Trattamento in vitro delle cellule A549

Per i saggi in vitro sono state utilizzate cellule polmonari umane (linea cellulare A549). Per le prove di citotossicità e di genotossicità sono state allestite subculture in piastre a 6 poz-zetti (diametro 34,8 mm) seminando 1×10⁶cellule/pozzetto. Le cellule sono state incubate per 24 ore al termine delle quali sono state messe a contatto con i materiali allo studio, in particolare sono stati saggiati:

- 50- 25 e 12,5 µg/cm²(corrispondenti a 95- 47,5 e 23,75 µg/ml), di TiO₂;

- 50- 25- 12,5-10- 5 e 2,5 µg/cm²(corrispondenti a 95- 47,5- 23,75- 19- 9,5 e 4,75 µg/ml), di ZnO;

- 200 Leq (litri equivalenti)/ml per i materiali raccolti nei due ambienti di lavoro.

La CONTARP tra rischi lavorativi e tutela della sicurezza

L’esposizione della linea cellulare ai materiali in analisi è stata condotta al buio, per 4 ore (test della cometa) o 24 ore (test del micronucleo) a 37°C in atmosfera umidificata al 5% di CO₂. Ogni prova è stata condotta in triplo e per ogni test sono stati allestiti come controlli negativi i rispettivi solventi e come controllo positivo un potente cancerogeno, 4-nitrossi-chinolina 1-ossido (4-NQO 1,5 µM ).

2.4. Test di citotossicità 2.4.1.Test del Trypan blue

Aliquote da 10 µl di sospensione cellulare sono state colorate con Trypan blue e quindi analiz-zate con un contatore di cellule automatico (Countess® Automated Cell Counter, Invitrogen).

2.4.2. Colorazione con cromofori fluorescenti

Nei casi in cui la forma e/o la colorazione dei materiali allo studio potevano interferire con una corretta lettura della vitalità cellulare secondo il metodo del Trypan Blue, il test di cito-tossicità è stato allestito utilizzando i cromofori fluorescenti, fluoresceina diacetato e propi-dio ioduro (Jones, 1985). La conta cellulare è stata effettuata al microscopio a fluorescenza (Dialux 20, Leitz, Germany) distinguendo le cellule vitali (fluorescenti in verde) da quelle non vitali (fluorescenti in rosso).

2.5. Valutazione del danno primario al DNA: test della cometa

Il test della cometa è stato condotto secondo la metodica originale (Tice et al., 2000) con minori modifiche procedurali. Tutti i passaggi sono stati effettuati sotto luce gialla al fine di prevenire l’insorgenza di danni al DNA dovuta alle condizioni operative. Al termine del trattamento in vitro, le cellule sono state risospese in gel di agarosio, stratificate su vetrini portaoggetto (circa 1,5×10⁵ cellule/vetrino) e sottoposte a lisi delle membrane cellulari e nucleari. I vetrini sono stati quindi alloggiati nella cella elettroforetica e lasciati equilibrare con il tampone elettroforeti-co (20 minuti) al fine di elettroforeti-consentire lo srotolamento delle catene di DNA (unwinding) e l’espres-sione dei siti alcali-labili. L’elettroforesi è stata condotta nello stesso tampone per 20 minuti (1 V/cm, 300 mA) ed al termine i vetrini sono stati lavati e disidratati in etanolo. Per la valutazione del danno al DNA, dopo colorazione dei preparati con bromuro di etidio, è stato utilizzato un microscopio a fluorescenza Olympus BX41 equipaggiato con una telecamera CCD ad alta riso-luzione collegata con un sistema computerizzato per l’analisi di immagini (“Comet Assay III”, Perspective Instruments Ltd., Suffolk, UK). Nel presente lavoro il parametro utilizzato per la quantificazione del danno al DNA è stato la tail intensity (TI) che rappresenta la % di DNA migrata nella coda. Per ogni punto sperimentale sono state valutate 100 cellule.

