LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS ANATOMIJOS INSTITUTAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

ANATOMIJOS INSTITUTAS

Agnė Bušeckytė

ŢIURKĖS TRIŠAKIO IR ALKŪNINIO MAZGŲ HISTOCHEMINIS

TYRIMAS

Medicinos vientisųjų studijų programa

BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS

Darbo vadovas: prof. Dainius H. Pauţa

TURINYS

PADĖKA (7)

INTERESŲ KONFLIKTAS (7)

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS (7) SANTRUMPOS (8)

SĄVOKOS (9) ĮVADAS (10)

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI (11) 1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Nervų sistema (12) 1.2. Sensorinės sistemos (12) 1.3 Trišakio nervo mazgas (13) 1.4. Alkūninis mazgas (14)

1.5. Baltymas susijęs su kalcitonino genu (15) 1.6. Azoto oksido sintazė (16)

1.7. Purinerginiai receptoriai (17)

1.8. Skausmo substancija arba substancija P (18) 2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimo medţiaga (20) 2.2. Mėginių paėmimas (20)

2.3. Makropreparatų paruošimas (20) 2.4. Mikropreparatų paruošimas (21) 2.5. Preparatų mikroskopavimas (23) 2.6. Duomenų analizės metodai (23) 3. REZULTATAI

3.1. Ţiurkės trišakio mazgo histochemija (24) 3.2. Ţiurkės alkūninio mazgo histochemija (28)

3.3. Ţiurkės alkūninio ir trišakio mazgų imunohistochemijos palyginimas (31) 4. REZULTATŲ APTARIMAS (33)

5. IŠVADOS (35)

SANTRAUKA

Darbo autorius: Agnė Bušeckytė

Darbo pavadinimas: ŢIURKĖS TRIŠAKIO IR ALKŪNINIO MAZGŲ HISTOCHEMINIS IŠTYRIMAS

Įţanga: Juntamieji mazgai yra periferinės nervų sistemos, kurioje yra susitelkę pirminių juntamųjų neuronų kūnai, dalis. Jie skirstomi į galvinius ir nugarinius. Galviniai juntamieji mazgai būna bendrųjų ir specialiųjų jutimų, tačiau šių mazgų neuronų cheminės savybės yra nepakankamai ištirtos, nes – iki šiol neţinoma kokio cheminio fenotipo juntamosios ląstelės yra būdingos skirtingiems juntamiesiems mazgams. Šiam tyrimui pasirinkti bendrųjų jutimų trišakis ir specialiųjų jutimų alkūninis mazgai. Gavus naujų ţinių apie skirtingų juntamųjų neuronų populiacijas, ne tik gilėja bendras supratimas apie jutimų sistemos veikimo mechanizmą bei jų hierarchiją, bet gali būti nustatyti nauji farmakoterapiniai taikiniai, galintys pagerinti kūno jutimų sistemos patologijų gydymą.

Tikslas: Ištyrinėti funkciškai skirtingų galvinių juntamųjų mazgų neuronų cheminius fenotipus, išryškinant jų specifinius skirtumus.

Uţdaviniai: (1) Nustatyti laboratorinių ţiurkių trišakio mazgo juntamųjų neuronų neurocheminį fenotipą. (2) Nustatyti laboratorinių ţiurkių alkūninio mazgo juntamųjų neuronų neurocheminį fenotipą. (3) Atlikti trišakio ir alkūninio mazgų juntamųjų neuronų lyginamąją analizę.

Metodika: Šiame darbe imunohistocheminiais metodais buvo ištirti keturių laboratorinių ţiurkių trišakio ir alkūninio juntamųjų mazgų pjūviai. Panaudojant antikūnus prieš baltymą, susijusį su kalcitonino genu (angl.Calcitonin gene related peptide, CGRP), skausmo substanciją (Sub P), purino receptoriaus P2X3 ir neuroninės azoto oksido sintazės (nNOS) antigenus. Taikant fluorescencinę ir lazerinę skenuojančiąją mikroskopiją gauti pjūvių vaizdai, kurie išanalizuoti pasitelkiant gautų vaizdų ir duomenų statistinio įvertinimo programas (ImageJ, MS Excel, SPSS).

SUMMARY

Author: Agnė Bušeckytė

Title: HISTOCHEMICAL ANALYSIS OF TRIGEMINAL AND GENICULATE GANGLIA IN RAT.

Background: Sensory ganglia are part of the peripheral nervous system where clusters of primary sensory neuron bodies are accumulated. Sensory ganglia are divided into dorsal and cranial. Cranial sensory ganglia respond to either general or special sensations but these qualities remain less well studied - to date it is unknown what chemical phenotype sensory cells are characteristic for different sensory ganglia. This study analyzes general somatosensory trigeminal ganglion and geniculate ganglion involved in viscerosensation. Collecting knowledge about different sensory neuron populations not only provides us understanding about the functional mechanisms and their hierarchy, but it might also help to reveal potential pharmacotherapy targets to aid in the treatment of the body's sensory system pathologies.

Aim of the study: To determine chemical phenotypes of cranial sensory ganglia and to reveal the differences based on varied specifications.

Objectives: (1) To determine the neurochemical phenotype of sensory neurons in the trigeminal ganglion. (2) To determine the neurochemical phenotype of sensory neurons in the geniculate ganglion. (3) To perform comparative analysis of neurochemical phenotype of the sensory neurons from trigeminal and geniculate ganglia.

Material and methods: Immunohistochemical methods were employed to analyse trigeminal and geniculate ganglia slices obtained from four laboratory rats for detection of neuronal nitric oxide synthase (nNOS), calcitonin gene related peptide (CGRP), substance P (Sub P) and purinergic receptor P2X3 antigens. While applying fluorescent and laser scanning microscopy, digital pictures of the neuronal clusters in ganglia were taken and analyzed using visual and statistical evaluation software (ImageJ, MS Excel, SPSSS).

Results: Neuronal populations with antigens for CGRP and Sub P were present only in the trigeminal ganglia. Purinergic receptor P2X3 and nNOS antigens containing neurons were determined in both of the ganglia. The higher distribution of both populations was seen in geniculate ganglion. Comparative analysis of the neuronal populations in the ganglia was based on statistical testing and found to be statistically significant (p>0,05).

PADĖKA

Dėkoju darbo vadovui prof. Dainiui H. Pauţai uţ suteiktą galimybę ir pamokas. Visam LSMU Anatomijos instituto personalui uţ visokeriopą pagalbą ruošiantis tyrimui ir darbo metu.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Tyrimo metu interesų konflikto nekilo.

