Flusso e trasporto degli ioni transmembrana negli spermatozoinegli spermatozoi

4.4.1 Premessa

L’analisi funzionale del flusso e del trasporto degli ioni transmembrana negli sper-matozoi può essere una via da percorrere nella ricerca di strumenti diagnostici per comprendere meglio l’infertilità maschile e i disturbi degli organi riproduttivi maschili. Il movimento orientato, la capacitazione, l’iperattivazione e l’esocitosi acro-Figura 4.3 Esempi di spermatozoi CMA3-positivi (a) e CMA3-negativi (b) (riquadro di sinistra)

Nel riquadro di destra (campo luminoso) è possibile visualizzare la presenza di spermatozoi CMA3-negativi nello stesso campo.

Adattato da Marchiani et al., 2014 [303].

CMA3 Campo luminoso

4. Esamiavanzati

ne2. Esame di base 3. Esame esteso 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

somiale sono orchestrati da cambiamenti nel pH intracellulare (pH_i), tensione di membrana (Vm) e concentrazione intracellulare di Ca²⁺. Questi segnali cellulari sono mediati da canali ionici, scambiatori e trasportatori unici e per lo più specifici per gli spermatozoi, per esempio i canali CatSper Ca²⁺, i canali Slo3 K⁺, i canali Hv1 H⁺, gli scambiatori Na⁺/H⁺ (sNHE, NHA1, NHA2), le ATPasi Ca²⁺ (PMCA4) e i trasportatori Mg²⁺ (CNNM2, CNNM4). Molti casi di disfunzione spermatica inspiegabile potrebbero essere dovuti al malfunzionamento di uno di questi canali. A sostegno di quest’ipo-tesi, aberrazioni genetiche che interessano i geni CatSper, la funzione o l’espres-sione difettosa di CatSper e la funzione difettosa dei canali K⁺ sono state associate all’infertilità maschile [304]. Finora mancano procedure diagnostiche di routine per valutare la funzione dei canali ionici, degli scambiatori e dei trasportatori negli sper-matozoi. Tuttavia, sono stati sviluppati protocolli di ricerca per indagare (in maniera non ancora del tutto efficiente) l’attività dei canali ionici negli spermatozoi dei pa-zienti nel quadro degli studi clinici.

4.4.2 Elettrofisiologia e fluorimetria cinetica del Ca

per valutare la funzione di CatSper

Il canale CatSper, specifico per lo spermatozoo e attivato dal progesterone, control-la l’afflusso di Ca²⁺ nel flagello, influenzando così il movimento flagellare. La perdita della funzione CatSper è associata all’infertilità maschile e al fallimento della FIVET [304-307], e questo suggerisce che gli spermatozoi disfunzionali di CatSper posso-no fecondare solo attraverso le procedure ICSI.

La funzione di CatSper negli spermatozoi umani può essere studiata rispettivamen-te tramirispettivamen-te elettrofisiologia e fluorimetria cinetica del Ca²⁺. Gli spermatozoi mobili vengono selezionati con la procedura di swim-up o DGC. Registrazioni elettrofisio-logiche di correnti CatSper da spermatozoi umani vengono eseguite in soluzioni prive di ioni divalenti nelle cellule intatte, con l’elettrodo di vetro posizionato nella gocciolina citoplasmatica o nella regione del collo. Una volta stabilito un valore di gigaohm (una misura della resistenza elettrica, GΩ) per la cellula integra, le correnti monovalenti CatSper tipiche possono essere generate dalla depolarizzazione della tensione di membrana. La mancanza di attenuazione significativa di queste correnti indica la disfunzione di CatSper.

Per la fluorimetria del Ca²⁺, gli spermatozoi in sospensione vengono addizionati con un colorante indicatore di Ca²⁺ fluorescente (per esempio, Fura-2 o Fluo-4). Per rimuovere l’eccesso di indicatore extracellulare dopo l’aggiunta, gli spermatozoi vengono sedi-mentati per centrifugazione e risospesi in tampone fresco e il [Ca²⁺]_idegli spermatozoi in sospensione viene monitorato attraverso l’emissione di fluorescenza degli indicato-ri, per esempio, in piastre da microtitolazione o in una cuvetta utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza o uno spettrometro, rispettivamente. La fluorescenza emessa dall’indicatore Ca²⁺ viene registrata prima e dopo l’iniezione di un agonista CatSper (per esempio, progesterone, prostaglandine), del tampone (controllo negativo) e dello ionoforo Ca²⁺ ionomicina (controllo positivo) nei pozzetti o nella cuvetta. Il fallimento dell’agonista o degli agonisti di CatSper, ma non della ionomicina, per aumentare la fluorescenza, cioè [Ca²⁺]_i, è indicativo di una perdita della funzione CatSper. Solo recen-temente, questa tecnica ha identificato due pazienti infertili che soffrono di una perdita di funzione di CatSper. La diagnostica genetica ha rivelato che la perdita di funzione di CatSper e, quindi, l’infertilità era dovuta a un’aberrazione genetica del gene CatSper.