2.6. Valutazione delle alterazioni citogenetiche: test del micronucleo

Per il test del micronucleo le cellule sono state mantenute in coltura per un totale di 72 ore.

Dopo le prime 24 ore il terreno di coltura è stato sostituito con terreno contenente il partico-lato recuperato per sonicazione dai diversi filtri e le colture cellulari sono state incubate per ulteriori 24 ore. Al termine del trattamento il terreno è stato eliminato e le cellule lavate con PBS sterile (pH 7,3). Dopo l’aggiunta di terreno fresco addizionato di Cit-B (per bloccare la citodieresi) le cellule sono incubate per altre 24 ore. Al termine del periodo di incubazione le cellule sono state risospese in soluzione ipotonica e fissate con il reagente di Carnoy (metanolo/acido acetico 5:1, v/v). I campioni sono stati fissati sui vetrini portaoggetto e colorati con Giemsa. Per ogni campione sono state esaminate al microscopio almeno 1.000 cellule binucleate con citoplasma integro ed ogni lettura è stata effettuata in doppio (per un totale di 2.000 cellule/punto sperimentale) (Fenech, 2000).

2.7. Analisi statistica dei risultati

Tutti i dati ottenuti sono stati confrontati mediante analisi della varianza (ANOVA) con confronti multipli tra i gruppi (post hoc analisi: test t di Dunnet; categoria di confronto:

controllo negativo). L’analisi delle correlazioni è stata condotta utilizzando il coefficiente di Pearson (r).

3. RISULTATI

3.1. Valutazione del danno primario al DNA: test della cometa TiO₂e ZnO in forma nanoparticellare

I risultati ottenuti mostrano che tutte le concentrazioni di TiO₂saggiate (Figura 1), incre-mentano i valori di TI, anche se solo la concentrazione più elevata raggiunge la significati-vità statistica. Inoltre, come mostrato dai valori di correlazione (r = 0,769, p = 0,003), l’incremento risulta significativamente dipendente dalla concentrazione di TiO₂.

La CONTARP tra rischi lavorativi e tutela della sicurezza

TI(tailintensity)

Figura 1 - Danno al DNA (TI) e vitalità (%) in cellule A549 trattate per 4 ore con concentrazioni scalari di TiO₂. Risultati espressi come media ± ES. (* p < 0,05 ANOVA (Dunnet post-hoc test): trattamento vs. controllo negativo).

Figura 2 - Immagine caratteristica di una cellula ghost, probabilmente in apoptosi.

Nei preparati per il test della cometa ottenuti saggiando concentrazioni di ZnO pari a 50, 25 e 12,5 µg/cm² le cellule A549 si presentavano con il DNA fortemente frammentato, nella quasi totalità classificabili come cellule ghost (Figura 2), indice questo di una possibile atti-vità necrotica/apoptotica dello ZnO. Le successive prove sono state pertanto condotte sag-giando concentrazioni di ZnO inferiori pari a 10, 5 e 2,5 µg/cm².

I risultati del test della cometa (Figura 3) mostrano, per tutte le concentrazioni testate, un incremento dei valori di TI con il raggiungimento della significatività statistica da parte della concentrazione più elevata. Anche nel caso dello ZnO si osserva che l’incremento del danno al DNA risulta significativamente dipendente dalla concentrazione (r = 0,788, p = 0,020).

*

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00

0,00 2,50 5,00 7,50 10,00 12,50

C. neg C. pos 10.00 5.00 2.50

vitalità %

TI (tail intensity)

μg/cm2 ZnO % vitalità

Figura 3 - Danno al DNA (TI) e vitalità (%) in cellule A549 trattate per 4 ore con concentrazioni scalari di ZnO.

Risultati espressi come media ± ES. * p < 0,05 ANOVA (Dunnet post-hoc test): trattamento vs. controllo negativo.

