Test dello stress ossidativo e delle specie reattive dell’ossigeno nel liquido seminale

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 153-157)

essenziali al concepimento

4.1 Test dello stress ossidativo e delle specie reattive dell’ossigeno nel liquido seminale

4.1.1 Premessa

L’ipotesi che uno squilibrio nelle reazioni di riduzione-ossidazione (REDOX) nel tratto maschile o nelle secrezioni seminali possa essere dannoso per la fertilità è stata suggerita per decenni [279-283]. È generalmente accettato che le specie reattive dell’ossigeno (ROS), prodotte dai leucociti, siano alla base dei loro effetti deleteri quando sono presenti ad alto livello nel liquido seminale (Sezione 3.4, p. 108). Non ci sono ancora evidenze forti che dimostrino l’associazione fra le reazioni REDOX e gli esiti del concepimento naturale o assistito. Tuttavia, è generalmente accettato che lo stress ossidativo sia probabilmente un importante modulatore della funzione spermatica umana e dei risultati del concepimento [284]. Poiché una conseguenza dello stress ossidativo è il danno al DNA nemaspermico (Sezione 3.2, p. 86), questo è il risultato più spesso misurato, ma esistono diversi altri metodi di ricerca che pos-sono essere utilizzati per esaminare più direttamente l’equilibrio di antiossidanti e ROS. Da un punto di vista clinico-diagnostico, quest’insieme di test dovrebbe essere usato e interpretato con cautela fino a quando non ci saranno evidenze maggior-mente conclusive sulla sua rilevanza diagnostica. Le procedure qui presentate sono state ampiamente utilizzate nella ricerca andrologica, così come in alcuni laboratori di diagnostica andrologica clinica e riproduzione assistita. I test che possono essere utilizzati per valutare l’equilibrio REDOX o ROS variano sia nel metodo che nel tipo di ROS che rilevano.

ne2. Esame di base 3. Esame esteso 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi4. Esamiavanzati

4.1.2 Luminol

Questo metodo si basa sulla risposta chemiluminescente del luminol quando reagi-sce con un radicale libero. Questa risposta può essere misurata con la luminome-tria e il numero di unità di luce relativa (RLU) per milione di spermatozoi calcolato.

4.1.2.1 Procedura

Adattata da Dias, 2021 [285].

1. Preparare 100 mM di luminol (5-ammino-2,3-diidro-1,4-ftalazinedione) soluzione stock in 10 ml di dimetilsolfossido (DMSO) pesando 177,1 mg di luminol in una vial di polistirene. Avvolgere la vial in un foglio di alluminio, poiché questa soluzione è sensibile alla luce. La soluzione dovrebbe essere stabile a temperatura ambiente, ma può anche essere conservata in frigorifero.

2. Soluzioni “sonda” di lavoro: 5 mM di luminol in DMSO, per diluizione di 20 µl di soluzione stock di luminol in 380 µl di DMSO. Questa dovrebbe essere preparata immediatamente prima dell’uso (è stabile solo per 24 ore). Dev’essere protetta dalla luce.

3. L’eiaculato dovrebbe essere lasciato liquefare prima della misurazione (meno di 30 minuti ma, in conformità con i metodi di esame dell’eiaculato di base dell’OMS, non più di 1 ora).

4. Le misurazioni in luminometria dovrebbero essere eseguite in duplicato (come minimo).

Per ogni eiaculato si prepara una singola vial mescolando 390 µl dell’eiaculato con 10 µl della soluzione “sonda” di lavoro. Mescolare con il vortex per 5 secondi prima di dividere in aliquote in almeno due vials di misurazione (o pozzetti in una piastra).

5. In tutti i set di analisi dovrebbero esserci:

spazi vuoti di DPBS, p. 228 o solo mezzo;

un controllo negativo di 390 µl di DPBS o mezzo + 10 µl di “sonda”;

controlli positivi, entrambi con aggiunta di 50 µl di perossido di idrogeno (30%) + 10 µl di “sonda” di:

eiaculato (340 µl) o

DPBS o mezzo (340 µl).

6. I dati dovrebbero essere presi su un certo numero di letture, equamente distan-ziate e nell’ordine di ogni analita, uno per volta e poi ripetute, secondo il tipo di strumento, e ne andrebbe calcolata la media.

7. I controlli positivi possono essere utilizzati per valutare la sensibilità del test nell’impostazione specifica, tramite serie di diluizioni, e anche per confermare che in qualsiasi set di test avvenga il rilevamento di un risultato significativo.

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8. I dati sono normalizzati sottraendo il risultato medio del campione dal controllo medio negativo. Questo può essere corretto per spermatozoo dividendo per la concentrazione di spermatozoi in milioni per ml, ma non è chiaro al momento se i risultati per spermatozoo abbiano più significato o meno che per campione, quindi entrambi i risultati potrebbero essere riportati.

4.1.2.2 Problemi

I luminometri non sono generalmente accreditati per la diagnostica in vitro, es-sendo pensati solo per la ricerca.

Il design degli strumenti (come il volume del campione) e quindi la calibrazione, la sensibilità, il range dinamico e anche le unità utilizzate variano molto.