Da notare che anche l’imaging [Ca²⁺]_i a singolo spermatozoo è stato utilizzato per stu-diare il CatSper nei nemaspermi per ottenere informazioni sui singoli spermatozoi, per esempio, la frazione di cellule reattive e la presenza di sottopopolazioni. Questa scoperta ha rivelato che una ridotta sensibilità al progesterone è comune nei pazienti subfertili e si correla con il tasso di fecondazione [308].

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4.4.3 Metodi elettrofisiologici e fluorimetrici per studiare la funzione dei canali K

La funzione dei canali K⁺, cioè Slo3, negli spermatozoi umani può essere studiata con un’attendibilità medio-bassa tramite registrazioni patch-clamp a cellule intere e fluorimetria Vm. Slo3 rappresenta il principale canale K⁺ negli spermatozoi umani.

È attivato dal Ca²⁺ e, quindi, imposta il potenziale di membrana degli spermatozoi umani in una modalità [Ca²⁺]i-dipendente.

Nelle registrazioni elettrofisiologiche delle cellule intere, utilizzando soluzioni extra-cellulari contenenti ioni divalenti per sopprimere le correnti CatSper e una pipetta con una soluzione a base di K⁺, le correnti prototipiche Slo3 possono essere evocate dalla depolarizzazione della tensione di membrana. Questo approccio ha portato alla scoperta di diversi pazienti con un’attività anomala dei canali K⁺ e un potenziale di membrana a riposo depolarizzato, nonché un basso tasso di fecondazione nella FIVET.

Un approccio di screening per valutare l’attività del canale K⁺ negli spermatozoi si basa su indicatori fluorescenti sensibili al voltaggio. Questi indicatori riportano i cambiamenti di V_m come cambiamenti nella loro emissione di fluorescenza, per esempio, attraverso una ridistribuzione dipendente da V_m tra il mezzo extracellulare e il citoplasma. Per lo screening, gli spermatozoi – purificati o diluiti dall’eiaculato – vengono incubati con l’indicatore per alcuni minuti. In seguito, la fluorescenza viene registrata sia in pool di piastre da microtitolazione sia in una cuvetta usando un let-tore di piastre a fluorescenza o uno spettrometro, rispettivamente, oppure a livello di singola cellula usando la citometria a flusso. Successivamente, gli spermatozoi vengono testati con il K⁺ ionoforo valinomicina e con soluzioni contenenti diverse concentrazioni di K⁺. La valinomicina imposta il potenziale di membrana al rispettivo potenziale di K⁺-Nernst. In questo modo, la fluorescenza può essere convertita in valori V_m, permettendo la quantificazione del potenziale di membrana a riposo dello spermatozoo (V_rest), soprannominata calibrazione del punto nullo K⁺. Diversi studi che hanno utilizzato quest’approccio per determinare V_rest e, quindi, indirettamente l’attività dei canali K⁺ negli spermatozoi hanno suggerito una relazione tra Vrest e il tasso di fecondazione nella FIVET.

4.4.4 Metodi per rilevare il (mal)funzionamento di trasportatori e scambiatori di ioni

Finora, non ci sono tecniche per valutare con attendibilità ragionevole l’attività degli scambiatori e dei trasportatori di ioni negli spermatozoi umani. Pertanto, il loro ruolo nella disfunzione nemaspermica rimane da indagare.

4.4.5 Riassunto

Nell’ultimo decennio, tecnologie nuove ed emergenti hanno dimostrato che la funzio-ne degli spermatozoi – e quindi la fecondaziofunzio-ne – è orchestrata da un insieme unico di canali ionici, trasportatori e scambiatori per lo più specifici per gli spermatozoi.

Tuttavia, le disfunzioni di queste componenti di segnalazione chiave non possono essere rilevate da un’analisi seminale di routine. Per la maggior parte di queste pro-teine mancano test funzionali e le tecniche attuali per valutare la funzione di CatSper o Slo3 sono troppo impegnative per essere implementate nel laboratorio clinico.

Quindi, per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi patologici alla base della disfunzione spermatica, è necessario un insieme di test nuovi, facili da usare e adatti a una perfetta integrazione nel quadro dell’attuale analisi del liquido seminale.

4. Esamiavanzati

ne2. Esame di base 3. Esame esteso 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

4.5 Analisi computerizzata del liquido seminale