MECCANISMI PATOGENI DELLA SILICE CRISTALLINA

Il meccanismi patogeni della silice cristallina sono parzialmente oscuri. Il potenziale patoge-no varia patoge-non solo da un polimorfo all’altro (Iler, 1979); (Castrapatoge-nova, 1996); (Fubini, 1998a) ma anche tra polveri dello stesso polimorfo. (Fubini et al., 2004; Bruch et al., 2004; Cakmak et al., 2004; Seiler et al., 2004). Quindi ad una formula così semplice corrispondono una varietà di particolati con proprietà superficiali differenti e quindi con reattività e patogenicità differenti. È stato evidenziato dalla International Agency for Research on cancer (IARC, 1997) una correlazione tra l’esposizione a polveri di silice cristallina e il cancro polmonare, anche se tale relazione non è presente in tutti i casi esaminati. Questo fenomeno è attribuibile alla possibile varietà di attività dei polimorfi o a fattori esterni, quali i contaminanti quasi sempre presenti nelle polveri di quarzo. In entrambi i casi le differenze chimico-fisiche tra una e l’altra sorgente di silice vengono coinvolte nel determinare il grado di patogenicità.

Molte proprietà chimico-fisiche risultano coinvolte nella patogenicità della silice. Ad esem-pio la tossicità della silice è strettamente legata alla forma, alla dimensione e alla micro-morfologia delle particelle che variano molto a seconda dell’origine della polvere. Anche la superficie di un solido, e quindi la sua reattività, è una proprietà coinvolta nella patogenicità della silice. Le funzionalità chimiche che possono essere presenti alla superficie delle parti-celle sono numerose e dipendono dalla storia del campione in esame, e queste determinano il tipo di interazione della particella con cellule e tessuti. I radicali di superficie e gli ioni ferro intrappolati costituiscono per esempio dei centri reattivi sia capaci di generare radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno (ROS) sia di distruggere le difese antiossidanti come acido ascorbico (Fenoglio et al., 2000) e glutatione (Fenoglio et al., 2003). Inoltre radicali di superficie e ioni ferro reagiscono con i ROS prodotti dai macrofagi attivati dall’interazio-ne con la silice portando ad ulteriore produziodall’interazio-ne di radicali e conseguente stress ossidativo.

Questo meccanismo contribuisce fortemente alla patogenicità della silice. Anche la presen-za di ioni metallici, come contaminanti alla superficie può influire sulla patogenicità della silice. Queste impurezze possono essere naturali (Al, Fe, Ti, Na, Ca, K) o derivare da conta-minazione durante i processi di lavorazione. La presenza di ioni metallici modifica per esempio il grado di idrofilia (altra caratteristica che ha un ruolo nella patogenicità della sili-ce), la carica superficiale e la capacità di generare radicali liberi. Ma, gli ioni metallici non hanno tutti lo stesso effetto, il ferro ad esempio può causare sia un aumento (Castranova et al., 1997; Hetland et al., 2001) sia una diminuzione (Ghiazza et al., 2011) della tossicità, mentre la presenza di alluminio la diminuisce (LeBouffant et al., 1977; Nola et al., 1981;

Begin et al., 1987b; Schins et al., 2002; Clouter et al., 2001; Schins et al., 2002).

In questo studio sono stati caratterizzati (analisi morfologica e composizionale) dei campio-ni di silice provecampio-nienti dai quattro comparti lavorativi che rappresentano una fonte di rischio maggiore per i lavoratori descritti nell’introduzione e sono state valutate alcune delle proprietà che influiscono sulla tossicità della silice cristallina, tra cui il rilascio di radi-cali liberi e la determinazione del ferro biodisponibile.

2.1 I campioni di silice

In tabella 1 sono descritti i campioni a base silicea esaminati.

Tabella 1 - campioni esaminati

Comparti Materiali Provenienza

Argilla rossa cotta e cruda Germania

Argilla bianca cotta e cruda Alessandria

Laterizi NB. I campioni crudi erano stati essiccati all’aria (a temperatura ambiente); i campioni cotti erano stati sottoposti ad un ciclo termico fino a 1400°C

Lapidei Cubetto di diorite Valdossola

Polvere sedimentata sotto la macchina cubettatrice Polvere sedimentata sulle pareti dell’azienda,

Vetro Sabbia utilizzata come materia prima già lavata setacciata e fluorurata Francia Scarto proveniente dai forni e miscelati in piccole percentuali alle materie prime

Fonderia Refrattario cotto (refrattario di rivestimento del forno a contatto con il bagno metallico) Non rilevata Refrattario crudo

La CONTARP tra rischi lavorativi e tutela della sicurezza

Tutti i campioni sono stati ridotti in polvere prima attraverso rottura manuale con martello e poi attraverso macinazione in un mulino ad oscillazione per 30 minuti a 27 Hz. Sono stati macinati circa 500 mg di campione in giare di agata.