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

SANTRUMPOS

CGRP - su kalcitonino genu susijęs baltymas Sub P - skausmo substancija, substancija P P2X3 - P2X klasės purino receptorius 3 nNOS - neuroninė azoto oksido sintazė iNOS - suţadinamoji azoto oksido sintazė eNOS - endotelinė azoto oksido sintazė

NADPH - nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas FAD - flavino adenino nukleotidas

FMN - flavino mononukleotidas CNS - centrinė nervų sistema PNS - periferinė nervų sistema NO - azoto oksidas

GMP – guanilmonofostatas ATP - adenozino-’5-trifosfatas PBS - fosfatinis buferinis tirpalas PFA – paraformaldehidas

SĄVOKOS

Antigenas - molekulė organizme, įskaitant virusus ir bakterijas, stimuliuojanti imuninį organizmo atsaką, ypač – antikūnų gaminimą.

Antikūnas - sudėtiniai baltyminiai glikoproteinai, kurie susidaro gyvūnų ar ţmogaus organizme. Ekstirpacija - viso organo pašalinimas.

Fagocitozė - tai procesas, endocitozės forma, kuriam vykstant didelė dalelė (maisto dalelė ar visa ląstelė) yra apgaubiama didesnės ląstelės membranos ir lieka šios ląstelės viduje kaip „maisto vakuolė“ (vadinama fagosoma).

Fenotipas - organizmo savybių, poţymių (morfologinių, fizinių, elgesio ir kt.) sandaros ir funkcijų visuma, susiklosčiusi jo individualaus vystymosi procese.

Imunohistochemija - diagnostikos metodas, galintis nustatyti tam tikrų antigenų (specifinių baltymų) audiniuose buvimą.

Mediatorius - tarpininkaujantis veiksnys.

Modalumas - pojūčio savybių ir kokybės nusakymas, pvz.: spalva - regos modalinė savybė, tonas ir tembras - klausos, kvapas - uoslės.

Morfologija - biologijos sritis, nagrinėjanti organizmų (augalų ir gyvūnų) išorinę ir vidinę sandarą, pradedant ląstelėmis ir baigiant organais ir jų sistemomis.

Neuronas - nervinė ląstelė.

Nocicepcija - tai informacijos priėmimas, kai audinių paţeidimo vietoje sudirginami specialūs receptoriai ir gimsta nervinis impulsas.

Perfuzija - fiziologinio tirpalo, kraujo, jo pakaitalo arba kito skysčio leidimas organo, kūno dalies arba viso organizmo kraujagyslėmis.

Receptorius - nervo galūnė ar speciali ląstelė, priimanti vidaus arba išorės dirgiklių energiją ir paverčianti ją nerviniu impulsu.

Sinapsė - tai jungtis tarp dviejų neuronų, pritaikyta signalams perduoti.

Transkriptomas - terminas, kuris apima baltymus koduojančią ir su ja susijusią organizmo genomo dalį, kuriai priskiriamos informacinės, pernašos, ribosominės ir kitos RNR molekulės. Transkriptomo tyrimai leidţia suprasti skirtingų ląstelių tipų struktūrą ir funkciją, kaip pokyčiai genome lemia organizmo ligas.

ĮVADAS

Juntamoji nervų sistema yra organizmo gebėjimo reaguoti į išorinius ar vidinius kūno pokyčius pagrindas. Visuotinai pripaţįstama, kad kiekvienas skirtingas jutimas centrinę nervų sistemą pasiekia tarpininkaujant periferinėje nervų sistemoje esantiems pirminiams juntamiesiems neuronams. Jie sudaro grupes, kurių kiekviena reaguoja į joms specifišką stimulą, pasiţymi joms būdingu sensoriniu modalumu [1]. Pirminių juntamųjų neuronų kūnai yra susitelkę nugariniuose ir galviniuose juntamuosiuose mazguose, jų periferinių aksonų terminalės yra vadinamos receptoriais. Pagrindinė receptorių funkcija - juos dirginantį stimulą paversti elektriniais signalais, kurie per pirminių juntamųjų neuronų įcentrinius aksonus perduoda sensorinę informaciją į centrinę nervų sistemą [2]. Taikant įvairius tyrimų metodus nustatyta, kad nervų sistemą sudarantys neuronai yra fenotipiškai heterogeniški savo morfologija, projekcijomis, elektrinėmis savybėmis ir chemine sudėtimi. Galvos juntamųjų mazgų neuronai taip pat pasiţymi skirtingomis funkcijomis bei modalumais, reikalingais tam tikroms funkcijoms atlikti. Imunohistochemija yra vienas tiksliausių metodų nervinių ląstelių cheminio fenotipo nustatymui, aptinkant ant tiriamųjų ląstelių ar jų viduje esančius joms specifiškus antigenus.

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Tyrimo tikslas: Ištirti funkciškai skirtingų galvinių juntamųjų mazgų neuronų cheminius fenotipus, išryškinant jų specifinius imunohistocheminius skirtumus.

Uţdaviniai:

1. Nustatyti laboratorinių ţiurkių trišakio mazgo juntamųjų cheminius fenotipus, panaudojant nNOS, CGRP, SP ir P2X3 ţymenis ir įvertinti atitinkamos neuronų populiacijos procentinį pasiskirstymą. 2. Nustatyti laboratorinių ţiurkių alkūninio mazgo juntamųjų cheminius fenotipus, panaudojant

nNOS, CGRP, SP ir P2X3 ţymenis ir įvertinti atitinkamos neuronų populiacijos procentinį pasiskirstymą.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Nervų sistema

Struktūriškai nervų sistema dalijama į centrinę (CNS) ir periferinę (PNS) nervų sistemas. Periferinę nervų sistemą sudaro galviniai ir nugariniai nervai. Nugariniai juntamieji nervai atlieka bendrųjų jutimų ir somatosensorinę funkcijas. Dalis galvinių nervų vystosi kitaip nei nugariniai ir perduoda specifinius kvapo, skonio, regos ir klausos jutimus [1].

Nervinis audinys yra sudarytas iš dviejų pagrindinių ląstelių tipų: neuronų ir neuroglijos ląstelių. Neuronai yra nervų sistemos informacijos ir komunikacijos ląstelės, kurios, veikdamos kartu skirtingomis sistemomis, leidţia ţmonėms suvokti aplinką, integruoti informaciją aukštesniam kognityviniam lygmeniui ir inicijuoti kūno atsakus, reikalingus homeostazės palaikymui ar judesiui atlikti. Kaip ląstelinis vienetas, neuronai yra sudaryti iš trijų komponentų: ląstelės kūno, plonų ląstelės ataugų – dendritų, kuriais perduodamas impulsas sklinda link neurono kūno, ir aksonų - ilgų, laidţių neurono projekcijų, kuriomis impulsas sklinda nuo ląstelės kūno [3]. Neuroglijos ląstelės yra randamos tiek CNS, tiek PNS ir jos sudaro apie pusę bendro smegenų tūrio (skaičiumi viršija neuronus nuo 5 iki 10 kartų). Taip pat pasiţymi įvairiomis funkcijomis: uţtikrina neuronų struktūrinį palaikymą bei mitybą; uţpildydamos tarpus tarp neuronų ir juos supančių kraujagyslių (fagocitozės būdu) šalina debrį; didina nervinio impulso perdavimo greitį, izoliuodamos aksono laidţiąją sistemą; veikdamos integruotai su neuronais, turi didelę reikšmę informacijos perdirbimui ir laikymui (pvz. atmintis) [4].

