Valutazione dei leucociti nel liquido seminale

I leucociti, prevalentemente quelli polimorfonucleati (neutrofili), sono presenti nella maggior parte del liquido seminale umano [53, 214]. A volte possono essere diffe-renziati da spermatidi e spermatociti su uno striscio di liquido seminale colorato con Papanicolaou (Sezione 2.4.9.3, p. 47). La differenziazione si basa sulle diver-sità di colorazione e sulla dimensione e forma del nucleo [53]. Morfologicamente, i leucociti polimorfonucleati possono essere facilmente confusi con gli spermatidi multinucleati, ma si presentano di un colore bluastro, in contrasto con quello più rosato degli spermatidi [53]. Anche le dimensioni del nucleo possono aiutare nell’i-dentificazione: i nuclei dei monociti mostrano un’ampia variazione di dimensioni, da circa 7 µm per i linfociti a oltre 15 µm per i macrofagi. Queste dimensioni sono solo indicative, in quanto la degenerazione e la divisione cellulare influenzano la dimen-sione del nucleo.

Esistono molte altre differenti tecniche per quantificare la popolazione di leucociti nel liquido seminale. Poiché i granulociti perossidasi-positivi sono la tipologia pre-dominante di leucociti nel liquido seminale, il test di routine dell’attività perossidasi-ca è utile come tecniperossidasi-ca di screening iniziale [53, 215] (vedere Sezione 3.4.1.1).

I leucociti possono essere ulteriormente differenziati con analisi immunocitochimi-che più lunghe e costose rispetto ai comuni antigeni leucocitari e spermatici [98, 216] (Sezione 3.4.2, p. 113).

3.4.1.1 Colorazione della perossidasi cellulare mediante l’orto-toluidina

Questo test è rapido ed economico ed è un utile screening iniziale per i granulociti.

Principio

Tradizionalmente, i leucociti nel liquido seminale umano sono contati mediante una procedura istochimica che identifica l’enzima perossidasi, caratteristico dei granulo-citi (Figura 3.6, p. 110). Questa tecnica ha il vantaggio di essere relativamente facile da eseguire, ma non rileva:

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polimorfi attivati che hanno rilasciato i loro granuli;

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altri tipi di leucociti, come linfociti, macrofagi e monociti, che non contengono pe-rossidasi.

Il test può essere utile per distinguere i leucociti polimorfonucleati dagli spermatidi multinucleati, che sono privi di perossidasi [53]. L’analisi che segue è basata sui protocolli forniti da Nahoum e Cardozo, 1980 [217]. In commercio è disponibile un kit per questo test.

Reagenti

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Buffer fosfato, 67 mmol/l, pH 6,0: sciogliere 9,47 g di idrogeno fosfato di sodio (Na₂HPO₄) in 1.000 ml di acqua distillata H₂O e 9,08 g di diidrogeno fosfato di potassio (KH₂PO₄) in 1.000 ml di acqua distillata H₂O. Aggiungere una soluzione all’altra (circa 12 ml di soluzione di Na₂HPO₄ a 88 ml di soluzione di KH₂PO₄) fino a che il pH non è pari a 6,0.

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

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Soluzione satura di cloruro di ammonio (NH₄Cl): aggiungere 250 g di NH₄Cl a

1.000 ml di H₂O distillata.

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148 mmol/l di acido disodico etilendiamina tetra-acetico (Na₂EDTA): sciogliere 50 g/l in tampone fosfato (pH 6,0) preparato nella fase 1.

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Substrato: sciogliere 2,5 mg di o-toluidina in 10 ml di soluzione salina 0,9% (9 g/l).

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Perossido di idrogeno (H₂O₂) 30% (v/v): come acquistato.

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Soluzione di lavoro: a 9 ml di soluzione di o-toluidina aggiungere 1 ml di soluzione satura di NH₄Cl, 1 ml di 148 mmol/l Na₂EDTA e 10 µl di 30% (v/v) H₂O₂ e mescolare bene. Questa soluzione può essere usata fino a 24 ore dopo la preparazione.