2.21 Le tecniche analitiche utilizzate

Di seguito sono descritte le tecniche analitiche utilizzate.

Diffrattometria a raggi X (XRD). Tale tecnica consente di identificare i costituenti di miscele contenenti componenti aventi diverse fasi cristalline. Gli spettri delle polveri sono stati registrati con un Philips PW 1830, con geometria θ-2θ e con sorgente di radiazioni al Cobalto.

Fluorescenza a raggi X (XRF). Tale tecnica consente di conoscere la composizione ele-mentare di un campione sia in termini qualitativi che quantitativi. I campioni sono stati ana-lizzati utilizzando uno spettrometro micro-XRF EDAX Eagle III equipaggiato con tubo a raggi-X a Rh e un policapillare in grado di eccitare un’area circolare di 30 mm nominali.

Microscopia elettronica a scansione (SEM). Tale tecnica consente di avere informazioni composizionali sulle particelle delle polveri, sulla morfologia e dimensione delle particelle.

I campioni sono stati esaminati attraverso un SEM Stereo Scan 420 Leica a differenti ingrandimenti per poter valutare in dettaglio la micro morfologia e la presenza di piccole particelle.

Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (spin-trap/EPR). Tale tecnica consente l’identificazione e la quantificazione delle specie radicaliche generate in soluzio-ne, originate dall’interazione dei solidi in esame con molecole bersaglio (es perossido di idrogeno e formiato di sodio) (Fenoglio et al., 2001; Fubini et al., 1995). Il rilascio di radi-cali è stato misurato attraverso uno spettrometro Miniscope 100 EPR Magnettech. I para-metri strumentali utilizzati sono i seguenti: potenza della microonda 10mW, modulazione 1000mG, intervallo di scansione 120G, centro del campo 3345G. È stato utilizzando il 5,5’-Dimethyl-1-pirroline-N-oxide (DMPO) come molecola spin trapping (Fubini et al., 1995;

Fenoglio et al., 2000). Il numero di radicali rilasciati è proporzionale all’intensità del segna-le EPR. Questa tecnica è stata impiegata in due test specifici denominati “test di generazio-ne di radicali ossidrile”mediante reaziogenerazio-ne simile alla nota reaziogenerazio-ne di Fenton e “test di rot-tura omolitica del legame C-H” con generazione del radicale ossidrile (Fubini et al 2001;

Elias et al 2002).

Determinazione della potenziale biodisponibilità del ferro. Tale tecnica consente di determinare spettrofotometricamente (UvKon 930) la quantità di Fe2+ facilmente rimovibi-le dalla superficie dei campioni, utilizzando dei chelanti come la ferrozina. La quantità tota-le di ferro rimovibitota-le è stata determinata incubando i campioni in una soluzione di ferrozi-na, in presenza anche di acido ascorbico che riduce il Fe3+ in Fe2+. La differenza tra i due valori indica la quantità di Fe3+ presente nel materiale di partenza. La quantità di ferro estratto è stato misurato sul surnatante spettrofotometricamente misurando l’assorbimento del complesso ferro-ferrozina a 562 nm (Lund et al., 1990).

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Figura 1 - Spettri XRD: a) quarzo puro, riferimento; b) comparto metallurgico; c) comparto laterizio; d) com-parto vetro; e) comcom-parto lapideo.

3. RISULTATI

3.1 Fase cristallina (analisi XRD) e composizione elementare (analisi XRF)

Nella figura 1 sono riportati gli spettri qualitativi dei campioni, uno per ogni comparto, ana-lizzati attraverso difrattometria a raggi X. Si può notare come tutti i campioni, ad eccezione di quello del comparto vetro (spettro d) siano costituiti sia da silice cristallina (quarzo) che da altre fasi cristalline probabilmente dovute alla presenza di impurezze. Le sabbie utilizzate nel comparto vetro, invece, presentano solamente picchi relativi al quarzo e sono caratteriz-zate da quantitativi di SiO2 variabili dal 70 al 96%; i restanti campioni sono caratterizzati da quantità di silice inferiore con un contenuto minimo, pari a circa 40 %, nei campioni preleva-ti in fonderia come evidenziato dall’analisi elementare (Tabella 2). La presenza di picchi dif-ferenti dalla silice cristallina può, quindi, essere dovuta alla presenza di altre fasi cristalline date dalle impurezze. L’analisi XRF ha confermato i risultati ottenuti dagli spettri XRD.