Daugumos neuronų kūnai yra CNS, kur jų telkiniai yra vadinami branduoliais. PNS esantys neuronų kūnai yra susigrupavę telkiniuose, vadinamuose mazgais ir rezginiais. Juntamųjų mazgų neuronai yra vadinami pirminiais juntamaisiais neuronais ir yra pseudounipoliniai. Periferiniai tokių neuronų aksonai atitinka dendritinį komponentą, jų terminalės sudaro receptorius, o įcentriniai aksonai turi projekcijas į CNS esančius branduolius [5]. Receptoriai, juos veikiantį išorinį dirgiklį paverčia elektriniu membranos potencialu ir pagal perduodamo jutimo tipą yra skirstomi į: fotoreceptorius, chemoreceptorius, mechanoreceptorius, termoreceptorius ir nociceptorius. Skirtingas funkcijas atliekantys neuronai pasiţymi specifiška neurochemine sudėtimi, skiriasi ląsteles sudarantys baltymai, joms būdingi augimo faktorių receptoriai, neuropeptidai ir neurotransmiteriai [6].

1.2. Sensorinės sistemos

suprantamu signalu, todėl per pirminių juntamųjų neuronų receptorius ji virsta į membranos veikimo potencialą. Per keletą paskutinių dešimtmečių, naudojant molekulinius biologinius tyrimų metodus, pradėti aiškinti ląsteliniai mechanizmai, kuriais sensorinės sistemos aptinka skonio, kvapo, mechaninius ir kitus stimulus [7]. Šie pirminiai elektriniai potencialai jau pirmuosiuose informacijos perdavimo etapuose, dar prieš patekdami į CNS, yra grupuojami bei integruojami per atitinkamą sensorinę sistemą ir taip yra sukuriama tvarkinga periferinės transdukcijos reprezentacija: suvokiama koks tai išorinis stimulas ir kur jis įvyko. Stimulas CNS vertinamas ne tik pagal skirtingus energijos tipus (pvz.: šviesos ir mechaninės stimuliacijos), bet ir pagal skirtingas stimulo savybes (pvz.: pastovus spaudimas ir didelio daţnio vibracija ant odos) [8].

Ţinome, kad nugaros smegenų uţpakaliniai ragai yra pirmoji somatosensorinės informacijos perdavimo į CNS vieta. Pastebėjus, kad bendrųjų jutimų perdavime dalyvaujantys neuronai skiriasi savo morfologinėmis bei fiziologinėmis savybėmis, buvo tiriamas taktilinio jutimo kelias. Nustatyta, kad jutimas į CNS patenka per jį atitinkančią sensorinę sistemą, sudarytą iš tai sistemai būdingų pirminių juntamųjų neuronų ir su jais saveikaujančių jaudinamųjų bei slopinančiųjų interneuronų. Tuo pat metu, kai jutimo sukelti membranos potencialai savo keliais sklinda į CNS, per sensorinę sistemą veikia ir iš CNS nusileidţiantieji mechanizmai, leidţiantys iš gausybės sensorinės informacijos atrinkti svarbiausius signalus [9]. Jutimo, sklindančio savo sensorine sistema kelias yra vadinamas ţymėtąja linija (angl. labeled line), o jis atlieka tam tikro jutimo modalumo perdavimą ir yra aiškinamas, kad kai suaktyvinama tam tikra juntamųjų neuronų populiacija, sąmoningai suvokiame juos dirginantį specifinį stimulą [6]. Ir atvirkščiai, manipuliuojant atitinkamų sensorinės ţievės neuronų aktyvumu, galima sukelti jutimo suvokimą. Tiriant pelių skonio jutimą nustatyta kokie elgesio pokyčiai išreiškia konkretaus skonio suvokimą. Tada stimuliuojant ţievės sritis, atsakingas uţ saldaus ir kartaus skonio informacijos priėmimą, buvo gautas atsakas, būdingas pelei pajutus saldų ar kartų skonį [10]. Ţymėtų linijų buvimas reiškia, kad atskirų sensorinių sistemų neuronai pasiţymi jiems specifišku modalumu [11]. Tai taip pat rodo, kad receptoriai yra specifiškai selektyvūs ne tik juos veikiantiems dirgikliams, bet ir postsinaptiniams taikiniams, per kuriuos jie komunikuoja su CNS. Kiekviena mazginė ląstelė perduoda impulsą į tiksliai apibrėţtą atitinkamą CNS sritį, po kurios informacija keliauja grieţtai organizuotomis sinaptinėmis jungtimis iki gumburo ir galiausiai smegenų ţievės [12].

1.3. Trišakio nervo mazgas

pagrindo vidurinės duobės ir yra apsuptas kietojo smegenų dangalo. Trišakio mazgo dangalas yra fenestruotas ir jo sudaromas kraujo barjeras yra pralaidesnis lygininant su nugaros ar galvos smegenų dangalais [14]. Mazge esantys tariamieji vienpoliai neuronai yra betarpiškai apsupti satelitinių glijos ląstelių, kurių skaičius sudaro daugiau nei 90 procentų ląstelių mazge. Atlikti tyrimai pademonstravo glaudţią tarpusavio sąveiką tarp neuronų ir satelitinių glijos ląstelių per plyšines jungtis [15]. Mazgo neuronų centrinės skaidulos sudaro juntamąją šaknelę, radix sensoria, kuri, posterioliai smegenų tilto ir vidurinių smegenėlių kojyčių, įsiskverbia į smegenis [15]. Sensorinė informacija pirma atkeliauja į trišakio nervo juntamuosius branduolius, esančius smegenų kamieno dangtyje, tilte, rombinės duobės srityje ir per gumburo branduolius yra perduodama į smegenų ţievę, kur įvyksta sąmoningas jutimo suvokimas. Iš trišakio mazgo išeinantys periferiniai neuronų aksonai sudaro trišakį mazgą, nervus trigeminus. Jis sudarytas iš 3 dalių: akinio nervo, nervus ophtalmicus (V1), viršutinio ţando nervo, nervus maxillaris (V2), ir apatinio ţando nervo, nervus mandibularis (V3) [15]. Vienoje studijoje buvo tiriama ţmogaus trišakio mazgo neuronų neurochemija ir nustatyta, kad daugiausia nNOS turi neuronai, kurių aksonai sudaro akinį nervą [16]. Tiriant ţmogaus trišakės sistemos topografiją, ţinoma, kad: V1 kerta viršutinį akiduobės plyšį, fissura orbitale superior, V2 - apvaliąja angą, foramen rotundum, V3 - ovaliąją angą, foramen ovale, visi patenka į sinus cavernosus regioną, tada pereina į trišakį mazgą [17].