Procedura

1. Miscelare accuratamente il campione di liquido seminale (vedere nota tecnica sotto).

2. Prelevare un’aliquota di 0,1 ml di liquido seminale e miscelare con 0,9 ml di solu-zione di lavoro (diluisolu-zione 1+9 (1 : 10)).

3. Miscelare con il vortex delicatamente la sospensione di spermatozoi per 10 se-condi e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. In alternativa, agitare continuamente con un sistema di dondolamento per vials.

4. Miscelare nuovamente il campione di spermatozoi prima di prelevare un’aliquota di replicato e mescolarla con la soluzione di lavoro come sopra.

Nota tecnica: miscelazione accurata del campione di liquido seminale

Prima di prelevare un’aliquota di liquido seminale per la valutazione, mescolare bene il campione nel contenitore originale, ma non così vigorosamente da creare bolle d’aria. Questo può essere ottenuto aspirando il campione 10 volte in una pipetta di plastica monouso a foro largo (circa 1,5 mm di diametro), sterile se necessario. Non miscelare con un mixer vortex ad alta velocità perché danneggia gli spermatozoi.

Valutazione del numero di cellule perossidasi-positive nelle camere dell’emocitometro 1. Dopo 20-30 minuti, miscelare nuovamente le sospensioni di liquido seminale e

riempire ogni lato di un emocitometro con una delle preparazioni del replicato.

2. Tenere l’emocitometro in posizione orizzontale per almeno 4 minuti a tempera-tura ambiente in una camera umida (per esempio, una capsula di Petri chiusa rivestita di carta da filtro imbibita d’acqua) per prevenirne l’essiccamento e per-mettere alle cellule di depositarsi.

3. Esaminare la camera, griglia per griglia, con un microscopio ottico a contrasto di fase a un ingrandimento 200x o 400x.

4. Contare almeno 200 cellule perossidasi-positive in ogni replicato, per ottenere un errore di campionamento accettabilmente basso (Tabella 2.3, p. 33). Le cellu-le perossidasi-positive risultano colorate di marrone, mentre cellu-le cellucellu-le perossi-dasi-negative non risultano colorate (Figura 3.6, p. 110).

Nota: L’Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC, 1982) ha stabilito che l’orto-toluidina dovrebbe essere considerata, ai fini pratici, a rischio cancerogeno per l’uomo. Prendere le opportune precauzioni (Sezione 8.2, p. 214).

3. Esame esteso

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5. Esaminare una camera, griglia per griglia; continuare a contare fino a quando non saranno osservate almeno 200 cellule perossidasi-positive e non sia stata esaminata una griglia completa. Il conteggio deve essere fatto per griglie com-plete; non interrompere il conteggio a metà griglia.

6. Prendere nota del numero di griglie valutate per raggiungere almeno 200 cellule perossidasi-positive. Lo stesso numero di griglie andrà contato nell’altra camera dell’emocitometro.

7. Contare il numero di cellule e griglie perossidasi-positive con l’aiuto di un conta-cellule da laboratorio.

8. Passare alla seconda camera dell’emocitometro ed eseguire il conteggio del replicato sullo stesso numero di griglie del primo replicato, anche se questo dovesse produrre meno di 200 cellule perossidasi-positive.

9. Calcolare la somma e la differenza dei due numeri di cellule perossidasi-positive.

10. Determinare l’accettabilità della differenza da Tabella 2.3, p. 33, la differenza massima tra due conteggi che ci si aspetta si verifichi nel 95% dei campioni a causa del solo errore di campionamento.

11. Se la differenza è accettabile, calcolare la concentrazione. Se la differenza è troppo alta, preparare due nuove diluizioni e ripetere la conta del replicato.