La CONTARP tra rischi lavorativi e tutela della sicurezza

0,00 25,00 50,00 75,00 100,00

0,000 1,000 2,000 3,000 4,000

C. neg. C. pos. dpa<0.25 0.25<dpa<1.0 dpa>1.0

Vitalità %

TI (tail intensity)

TI % vitalità

Figura 4 - Danno al DNA (TI) e vitalità (%) in cellule A549 trattate per 4 ore con 200 Leq/ml di diverse frazioni di particolato raccolto ( dpa<0,25 μm, 0,25 μm<dpa<1,0 μm, dpa>1,0 μm) durante la fase di ossitaglio dell’acciaio ferritico. Risultati espressi come media ± ES.

Settore metallurgico: fase di ossitaglio acciao INOX

In relazione alla quantità di materiale recuperato dai campionamenti, il test della cometa è stato eseguito come prova singola su tutte le frazioni raccolte nell’ossitaglio dell’acciaio ferritico e in sole 2 frazioni (dpa < 0,25 µm e 0,25 µm < dpa < 1,00 µm) relative all’ossita-glio dell’acciaio austenitico. In Figura 4 vengono mostrati i dati relativi all’ossitaall’ossita-glio dell’acciaio ferritico. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata tra i valori della TI dopo trattamento di cellule A549 con i campioni in analisi e il controllo negativo. In Figura 4 vengono mostrati anche i valori di vitalità % che risultano inferiori al 50% per il particolato di dimensioni comprese tra 0,25 e 1,00 µm.

In Figura 5 vengono mostrati i dati relativi all’ossitaglio dell’acciaio austenitico. Anche in questo caso non sono emerse differenze statisticamente significative tra i valori di TI osser-vati dopo trattamento di cellule A549 con i campioni in analisi e il controllo negativo.

Analogamente lo studio della correlazione tra parametri di danno al DNA e granulometria del particolato non ha evidenziato significatività. Una percentuale di vitalità estremamente bassa (pari al 52,30 %) viene osservata dopo trattamento delle cellule con particolato di dimensioni comprese tra 0,25 e 1 µm.

3.2. Valutazione della genotossicità: test del micronucleo Escavazione in sottosuolo

I dati relativi alla valutazione della genotossicità dei particolati raccolti nel campionamento condotto durante le operazioni di scavo della galleria sono mostrati nella Figura 6.

0,00

C. neg. C. pos. dpa<0.25 0.25<dpa<1.0 dpa>1.0

Vitalità %

TI (tail intensity)

TI % vitalità

nd

Figura 5 - Danno al DNA (TI) e vitalità (%) in cellule A549 trattate per 4 ore con 200 Leq/ml di diverse frazioni di particolato raccolto ( dpa<0,25 μm, 0,25 μm<dpa<1,0 μm, dpa>1,0 μm) durante l’ossitaglio dell’acciaio austenitico. Risultati espressi come media ± ES.

0

Figura 6 - Frequenza di micronuclei (MN) in 1000 cellule binucleate in cellule A549 trattate con particolato rac-colto nel secondo campionamento. Risultati espressi come media ± ES. * p < 0,05 ANOVA (Dunnet post-hoc test): trattamento vs. controllo negativo.

La CONTARP tra rischi lavorativi e tutela della sicurezza

0 2 4 6 8 10 12 14 16

MN/1000 cellule binucleate

acciao ferritico acciaio austenitico

Figura 7 - Frequenza di micronuclei (MN) in 1000 cellule binucleate in cellule A549 trattate con particolato rac-colto durante l’ossitaglio dell’acciaio ferritico e austenitico. Risultati espressi come media ± ES.

I valori medi (±ES) della frequenza dei MN mostrano che solo il particolato a granulome-tria più fine ha indotto effetti genotossici e che la significatività statistica nei confronti del controllo negativo viene raggiunta solo per la frazione sub-micronica (< 0,25 µm). La fre-quenza di MN valutata in cellule A549 trattate con tale frazione risulta essere inoltre signi-ficativamente più elevata rispetto a quanto osservato per tutte le altre frazioni allo studio ad eccezione della frazione con valori di dpa compresi tra 0,5 µm e 0,25 µm. L’analisi della correlazione conferma ulteriormente che l’attività genotossica è strettamente dipendente dalle dimensioni del particolato (r = 0,705; p = 0,01).