1.4. Alkūninis mazgas

Gacek atliktame anatominiame tyrime su 100 ţmogaus smilkinkaulių (pacientų amţiaus imtis nuo 1 mėnesio iki 92 metų), intratemporalinis veidinis nervas buvo padalintas į 4 segmentus: landinį, uolinį, alkūninį ir būgninį. Nustatyta, kad veidinio nervo juntamasis mazgas, ganglion geniculatum, visuose tirtuose smilkinkauliuose buvo sudarytas iš 2 dalių: landinės ir alkūninės. Landinė dalis yra vidinėje klausomojoje landoje, meatus acusticus internus, o alkūninė – tarp uolinio ir būgninio segmentų, ties smilkinkaulio jungtimi. Pagal morfometrinius matavimus, alkūninis mazgas – piramidės formos struktūra – kurios dimensijos yra: 1050 µm ties pagrindu ir 1800 µm ties statine. Pagal atliktus mazgo neuronų populiacijos skaičiavimus, bendras ląstelių skaičius svyravo nuo 539 iki 4017 (vidurkis 2126, standartinė deviacija 774). Ištyrus neuronų pasiskirstymą alkūninio mazgo atskirose dalyse, gauti rezultatai parodė, kad 88% tirtų atvejų didţioji neuronų populiacijos dalis yra alkūninėje dalyje, 8% tirtų atvejų - landinėje dalyje, o 4% - alkūninėje ir landinėje dalyse - turėjo vienodą kiekį neuronų. [18]

rūgštumą, sūrumą, kartumą ar umami. Taip pat alkūniniame mazge yra ne gustacinių (angl. non-gustatory) neuronų, kurie per uţpakalinį ausies kaušelio nervą, nervus auricularis posterior, įnervuoja išorinę klausomąją landą. [19] Pelės alkūninis mazgas yra sudarytas iš chemosensorinių neuronų, įnervuojančių lieţuvį ir gomurį, bei somatosensornių, įnervuojančių ausies kaušelį. Naudojant transkriptomo analizės metodus buvo rasta išreikšta atskirtis tarp šių dviejų alkūninio mazgo neuronų grupių. Tyrimo metu nustatyta, kad visi gustaciniai neuronai savo transkriptome turi P2rx2 ir/arba P2rx3 genus, kurie koduoja jonotropinius purino receptorius, reikalingus aferentinės informacijos transmisijai iš skonio svogūnėlių į alkūninio mazgo neuronus. Tuo tarpu somatosensorniai neuronai mazge šių genų neišreiškė arba jie buvo randami labai maţais kiekiais. Taip pat, naudojant Ca2+ vaizdavimo duomenis, buvo matoma aiški atskirtis tarp neuronų, kurie generuoja ir negeneruoja atsaką į ATP [20].

Alkūninio mazgo neuronų aferentinės ataugos su lieţuviu jungiasi per būgninę stygą, nervus chorda tympani. Finger et al., 2005 atliko tyrimą naudojant peles su genetiškai pašalintais jonotropiniais purinerginiais receptoriais (P2X2 ir P2X3) ir rado, kad nors atsakas į skonį išnyko, būgninės stygos atsakas į lietimą bei temperatūrą, liko [21]. Toliau atliktos fiziologinės studijos su ţiurkėmis, naudojant įvairaus diapazono ir tipo stimulus, parodė, kad alkūninis mazgas perduoda daugiau nei chemosensorinę informaciją ir atlieka svarbų vaidmenį priekinės lieţuvio dalies somatosensorinei funkcijai. Pagal atsaką į skirtingus stimulus, buvo suskirstytos 4 pagrindinės alkūninio mazgo neuronų kategorijos: 1. Cheminiai - turėjo atsaką į skonį; 2. Cheminiai/Terminiai - generavo atsaką į skonį ir šaltą vandenį; 3. Terminiai - tik į šaltą vandenį; 4. Taktiliniai - atsaką suformavo tik į lytėjimo stimulą [21]. Ţiurkės alkūninis mazgas turi 1787 (+/- 82) neuronus, iš kurių 20% aferenčių eina per didįjį uolinį nervą, nervus petrosi majoris, į skonio svogūnėlius minkštajame gomuryje, 28% yra pasiskirsčiusios per būgninę stygą į grybinius spenelius, o likusios aferentės įeina į uţpakalinį ausies kaušelio nervą ir įnervuoja somatosensorinius ausies kaušelio receptorius [21].

1.5. Baltymas susijęs su kalcitonino genu

Baltymas susijęs su kalcitonino genu (CGRP) yra labai stiprus vazodilatatorius ir multifunkcinis reguliacinis neuropeptidas, kuris atlieka svarbią funkciją esant neuropatiniam ir uţdegiminiam skausmams bei dalyvauja migreninio skausmo patogenezėje [13].

nustatyta, kad beveik pusė ţmogaus trišakio mazgo neuronų turi CGRP. CGRP randamas ląstelių citoplazmoje greta Goldţio aparato membranų, jo imunoreaktyvumas buvo nustatytas sensorinių neuronų C tipo nemielinizuotose skaidulose. CGRP teigiamų neuronų kūnai yra maţo-vidutinio diametro ir jų struktūra morfologiškai primena perlus [22]. Trišakiame mazge CGRP receptorių komponentai randami satelitinėse glijos ląstelėse ir didesnio diametro neuronuose, kurių ataugos yra mielinizuotos, Švano ląstelėmis apsuptos A tipo skaidulos [23]. CGRP ir CGRP receptoriaus komponentai tuose pačiuose neuronuose nėra randami, todėl manoma, kad CGRP yra išskiriamas trišakiame mazge ir lokaliai veikia satelitines glijos ląsteles bei didelius neuronus [23].

Keletas studijų rado koreliaciją tarp migrenos skausmo ir CGRP išsiskyrimo galvoje. Buvo pastebėta, kad migrenos atakų metu CGRP kiekis serume, cerebrospinaliniame skystyje bei seilėse yra pakilęs. CGRP vaidmuo migrenos patofiziologijoje yra paremtas klinikiniais įrodymais: (1) CGRP infuzija sukėlė migreną grupei tirtų jautrių individų; (2) CGRP receptorių antagonistai efektyviai veikia ūmios migrenos gydymo metu. Dėl savo gebėjimo sukelti smegenų ir jų dangalų kraujagyslių išsiplėtimą bei perduoti nociceptinę informaciją antros eilės CNS neuronams, CGRP atlieka svarbų vaidmenį migrenos patofiziologijoje [23]. Fiziologinė satelitinių glijos ląstelių funkcija trišakiame mazge nėra iki galo suprasta, bet pastarosios studijos, tiriant CGRP pasiskirstymą mazge, rodo galimą neuronų-glijos signalizaciją per plyšines jungtis ir galimą tolimesnę baltymo susijusio su kalcitonino genu stimuliaciją, lemiančią NO ir tam tikrų priešuţdegiminių mediatorių išsiskyrimą iš glijos ląstelių [23].