A causa della variazione descritta tra le macchine e le metodologie e della bassa qualità degli studi per la prognosi, non ci sono valori di riferimento concordati.

Le forze di taglio/miscelazione cambiano il segnale, quindi i risultati sono molto sensibili alla manipolazione del campione e al momento della misurazione.

Il luminol è sensibile al pH, ai cambiamenti di temperatura e all’interferenza delle sostanze chimiche che spesso variano tra gli eiaculati, come l’acido ascorbico (che diminuisce il segnale) o le molecole contenenti tioli (che aumentano i risultati) e i livelli di altre proteine presenti.

4.1.3 Potenziale di ossido-riduzione

Questo metodo si basa sulla misurazione diretta dell’equilibrio REDOX di un cam-pione per via elettrochimica. Essendo una misura integrante del camcam-pione combi-nato che richiede una manipolazione minima, quindi abbastanza standardizzabile, è oggi argomento di molte ricerche nella subfertilità. Attualmente, esiste una sola macchina sul mercato ed è protetta da un brevetto. Utilizza sensori monouso per la misurazione. Nell’uso si dovrebbero seguire i più recenti protocolli del produttore, che non sono argomento di discussione in questo manuale.

4.1.3.1 Problemi

Manca una forte base di evidenza pubblicata per il test; attualmente è ancora con-siderato un test di ricerca, fino a quando non emergeranno dati conclusivi relativi all’esito riproduttivo.

La viscosità del campione e la scarsa fluidificazione possono ostacolare il flusso del campione e quindi il riempimento della camera di riferimento.

Come per tutte le analisi del liquido seminale, il tempo di analisi dopo l’eiaculazio-ne dovrebbe essere standardizzato.

4.1.4 Capacità antiossidante totale

Questa metodica è utilizzata per valutare la capacità totale dell’eiaculato di bilancia-re qualsiasi stbilancia-ress ossidativo. Si tratta quindi di quantificabilancia-re all’interno del plasma seminale la capacità degli enzimi e dei sistemi antiossidanti, così come qualsiasi

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antiossidante derivato da cibo o altro che finisce nel plasma seminale (ma non negli spermatozoi; questi vengono rimossi per centrifugazione). Nel test, gli antiossidanti presenti inibiscono l’ossidazione dell’acido 2’-azinobis-(3-etil-benztiazolin solfonico) (ABTS) da parte di un radicale cationico. Questo è stato sviluppato per essere usa-to, ed è effettivamente usausa-to, in molti fluidi corporei, e non è quindi specifico per il plasma seminale [286]. Trolox, un analogo della vitamina E (tocoferolo), è usato per creare un intervallo standard, quindi il test è solitamente espresso come micromoli di Trolox equivalenti. Il test viene letto con metodo colorimetrico; è perciò necessa-rio un analizzatore appropriato.

4.1.4.1 Procedura

1. A causa del suo ampio utilizzo al di là della fertilità, il test è disponibile come kit preconfezionato da un certo numero di produttori. Si devono quindi seguire le istruzioni relative a ciascun kit. È anche possibile costruire i kit a partire dagli ingredienti costitutivi acquistati separatamente.

2. L’eiaculato deve essere lasciato fluidificare completamente e poi centrifugato a 1.000 g per 15 minuti. Il plasma seminale centrifugato può quindi essere rimosso.

10 µl di questo plasma possono essere controllati per confermare l’assenza di spermatozoi. Se fossero presenti ancora degli spermatozoi, è necessario centri-fugare nuovamente.

3. Il plasma seminale centrifugato può essere diviso in aliquote e subito dopo con-gelato per analisi successive. Questo può essere vantaggioso per consentire il raggruppamento in lotti del test. La stabilità dei risultati a qualsiasi temperatura di congelamento dovrebbe essere controllata e convalidata dal laboratorio che esegue il test.

4. Nella preparazione del test per le misurazioni, tutti i componenti dovrebbero es-sere portati prima a temperatura ambiente. I componenti del test sono tutti sensi-bili alla luce, quindi la luce dovrebbe essere ridotta il più possibile – per esempio, spegnendo le luci del laboratorio – mentre il test viene preparato ed eseguito.

5. Le misurazioni dovrebbero essere eseguite in duplicato (come minimo). L’assor-banza viene letta a 750 nm.

4.1.4.2 Problemi

Esiste un’ampia letteratura, solida e chiaramente definita, per la procedura del test e degli agenti che possono influenzare i risultati nei vari sistemi [287], ma attualmente questo test – per trarre una conclusione medica sui parametri del liquido seminale maschile e sugli effetti dei ROS sulla fertilità – è ancora consi-derato come un test di ricerca, e sarà così fino a quando non emergeranno dati conclusivi relativi al risultato riproduttivo.

A causa della variazione tra gli strumenti e le metodologie e della bassa qualità delle evidenze per la prognosi, non ci sono valori di riferimento basati sulle evi-denze.

Idealmente, il test viene letto in un lettore di micropiastre a causa del numero di duplicati e standard.

4. Esamiavanzati

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