STRESS OSSIDATIVO

Alcuni radicali sono prodotti fisiologicamente dall’organismo (bio-radicali) e sono essenziali alla vita, essendo coinvolti nella catalisi enzimatica e in processi importanti che vanno dalla regolazione dell’embriogenesi al funzionamento delle cellule neuronali:

Anche O2- ha il ruolo di molecola segnale nei processi proliferativi

Il radicale gassoso ossido nitrico (NO•) è una molecola utilizzata come messaggero in un’incredibile varietà di processi fisiologici quali la regolazione del tono vascolare, le difese immunitarie, la comunicazione cellula-cellula, l’adesione, l’apprendimento e la memoria.

Una volta si riteneva che queste molecole fossero un prodotto secondario di reazioni normalmente svolte dall’organismo e che la loro azione fosse esclusivamente dannosa per le cellule, oggi si ritiene che abbiano un loro ruolo nella modulazione di funzioni cellulari critiche e che solo in seguito ad un eccessivo aumento dovuto ad uno sbilancia-mento tra la loro produzione e smaltisbilancia-mento possano essere considerati tra le cause di una varietà di eventi patologici e disordini neuronali quali l’Alzheimer, il Parkinson, non-chè del naturale processo diinvecchiamento.

Una delle definizioni più comuni dello stress ossidativo è quella dello sbilanciamento fra la normale e fisiologica produzione di radicali e specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto da parte della cellula e la presenza di antiossidanti endogeni.

Sia i ROS sia gli RNS rientrano in un sistema di equilibrio bilanciato tra ossidanti/antiossidanti che permette di mantenere l’omeostasi cellulare.

l’O2- ANIONE SUPERPEROSSIDO è prodotto enzimaticamente in numerosi proces-si cellulari, ma anche non-enzimaticamente e in grossa quantità (circa 0,5 mMoli al secondo) durante la produzione di ATP nel metabolismo aerobico dei mitocondri.

Tuttavia, la concentrazione intracellulare di O2- è mantenuta a livelli sub-nanomolari dall’enzima SOD.

Questo enzima, infatti, in alcuni tessuti, come fegato e cervello, raggiunge concen-trazioni intracellulari elevate (5-10 mM) ed esiste una forma specializzata nei mito-condri (Mn-SOD), mentre in altri comparti è presente in concentrazioni decisamente minori (ad esempio, nei fluidi extracellulari). La SOD non detossifica l’O2-, ma lo trasforma in un ossidante, l’acqua ossigenata, e questo ne garantisce le funzioni di segnale redox. Il livello di H2O2 derivata dall’O2- e da quella prodotta nel metaboli-smo ossidativo delle ammine, è regolato, a sua volta, da enzimi ad attività catalasica che, trasformandola ad acqua, ne mantengono la concentrazione a livelli sub-micro-molari. Tuttavia, le concentrazioni di O2- e H2O2 possono aumentare di diversi ordini di grandezza nell’intorno di un tessuto esposto ad uno stress infiammatorio o per attivazione di cellule predisposte alla produzione di radicali (ad esempio, granu-lociti, macrofagi, microglia, endotelio).

Radicale ossidrile: OH•

La tossicità dell’acqua ossigenata, ampiamente dimostrata soprattutto per il siste-ma nervoso, solitamente non è imputabile ad un effetto diretto della stessa, tranne nel caso di eccessi probabilmente non fisiologici. L’H2O2 è il precursore infatti di un radicale ad alto potere ossidante responsabile di danni ai tessuti: il radicale ossi-drile (OH•) che si forma dalla reazione tra il ferro bivalente e il perossido di idroge-no attraverso la reazione di Fenton Anche il rame (Cu) può reagire con l’H2O2 per formare OH•

OSSIGENOSINGOLETTO1 O2 Ossido nitrico: NO•

L’NO è una sostanza abbastanza ubiquitaria prodotta a partire dall’amminoacido L-arginina in una reazione catalizzata dall’enzima ossido nitrico sintetasi Quest’ultimo esi-ste in numerose isoforme,