1.6. Azoto oksido sintazė

reguliuoja neurotransmiterių išsiskyrimą, neuronų diferenciaciją, migraciją ir tolimesnį neuritų šakojimąsi neuronų paţeidimo metu [26]. NO yra svarbus moduliuojant nocicepciją ir vystantis skausmo hipersensityvumo būklėms [27]. Esant neuropatiniam skausmui po periferinio nervo paţeidimo, nNOS kiekis juntamuosiuose neuronuose didėja [26]. Periferinėje nervų sistemoje nNOS pagamintas NO veikia kaip atipinis neurotransmiteris, kuris, stimuliuodamas guanililo ciklazę ir ciklinio GMP gamybą, tarpininkauja vykstant komponentų, reikalingų ţarnų peristaltikai, vazodilatacijai ir varpos erekcijai, išsiskyrimui [24]. Neuroninės NOS aktyvumą smegenyse reguliuoja Ca2+ jonai ir fermentas kalmodulinas. Šis fermentas randamas tiek tirpiąja, tiek kietųjų dalelių formomis ir yra įvairiai pasiskirstęs tarp ląstelių. Tokios jo savybės lemia nNOS poveikio įvairovę sinaptinių signalų metu [24]. Trišakio nervo mazge nNOS daţniausiai randama maţo ir vidutinio dydţio neuronuose, kurių dalis taip pat turi CGRP. CGRP skatina NO sintezę bei išskyrimą, ir atvirkščiai.

1.7. Purinerginiai receptoriai

normaliu šlapimo pūslės spaudimu [31]. Tyrimas su ţmonėmis (aplikuojant ATP ant odos) ir atliktos in vivo fiziologinės studijos (naudojant P2XR agonistus ir antagonistus) siūlo, kad ATP aktyvuotas P2X3 receptorius depoliarizuoja nociceptinius neuronus ir sukelia skausmo jutimą [29]. Kiti moksliniai stebėjimai, atlikti su selektyviais P2X3 receptorių antagonistais ir neturinčių P2X3 receptoriaus pelių modeliais patvirtino, kad P2X3 receptorius atlieka svarbų vaidmenį formuojantis lėtiniam neuropatiniam skausmui. Atliktuose tyrimuose, kuriuose buvo naudojami lėtinio neuropatinio skausmo modeliai, buvo nustatytas pagausėjęs P2X3 receptorių imunoreaktyvumas nugariniuose juntamuosiuose mazguose [32]. Tiriant trišakio nervo neuropatinį skausmą su ţiurkių modeliais nustatyta, kad po trišakio nervo paţeidimo P2X3 receptorius tarpininkauja vystantis karščio hiperalgezijai: aktyvavus P2X3 receptorius trišakio mazgo pirminių juntamųjų neuronų centrinėse terminalėse sukeliamas glutamato išskyrimas į nugarinį trišakio nervo branduolį, taip prisidedant prie terminės hiperalgezijos indukcijos [29]. P2X3 receptorius taip pat gausiai aptinkamas tarp alkūninio mazgo neuronų. P2X2 ir P2X3 receptoriai esantys ant alkūninio mazgo neuronų tarpininkauja visų skonio modalumų perdavime ir yra būtini jo suvokimui. Tiriant peles, kurioms buvo panaikinti genai koduojantys P2X3 ir P2X2 receptorius sudarančius baltymus, buvo įrodyta, kad visiems penkiems skonio modalumams perduoti į CNS yra būtinas ATP signalizavimas per šiuos purino receptorius [33].

1.8. Skausmo substancija arba substancija P

2. TYRIMO METODIKA

Tyrimui buvo panaudotos keturios suaugusios WISTAR veislės abiejų lyčių ţiurkės, iš kurių gauta 16 juntamųjų mazgų. Gyvūnų mėginiai gauti iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Vivariumo, kuriame gyvūno ir jo organų panaudojimas moksliniams tikslams vyksta laikantis Lietuvos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos nustatytų laboratorinės praktikos normų. Gyvūnai eutanazuoti LSMU Gyvūnų tyrimų centre pagal Valstybinės maisto ir veterinarinės tarnybos leidimą Nr. LT-61-19-004.

2.2. Mėginių paėmimas

Gyvūnui atlikus eutanaziją anglies dioksido dujomis, buvo atlikta torakotomija. Perkirpus perikardą, į kairįjį skilvelį buvo įvedama perfuzinė sistema, naudojant 14G diametro injekcinę adatą. Atlikus viso gyvūno perfuziją fiziologiniu 0,01 M fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS; pH 7,4), kraujas buvo išplautas iš kraujotakos sistemos. Panaudojant tą pačią infuzinę sistemą, visas gyvūnas buvo prefiksuojamas 4% paraformaldehido (PFA; pH 7,4) tirpalu perfuzijos būdu.

2.3. Makropreparatų paruošimas

Naudojant ţirkles, ţiurkėms buvo nukerpama galva su kaklu ir, pradedant nuo veidinės kaukolės dalies, paeiliui buvo rezekuojami skliauto kaulai: nosikaulis, kaktikaulis, momenkauliai, tarpmomenkauliai ir pakaušio ţvynas. Atvėrus smegeninę buvo ekstirpuojamos galvos smegenys. Likęs kaukolės pamatas su trišakiu ir alkūniniu mazgais 30 minučių buvo chemiškai fiksuojamas 4% PFA tirpale. Po fiksacijos kaukolės pamatas su minėtais mazgais buvo nuplaunamas PBS tirpalu ir, panaudojant stereoskopinį mikroskopą, per vidinį kaukolės pamatą, buvo ekstirpuojami trišakis ir alkūninis mazgai. Pastarasis mazgas buvo eksponuojamas trepanuojant smilkinkaulio uolinę dalį per vidinę klausomąją landą. Paimti mazgai buvo perkeliami ir parą laikomi šaldytuve (4℃) 25% sacharozės ir 0,05% PBS tirpale, siekiant uţtikrinti audinių intaktiškumą jų uţšaldymo metu. Po krioprotekcijos mazgai buvo perkeliami į šaldomąją audinių terpę (Mounting medium for cryotomy, VWR Prolabo Chemicals, Vokietija), kur uţšaldomi naudojant skystą azotą.