LATERIZIOLAPID.VETROMETAL

Tabella 2 - Composizione elementare dei campioni di silice, (%w di ossidi).

Campioni SiO2 Al Fe K Ca Ti Na Zn

Argilla rossa cruda 73.17 19.76 2.19 3.29 0.43 1.07 -

-Argilla bianca cruda 76.40 18.36 0.59 2.05 0.33 0.66 - 0.11

Argilla rossa cotta 74.92 18.28 2.27 3.29 0.31 1.05 -

-Argilla bianca cotta 77.73 18.60 0.62 1.72 0.15 0.72 - 0.12

Cubetto 61.20 15.24 3.51 3.37 6.83 0.37 4.94

-Polvere cubettatrice 63.41 16.59 0.88 2.48 5.59 0.28 6.27

-Scarto 70.64 - 0.03 - 10.95 0.04 17.81

-Sabbia 96.63 3.24 - - 0.09 - -

-Refrattario cotto 37.33 50.85 2.05 0.52 0.62 8.03 - 0.09

Refrattario crudo 40.12 47.91 0.68 0.80 6.73 0.95 - 0.12

3.2 Morfologia delle particelle (analisi SEM)

L’analisi di microscopia elettronica a scansione (SEM) ha rilevato una morfologia tipica del quarzo con particelle aventi forma e distribuzione irregolari per tutti i campioni analizzati.

Per quanto riguarda le dimensioni delle particelle, i campioni risultano essere molto etero-genei (da pochi μm fino a 100 μm). Nella Figura 2 sono riportate le immagini SEM relative ai campioni dei vari comparti: a) laterizio, b) metallurgico, c) vetro, d) lapideo.

Figura 2 - Immagine SEM del campione di (a) argilla bianca cruda, (b) refrattario crudo, (c) sabbia, (d) cubetto.

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Figura 3 - Test di rottura omolitica del legame C-H (a) e test di rilascio di radicali ossidrile (b) dei campioni appartenenti ai quattro comparti scelti: laterizio, lapideo, vetro, metallurgico. L’intensità espressa in unità arbi-trarie è stata calcolata misurando l’altezza del picco. Sono riportati i tipici spettri ottenuti dal test di rottura omolitica del legame C-H e dal test di rilascio di radicali ossidrile.

3.3 Generazione di radicali liberi (analisi spin-trap/EPR)

Tutti i campioni sono stati testati attraverso la tecnica dello spin trapping per valutare la capacità di generare radicali liberi. È stata valutata la generazione di radicali ossidrile gene-rati attraverso la reazione di Fenton e la generazione di radicali carbossile ottenuti per rottu-ra omolitica del legame C-H della molecola target formiato di sodio. Gli spettri EPR dell’addotto DMPO/CO2·-, formato da 6 righe di uguale intensità e dell’addotto DMPO/OH·, formato da 4 righe con intensità 1:2:2:1 sono riportati in Figura 3 come esem-pio [ CO2·- e OH·.].

La figura 3 (a e b) riporta l’intensità del segnale degli spettri dei campioni dei diversi com-parti misurata come altezza del picco. Dall’analisi degli spettri EPR è emerso che tutti i campioni sono in grado di generare radicali ossidrile, mentre non tutti generano radicali carbossile. Infatti le argille crude (rossa e bianca), del comparto laterizio, e la polvere pro-veniente dalle pareti, del comparto lapideo, risultano essere inattive nella generazione di questi radicali, al contrario degli altri campioni che invece sono attivi e in particolar modo il campione refrattario cotto.

La generazione di radicale ossidrile risulta pressoché simile in tutti i campioni mentre la generazione del radicale carbossile è nettamente maggiore per il campione refrattario cotto del comparto metallurgico. Tale differenza potrebbe essere dovuta alla differente presenza di ioni ferro alla superficie o di radicali stabili sempre alla superficie che intervengono nella reazione di generazione di radicali liberi in soluzione. Per valutare il meccanismo di gene-razione dei radicali liberi è stato valutato il ferro biodisponibile con l’utilizzo di chelanti.

3.4 Determinazione della potenziale disponibilità del Ferro

Svolgendo il ferro un ruolo fondamentale nella tossicità di diversi particolati, è stata misurata

Figura 4 - Quantità di ioni ferro solubilizzati dalla superficie di polveri di quarzo attraverso l’utilizzo di ferrozi-na (Fe²⁺, colonne bianche) e sistema ferrozina-acido ascorbico (ferro totale, colonne grigio chiaro). La quantità di Fe³⁺(colonne grigio scuro) è stata ottenuta dalla differenza tra la quantità di ferro totale e la frazione di Fe²⁺.

la quantità di ferro facilmente rimovibile presente sulla superficie dei campioni esaminati.

