OBBIETTIVI DELLA TESI Obbiettivi di questa tesi sono:
CAPITOLO 3 MATERIALI E METOD
1 Materiali
Nel Laboratorio di Patologia clinica del Dipartimento di Scienze Veterinarie di Pisa fino a Gennaio 2013 le siero-elettroforesi zonali sono state realizzate impiegando un mezzo di supporto a base di acetato di cellulosa. Poi da Febbraio 2013 le siero-elettroforesi zonali sono state realizzate utilizzando un mezzo di supporto a base di gel di agarosio.
È chiaro perciò che nei due periodi di tempo il laboratorio ha impiegato attrezzature e metodi di separazione elettroforetica delle proteine sieriche diversi.
Fino a Gennaio 2013 la siero-elettroforesi zonale è stata condotta con un sistema automatico per elettroforesi, dotato di scansione densitometrica e fornito dalla ditta Interlab®, di Roma, Italia. Questo sistema, definito MICROTECH648ISO, è un sistema capace di eseguire in modo
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completamente automatico tutte le operazioni necessarie per la separazione elettroforetica di sieroproteine, lipoproteine, emoglobine e isoenzimi.[78bis] Il sistema comprende le seguenti parti:
Un apparecchio che include un preparatore di elettroforesi e un densitometro per la lettura dei protidogrammi ottenuti; [78bis]
Un computer dotato di un apposito software per la regolazione del precedente apparecchio e per la gestione e l’elaborazione dei dati ottenuti; [78bis]
Una stampante.
L’apparecchio elettroforetico utilizza un mezzo di supporto formato da uno strato di materiale plastico (Mylar®) e uno strato di acetato di cellulosa. Proprio a livello dello strato di acetato di cellulosa viene ad essere realizzata la corsa elettroforetica. [78bis]
Per il suo funzionamento necessita di specifici kit. Il kit impiegato per la realizzazione della corsa elettroforetica delle proteine sieriche è quello indicato con la sigla SRE204K, fornito dalla Interlab® per il suddetto sistema MICROTECH648ISO. [78bis]
L’apparecchio elettroforetico presenta una serie di elementi (riportati nella figura s.3.1) qui di seguito descritti:
Il portacampioni è l’elemento dove sono posizionati i campioni di siero ed è strutturato in modo tale da mantenere una temperatura di circa 12°C. In realtà i campioni di siero sono posizionati su un supporto monouso dotato di 48 pozzetti, ciascuno con una capienza di 30µl, da posizionare nell’apposito spazio nel portacampioni. Infatti questo è dotato anche di una vaschetta e di una spugnetta di materiale assorbente dove l’elemento che applica i campioni effettua rispettivamente dei lavaggi e una asciugatura. [78bis]
L’applicatore è l’elemento che preleva i campioni dai relativi pozzetti del portacampioni e li applica sul mezzo di supporto dove avverrà la corsa elettroforetica. [78bis]
La camera di migrazione è l’ambiente dove avviene la corsa elettroforetica. Presenta due scomparti dove è necessario posizionare il tampone di migrazione. [78bis]
Il porta tamponi assorbenti è l’elemento dove sono posizionati i due tamponi assorbenti, tra la camera di migrazione e la piastra di deposizione. [78bis]
La piastra di deposizione è l’elemento su cui la macchina posizionerà la striscia che costituisce il mezzo di supporto, prelevandola dal portastrisce. [78bis]
Il portastrisce è l’elemento su cui l’operatore posiziona l’apposita striscia che costituisce il mezzo di supporto per la corsa elettroforetica. [78bis]
La camera di asciugatura è l’elemento dove viene asciugata mediante ventilazione la striscia di acetato di cellulosa. [78bis]
La camera del lettore ottico è l’elemento dove avviene la fotodensitometria. [78bis]
Il sistema di vaschette multiple porta reagenti è un elemento formato da una serie di spazi, numerati da 7 a 17, in cui vengono inserite vaschette e tamponcini per l’asciugatura del
Figura s.3.1, tratta da [78bis]
Interno dell’apparecchio elettroforetico
MICROTECH648ISO con indicazione delle componenti.