12. Riportare la concentrazione media di cellule perossidasi-positive arrotondando alla seconda cifra.

13. Calcolare il numero totale di cellule perossidasi-positive per eiaculato (vedere Calcolo della concentrazione di cellule perossidasi-positive, p. 111).

Figura 3.6 Cellule perossidasi-positive nel liquido seminale umano

Un granulocita perossidasi-positivo (P) (colore marrone) e una cellula rotonda perossidasi-negativa (N). Scala 10 µm.

Micrografia per gentile concessione di T.G. Cooper.

3. Esame esteso

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Calcolo della concentrazione di cellule perossidasi-positive

La concentrazione di cellule perossidasi-positive nel liquido seminale è il loro nume-ro (N) diviso per il volume del numenume-ro totale (n) di griglie esaminate per i replicati (dove il volume di una griglia è 100 nl), moltiplicato per il fattore di diluizione.

Per una diluizione di 1+9 (1 : 10), la concentrazione è C = (N/n) × (1/100) × 10 cellule per nl = (N/n) × (1/10) cellule per nl. Quindi (N/n) viene diviso per 10 per ottenere la concentrazione di cellule perossidasi-positive per nl (= milioni di cellule per ml).

Quando tutte e nove le griglie di ogni camera dell’emocitometro sono state valutate, il numero totale di cellule perossidasi-positive può essere diviso per il volume totale di entrambe le camere (1,8 µl) e moltiplicato per il fattore di diluizione (10) per otte-nere la concentrazione in cellule per µl (migliaia di cellule per ml).

Sensibilità del metodo

Se nella camera ci sono meno di 200 cellule positive alla perossidasi, l’errore di campionamento supererà il 5%. Quando si trovano meno di 400 cellule perossida-si-positive in tutte le griglie di entrambe le camere, segnalare l’errore di campiona-mento per il numero di cellule contate (Tabella 2.3, p. 33).

Se si contano meno di 25 cellule perossidasi-positive in ogni camera, la concentrazio-ne sarà < 277.000 cellule/ml. Segnalare il numero di cellule perossidasi-positive os-servate con il commento “Troppe poche cellule per una determinazione accurata della concentrazione (< 277.000/ml)”. L’assenza di cellule perossidasi-positive nell’aliquota esaminata non significa necessariamente che siano assenti nel resto del campione.

Esempi pratici Esempio 1

Con una diluizione di 1+9 (1 : 10), il replicato 1 contiene 60 cellule perossidasi-po-sitive in 9 griglie, mentre il replicato 2 contiene 90 cellule perossidasi-poperossidasi-po-sitive in 9 griglie. La somma dei valori (60+90) è 150 in 18 griglie e la differenza (90-60) è 30.

Dalla Tabella 2.3, p. 33 si vede che questa supera la differenza prevista per il solo effetto della variabilità casuale (24), quindi i risultati vengono scartati e vengono preparati nuovi replicati.

Esempio 2

Con una diluizione di 1+9 (1 : 10), il replicato 1 contiene 204 cellule perossidasi-po-sitive in 5 griglie, mentre il replicato 2 contiene 198 cellule perossidasi-poperossidasi-po-sitive in 5 griglie. La somma dei valori (204+198) è 402 in 10 griglie e la differenza (204-198) è 6. Dalla Tabella 2.3, p. 33 si vede che questa è inferiore a quella prevista per il solo effetto della variabilità casuale (39), quindi i valori sono accettati.

La concentrazione di cellule positive alla perossidasi nel campione è calcolata con l’aiuto della Tabella 2.4, p. 35 per una diluizione di 1+9 (1 : 10), C = (N/n)/10 cellule per nl, o (402/10)/10 = 4,02 cellule/nl, o 4,0×10⁶ cellule per ml (arrotondando alla seconda cifra).

