Oggi giorno per il clinico è fondamentale disporre di appositi intervalli di riferimento per poter interpretare i risultati degli esami di laboratorio eseguiti su un certo soggetto. [87, 63, 164, 187, 153] Solo confrontando i risultati ottenuti con i valori di riferimento e, più che altro, con gli intervalli di riferimento può trarre tutte quelle informazioni utili non solo per fare diagnosi, ma eventualmente anche prognosi e terapia. [63, 87, 164, 187, 153]
Perché questa interpretazione sia corretta è opportuno che prima di tutto il clinico disponga di intervalli validi e determinati secondo criteri ben precisi. [63, 87, 187, 164]
È chiaro che per ogni analita o misurando esistono specifici intervalli e per lo stesso analita o misurando gli intervalli possono essere diversi a seconda del metodo con cui sono stati determinati, nonché del processo di studio a cui sono stati sottoposti. [63, 187, 87]
Per questo motivo ogni laboratorio dovrebbe adottare specifici intervalli di riferimento per gli analiti misurati e il clinico, oltre che i semplici intervalli, dovrebbe sempre richiedere informazioni sulle modalità con cui tali intervalli sono stati ottenuti, quindi gli eventuali criteri adottati per la selezione degli individui di riferimento. [187, 87, 63]
Innanzitutto è necessario precisare che esistono tre differenti modalità di determinazione degli intervalli di riferimento circa un dato analita in una data popolazione. [63] Questi sono:
Determinazione ex-novo di questi intervalli. Si tratta di un processo piuttosto complesso ed articolato; [63]
Trasferimento di intervalli di riferimento preesistenti, quando un metodo o uno strumento è cambiato; [63]
Validazione di un intervallo di riferimento precedentemente stabilito o trasferito. [63] Il trasferimento degli intervalli di riferimento già presenti in laboratorio (o provenienti da un altro laboratorio), dovrebbe essere di per se scoraggiato. [23] Tuttavia è anche vero che se sistemi analitici differenti forniscono risultati confrontabili, perché entrambi riferibili ad un sistema di riferimento comune, non c’è motivo per cui gli stessi intervalli di riferimento non possano o non debbano essere adottati. [22, 23] Dipende tutto dal livello di standardizzazione. [23]
Prima comunque di applicare tali limiti è sempre necessario validare tali intervalli. [63, 23, 187] Invece determinare ex-novo tali intervalli risulta un processo parecchio complesso ed articolato, per cui non sempre nella pratica viene applicato in maniera completa e corretta. [63]
Le raccomandazioni circa una buona determinazione degli intervalli di riferimento sono stati descritti in una serie originale di articoli pubblicati dalla IFCC, Federazione Internazionale di Chimica Clinica e Medicina di Laboratorio. [63]
Esporre qui di seguito tutte queste linee guida sarebbe quanto mai inutile e fuori luogo, pertanto sono indicati solo i punti principali.
Innanzitutto è sempre importante determinare attraverso la ricerca bibliografica quali sono i fattori di variazione pre-analitici, analitici e biologici che riguardano un certo analita. [63] In questo modo è possibile avere un controllo sulla variabilità dei risultati ottenuti e alcuni fattori possono poi
diventare dei veri e propri criteri di selezione degli individui da cui ottenere i valori di riferimento. [63] Tuttavia non è sempre facile controllare questi fattori, anche perché la valutazione della loro eventuale presenza ha spesso un carattere soggettivo. [63] I fattori che condizionano i livelli sierici o plasmatici delle proteine sono già stati ampiamente discussi nel paragrafo 3 del capitolo 3.