NOS neuronale (detta NOS 1)

NOS inducibile (detta i NOS o NOS 2) NOS endoteliale ( detta e NOS O NOS 3)

alcune sono costitutive Ca++-dipendenti, (cellule endoteliali, piastrine, sistema nervo-so), altre inducibili Ca++-indipendente e in grado di produrre livelli micromolari di NO•. La sintesi di questo enzima viene attivata in quasi tutti i tessuti durante la difesa dalle infezioni o per gravi traumi come nell’ischemia e nell’ipossia e, in generale, in tutte le condizioni infiammatorie.

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NO è un gas diffusibile ad emivita brevissima dell’ordine di secondi in grado di diffon-dere attraverso le membrane e di reagire con una varità di bersagli:

1. modulare l’attività della guanilil-ciclasi che porta alla formazione del II messaggero cGMP (nella muscolatura liscia cGMP causa dilatazione)

2. reagisce con 02 in soluzione acquosa producendo ioni nitrati (NO3-) e nitriti NO2-3. in presenza di ione superperossido O2- l NO da luogo a perossinitrito (ONOO)

spe-cie chimica molto tossica

Nei sistemi biologici, l’NO agisce come un importante messaggero intra- ed inter-cellu-lare regolando numerosissime funzioni, in primis quella dell’endotelio vascointer-cellu-lare Infatti, in seguito ad adeguata stimolazione (meccanica o chimica), le cellule endoteliali produ-cono l’NO che, in parte, diffonde nel compartimento ematico, riducendo l’aggregabilità delle piastrine e l’adesività dei leucociti alle pareti dei vasi sanguigni, e, in parte, rag-giunge la sottostante muscolatura liscia vascolare inducendone il rilasciamento. I con-seguenti effetti anti-aggreganti, anti-infiammatori ed anti-ipertensivi sono ritenuti di grande importanza nella prevenzione dell’aterosclerosi. D’altronde, i famosi nitriti este-ri e la stessa nitrogliceeste-rina sublinguale, ampiamente usati come anti-anginosi decenni prima della “scoperta” dell’NO, sono, in realtà, dei “donatori” di questo mediatore ed è relativamente recente la messa a punto delle nitro-aspirine, derivati “nitrati”

dell’acido acetilsalicilico in grado di rilasciare NO a livello periferico Rimanendo nell’ambito della farmacologia cardiovascolare, giova anche sottolineare che il sildena-fil agisce “prolungando” la durata d’azione dell’NO a livello dei corpi cavernosi del pene, contribuendo in questo modo a migliorare la funzione erettile, variamente com-promessa nell’impotenza maschile

Oltre all’effetto primario sull’endotelio, all’NO è riconosciuto un ruolo determinante di mediatore biochimico in numerose funzioni, a livello cerebrale (es. controllo dell’apprendimento e della memoria), gastrointestinale (modulazione delle secrezioni e della motilità), respiratorio (modulazione del tono della muscolatura liscia bronchiale), renale (autoregolazione del flusso ematico), e così via.

All’NO, in quanto radicale, è attribuita un’importante funzione di difesa nei confronti delle infezioni batteriche e, probabilmente, nel controllo della crescita dei tumori. A questo proposito occorre aggiungere, comunque, che condizioni di aumentato stress ossidativo - es. eccessiva produzione di anione superossido - comportano la conversione dell’NO in perossinitrito, una forma radicalica molto tossica.

Figura 4

Dopo che ha agito, l’NO viene trasformato in una serie di derivati, quali i nitriti ed i nitra-ti, che si accumulano, in funzione della quantità del mediatore primario prodotto, nel san-gue ed in altri fluidi extracellulari per poi essere definitivamente allontanati dall’organismo attraverso le urine. Infatti, numerosi studi sperimentali e clinici hanno documentato che i livelli plasmatici ed urinari di nitriti/nitrati correlano abbastanza bene con la produzione

“endogena” di NO.