Esempio 3

Con una diluizione di 1+9 (1 : 10), il replicato 1 contiene 144 cellule perossidasi-po-sitive in 9 griglie, mentre il replicato 2 contiene 162 cellule perossidasi-poperossidasi-po-sitive in 9

Nota: Questa procedura può essere usata per calcolare la concentrazio-ne di cellule rotonde quando il numero totale di cellule rotonde contate (perossidasi-positive e negative) è usato per N nel calcolo.

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

griglie. La somma dei valori (144+162) è 306 in 18 griglie e la differenza (162-144) è 18. Dalla Tabella 2.3, p. 33 si vede che questa è inferiore a quella prevista per il solo effetto della variabilità casuale (34), quindi i valori sono accettati.

Quando tutte le nove griglie sono state valutate in ogni camera, la concentrazione del campione per una diluizione di 1+9 (1 : 10), calcolata utilizzando la Tabella 2.4, p.

35, è pari a C = 1,7×10⁶ cellule per ml arrotondando alla seconda cifra. Poiché sono state contate meno di 400 cellule, segnalare l’errore di campionamento per 306 cellule dato nella Tabella 2.3, p. 33 (circa il 6%).

Esempio 4

Con una diluizione di 1+9 (1 : 10), non si evidenziano cellule positive alla perossidasi in nessuno dei due replicati. Poiché in tutte le 9 griglie si trovano meno di 25 cellule positive alla perossidasi, la concentrazione è < 277.000 per ml; segnalare “Non sono state viste cellule positive alla perossidasi nei campioni. Troppe poche cellule per una determinazione accurata della concentrazione (< 277.000/ml)”.

3.4.1.2 Limiti tra risultato normale e patologico

Attualmente, non ci sono intervalli di riferimento basati sull’evidenza per le cellule perossidasi-positive nel liquido seminale di uomini fertili. In attesa di ulteriori prove, questo manuale mantiene il valore di consenso di 1,0×10⁶ cellule perossidasi-po-sitive per ml come valore di soglia per la rilevanza clinica. Di conseguenza, valori maggiori o uguali a 1,0×10⁶ di cellule perossidasi-positive per ml sono considerati anormali. Per questo test risultano rilevanti diversi punti.

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Il numero totale di cellule perossidasi-positive nell’eiaculato può riflettere la gra-vità di una condizione infiammatoria [215]. Il numero di cellule perossidasi-positi-ve si ottiene moltiplicando la concentrazione di cellule perossidasi-positiperossidasi-positi-ve per il volume dell’intero eiaculato.

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Le segnalazioni di valori di cut-off per le cellule perossidasi-positive negli uomini fertili variano a partire da 0,5×10⁶-1,0×10⁶ leucociti polimorfonucleati/ml o a parti-re da 1×10⁶-2×10⁶ leucociti totali/ml [215]. Le edizioni precedenti di questo manuale hanno considerato 1×10⁶ leucociti/ml come soglia per la leucocitospermia. Alcuni hanno ritenuto questo valore troppo basso [215], mentre altri lo hanno conside-rato troppo alto [218, 219], a seconda dell’endpoint esaminato (qualità del liquido seminale, risultati della FIV, presenza di batteri, risposta del liquido seminale alle specie reattive dell’ossigeno).

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Un numero eccessivo di leucociti nell’eiaculato (leucocitospermia, piospermia)

può essere associato a un’infezione e a una scarsa qualità del liquido seminale.

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Il danno agli spermatozoi dipendente dai leucociti è condizionato dal numero to-tale dei leucociti nell’eiaculato e dal numero di leucociti rispetto al numero degli spermatozoi.

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I leucociti possono compromettere la motilità nemaspermica e l’integrità del DNA attraverso un’attività ossidativa (Sezione 4.1, p. 140). Tuttavia, la possibilità che il livello di infiltrazione leucocitaria produca danni dipende da fattori impossibili da dedurre da un campione di liquido seminale, come la causa, i tempi e la posizione anatomica dell’infiltrazione, così come la natura dei leucociti coinvolti e se questi siano in uno stato attivato [214, 220, 221].

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 121-126)