2.4. Mikropreparatų paruošimas

1 lentelė. Tyrime naudoti pirminiai ir antriniai antikūnai

Antigenas Kilmė Tipas Skiedimas Tiekėjas Katal. #

Pirminiai antikūnai

CGRP Pelės (Mouse) Monokloninis 1:500 Abcam AB9498

nNOS Pelės (Mouse) Monokloninis 1:500 SantaCruz SC-5302

PGP 9,5 Triušio (Rabbit) Polikloninis 1:500 Abcam AB10404

P2X3 Jūrų kiaulytės (G. Pig)

Polikloninis 1:500 Abcam AB10267

Sub P Jūrų kiaulytės (G. Pig)

Polikloninis 1:500 Abcam AB10353

Antriniai antikūnai

Pelės (Mouse)Cy3

Asilo (Donkey) Polikloninis 1:500 Chemicon AP192C

Triušio (Rabbit)FITC

Asilo (Donkey) Polikloninis 1:500 Chemicon AP182C

Jūrų kiaulytės (G. Pig)Cy3

2.5. Preparatų mikroskopavimas

Preparatai buvo mikroskopuoti, analizuoti ir fotografuoti naudojant fluorescentinį AxioImager Z1 mikroskopą su skaitmenine kamera AxioCamMRm (Carl Zeiss, Gottingen, Vokietija). Mikroskopuojant preparatus buvo nustatomi mazge esantys neuronų kūnų telkiniai ir daromos jų nuotraukos. Duomenys suskaitmeninti, apdoroti ir lyginti naudojant AXIOVISION.REL 4.8.2. programinę įrangą (Carl Zeiss, Jena, Vokietija).

2.6. Duomenų analizės metodai

3. REZULTATAI

Tiriant trišakio mazgo histochemiją su CGRP, Sub P, nNOS ir P2X3 ţymenimis, buvo ištirti 108 šių mazgų pjūviai, kuriuose buvo matomos telkiniais susigrupavusios nervinės ląstelės, kurias skyrė nervinių skaidulų sruogos.

Trišakiame mazge aptikti visi keturi neuronų cheminiai fenotipai. Norint palyginti skirtingų fenotipų pasiskirstymą mazge panaudotas neparametrinis Kruskalio Voliso kriterijus, naudojamas nepriklausomoms imtims nustatyti. Apskaičiuota, kad skirtumai tarp tirtų neuronų grupių yra statistiškai reikšmingi (p<0,05).

2 lentelė. Skirtingo cheminio fenotipo neuronų procentinis gausumas trišakiame mazge. Neurocheminis fenotipas Vidurkis /Mediana Standartinė paklaida /[minimali-maksimali reikšmės] Vaizdų skaičius P2X3 46,8 14 27 nNOS 4,3 [1,7 - 86] 27 Sub P 25,7 10 27 CGRP 32,9 6 27

2 pav. Trišakio mazgo pjūvio vaizdas. Raudona spalva matomos ląstelės yra substancijai P pozityvūs neuronų kūnai, o žaliai švytintys neuronai yra pozityvūs bendrajam neuronų žymeniui PGP 9,5.

4 pav. Trišakio mazgo pjūvio vaizdas. Raudona spalva matomos ląstelės yra P2X3 pozityvūs neuronų kūnai, o žaliai švytintys neuronai yra pozityvūs bendrajam neuronų žymeniui PGP 9,5.

3.2. Ţiurkės alkūninio mazgo histochemija

6 pav. Skirtingų cheminių fenotipų procentinis gausumas alkūniniame mazge.

3 lentelė. Alkūninio mazgo skirtingo cheminio fenotipo neuronų kūnų prodentinis pasiskirstymas.

Neurocheminis fenotipas

Vidurkis Standartinė paklaida Vaizdų skaičius

P2X3 92,1 13,3 13

nNOS 7,35 5 13

Sub P 0 0 8

7 pav. Alkūninio mazgo pjūvių vaizdai. Raudona spalva turėtų būti matomi nervinių ląstelių kūnai pozityvūs substancijai P (viršuje) ir CGRP (apačioje). Tačiau tokių ląstelių kūnų alkūniniame mazge

nėra, o žaliai švytintys neuronai yra pozityvūs bendrajam neuronų žymeniui PGP 9,5. Apatinėje nuotraukoje gerai matosi CGRP pozityvios nervinės skaidulos (rodyklės), kurios driekiasi link

Tiriant neuronų imunoreaktyvumą antikūnais prieš CGRP ir substanciją P, šiems antikūnams pozityvių ląstelių kūnų nebuvo rasta (3 lentelė, 6, 7 pav.). Visose atliktose nuotraukose ant alkūninio mazgo neuronų buvo matomas tik ţalios spalvos švytėjimas.

Purino receptorių P2X3 pozityvių neuronų kūnų alkūniniame mazge buvo 92 procentai, o nNOS pozityvių apie 7 procentus (3 lentelė, 6, 8-9 pav.).

9 pav. Alkūninio mazgo pjūvio vaizdas. Viršuje matoma spalvota pjūvio nuotrauka kurioje beveik visos ląstelės yra P2X3 pozityvūs neuronų kūnai, o žaliai švytintys neuronai yra pozityvūs bendrajam neuronų žymeniui PGP 9,5. Apačioje ta pati nuotrauka panaudojus spalvų filtrus, kairėje yra tik žaliai

3.3 Ţiurkės alkūninio ir trišakio mazgų imunohistocheminis palyginimas

Trišakio mazgo neuronų kūnai pasiţymėjo visais keturiais ieškotais cheminiais fenotipais, alkūninio mazgo neuronuose buvo aptikti du iš keturių tirtų antigenų, t.y. P2X3 ir nNOS.

Neuroniniai NOS pozityvių nervinių ląstelių kūnai buvo skirtingo gausumo tirtuose mazguose, nes trišakiame mazge jų vidutiniškai buvo 4 procentai, o alkūniniame - 7 procentai. Šiuos duomenis patikrinus nepriklausomų imčių t-test testu, buvo pastebėta, kad šis gausumo skirtumas nėra statistiškai reikšmingas (10 pav.).

10 pav. Neuroninei azoto oksido sintazei (nNOS) pozityvių nervinių ląstelių gausumas trišakiame ir alkūniniame mazguose.

1. REZULTATŲ APTARIMAS

Šiuo tyrimu buvo siekiama nustatyti trišakio ir alkūninio mazgų juntamųjų neuronų cheminius fenotipus pagal keturis neuroţymenis. Buvo atliekamos imunohistocheminės reakcijos naudojant antikūnus prieš baltymą, susijusį su kalcitonino genu (CGRP), neuroninę azoto oksido sintazę (nNOS), substanciją P (Sub P) ir purino receptorių P2X3.

