Metodo primario

Reagenti

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Fluido tubarico umano o Biggers, Whitten e Whittingham (vedere Appendice,

p. 229 per la composizione; HTF, BWW).

Figura 3.1 TUNEL test su vetrino per l’analisi della frammentazione del DNA mediante fluorescenza

I pannelli superiori mostrano spermatozoi colorati con DAPI (blu) e spermatozoi colorati con fluorescenza (verde) che evi-denziano danni al DNA e presentano un livello di danno basale; i pannelli inferiori rappresentano un controllo positivo in cui virtualmente sono rappresentati tutti gli spermatozoi colorati (blu) e quelli che presentano frammentazione del DNA sono evidenziati dalla fluorescenza verde.

Foto concesse da C. Roman-Montanana e da J. Kirkman-Brown.

CONTROLLO POSITIVO

TUNEL BASALE NORMALE

DAPI

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

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Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (vedere Appendice, p. 227

per la composizione; DPBS).

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DPBS contenente 1% di sieroalbumina bovina (BSA).

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DPBS contenente 0,1% citrato e 0,1% triton.

•

Paraformaldeide 3,7% preparata in DPBS ogni settimana.

•

3.000 U/ml-3 U/ml di nucleasi micrococcica o deossiribonucleasi ricombinante

(DNasi I) in 50 mm Tris-HCL, pH 7,5, 1 mg/ml BSA.

Procedura

1. Un’aliquota di liquido seminale, contenente almeno 2 milioni di spermatozoi (per i campioni con un basso numero di spermatozoi) ma preferibilmente 10 milioni, viene lavata due volte con un tampone (HTF o BWW, vedere Appendice, p. 228 per la composizione); per i campioni inferiori a 2 milioni si può usare, invece, la microscopia a fluorescenza e valutare la percentuale di spermatozoi TUNEL-po-sitivi, centrifugando a 500 g per 5 minuti. Per i campioni con un numero di sper-matozoi inferiore a 2 milioni, dopo la procedura di colorazione gli spersper-matozoi TUNEL-positivi possono essere valutati come riportato nella sezione TUNEL con microscopia a fluorescenza, p. 92.

2. Il pellet viene risospeso in 500 µl di paraformaldeide (3,7% preparato fresco in DPBS ogni settimana) per la fissazione a temperatura ambiente per 30 minuti.

3. Centrifugare a 500 g per 5 minuti e lavare il pellet due volte in 200 µl di DPBS contenente 1% BSA come sopra.

4. Per permeabilizzare gli spermatozoi, aggiungere 100 µl di tampone contenente citrato (0,1%) e triton (0,1%) e incubare in ghiaccio per 4 minuti.

5. Per fermare la permeabilizzazione, aggiungere 300 µl di DPBS contenente 1%

BSA e centrifugare a 500 g per 5 minuti.

6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 400 µl di DPBS contenente 1% BSA e dividere in due aliquote, rispettivamente controllo negativo (TDT-) e campione da analizzare (TDT+).

7. Un controllo positivo può essere utile per dimostrare che la procedura può ri-conoscere il DNA frammentato. In questo caso, un’altra aliquota di spermatozoi dev’essere preparata come sopra e, dopo la permeabilizzazione, incubata con nucleasi micrococcica o DNasi I ricombinante (3.000 U/ml-3 U/ml in 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 1 mg/ml BSA) per 10 minuti a 15-25°C per indurre rotture del fila-mento di DNA, prima delle procedure di marcatura.

8. Centrifugare le tre aliquote (a 500 g per 5 minuti) e risospendere come segue: a TDT- aggiungere solo il tampone contenente la sonda marcata; a TDT+ e control-lo positivo aggiungere il tampone contenente la sonda marcata e TDT (30 unità o come diversamente indicato nei kit commerciali).

9. Incubare (nel caso di sonde fluorescenti al buio) per 1 ora a 37°C.

10. Lavare due volte con 200 µl di DPBS contenente 1% BSA e risospendere in DPBS.

Il volume finale di DPBS varia a seconda del metodo usato per rivelare la son-da marcata. Quando si usa un microscopio, un piccolo volume (massimo 100 ul) dovrebbe essere usato per allestire i vetrini con un numero sufficiente di

sper-3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

matozoi da osservare al microscopio a fluorescenza o al microscopio ottico. Si dovrebbero conteggiare almeno 200 spermatozoi.

11. In caso di analisi con citometria a flusso, i campioni devono essere lavati due volte, risospesi in 500 µl di DPBS, colorati con ioduro di propidio (PI, 30 ug/ml in DPBS) o un’altra colorazione nucleare compatibile con la fluorescenza del TUNEL e incubati al buio per 10 minuti a temperatura ambiente per identificare gli eventi nucleati. Per ogni campione, devono essere registrati 8.000-10.000 eventi positivi PI all’interno della regione contenente spermatozoi (regione a forma di fiamma; R1 nella Figura 3.2 A) [174] tracciata nel diagramma a punti generato dal rilevatore frontale e late-rale di eventi cellulari (FSC/SSC), per escludere altre cellule (come cellule germina-li o leucociti che sono al di fuori della fiamma) e interferenti presenti nell’eiaculato (compresi eventi PI negativi come corpi apoptotici che possono essere presenti all’interno di R1) [174, 175]. La fluorescenza verde (relativa ai nucleotidi coniugati con la fluoresceina) e la fluorescenza rossa (eventi PI) sono rivelate rispettivamen-te dai rivelatori di banda di lunghezza d’onda 515-555 e 563-607 nm. Una regione R2 viene poi tracciata per includere tutti gli eventi PI positivi all’interno della regio-ne R1 (Figura 3.2 B, entrambi i riquadri). Una soglia per la fluorescenza della fram-mentazione del DNA (spermatozoi TUNEL-positivi) è fissata nel controllo negativo e comprende il 99% degli eventi PI positivi (Figura 3.2 C, riquadro sinistro). Questa soglia viene poi riportata nel campione in esame (Figura 3.2 C, riquadro destro) per calcolare la percentuale di eventi positivi alla fluorescenza PI e verde oltre la soglia, che rappresenta la percentuale di spermatozoi con frammentazione del DNA.

(A) La tipica regione a forma di fiamma (R1) nel diagramma a punti FSC/SSC conte-nente spermatozoi e corpi apoptotici. (B) Intorno agli eventi positivi di PI (R2) viene tracciato un riquadro, escludendo i corpi apoptotici. (C, riquadro sinistro) Controllo negativo dove è impostato un marcatore, comprendente il 99% degli eventi negativi.

(C, riquadro destro) Campione di test in cui vengono tradotti i marcatori impostati nel controllo negativo. La percentuale di spermatozoi con frammentazione del DNA si trova nel quadrante superiore destro.

Figura 3.2 Citometria a flusso per l’analisi dello ioduro di propidio e della fluorescenza verde

Per gentile concessione di Elisabetta Baldi.

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 101-104)