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mezzo di supporto in quantità e modalità differenti a seconda di ciò che si vuole separare elettroforeticamente. [78bis] Nel caso delle sieroproteine le modalità di riempimento delle vaschette è indicato in figura s.3.2. E’ interessante sottolineare che in questo apparecchio il colorante impiegato nella colorazione delle sieroproteine è il Rosso di Ponceau. [78bis]
L’apparecchio elettroforetico è collegato ad un computer, dotato di un software fornito dalla ditta Interlab®, denominato Elfolab (vedi figura s.3.3 a pagina 162). Consente la regolazione
dell’apparecchio nonché la gestione e l’elaborazione dei dati ottenuti. Con questo software è possibile visualizzare i vari protidogrammi e i relativi grafici densitometrici a bande, effettuare eventuali correzioni del caso e produrre file in formato PDF dove sono riportati il protidogramma, il grafico densitometrico a picchi e le quantità relative ed assolute (con gli specifici intervalli di riferimento) di ogni frazione rilevata e dove sono riassunti i dati relativi al segnalamento del soggetto. [78bis] Nel Gennaio 2013 la suddetta apparecchiatura è stata sostituita e perciò in questo laboratorio sono cambiati i materiali e i metodi con cui si eseguono le siero-elettroforesi zonali.
Adesso queste sono condotte sempre con un sistema automatico per siero-elettroforesi, fornito dalla ditta Interlab®, però diverso rispetto al precedente.
Questo sistema, definito Pretty Interlab (vedi figura s.3.4), è un sistema capace di eseguire in modo completamente automatico tutte le operazioni necessarie per la separazione elettroforetica di
sieroproteine, proteine urinarie, lipoproteine, isoenzimi ed emoglobine. [78] Inoltre questo sistema può essere utilizzato per eseguire isoelettrofocalizzazione del liquido cefalo-rachidiano, nonché diversi tipi di immunofissazione. [78]
Il sistema consta delle seguenti componenti:
Un apparecchio elettroforetico; [78]
Un apparecchio fotodensitometrico; [78]
Un computer dotato di appositi software per la regolazione dei suddetti apparecchi e per la gestione e l’elaborazione dei dati; [78]
Una stampante. [78]
L’apparecchio elettroforetico utilizza un mezzo di supporto costituito da piastre in gel di agarosio. [78] Ogni piastra contiene agarosio in tampone Tris-Barbital, con aggiunta di conservanti e stabilizzanti. [78]
Per il suo funzionamento è necessario l’impiego di specifici kit. Ogni kit ha delle proprietà differenti e consente la separazione elettroforetica di elementi diversi. [78] Nel caso delle sieroproteine esistono kit più o meno sensibili. In questo laboratorio è utilizzato il kit con la sigla SRE602K, fornito dalla ditta Interlab® per diversi sistemi elettroforetici, tra cui il Pretty Interlab. [78] Tale kit ha il contenuto illustrato nella tabella s.3.5. Si tratta di elementi monouso e che perciò ad ogni corsa
Figura s.3.2, tratta da [78bis] Modalità di riempimento del sistema di vaschette multiple porta reagenti.
Figura s.3.4, tratta da [78] Apparecchio Pretty Interlab.