Settore metallurgico: fase di ossitaglio acciao INOX

In Figura 7 sono mostrati i risultati del test del MN condotto utilizzando le diverse frazioni di particolato raccolte durante l’ossitaglio dei due tipi di acciaio inox.

Nessuna delle classi granulometriche di particolato raccolto durante la fase dell’ossitaglio dell’acciaio ferritico è risultata in grado di indurre, in maniera statisticamente significativa, la formazione di MN in cellule A549. Inoltre i valori medi del NDI relativi a cellule A549 trattate con le 3 frazioni di particolato sono risultati perfettamente sovrapponibili ai valori di NDI del controllo negativo.

I valori medi (±DS) della frequenza dei MN dopo trattamento delle cellule A549 con il par-ticolato racconto durante l’ossitaglio dell’acciaio austenitico, mostrano che il trattamento con le frazioni di particolato a granulometria più fine (dpa < 1,00 µm) ha causato un aumento statisticamente significativo della frequenza di MN rispetto a quanto osservato per il controllo negativo. L’analisi della correlazione conferma che l’attività genotossica è inversamente correlata alle dimensioni del particolato.

controllo negativo controllo positivo dpa<0,25 μm 0,25μm <dpa<1,00 μm dpa>1,00 μm

4. CONCLUSIONI

Dall’analisi dei risultati ottenuti si evince che il test della cometa condotto in vitro utiliz-zando cellule polmonari umane (A549), è in grado di evidenziare l’azione di genotossica di nanomateriali, come TiO₂ e ZnO, mentre risulta meno sensibile nell’evidenziare l’azione genotossica di materiali sub-micrometrici raccolti nei comparti lavorativi.

I campioni raccolti durante le operazioni di escavazione in sottosuolo sono risultati privi di attività citotossica, mentre le due frazioni a granulometria più fine hanno mostrato al test del MN una evidente azione genotossica che non sembra essere posseduta dalle frazioni a granulometria più elevata.

I campioni relativi ai monitoraggio condotti nel settore metallurgico, hanno mostrato, relativa-mente ai materiali raccolti durante l’ossitaglio dell’acciaio ferritico, che nessuna delle frazioni analizzate possedeva attività citotossica o genotossica nei confronti delle cellule polmonari A549. Anche le polveri raccolte durante la fase di ossitaglio dell’acciaio austenitico sono risul-tate prive di attività citotossica. Relativamente alla genotossicità i due test applicati hanno for-nito risultati diversi. Infatti, mentre tutte le frazione di particolato raccolto durante l’ossitaglio dell’acciaio austenitico risultavano non genotossiche al test della cometa, le due frazioni a gra-nulometria più fine mostravano una evidente azione genotossica al test del MN. Ciò è proba-bilmente dovuto alla necessità, affinché in particolato raggiunga il nucleo, che le cellule com-piano almeno una divisione mitotica durante l’esposizione al composto in studio. È inoltre importante osservare come l’acciaio austenitico contenga una percentuale di Ni, non presente nell’acciaio ferritico; tale elemento potrebbe essere la causa della genotossicità osservata.

Sulla scorta di quanto osservato in due ambienti lavorativi differenti, si può pertanto con-cludere che il sistema di campionamento di particelle sub-microniche utilizzato risulta effi-ciente e che tra i test di genotossicità quello che risulta maggiormente sensibile all’azione del particolato è il test del micronucleo. Tale test, pertanto, eseguito su cellule polmonari umane con le metodiche procedurali apportate, si conferma applicabile alla valutazione dei rischi genotossici conseguenti ad una possibile inalazione di xenobiotici presenti negli ambienti di lavoro in esame.

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