CGRP yra nociceptinis neurotransmiteris, kurio esminis vaidmuo sensorinėje sistemoje yra informacijos apie skausmo impulsus perdavimas. Iš ankstesnių tyrimų yra ţinoma, kad nugarinių šaknelių juntamuosiuose mazguose ir trišakiame mazge, perduodančiuose juntamąją informaciją apie bendruosius jutimus, yra randamos didelės CGRP-IR neuronų grupės. Tiriant ţiurkes, kurioms buvo dirbtinai sukelta trišakio nervo neuralgija, buvo matomas trišakio mazgo CGRP antigeną turinčių neuronų pagausėjimas [39]. Šiame tyrime, analizuojant trišakio mazgo neuronų cheminį fenotipą, neuronų su CGRP cheminiu fenotipu vidutiniškai buvo randama 39 procentai. Panašiuose ankstesniuose tyrimuose, vertinant CGRP cheminį fenotipą turinčius neuronus ţiurkės, pelės ir ţmogaus trišakiuose mazguose, CGRP imunoreaktyvūs neuronai taip pat sudarė nuo 30 iki 50 proc. mazge esančių neuronų [16]. 1993 metais atliktas Hino N. et al. šunų lieţuvio inervacijos tyrimas atskleidė, kad lieţuvį siekiantys CGRP turintys neuronai ateina iš trišakio mazgo, jų projekcijų siekiančių alkūninį mazgą aptikta nebuvo [40]. Svarbu paţymėti, kad mūsų tirtuose alkūniniuose mazguose CGRP cheminį fenotipą turinčių neuronų kūnų nebuvo aptikta.

Kaip ir CGRP, substancija P taip pat yra nociceptinis neurotransmiteris, kurio buvimo specialiųjų jutimų alkūniniame mazge nebuvo aptikta. Tačiau bendrųjų jutimų trišakis mazgas turėjo vidutiniškai 26 procentus substancijai P pozityvių neuronų kūnų. Imunohistochemiškai tiriant neuronus, Sub P yra plačiai naudojama kaip neuronų su nemielinizuotomis ir plonomis mielinizuotomis ataugomis ţymuo [41]. Eilėje tyrimų rastos gausios Sub P sankaupos somatosensoriniuose nugarinių šaknelių juntamuosiuose mazguose ir dorsalinėje nugaros smegenų dalyje, kas rodo, kad Sub P yra pirminių juntamųjų neuronų ţymuo [42] ir yra pripaţįstamas kaip jaudinantis neuromoduliatorius skausmo impulso perdavime, lemiantis lygiųjų raumenų susitraukimą. Sub P taip pat dalyvauja imuninio organizmo atsako formavimesi [34]. Mūsų gauti duomenys patvirtina, kad bendrųjų jutimų funkciją atliekantis trišakis mazgas yra į nugarinius juntamuosius mazgus panašiausias galvinis mazgas.

srityse, jose aptikti maţesni ar didesni nNOS-IR neuronų kiekiai. Tačiau juntamieji mazgai šiame tyrime liko neištirti [43]. Literatūrinių duomenų apie nNOS antigeno buvimą ant alkūninio mazgo neuronų nebuvo rasta, bet šio tyrimo metu nNOS cheminį fenotipą turinčių neuronų dalis vidutiniškai sudarė net 7 procentus. Tirtuose ţiurkės trišakio mazgo pjūviuose buvo vidutiniškai randama 4 procentai tokių neuronų. Ankstesni tyrimai su pelių trišakiais mazgais rado apie 3 procentus. nNOS antigenu pasiţyminčių neuronų, bet ţmogaus trišakiame mazge tokių nervinių ląstelių buvo rasta net 33 procentai. Manoma kad šis skirtumas gali būti paaiškintas skirtingomis nNOS formomis skirtingose rūšyse [16].

2. IŠVADOS

1. Trišakio mazgo neuronų kūnai pasiţymi pozityvumu visiems keturiems antikūnams: didţiausią dalį sudarė P2X3-IR neuronai, gerokai maţiau buvo CGRP, Sub P ir maţiausiai nNOS IR neuronų kūnų. 2. Alkūninio mazgo neuronams CGRP ir Sub P antigenai nebuvo nustatyti, bet beveik visi alkūninio mazgo juntamųjų neuronų kūnai pasiţymėjo P2X3 cheminiu fenotipu, o nNOS-IR neuronai

buvo itin negausūs.

3. Alkūninio ir trišakio mazgų nervinių ląstelių palyginamoji imunohistochemija rodo, kad: a. Nociceptiniai neurotransmiteriai Sub P ir CGRP yra būdingi tik bendrųjų jutimų nerviniam mazgui -

trišakiam mazgui.

b. Įvairias funkcijas atliekantis jonų kanalas P2X3 yra būdingas tiek trišakiam, tiek alkūniniam mazgams. c. nNOS pozityvūs neuronų kūnai yra būdingi tiek trišakiam, tiek alkūniniam mazgams, bet yra santykinai negausūs ir jų funkcinė prasmė nėra aiški.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Patthey, C., Clifford, H., Haerty, W. et al. Identification of molecular signatures specific for distinct cranial sensory ganglia in the developing chick. Neural Dev 2016; 11, 3.

2. Sternini C. Organisation of the peripheral nervous system: autonomic and sensory ganglia. J Investig Dermatol Symp Proc. 1997; 2(1):1-7.

3. Arendt D, Bertucci PY, Achim K, Musser JM. Evolution of neuronal types and families. Curr Opin Neurobiol. 2019; 56:144-152

4. Dzamba D, Harantova L, Butenko O, Anderova M. Glial Cells - The Key Elements of Alzheimer’s Disease. Curr Alzheimer Res. 2016; 13(8):894-911

5. Arcilla CK, Tadi P. Neuroanatomy, Unmyelinated Nerve Fibers. 2020. StatPearls Publishing; 2020-.

6. Lee H, Macpherson LJ, Parada CA, Zuker CS, Ryba NJP. Rewiring the taste system. Nature. 2017; 548(7667):330-333

7. Vosshall LB, Carandini M. Sensory systems. Current Opinion in Neurobiology. 2009; 19:343-344 8. Menceloglu M, Grabowecky M, Suzuki S. Probability-driven and stimulus-driven orienting of

attention to time and sensory modality. Atten Percept Psychophys. 2019; 81(8):2732-2744.

9. Abraira VE, Kuehn ED, Chirila AM, Heintz N, Hughes DI, Kus L, Bashista KA. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell 2017; 168, 295-310

10. Yueqing P, Gillis-Smith S, Jin H, Trankner D, Ryba NJP, Zuker CS. Sweet and bitter taste in the brain of awake behaving animals. Nature. 2015; 527(7579):512-515

11. Bokiniec P, Zampieri N, Lewin GR, Poulet JF. The neural circuits of thermal perception. Curr Opin Neurobiol. 2018;52:98-106.