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elettroforetica vengono progressivamente consumati. Questo kit consente la realizzazione di 10 corse elettroforetiche, ciascuna con un massimo di 13 campioni di siero. [78]
Per il funzionamento dell’apparecchio è necessario anche l’impiego di acqua distillata e soluzione decolorante, quest’ultima appositamente prodotta dalla ditta Interlab®. [78]
L’apparecchio fisicamente presenta una serie di elementi (riportati nella figura s.3.6) qui di seguito descritti:
Il portacampioni è una barra su cui viene inserito un supporto monouso, presente in ogni kit, costituito da una serie di pozzetti disposti in due file da 13. Figura s.3.7. Ogni pozzetto ha una capienza di 30 µl ed è destinato a contenere il campione di siero in esame; [78]
L’applicatore dei campioni è un elemento metallico mobile capace di prelevare i campioni posizionati nel suddetto portacampioni e distribuirli in maniera automatica, uniforme e precisa sul mezzo di supporto; [78] (vedi figura s.3.7)
La piastra di alluminio è l’elemento centrale, nonché il cuore della macchina. Figura s.3.8. Qui avvengono tutte le fasi della separazione elettroforetica delle proteine presenti nel campione. Infatti su tale piastra l’operatore vi dispone il mezzo di supporto e dopo di ciò la macchina, tramite una serie di elementi mobili, provvede a eseguire tutte le operazioni necessarie perché si realizzi la corsa elettroforetica; [78]
La camera di migrazione è un elemento mobile capace al momento giusto di posizionarsi sulla piastra di alluminio e consentire alle proteine presenti nel campione di migrare nel supporto; [78] (vedi figura s.3.9)
Poi ci sono una serie di elementi più o meno mobili che intervengono nelle fasi di essiccazione, colorazione, decolorazione e asciugatura della piastra in gel. Inoltre ci
Tabella s.3.5, tratta da [78]
Contenuto del kit SRE602K per siero- elettroforesi.
Figura s.3.6, modificata da [78]
Interno dell’apparecchio elettroforetico Pretty Interlab con indicazione delle principali
componenti.
Figura s.3.7, tratta da [78] Portacampioni e
applicatore dei campioni
Figura s.3.8, tratta da [78] Piastra di alluminio con supporto in gel prima (sotto) e dopo (sopra) la corsa elettroforetica.
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sono le componenti per il lavaggio dei suddetti elementi che avviene di regola all’inizio e alla fine di ogni corsa e
durante la corsa stessa in particolari momenti. Quindi al di fuori dell’apparecchio sono presenti i contenitori del
colorante, dell’acqua distillata, della soluzione decolorante e dei liquidi reflui. [78]
L’apparecchio elettroforetico è collegato ad un computer contenente due software forniti dalla ditta Interlab®. Uno è il Pretty Interlab che
consente la regolazione
dell’apparecchio elettroforetico. L’altro è il suddetto Elfolab (vedi figura s.3.3), che consente la regolazione dell’apparecchio
fotodensitometrico nonché la gestione e l’elaborazione dei dati provenienti da quest’ultimo apparecchio. Con questo software è possibile visualizzare i vari protidogrammi e i relativi grafici densitometrici a picchi, effettuare eventuali correzioni del caso e produrre file in formato PDF dove sono riportati il protidogramma, il grafico densitometrico a picchi e le quantità relative ed assolute (con gli specifici intervalli di riferimento) di ogni frazione rilevata e dove sono riassunti i dati relativi al segnalamento del soggetto. [78]
L’apparecchio densitometrico è in sostanza uno scanner, separato dall’apparecchio elettroforetico, capace di leggere i protidogrammi presenti sulla piastra in gel di agarosio essiccata.
Il computer è collegato anche con la banca dati elettronica della struttura, così che l’operatore al termine della procedura possa inserirvi i risultati ottenuti.
Come indicato nei metodi l’operatore deve provvedere anche all’inserimento dei livelli delle proteine totali per ogni protidogramma così che il software possa calcolare autonomamente le quantità assolute di ogni frazione rilevata.
Le proteine totali nel laboratorio di Patologia clinica del Dipartimento di Scienze Veterinarie di Pisa vengono determinate tramite il metodo colorimetrico al Biureto, utilizzando un apposito kit e lo spettrofotometro Liasys, forniti dalla ditta Assel S.r.l. di Roma. Il kit contiene un reattivo al Biureto, formato da potassio sodio tartrato, ioduro di potassio, rame solfato e idrossido di sodio.
2 Metodi
Tramite la banca dati elettronica presente nell’ospedale didattico veterinario del Dipartimento di Scienze Veterinarie di Pisa sono state raccolte tutte le siero-elettroforesi zonali eseguite su siero di gatto comune Europeo e condotte su acetato di cellulosa dal relativo laboratorio di Patologia clinica tra Gennaio 2010 e Gennaio 2013.