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Figura 5

La produzione cellulare di ROS è legata sia a reazioni enzimatiche che non enzimatiche Qualsiasi sistema proteico o enzimatico in grado di trasferire elettroni può portare alla formazione di ROS.

Nonostante la produzione di ROS sia generalmente dovuta ad attività metaboliche endogene (mitocondri, perossisomi, lipossigenasi, NADPH ossidasi, citocromo P450), stimoli esterni:

Questi comprendono citochine legate a processi infiammatori, radiazioni ultraviolette (UV), radiazioni ionizzanti, agenti chemioterapici, ormoni, tossine ambientali, iperter-mia e anche fattori di crescita (Finkel e Holbrook, 2000), nonché metalli, xenobiotici ed altre sostanze esogene. Gli xenobiotici innescano cicli redox ( es. disaccoppianti delle monossigenasi, o deviano elettroni dalla catena di trasporto degli elettroninei mitocon-dri)

Mitocondri

la maggior sede di produzione di ROS. La sintesi di superossido avviene in due punti precisi della catena mitocondriale: il complesso I (NADH deidrogenasi) ed il complesso III (ubiquinone-citocromo c reduttasi); in condizioni normali il complesso III è il prin-cipale sito di produzione dei ROS La sintesi di ROS nei mitocondri coinvolge circa l’1-2% di ossigeno consumato

Reticolo endoplasmatico liscio (ER)

contiene enzimi che catalizzano una serie di reazioni di detossificazione di farmaci lipo-solubili e di altri prodotti endogeni. La maggior parte degli studi sono rivolti alla fami-glia dei citocromi P450 in grado di ossidare acidi grassi insaturi e xenobiotici e di ridur-re l’ossigeno molecolaridur-re per produrridur-re superossido e/o acqua ossigenata

Le membrane nucleari contengono citocromo ossidasi e sistemi di trasporto degli elet-troni che sembrano simili a quelli dell’ER, ma la cui funzione non è ancora ben nota.

Si suppone che la fuga degli elettroni da questi sistemi enzimatici possa portare alla

for-Figura 6: Produzione a livello dei tessuti dei ROS e RNS

mazione di ROS responsabili in vivo dei danni al DNA

Anche i Perossisomi sono una importante sede di produzione di acqua ossigenata cellu-lare totale e contengono enzimi responsabili della generazione del perossido di idroge-no (ad es: glicolato ossidasi, l’urato ossidasi, Damiidroge-no acido ossidasi). La catalasi dei perossisomi utilizza il H2O2 prodotto da questi enzimi per ossidare numerosi altri sub-strati attraverso reazioni perossidative. Queste reazioni sono particolarmente impor-tanti nel fegato e nel rene, dove i perossisomi provvedono alla detossificazione di com-posti tossici (incluso l’etanolo) che entrano in circolo. Inoltre nei perossisomi si attua la _-ossidazione degli acidi grassi (nei mammiferi la _-ossidazione avviene nei mitocondri e nei perossisomi)

In aggiunta alle ossidasi intracellulari associate alla membrana, alcuni enzimi solubili come la xantina ossidasi, l’aldeide ossidasi, la flavoproteina deidrogenasi etc., possono generare ROS durante il ciclo catalitico. Fra questi enzimi la xantina ossidasi (che si forma dalla xantina deidrogenasi in seguito ad esposizione all’ipossia dei tessuti è ampiamente studiata per la generazione di superossido.

L’ossidasi di membrana meglio caratterizzata è rappresentata dalla NADPH ossidasi dei fagociti che svolge una importante funzione di difesa dell’ospite contro l’attacco dei microrganismi. Durante la fagocitosi la membrana plasmatica si introflette formando la parete delle vescicole fagocitiche e quella che prima era la superficie esterna della mem-brana ora, nelle vescicole, rappresenta la superficie interna. Questo scatena all’interno il rilascio di superossido e dei suoi metaboliti reattivi per l’attività microbicida.