Comunque sia sapere se questi fattori sono presenti è importante per elaborare correttamente i limiti di riferimento a partire dai valori ottenuti. [87, 63, 164, 187]
Una volta valutato l’analita da studiare e i fattori che lo condizionano, un altro punto cardine del processo di determinazione degli intervalli di riferimento è senz’altro quello in cui vengono stabiliti i criteri di selezione degli individui di riferimento. [63, 164, 187] Questa operazione deve essere sempre conclusa prima della valutazione, e quindi poi selezione, dei dati ottenuti. [63, 164]
150
Gli individui di riferimento vengono perciò selezionati all’interno della popolazione applicando una serie di criteri. [164, 63, 87, 187, 153] Alla fine si ottiene un gruppo di soggetti, il gruppo campione di riferimento, ognuno dotato di caratteristiche ben determinate. [63, 164]
I criteri di selezione possono essere applicati a priori, cioè prima della raccolta dei campioni, oppure a posteriori, cioè dopo la raccolta dei campioni. [63] Quest’ultima pratica è chiaramente preferita quando i dati circa un certo analita sono già tutti disponibili. [63] L’importante è che i criteri siano stati stabiliti prima della considerazione di questi dati, in modo che la selezione sia priva di qualsiasi pregiudizio. [63, 164]
A seconda delle circostanze vengono ad essere utilizzati criteri diversi. Di solito quelli più impiegati sono la distinzione in base alla specie, razza, sesso, età, stato di salute, somministrazione di farmaci, parametri clinici, esami di laboratorio… Alla fine si dovrebbe ottenere un insieme di individui presumibilmente sani. La selezione degli individui di riferimento comunque non dovrebbe essere troppo restrittiva, eventualmente è possibile distinguere all’interno del gruppo campione di riferimento ulteriori sottocategorie in base a specifici criteri. [63, 164]
Infatti applicando questi criteri l’ideale sarebbe ottenere un numero di individui di riferimento tale da ridurre al minimo l’intervallo di confidenza. [164, 63] Molti Autori ritengono appropriato un numero di 120 soggetti, poiché è il più piccolo numero dal quale è possibile stimare i limiti di
riferimento con un intervallo di confidenza del 90%, utilizzando metodi non parametrici. [63, 164, 87, 187]
Tuttavia in medicina veterinaria un numero tanto elevato è difficilmente ottenibile. [164] Un numero di 60 individui potrebbe essere sufficiente se i dati fossero distribuiti in modo tale da poter applicare metodi parametrici. [164, 63] Al di sotto di questa soglia è possibile ottenere intervalli poco validi. [164]
Ecco che molti Autori oggi preferiscono in questo contesto affermare che il numero di campioni dovrebbe essere il più alto possibile, senza indicare un minimo. [63]
Selezionati gli individui di riferimento è necessario prepararli in accordo con i fattori descritti in precedenza. [63] Dopo di ciò si passa alla raccolta, collezione e processamento dei campioni. [63, 164] Queste operazioni dovrebbero essere condotte nel modo più naturale e quindi sovrapponibile a quanto accade nella attività quotidiana. [164, 63] I materiali e i metodi impiegati devono essere sempre gli stessi e devono essere sempre ben indicati alla fine del processo. [164]
E anche l’analisi dei campioni per la ricerca dell’analita deve avvenire in modo ben definito e tutto il processo deve essere descritto dettagliatamente. [63] Solo così è possibile la tracciabilità e quindi poi la ripetibilità dei risultati. [63]
Tutte queste informazioni secondo alcuni esperti dovrebbero sempre essere fornite al clinico al fine di aiutarlo nella corretta interpretazione dei risultati ottenuti. [63, 87]
Ottenuti i valori di riferimento a questo punto è opportuno valutare la loro distribuzione. [164] Infatti a seconda del tipo di distribuzione vengono applicati metodi diversi per la determinazione degli intervalli di riferimento. [87, 164, 187, 162]
Se la distribuzione è normale, o Gaussiana, vengono applicati metodi detti parametrici. [164, 63, 87] Questi metodi generano un intervallo di riferimento dato dalla media più o meno due volte la deviazione standard della distribuzione. [164] Tuttavia quando il numero degli individui di riferimento è ridotto risultano più appropriati metodi non parametrici. [164] Per valutare se i dati hanno una distribuzione normale esistono appositi test statistici come il D’Agostino-Pearson. [87, 63] Se la distribuzione non è normale o se il numero di valori di riferimento è troppo ridotto allora è necessario applicare metodi non parametrici. [164, 63, 87] In alcuni casi si può anche procedere alla trattazione dei dati in modo da ottenere una distribuzione normale e quindi poi applicare metodi parametrici. [164, 87, 162]