Poi sempre tramite la suddetta banca dati elettronica sono stati raccolte tutte le siero-elettroforesi zonali eseguite su siero di gatto comune Europeo e condotte su gel di agarosio dal relativo laboratorio di Patologia clinica tra Febbraio 2013 e Dicembre 2014.
Infatti nel Gennaio 2013, come indicato nei materiali, in tale laboratorio è stata sostituita l’apparecchiatura per la siero-elettroforesi zonale e quindi è stato modificato anche il metodo di separazione elettroforetica delle proteine sieriche.
Al di là quindi della semplice attrezzatura è proprio diversa la procedura a cui l’operatore deve attenersi.
Con il precedente apparecchio, il MICROTECH648ISO, l’operatore, dopo aver opportunamente posizionato le componenti monouso del kit, doveva semplicemente caricare ciascun pozzetto del supporto portacampioni con 30 µl di siero. Dopo poco più di un’ora la macchina era in grado di fornire i risultati della siero-elettroforesi di un numero massimo di 48 campioni. [78bis] E’ chiaro però che per motivi di praticità prima di eseguire una corsa elettroforetica veniva raccolto un numero
Figura s.3.9, tratta da [78] Camera di migrazione (a dx) e piastra di alluminio (a sx).
Figura s.3.3, tratta da [78] Schermata software Elfolab
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sufficiente di campioni, per cui alcuni sieri potevano essere congelati a -20°C in attesa di essere esaminati.
La macchina automaticamente, una volta avviata la procedura, compiva tutte le fasi, compresa la lettura fotodensitometrica. La colorazione era con Rosso di Ponceau. [78bis]
Con il nuovo apparecchio, Pretty Interlab, l’operatore deve innanzitutto controllare sempre i livelli di acqua distillata, colorante (Blu Acido in soluzione acida), soluzione decolorante (soluzione acquosa concentrata di acido citrico) e liquidi reflui nei rispettivi contenitori esterni. Poi deve posizionare le componenti monouso dei kit negli specifici siti. Dopo di ciò deve caricare ciascun pozzetto del supporto portacampione con 30 µl di siero. [78]
In 40-45 minuti la macchina ha terminato la corsa elettroforetica di un numero massimo di 13 campioni e la piastra in gel di agarosio è pronta per essere sottoposta a lettura fotodensitometrica. [78] L’operatore deve quindi prendere le piastre e posizionarle nell’apparecchio densitometrico e tramite apposito software (Elfolab) deve procedere alla lettura di tali piastre. [78]
Così si ottiene il grafico densitometrico e le quantità relative delle varie frazioni proteiche rilevate. Se si vogliono ottenere anche le quantità assolute è necessario inserire nel software il livello delle proteine totali.
Nel laboratorio di Patologia clinica del Dipartimento di Scienze Veterinarie di Pisa le proteine totali sono determinate con il metodo colorimetrico al Biureto. Solitamente l’operatore procede così: pone 20 µl di ogni campione di siero in una cuvette monouso insieme a 1000 µl di reattivo al Biureto dell’apposito kit fornito dalla ditta Assel S.r.l.. Tali cuvette sono poi incubate a 37°C per 5 minuti. Intanto l’operatore provvede ad azzerare e calibrare l’apparecchio spettrofotometrico qualora non lo sia già. A quel punto i campioni sono letti con tale apparecchio: con il variare dell’assorbanza del campione varia la quantità delle proteine totali.
Il siero utilizzato sia per la determinazione delle proteine totali che per la siero-elettroforesi è stato sempre ottenuto mediante prelievo ematico dalla vena giugulare o meno frequentemente dalla vena cefalica dei gatti comuni europei che accedevano alla nostra struttura e necessitavano di esami emato-biochimici approfonditi. Il sangue intero prelevato era poi posto in provette con una capienza di 5 ml contenenti granuli di silicone e sprovvisti di qualsiasi tipo di anticoagulante. Tali provette di regola, dopo che si è formato il coagulo, sono centrifugate a 3000 giri al minuto per 5 minuti. Il siero è separato dal resto del materiale ed è posto in provette monouso. In attesa di eseguire la siero- elettroforesi queste vengono solitamente mantenute a +4°C oppure addirittura congelate a -20°C. Tornando alle siero-elettroforesi raccolte, queste sono catalogate in due gruppi dipendenti dal mezzo di supporto impiegato e quindi dal periodo temporale in cui sono state realizzate.
