La quantità di globuline presenti a livello plasmatico o sierico può essere determinata in maniera diretta o indiretta. [84, 165, 186]
La determinazione indiretta consiste nella quantificazione delle globuline totali sieriche sottraendo alla concentrazione delle proteine totali la concentrazione dell’albumina. [165, 85] Si tratta di un metodo empirico che si basa sul concetto che a livello sierico tutte le proteine al di là dell’albumina sono globuline. [165] La quantità di globuline avrà perciò una accuratezza dipendente dalla
accuratezza con cui sono state calcolate le proteine totali e l’albumina. [165] Questa determinazione indiretta, come indicato nel paragrafo precedente, è proprio tipica delle globuline ma in maniera inversa può essere utilizzata per la determinazione dell’albumina. [84, 165, 186]
Ecco che tale metodo indiretto rappresenta il metodo classico di determinazione delle globuline. La determinazione diretta invece consiste nell’utilizzare metodi specifici volti a quantificare tali proteine. [84] In realtà metodi di determinazione diretta di tutte le globuline ad oggi non sono accettati. [84, 165]
Esiste infatti un metodo colorimetrico che prevede l’impiego di acido glicossilico. [84, 150] Qui si ha la formazione di un complesso con le globuline, poiché ricche in triptofano, che impartisce una colorazione violetta al campione. [84, 150] Il tutto è poi valutato mediante spettrofotometria. A causa della variabilità dei risultati non è accettato nella biochimica clinica. [84]
Sicuramente diverso è il discorso circa la siero-elettroforesi zonale. [85, 84, 165] Qui è possibile ottenere una quantificazione relativa delle globuline, anche se tuttavia, come indicato nel paragrafo 6 di questo capitolo, si tratta di un metodo più che altro adatto alla valutazione delle singole frazioni globuliniche. [165, 84, 85]
Ecco che i metodi di determinazione diretta riguardano più che altro la quantificazione delle singole frazioni globuliniche. [84, 85, 165] In particolare sono oggetto di tali metodi le γ-globuline. [165, 85] Infatti si tratta di metodi che vengono solitamente impiegati per valutare i livelli di
immunoglobuline presenti in un certo organismo. [165, 85, 84] Quindi rivestono un ruolo molto importante nella diagnosi di fallimento del trasferimento dell’immunità passiva materna o di stati di immunodeficienza. [165] Sono spesso dei metodi pratici e molto veloci a fornire i risultati. [85, 165] Ma ve ne sono alcuni anche più dispendiosi, sia per quanto riguarda i tempi sia per quanto riguarda i costi. [165]
Metodi classici di determinazione delle γ-globuline sono quelli in cui si vanno ad applicare al campione sostanze tali da portare alla precipitazione e flocculazione di queste globuline. [85, 84, 97,165] Ecco che si parla anche di test di sieroflocculazione o sierotorbidità. [97] Si formano precipitati e coaguli o comunque si registra un aumento della torbidità del campione, se sono presenti adeguate quantità di queste globuline. [85, 84, 97]
In sostanza questi metodi sfruttano proprietà fisico-chimiche di tali proteine e, alterando il
microambiente a livello del campione di siero o plasma, conducono a precipitazione tutte le molecole che presentano determinate caratteristiche. [85, 84]
Poiché le proprietà fisico-chimiche delle proteine, come si è visto dal capitolo 2, dipendono dalla loro composizione aminoacidica e dalla loro struttura secondaria, terziaria e quaternaria, è chiaro che non tutte le proteine risentono in ugual modo di queste sostanze. Ogni proteina sierica reagisce in modo diverso poiché ha proprietà fisico-chimiche diverse. Solitamente l’albumina è quella più resistente alla precipitazione, mentre le immunoglobuline sono quelle più sensibili. [85, 84, 165, 97, 136]
In passato un metodo molto utilizzato per rilevare rapidamente se c’era un incremento delle γ- globuline nel campione in esame era appunto il metodo di formolgelificazione. [97] Questo prevedeva l’aggiunta di 1/10 di formaldeide rispetto al volume di siero e se rapidamente (meno di un minuto) questo gelificava era indicativo di forte ipergammaglobulinemia. [97, 102]
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Oggi è stato soppiantato da metodi più precisi come quelli che prevedono l’aggiunta di sali. Si tratta di metodi dove la precipitazione delle globuline, e in particolare delle γ-globuline, si ottiene tramite l’utilizzo di sali come il solfato di ammonio, il solfato di sodio o il solfato di zinco.