12. Darian-Smith I, Galea MP, Darian-Smith C. Manual dexterity: how does the cerebral cortex contribute? Clin Exp Pharmacol Physiol. 1996;23(10-11):948-56

13. Okada S, Saito H,, Matsuura Y, Mikuzuki L, Sugawara S, Onose H, Asaka J, Ohara K, Lee J, Iinuma T, Katagiri A, Iwata K. Upregulation of calcitonin gene-related peptide, neuronal nitric oxide synthase, and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 in the trigeminal ganglion after bright light stimulation of the eye in rats. J Oral Sci. 2019;61(1):146-155.

15. Edvinsson L, Grell AS, Warfvinge K. Expression of the CGRP Family of Neuropeptides and their Receptors in the Trigeminal Ganglion. J Mol Neurosci. 2020; 70(2):230-235.

16. Flowerdew SE, Wick D, Himmelein S, Horn AK, Sinicina I, Strupp M, Brandt T, Theil D, Hüfner K. Characterization of neuronal populations in the human trigeminal ganglion and their association with latent herpes simplex virus-1 infection. PLoS One. 2013; 8(12):e83603

17. Liang L, Diao Y, Xu Q, Zhang M. Transcranial segment of the trigeminal nerve: macro-/microscopic anatomical study using sheet plastination. Acta Neurochir (Wien). 2014; 156(3):605-12

18. Sánchez-Del-Rey A, Sánchez-Fernández JM, Ibargutxi A, Martinez-Ibargüen A, Santaolalla F. A comparative morphologic and morphometric study about geniculate ganglion development in man and in rat. Acta Otolaryngol. 2017;137(4):375-383.

19. Ohman-Gault L, Huang T, Krimm R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comp Neurol. 2017;525(18):3935-3950.

20. Dvoryanchikov G, Hernandez D, Roebber JK, Hill DL, Roper SD, Chaudhari N. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nat Commun. 2017;8(1):760.

21. Yokota Y, Bradley RM. Geniculate Ganglion Neurons are Multimodal and Variable in Receptive Field Characteristics. Neuroscience. 2017;367:147-158.

22. Eftekhari S, Warfvinge K, Blixt FW, Edvinsson L. Differentiation of Nerve Fibers Storing CGRP and CGRP Receptors in the Peripheral Trigeminovascular System. J Pain. 2013;14(11):1289-303 23. Eftekhari S, Salvatore CA, Calamari A, Kane SA, Tajti J, Edvinsson L. Differential distribution of

calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 2010;169(2):683-96.

24. Förstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 2012; 33(7):829-37

25. Moiseev KY, Romanova IV, Masliukov AP, Masliukov PM. Development of nNOS-positive preganglionic sympathetic neurons in the rat thoracic spinal cord. Cell Tissue Res. 2019; 375(2):345-357.

26. Masliukov PM, Moiseev KY, Korzina MB, Porseva VV. Development of nNOS-positive neurons in the rat sensory ganglia after capsaicin treatment. Brain Res. 2015; 18:212-21.

28. Burnstock G. P2X receptors in sensory neurones. Br J Anaesth. 2000;84(4):476-88.

29. Shinoda M, Kawashima K, Ozaki N, Asai H, Nagamine K, Sugiura Y. P2X3 Receptor Mediates Heat Hyperalgesia in a Rat Model of Trigeminal Neuropathic Pain. J Pain. 2007;8(7):588-97. 30. Li M, Wang Y, Banerjee R, Marinelli F, Silberberg S, Faraldo-Gómez JD, Hattori M, Swartz KJ.

Molecular mechanisms of human P2X3 receptor channel activation and modulation by divalent cation bound ATP. Elife. 2019; 8. pii: e47060

31. Cockayne DA, Hamilton SG, Zhu QM, Dunn PM, Zhong Y, Novakovic S, Malmberg AB, Cain G, Berson A, Kassotakis L, Hedley L, Lachnit WG, Burnstock G, McMahon SB, Ford AP. Urinary bladder hyporeflexia and reduced pain-related behaviour in P2X3-deficient mice. Nature. 2000;407(6807):1011-5.

32. Ru Q, Xiong Q, Zhou M, Tian X, Yue K, Li C, Wu Y. 2  Hz EA Reduces Heroin Withdrawal-Induced Hyperalgesia and Heroin Relapse by Downregulating P2X3 Receptors in DRG Neurons. Biomed Res Int. 2019; 2019:1873859.

33. Vandenbeuch A, Larson ED, Anderson CB, Smith SA, Ford AP, Finger TE, Kinnamon SC. Postsynaptic P2X3-containing receptors in gustatory nerve fibres mediate responses to all taste qualities in mice. J Physiol. 2015;593(5):1113-25.

34. Simões ALB, Silva GAR, Giorgetto C, de Cassia do Carmo-Campos E, Dias FJ, Fazan VPS. Substance P in Dorsal Root Ganglion Neurons in Young and Adult Rats, after Nociceptive Stimulation during the Neonatal Period. Anat Rec (Hoboken). 2018;301(5):849-861.

35. Zhang Y, Song N, Liu F, Lin J, Liu M, Huang C, Liao D, Zhou C, Wang H, Shen J. Activation of mitogen-activated protein kinases in satellite glial cells of the trigeminal ganglion contributes to substance P-mediated inflammatory pain. Int J Oral Sci. 2019; 11(3):24

36. Uhlman D, Nguyen T, Grignol G, Merchenthaler I, Dudas B. Substance P appears to affect growth via growth hormone-releasing hormone (GHRH) neurons in the human hypothalamus. Brain Struct Funct. 2019;224(6):2079-2085.

37. Adamus M. Substance P as a regulatory peptide of hematopoiesis and blood cell functions. Postepy Hig Med Dosw. 2009; 63:106-13.

38. Day IN, Thompson RJ. UCHL1 (PGP 9.5): neuronal biomarker and ubiquitin system protein. Prog Neurobiol. 2010;90(3):327-62.

40. Hino N, Masuko S, Katsuki T. An immunohistochemical study of sensory and autonomic innervation of the dog tongue with special reference to substance P- and calcitonin gene- related peptide-containing fibers in blood vessels and the intralingual ganglia. Arch Histol Cytol. 1993;56(5):505-16.

41. Azimi E, Reddy VB, Pereira PJS, Talbot S, Woolf CJ, Lerner EA. Substance P activates Mas-related G protein–coupled receptors to induce itch. J Allergy Clin Immunol. 2017; 140(2):447-453.e3

42. Zieglgänsberger W. Substance P and pain chronicity. Cell Tissue Res. 2019; 375(1):227-241. 43. Chong PS, Poon CH, Fung ML, Guan L, Steinbusch HWM, Chan YS, Lim WL, Lim LW.

Distribution of neuronal nitric oxide synthase immunoreactivity in adult male Sprague-Dawley rat brain. Acta Histochem. 2019;121(8):151437