I macrofagi e i neutrofili mostrano una varietà di recettori di superficie,cheli rendono in grado di riconoscere e di inglobare i patogeni, fra i quali sono inclusi recettori di riconoscimento di schemi come i TLR. Inoltre, i macrofagi hanno recettori di superficie per la porzione Fc degli anticorpi prodotti dal sistema immunitario adattativo, oltre che per il componente C3b del complemento. L’attacco di un ligando ad uno di questi recettori induce polimerizzazione di actina al sito di attacco del patogeno, facendo cir-condare il patogeno dalla membrana plasmatica del fagocita e facendolo inglobare in un grosso fagosoma avvolto da membrana

Una volta che il patogeno è stato fagocitato, il macrofago o il neutrofIlo scatenano un arsenale impressionante di armi per ucciderlo. TI fagosoma viene acidificato e si fonde con i lisosomi, che contengono lisozima e idrolasi acideche possono degradare le pareti cellulari e le proteine del batterio. I lisosomi contengono anche difensine, che compon-gono il 15%circa delle proteine totali dei neutrofili. Inoltre, i fagociti assemblano un complesso NADPH ossidasi sulla membrana del fagosoma che catalizza la produzione di una serie di composti derivati dall’ossigeno altamente tossici, che comprendono superos-sido (02-), ipoclorito(HOCl, l’ingrediente attivo della candeggina), acqua ossigenata, radicali ossidrilici e ossido nitrico (NO). La produzione di questi composti tossici è accompagnata da un aumento transitorio del consumo di ossigeno da parte delle cellule, chiamato respiratory burst (esplosione respiratoria).Mentre i macrofagi in genere sopravvivono i neutrofIli in genere muoiono. I Neutrofili morti o morenti sono uno dei componenti principali del pus che si forma nelle ferite infettate acutamente. La tinta ver-dastra caratteristica del pus è dovuta all’abbondanza nei neutrofili dell’enzima conte-nente rame mieloperossidasi che è uno dei componenti attivi nell’esplosione respiratoria.

L’autossidazione di piccole molecole come la dopamina, l’epinefrina, le flavine e gli idrochinoni, possono essere un’importante fonte di ROS Nonostante non si conosca il ruolo delle autossidazioni di queste piccole molecole legate al fattore della crescita e/o alla mediazione delle citochine, tali reazioni possono indurre stress ossidativo e alterare lo stato redox della cellula. Ad esempio il manganese (Mn) accelera l’ossidazione delle

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catecolamine con la produzione di chinoni, semichinoni e radicali dell’ossigeno Produzione dei RNS

Le isoforme neuronale ed endoteliali sono NO-sintasi costitutive calcio-dipendente:

sono attivate solo quando nella cellula aumenta la concentrazione dello ione calcio.

NO prodotta nelle cellule endoteliali, diffonde nelle cellule muscolari vicine causandone rilassamento e nel lume del vaso inibendo l’aggregazione piastrinica.

Nel SNC regola diverse funzioni sinaptiche

La iNOS inducibile presente nei macrofagi polimorfonucleati invece genera NO indi-pendentemente dalla concentrazione del catione e viene indotta a livelli trascrizionali solo in seguito a stimoli specifici quali citochine (al loro volta attive in presenza di pro-dotti di degradazione batterica a sottolineare un ruolo nelle risposte immunitarie da parte delle cellule che esprimono questa isoforma) per cui si parla di forma inducibile dell’enzima. Nelle cellule a riposo vi è poco enzima, quando la cellula viene attivata da stimoli vari (es infiammazione, presenza di batteri) essa viene “indotta” a produrre molta NO-sintasi. L’alta concentrazione di enzima porta alla produzione di grosse quantità di NO che uccidono il batterio (e lo stesso neutrofilo).