Questi sali, una volta aggiunti al campione, portano ad una precipitazione selettiva delle proteine caricate positivamente a pH alcalino, come appunto le immunoglobuline. [165, 84, 85] Ne deriva l’incremento della torbidità del campione. [84] A parità di concentrazione di questi sali una torbidità maggiore indica una quantità superiore di immunoglobuline. [165]
Però attenzione: all’aumentare della concentrazione di questi solfati è possibile la precipitazione di immunoglobuline a concentrazioni più ridotte. [165]
Quindi la precipitazione dipende dalla concentrazione delle immunoglobuline, ma anche dalla concentrazione dei sali che vengono impiegati in questi metodi. [165]
L’aumento della torbidità può essere saggiato anche mediante spettrofotometria. [165, 85] In questi casi l’emolisi può falsare i risultati. [165]
È chiaro che una misura precisa delle immunoglobuline presenti con questi metodi non è possibile: si tratta di metodi semi-quantitativi e i risultati variano dalla quantità delle immunoglobuline e dalla concentrazione dei sali impiegati. [84, 165]
Ad oggi trova ampio impiego per valutare il trasferimento dell’immunità passiva materna nei puledri e nei vitelli. [185, 165, 84, 85] In particolare il metodo che impiega solfato di zinco è utilizzato più che altro per i puledri, mentre per i vitelli si utilizza il solfato di sodio. [165, 185, 84, 85] Infatti nel vitello il solfato di zinco sembrerebbe fornire risultati non accurati. [165] Stessa cosa il solfato di sodio per i puledri. [165]
Tra l’altro questi metodi solitamente si concludono con una valutazione esclusivamente visuale e perciò risultano anche relativamente economici e rapidi. [165] Il solfato di zinco sembrerebbe capace di rilevare, per lo meno nel puledro, le immunoglobuline con intervalli di concentrazione molto più ampi rispetto a quanto accade con il solfato di sodio nel vitello. [165]
Un altro metodo che si basa sulla precipitazione delle proteine per l’aggiunta al campione di una certa sostanza è il metodo della coagulazione con glutaraldeide. [84, 85, 165] La glutaraldeide è una sostanza capace di reagire con i gruppi aminoacidici liberi delle proteine plasmatiche o sieriche, comportando la formazione di legami molecolari che, se in numero sufficiente, possono portare alla precipitazione di tali proteine. [85, 165]
Le proteine ricche di questi gruppi aminoacidici liberi, e che quindi possono teoricamente essere coagulate dalla glutaraldeide, sono proteine basiche , cioè proteine ricche di aminoacidi basici, come le immunoglobuline e il fibrinogeno. [85, 165]
È chiaro che se si utilizza un campione di siero il precipitato che si ottiene aggiungendo glutaraldeide è dato solo da immunoglobuline. [85, 165] Mentre se si utilizza un campione di plasma il precipitato che si ottiene aggiungendo glutaraldeide può essere costituito anche solo da fibrinogeno, specie se presente uno stato di iperfibrinogenemia. [165, 85]
Anche in questo metodo è molto importante la quantità di glutaraldeide aggiunta al campione: a parità di concentrazione di glutaraldeide i campioni di siero dove si forma un maggiore precipitato sono più ricchi di immunoglobuline. [85, 165]
Vista la sua praticità e semplicità è un metodo oggi spesso utilizzato per rilevare condizioni di ipogammaglobulinemia in puledri e vitelli, riconducibili al fallimento del trasferimento
dell’immunità passiva materna. [12, 165, 36] Di solito se in questi casi la coagulazione del siero non si verifica ad un’ora dalla applicazione della glutaraldeide si ritiene che il trasferimento