Per ciascuna siero-elettroforesi di ciascun gruppo è stato valutato il livello di proteine totali, il livello di albumina e il livello di globuline.
Ecco che per ogni gruppo sono state distinte le siero-elettroforesi a cui corrispondevano livelli di proteine totali entro l’intervallo 5,5-7,8 g/100ml (estremi inclusi) da quelle a cui corrispondevano livelli di proteine totali fuori dallo stesso intervallo.
Tra le siero-elettroforesi a cui corrispondevano livelli di proteine totali entro il suddetto intervallo sono state distinte le siero-elettroforesi dove il valore assoluto dell’albumina era compreso tra 2,8 e 4 g/100ml da quelle dove invece il valore assoluto dell’albumina era fuori da tale intervallo.
Tra le siero-elettroforesi dove il valore assoluto dell’albumina era compreso nel suddetto intervallo sono state distinte le siero-elettroforesi dove il valore assoluto delle globuline era compreso tra 2 e 4,5 g/100ml da quelle dove invece il valore assoluto delle globuline era fuori da tale intervallo. Tra le siero-elettroforesi dove il valore assoluto delle globuline era compreso nel suddetto intervallo sono state distinte le siero-elettroforesi che mostravano all’ispezione visiva un protidogramma e un grafico densitometrico a picchi regolari da quelle dove invece all’ispezione visiva risultava un protidogramma e/o un grafico densitometrico a picchi anomali.
Per ciascun gruppo, le siero-elettroforesi a cui corrispondevano livelli di proteine totali e valori assoluti di albumina e globuline entro i suddetti intervalli di riferimento e che presentavano, all’ispezione visiva, un protidogramma e un grafico densitometrico a picchi regolari sono state
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considerate riconducibili a soggetti potenzialmente sani. Tutte le altre sono state considerate riconducibili a soggetti potenzialmente malati. La figura s.3.10 riassume tutto il suddetto iter di selezione dei tracciati siero-elettroforetici. I suddetti intervalli di riferimento sono quelli
normalmente impiegati nel laboratorio di Patologia clinica del Dipartimento di Scienze Veterinarie di Pisa, quindi sono da lungo tempo validati ed utilizzati.
Figura s.3.10
Iter di selezione dei tracciati siero-elettroforetici raccolti.
Dopo di ciò sono stati accuratamente analizzati i risultati ottenuti in tutte le siero-elettroforesi che, per quanto detto, potevano essere considerate riconducibili a soggetti sani, all’interno di entrambi i gruppi. Infatti l’obbiettivo principale era elaborare specifici intervalli di riferimento per ogni frazione rilevata nel tracciato siero-elettroforetico in entrambi i gruppi, per quanto riguarda sia i loro valori assoluti che i loro valori relativi.
Ecco che per ciascun tipo di valore (assoluto e relativo), misurato all’interno di ogni frazione dei due gruppi, sono state elaborate specifiche distribuzioni di riferimento.
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Ogni distribuzione di riferimento è stata accuratamente valutata circa la sua normalità tramite il test D’Agostino-Pearson, per mezzo del software MedCalc®. Nelle poche distribuzioni dove non si aveva normalità si è operata una attenta rimozione di quei valori che costituivano outlier od errori, vista la loro posizione rispetto agli altri dati.
Ottenuta la normalità anche in queste distribuzioni, sono stati calcolati gli specifici intervalli di riferimento tramite un metodo non parametrico, definito metodo robusto, raccomandato dalle linee guida quando il numero di campioni a disposizione è ridotto (meno di 120 unità). [68] A tale
proposito è stato utilizzato il suddetto software Medcalc®. Nel calcolo degli intervalli di riferimento è stato deciso l’impiego del 90% dei valori di riferimento centrali, con un intervallo di confidenza del 90%.
