimensioni attese è stata ritagliata dal gel in condizioni sterili ed eluita seguendo il protoccolo indicato dal KIT “Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System” (Promega). Questo procedimento, di seguito descritto in dettaglio, prevede lo scioglimento del frammento di gel d’agarosio in presenza di guanidina isotiocianato, dopodiché il DNA viene legato ad una colonnina di 1 ml con supporto di silice.
• Al frammento di gel è stato aggiunto un volume, pari al peso del frammento stesso, di “Membrane Binding Solution” che è stata incubata a 50 °C fino al completo scioglimento del gel (per un massimo di 10 minuti)
• Il campione è stato caricato sulla colonnina e centrifugato per 1 minuto a 16000 xg
• Il contenuto del tubo eppendorf è stato eliminato e sono stati aggiunti alla colonnina 700 μl di “Membrane Wash Solution” e centrifugati per 1 minuto a 16000 xg
• È stato ripetuto il lavaggio aggiungendo 500 μl di “Membrane Wash Solution” centrifugando per 5 minuti a 16000 xg
• È stato eliminato l’eluato e la colonnina è stata centrifugata nuovamente per 1 minuto a 16000 xg in modo da farla seccare
• Il DNA è stato eluito aggiungendo 25-40 μl di acqua sterile direttamente sulla membrana della colonnina e centrifugando per 1 minuto a 16000xg
Dopo l’eluizione la quantità di amplificato recuperata è stata misurata utilizzando il NanoDrop (Celbio).
7.6 Sequenziamento dell’amplificato atteso
La sequenza nucleotidica degli amplificati di interesse eluiti è stata ottenuta mediante l’utilizzo di un sequenziatore automatico che si basa sul metodo di Sanger, che permette il sequenziamento del DNA mediante sintesi enzimatica con inibitori dell’allungamento della catena della DNA polimerasi.
Il sequenziamento (Fig.3) effettuato presso il “Servizio di Sequenziamento di DNA del C.R.I.B.I. dell’ Università degli Studi di Padova” richiedeva una quantità variabile tra 1-3 ng di amplificato per ogni 100 pb di lunghezza del frammento e 3,2pmoli di primer.
Ciascun campione è stato preparato in doppio, mettendo una volta solo il primer senso e una volta solo il primer antisenso. Una volta preparati i campioni con i loro rispettivi primers sono stati liofilizzati per circa 3-4 ore ed inviati per il sequenziamento.
Fig. 3: Esempio di elettroferogramma ottenuto in seguito al sequenziamento dei prodotti di PCR
7.7 Analisi delle sequenze nucleotidiche
La sequenza nucleotidica ottenuta è stata confrontata con le sequenze note in banca dati per le rispettive isoforme, mediante i programmi di allineamento di sequenze CLUSTAL e BLASTN. Quest’ultimo è uno dei programmi basati su di un algoritmo che permette il riconoscimento e l’allineamento tra due sequenze nucleotidiche, evidenziandone le regioni conservate e il grado di omologia.