dell’immunità passiva materna sia fallito. [165] Alcuni Autori, quali Tylee et al., 1996, ritengono però che tale metodo sia poco sensibile e specifico, per lo meno nel vitello. [85]
Infine di recente questo metodo si è mostrato valido, vista la capacità di reagire con il fibrinogeno, nel distinguere nel cavallo stati patologici acuti da quelli cronici. [85]
Un ulteriore metodo in cui si verifica la precipitazione delle globuline a seguito dell’aggiunta di una certa sostanza è il così detto metodo delle euglobine di Sia. [165] Questo metodo, descritto per la prima volta da Sia nel 1929, prevede l’aggiunta al campione di siero di una goccia di acqua distillata
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pura. [165] Alcune proteine, dette per l’appunto euglobine, a contatto con l’acqua pura precipitano. [165] Il metodo era stato ideato per rilevare nel siero umano la presenza di macroglobuline. [165] Ma in realtà le macroglobuline non sono le uniche euglobine: diverse immunoglobuline hanno tale proprietà. Ecco che anche in corso di gammopatie mono o policlonali si può ottenere un precipitato aggiungendo al campione acqua distillata. [165] Tale metodo ha perciò perso utilità diagnostica. Ritzmann et al., 1969. [165]
È chiaro che una volta quantificate le proteine totali, l’albumina e le γ-globuline è poi possibile, per semplice sottrazione, quantificare le altre globuline. [84, 165]
A questo proposito è bene ricordare che esiste anche un metodo di precipitazione delle globuline che non interessa le γ-globuline. [85] Si tratta di un metodo che vede di nuovo l’impiego di un acido, l’acido perclorico, ed è utile per quantificare un particolare gruppo di proteine, le mucoproteine. [85] Come indicato nel paragrafo 4 VIII del capitolo 3, le mucoproteine sono un insieme di proteine plasmatiche dotate di una porzione mucoide. [150, 25, 53, 120] Queste proteine, da alcuni Autori definite forse impropriamente glicoproteine, sono proteine molto resistenti agli acidi, solubili in acido perclorico ma insolubili nell’acido tungstenico. [150, 120]
Ecco che quando l’acido perclorico è aggiunto ad un campione di siero si ottiene la precipitazione di tutte le proteine, fatta eccezione delle mucoproteine. [85, 150, 120] A quel punto se viene valutato, anche con un semplice metodo fisico, il contenuto proteico del fluido che residua è possibile ottenere una buona stima della quantità di queste proteine. [85]
Una delle più abbondanti mucoproteine presenti a livello sierico è l’α1-glicoproteina acida, che tra l’altro risulta anche una importante proteina della fase acuta positiva, specie nel gatto. [119, 126, 25, 28] Ecco che avere una stima delle mucoproteine può essere molto utile per indagare l’eventuale presenza nell’organismo animale di una reazione della fase acuta. [85, 150]
Indipendentemente dai metodi utilizzati, una volta quantificate l’albumina e le globuline di solito si procede con il calcolare il rapporto tra albumina e globuline, che, come indicato nel capitolo 4, rappresentano un importante indicatore di disprotidemie selettive. [85, 84, 165, 92, 186] Infatti fornisce un mezzo di valutazione del contributo relativo dell’albumina o delle globuline alle proteine totali sieriche. [85, 165] Ecco che una volta calcolate le proteine totali, l’albumina e le globuline, conoscere questo rapporto è fondamentale per comprendere che eventuale tipo di alterazione
quantitativa delle proteine plasmatiche è presente e quindi poi sviluppare un possibile orientamento diagnostico. [84, 85, 165, 92, 69]