Gli intervalli di riferimento sono stati calcolati non solo per i valori assoluti e relativi di ciascuna frazione proteica di entrambi i gruppi, ma anche per il relativo rapporto tra albumina e globuline, rapporto di estrema importanza nella interpretazione dei risultati della siero-elettroforesi.
Una volta fatto ciò le distribuzioni e i relativi intervalli di riferimento dello stesso tipo di frazione proteica rilevata con i due metodi siero-elettroforetici sono stati confrontati mediante un metodo non parametrico per dati indipendenti, il Mann-Whitney test. Cioè in altri termini si è voluto verificare se tra i valori misurati per la stessa tipologia di frazione proteica e ottenuti con metodi siero- elettroforetici diversi esisteva una differenza statisticamente significativa. In questo test esistono differenze statisticamente significative tra i dati posti a confronto se le loro distribuzioni si
sovrappongono per meno del 5%, quindi con un valore della probabilità a due code inferiore a 0,05. [68]
A quel punto l’attenzione è stata rivolta all’insieme delle siero-elettroforesi realizzate su gel di agarosio e, per quanto è stato detto, riconducibili a gatti comuni Europei potenzialmente patologici. Utilizzando gli intervalli di riferimento appena calcolati circa la quantità relativa di ogni frazione proteica è stato possibile stabilire la frequenza delle modificazioni presenti. Nell’occasione è stata effettuata simile valutazione per quanto riguarda le proteine totali, con l’intervallo fornito dal laboratorio, e il valore del rapporto tra albumina e globuline, con l’intervallo precedentemente calcolato.
Lo scopo era quello di avere un quadro generale delle modificazioni dei tracciati condotti su gel di agariosio ed esclusi dal calcolo degli intervalli di riferimento perché, per vari motivi, risultavano riconducibili a soggetti patologici.
Questa valutazione è stata effettuata impiegando solo i valori percentuali perché, come ampiamente discusso in letteratura, quelli relativi sono molto più affidabili, mentre quelli assoluti sono
condizionati dai livelli delle proteine totali e quindi variano anche quando in realtà l’aspetto del tracciato e del grafico densitometrico a picchi è normale. [84, 85, 186, 165, 126] Le quantità relative invece sono più indicative delle reali modificazioni del tracciato siero-elettroforetico. [186, 84, 85, 165, 71, 122, 181, 188]
Fatto ciò l’attenzione è stata rivolta a quei tracciati che hanno mostrato, rispetto ai nuovi intervalli, un incremento della frazione γ-globulinica.
Da ogni tracciato si è risaliti all’effettivo paziente tramite la solita banca dati elettronica e si è ricostruita la storia clinica al fine di stabilire quale era l’alterazione patologica presente al momento della realizzazione della siero-elettroforesi.
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CAPITOLO 4
RISULTATI
Tramite la banca dati elettronica dell’Ospedale didattico veterinario del Dipartimento di Scienze Veterinarie di Pisa è stato possibile recuperare 291 siero-elettroforesi zonali eseguite su siero di gatti comuni Europei e condotte su acetato di cellulosa dal relativo laboratorio di Patologia clinica tra Gennaio 2010 e Gennaio 2013. Quindi questi 291 tracciati costituiscono il gruppo delle siero- elettroforesi condotte su acetato di cellulosa.
Poi sempre tramite la suddetta banca dati elettronica è stato possibile recuperare 224 siero-
elettroforesi zonali eseguite su siero di gatti comuni Europei e condotte su gel di agarosio dal relativo laboratorio di Patologia clinica tra Febbraio 2013 e Dicembre 2014. Quindi questi 224 tracciati costituiscono il gruppo delle siero-elettroforesi condotte su gel di agarosio.
A seguito della valutazione dei livelli delle proteine totali mediante comparazione con il suddetto intervallo di riferimento (Pt tra 5,5 e 7,8 g/100ml) è emerso che:
Nel gruppo delle siero-elettroforesi condotte su acetato di cellulosa ben 165 tracciati hanno un valore di proteine totali che cade nell’intervallo di riferimento. Quindi poi 126 tracciati