Considerazioni statistiche

2.5.15.1 Raggiungere 200 spermatozoi per replicato nelle griglie della camera di Neubauer modificata

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Se ci sono 10 spermatozoi per campo visivo ad alto ingrandimento HPF della

preparazione a fresco, ce ne sarebbero 2,5/nl e 250/griglia centrale. Diluendo il campione 1+1 (1 : 2) si ridurrebbe il fondo e il numero di spermatozoi a circa 125 per griglia; valutando una seconda griglia il numero aumenterebbe a circa 250, che è sufficiente per un errore di campionamento accettabile.

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Queste concentrazioni calcolate sono solo stime approssimative perché vengo-no contati pochi spermatozoi e anche i volumi sovengo-no piuttosto inesatti. Le con-centrazioni stimate dai preparati non diluiti possono essere tra il 30% e il 130%

delle concentrazioni derivate dai campioni diluiti nelle camere di conteggio.

2.5.15.2 Errori di campionamento stimati e limiti di confidenza secondo il numero totale di spermatozoi contati

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Contando troppo pochi spermatozoi si ottiene un risultato incerto, che può avere conseguenze per la diagnosi e la terapia. Questo può essere inevitabile quando gli spermatozoi vengono raccolti per scopi terapeutici e il loro numero è basso.

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Quando il volume del liquido seminale è basso e si contano meno spermatozoi di

quelli raccomandati, la precisione dei valori ottenuti sarà notevolmente ridotta.

Se vengono contati meno di 200 spermatozoi per replicato, riportare l’errore di campionamento come indicato nella Tabella 2.16.

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L’errore di campionamento è una misura dell’errore previsto nei risultati in base al numero di osservazioni. L’intervallo di confidenza al 95% fornisce i limiti supe-riore e infesupe-riore dell’intervallo in cui si trova il vero valore della popolazione, in base al numero di osservazioni nell’aliquota studiata.

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

2.5.15.3 Errori nella stima delle percentuali

Quanto sia certa la stima di una percentuale dipende non solo dal numero (N) di spermatozoi contati, ma anche dalla percentuale vera ma sconosciuta (p) (distribu-zione binomiale). L’errore standard approssimativo (SE) è √((p(100-p))/N) per per-centuali tra 20 e 80. Al di fuori di questo intervallo, un metodo più appropriato da usare è la trasformazione angolare (arco sin radice quadrata), z = sin^-1√(p/100), con una deviazione standard di 1/(2√N) radianti, che dipende solo dal numero di sper-matozoi contati e non dalla vera percentuale.

2. Esame di base

Tabella 2.16 Errori di campionamento approssimati (%) e limiti dell’intervallo di confidenza al 95% secondo il numero totale di spermatozoi contati

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

2.5.15.4 Confronto delle percentuali dei replicati

Una differenza tra i replicati più grande di quella accettabile suggerisce che ci sono stati un conteggio errato o degli errori di pipettaggio, oppure che le cellule non sono state mescolate bene, con una distribuzione non casuale nella camera o sul vetrino. Con questi valori di cut-off dell’intervallo di confidenza del 95%, circa il 5% dei replicati sarà fuori dai limiti solo per caso. I limiti di confidenza binomiali esatti possono ora essere generati dal computer; questo manuale li utilizza, arro-tondati per accertare che le probabilità ipotizzate, per esempio di “meno del 5%”, siano corrette.

2.5.15.5 Importanza di contare un numero sufficiente di spermatozoi

Per ridurre l’influenza della variazione casuale, è importante che le valutazioni siano basate su un numero sufficiente di osservazioni (preferibilmente un totale di alme-no 400, da conteggi di replicati di circa 200) (Tabella 2.16, p. 78). La precisione della stima del numero di spermatozoi dipende dal numero di spermatozoi contati. In una distribuzione di Poisson, l’errore standard (SE) di un conteggio (N) è la sua radice quadrata (√N) e l’intervallo di confidenza (CI) al 95% per il numero di spermatozoi nel volume di liquido seminale è circa N ± 1,96x√N (o N ± circa 2x√N).

Se si contano 100 spermatozoi, il SE è 10 (√100) e il CI 95% è 80-120 (100 ± 20, o 20%).

Se si contano 200 spermatozoi, il SE è 14 (√200) e il CI 95% è 172-228 (200 ± 28, o 14%). Se si contano 400 spermatozoi, il SE è 20 (√400) e il CI 95% è 360-440 (400 ± 40, o 10%).

Va notato che con un cut-off del 4% per le forme normali, sarebbe necessario va-lutare più di 1.500 spermatozoi per poter affermare che il 3% e il 5% sono diversi.

2.5.15.6 Nozioni statistiche alla base dei confronti dei conteggi di replicati

La differenza tra conteggi indipendenti dovrebbe essere zero, con un SE uguale alla radice quadrata della somma dei due conteggi. Così (N1-N2)/(√[N1+N2]) dovrebbe essere < 1,96 solo per caso per un CI al 95%.

Se la differenza tra i conteggi è inferiore o uguale a quella indicata nella Tabella 2.3, p. 33 per la somma data, le stime sono accettate e la concentrazione è calcolata dalla loro media (Tabella 2.4, p. 35).

Differenze maggiori suggeriscono che si è verificato un conteggio errato, che ci sono stati errori di pipettaggio o che le cellule non sono state ben mescolate, con una conseguente distribuzione non casuale nella camera o sul vetrino.

Quando la differenza tra i conteggi è maggiore di quella accettabile, scartare i pri-mi due valori e preparare e valutare due nuove diluizioni di liquido sepri-minale (non contare un terzo campione e prendere la media dei tre valori, oppure la media dei due valori più vicini).

Questo vale per la conta degli spermatozoi e delle cellule positive alla perossidasi (Sezione 3.4.1.1, p. 108). Per le cellule CD45-positive (Sezione 3.4.2, p. 113) e le cellule germinali immature (Sezione 3.6, p. 118), i preparati colorati dovrebbero essere rivalutati.

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Con questi valori di cut-off del CI al 95%, circa il 5% dei replicati sarà fuori dai limiti solo per caso.

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 90-93)