Come si osserva dalla Figura 4, nei campioni di argilla rossa si ha in generale, con la cottura, un aumento del ferro disponibile presente principalmente in forma di Fe³⁺. Nelle argille bianche la quantità di ferro disponibile è uguale sia nel campione cotto che in quello crudo, ma al contrario delle argille rosse la cottura porta all’aumento del Fe²⁺. I campioni del com-parto lapideo, cubetto e polvere sottostante la macchina cubettatrice, possiedono la stessa quantità di ferro con prevalenza della forma Fe³⁺. Il campione scarto invece non contiene ferro e la sabbia in quantità minime. Per ciò che riguarda i campioni refrattario crudo e cotto, si può osservare che in questo caso la cottura porta ad una diminuzione del ferro biodisponi-bile, e quello presente nel campione crudo è in uguale quantità sottoforma di Fe²⁺e Fe³⁺.

4. CONCLUSIONI

Dall’analisi effettuate risulta che i campioni consistono di quarzo miscelato ad altre fasi cristalli-ne come confermato sia dagli spettri XRD che dall’analisi elementare. Anche l’analisi al SEM indica una morfologia tipica del quarzo con particelle aventi forma e distribuzione irregolari.

Come descritto precedentemente la presenza di ferro modula la tossicità della silice (Castranova et al., 1997; Hetland et al., 2001; Ghiazza et al., 2011). In particolare esso può contribuire alla generazione di radicali liberi, sia in forma di Fe³⁺che in forma Fe²⁺avendo un ruolo sia nella rottura omolitica del legame C-H che nella reazione di Fenton. Per spie-gare quindi il rilascio di radicali, è stato effettuato il test di valutazione di ferro biodisponi-bile nei vari campioni in esame (Lund et al., 1990).

Per le argille rosse si può osservare che la cottura porta ad un aumento del ferro

biodisponi-bile che può essere la causa dell’aumento del rilascio di radicali, mentre nelle argille bian-che, la cottura non porta all’aumento del ferro biodisponibile ma la generazione di radicali centrati al carbonio aumenta a causa probabilmente dell’aumentare del ferro in forma Fe²⁺. I campioni del comparto lapideo, presentano la stessa quantità di ferro, ma il cubetto risulta essere più attivo nel test di rottura omolitica del legame C-H rispetto alla polvere depositata sotto la macchina cubettatrice. Questo effetto potrebbe essere dovuto al fatto che il campio-ne derivante dal cubetto è stato macinato di fresco rispetto alla polvere depositata sotto la cubettatrice, che è già in forma di polvere. La presenza di dangling bonds generata durante la macinazione, potrebbe essere il sito attivo da cui si generano i radicali.

Nonostante l’assenza di ferro nel campione scarto proveniente dal comparto di lavorazione del vetro, questo risulta essere attivo nella generazione di radicali, in particolar modo nel test di generazione del radicale ossidrile. Risulta inoltre essere più attivo rispetto al campio-ne di sabbia che contiecampio-ne invece una piccola quantità di ferro, e questo si pensa possa essere dovuto alla rottura omolitica del legame Si-O che avviene in seguito al processo di macina-zione che non vi è stato per il campione di sabbia (Fubini et al., 1990; Fubini et al., 1998a).

Per quel che riguarda i campioni di refrattario cotto e crudo, invece, il primo risulta essere il più attivo nella generazione dei radicali nonostante la quantità di ferro sia inferiore. Ciò potrebbe essere dovuto al processo di cottura che espone siti attivi nella generazione di radicali liberi, mascherando invece il Fe presente all’interno della struttura rendendolo meno disponibile.

I dati ottenuti indicano, quindi, diverse reattività della silice in funzione del contenuto in ferro e della sua disponibilità oltre che di eventuali azioni meccaniche subite dai materiali, quali la macinazione, in grado di favorire la rottura omolitica del legame Si-O.

Inoltre la generazione di radicali dovuta alla rottura omolitica del legame C-H sembra essere in accordo con i dati relativi al rischio pregresso associato all’inalazione di silice cristallina nella Regione Piemonte per cui il comparto metallurgico (fonderia) sembra caratterizzato da un eccesso di rischio, seguito dal comparto lapideo, laterizio e infine dal comparto vetro.

Sono in corso ulteriori studi per verificare questi dati anche in considerazione della non totale sovrapponibilità dei materiali silicei utilizzati in passato con quelli oggetto del pre-sente studio.

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PROGETTO DI RICERCA FINALIZZATO ALLA PREVENZIONE