Che siano parametrici o non parametrici alla fin questi metodi consentono di selezionare una certa frazione centrale (di solito il 95%) dei valori di riferimento trovati. [164, 87, 63]
È chiaro che prima di applicare questi metodi i valori di riferimento devono essere stati ordinati e devono essere stati eleminati gli outlier. [164] Gli outlier sono i risultati che si discostano
151
eccessivamente dalla media e a questo proposito possono falsare i risultati. [164, 162, 63] Ecco che riscontrata la loro presenza l’ideale sarebbe applicare specifici test statistici, come il Q test, per decidere se rigettare o meno questi dati. [164, 162, 63] Il problema di questi test è che possono essere applicati solo quando i dati hanno una distribuzione Gaussiana. [162, 63]
In generale è ritenuto che l’intervallo di riferimento debba coprire il 95% centrale dei valori di riferimento collezionati, in modo tale da escluderne il 5%. [63, 164, 87] Alcuni Autori suggeriscono invece di coprire il 99,8% dei valori di riferimento così da limitare i falsi positivi ed escluderne appena lo 0,2%. [63]
Quando si considerano il 95% dei valori di riferimento, se tali valori hanno una distribuzione
normale per determinare i limiti di riferimento, e quindi poi gli intervalli di riferimento, si applica il suddetto metodo parametrico. I limiti corrispondono ai valori che si ottengono sommando e
sottraendo alla loro media il doppio della deviazione standard. [164, 87, 63] Se però la distribuzione non è normale allora come suddetto è necessario applicare metodi non parametrici, come quello dei percentili. [164, 87, 162] Il limite inferiore corrisponde comunque al valore che esclude il 2,5% dei valori di riferimento più bassi e il limite superiore corrisponde al valore che esclude il 2,5% dei valori più alti. [164, 87] Alla fine sono sempre esclusi il 5% dei valori e considerati il 95% dei valori centrali. [164, 87] Identificare però i limiti che escludono questi valori non è sempre cosa facile. [164]
Ecco che solitamente i dati vengono trattati in modo da ottenere una distribuzione normale o Gaussiana. [164, 63, 87] I metodi per eseguire questa trasformazione sono diversi, come il metodo di Anderson-Darling o il metodo di trasformazione logaritmica o della radice quadrata. [63, 87]
Quando il numero di valori di riferimento è molto ridotto, però possiedono pur sempre una
distribuzione normale, è necessario applicare specifici metodi di determinazione degli intervalli di riferimento, definiti sempre non parametrici, come il così detto metodo robusto. [87]
Dopo di ciò non resta che utilizzare gli intervalli di riferimento ottenuti.
È bene precisare che in alcune circostanze i valori di riferimento provenienti da una certa popolazione vengono raccolti senza che prima sia stata fatta una selezione degli individui di riferimento. [63, 87] In questo caso basta semplicemente applicare i criteri a posteriori e quindi selezionare gli individui dopo che sono già stati raccolti ed analizzati i campioni. [63] L’importante è elaborare ed applicare i criteri senza aver prima consultato questi valori, perché c’è il rischio di sviluppare dei pregiudizi. [63, 87]
Il problema è quando questi campioni provengono da una popolazione non di riferimento. [63] In questo caso si hanno valori ottenuti da individui che non sono stati minimamente selezionati e perciò comprende anche soggetti malati. [63]
Si parla di determinazione degli intervalli di riferimento indiretta. [63] E’ simile al processo di determinazione a posteriori, tuttavia qui c’è il problema che non si ha certezza dello stato di salute di tutti gli animali. È tipico di dati ottenuti da raccolte eseguite all’interno di ospedali. [63]
In questo caso c’è il rischio che i criteri di selezione non possano essere applicati in maniera ferrea e quindi i valori ottenuti non siano corretti. [63] Perciò si tratta di pratiche da eseguire solo quando la raccolta di individui di riferimento risulta molto difficile. [63]
Particolare attenzione deve essere inoltre fatta quando i limiti di riferimento vengono calcolati su un numero ridotto di individui di riferimento: c’è il rischio di forte imprecisione di questi limiti. [63, 73, 64]