regime di urgenza. Invece i metodi chimici si prestano bene ad essere adattati ad analisi
automatizzate, che stanno diventando sempre più diffuse, da una parte per la disponibilità delle opportune attrezzature a prezzi relativamente accessibili, dall’altra per gli alti livelli di precisione e qualità richiesti oggigiorno nella diagnostica di laboratorio. [84, 85]
Ogni metodo chiaramente possiede certi vantaggi e certi svantaggi, può presentare determinate limitazioni e può essere soggetto a possibili interferenze. [186, 164]
Il clinico perciò nel momento in cui richiede un esame di laboratorio di questo tipo o ne va ad interpretare i risultati deve tener conto di molteplici fattori. [164]
Qui di seguito saranno prima trattati i metodi fisici e poi quelli chimici, facendo tutte le opportune considerazioni e distinguo
I Metodi fisici
I metodi fisici per la determinazione delle proteine totali sono quei metodi che consentono di quantificare le proteine presenti all’interno di una certa soluzione sfruttando le proprietà fisiche di queste molecole. [84, 85, 165]
Questi metodi di solito presentano un’elevata semplicità e rapidità, tanto che sono utilizzati più che altro in regime di urgenza o quando mancano appositi macchinari per studi di natura chimica. [85, 69]
Il metodo fisico per eccellenza che ancora oggi viene utilizzato nella determinazione delle proteine totali presenti nel plasma o nel siero è il metodo refrattometrico. [165, 85, 84]
Esso è in grado di stimare la concentrazione delle proteine totali presenti in questi fluidi attraverso la valutazione dell’indice di rifrazione della luce che attraversa quelle soluzioni. [165, 164, 85, 84] Come indicato nel capitolo 2 le proteine disperse in una soluzione acquosa come il plasma o siero si comportano da veri e propri soluti. Poiché il grado di rifrazione della luce che attraversa un certa soluzione è proporzionale alla concentrazione dei suoi soluti, appare chiaro che anche le proteine disperse in quella soluzione contribuiscano a determinare questo grado di rifrazione. [117, 182, 165] È anche vero che all’interno del plasma o del siero le proteine non sono gli unici soluti presenti (si veda capitolo1) e quindi in misura minore anche altre sostanze, normalmente presenti in questi fluidi, possono condizionare il gradi di rifrazione della luce. [182, 117, 165]
Inoltre, sempre come indiato nel capitolo 2, le proteine possono modificare il grado di rifrazione della luce a seconda della loro struttura fisica. Ciò significa che l’indice di rifrazione si modifica non solo in base alla quantità di proteine presenti ma anche in base alla loro qualità. [117, 165, 169] E poiché la composizione sierica o plasmatica delle proteine varia a seconda della specie, come indicato nel capitolo 3, a rigore di logica in ogni specie a parità di quantità l’indice di rifrazione dovrebbe essere diverso. [169, 165] In realtà si è visto che negli animali domestici la differente composizione delle proteine plasmatiche e sieriche non comporta modificazioni dell’indice di rifrazione che abbiano un significato clinico. [169, 165] Perciò la qualità delle proteine presenti in questi casi non viene considerata.
E poiché in condizioni fisiologiche le proteine totali costituiscono i principali soluti del plasma o siero, solitamente le modificazioni dell’indice di rifrazione sono attribuite solo ad alterazioni della loro quantità. [165]
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Lo strumento utilizzato per saggiare il grado di rifrazione è il refrattometro. [84, 85] In veterinaria il refrattometro più utilizzato e versatile risulta quello manuale di Goldberg. [84] Questo presenta due scale, una indica il valore delle proteine totali, espresso in g/100 ml, e una indica il peso specifico delle urine. [84]
In alcuni refrattometri la scala che indica il valore delle proteine totali è calibrata tenendo conto della normale quantità degli altri soluti che possono interferire nella misurazione. [165] Invece in altri refrattometri la suddetta scala è calibrata con l’assunzione che cambiamenti di questo indice sono dipendenti solo dalle proteine presenti. [165]
Appare chiaro che nella determinazione delle proteine totali con questo metodo vi possono essere una serie di interferenti. [165, 84, 85, 169] Si tratta di tutta una serie di sostanze che disperse in queste soluzioni alterano l’indice di rifrazione della luce e quindi determinano un falso incremento delle proteine totali. [85, 165] Si tratta di sostanze come glucosio, urea, sodio, cloro… che in certe
condizioni patologiche possono raggiungere concentrazioni così elevate da diventare dei soluti capaci di modificare in modo significativo l’indice di rifrazione. [165, 84, 85]
L’emolisi invece, comportando la liberazione di emoglobina a livello ematico, non altera l’indice di rifrazione, ma crea una difficoltosa lettura del valore delle proteine totali. [169, 165] Inoltre può ridurre i livelli sierici di alcune proteine, come l’aptoglobina e l’emopessina, modificando così il valore totale.
L’iperbilirubinemia, almeno che non raggiunga concentrazioni veramente elevate, non determina modificazioni dell’indice di rifrazione. [169, 165]
Ecco che il campione sottoposto ad analisi in definitiva deve essere chiaro, non torbido, non lipemico e non emolizzato. [84, 85] Un moderato grado di emolisi o di ittero non interferisce. [84, 169]
Il refrattometro inoltre dovrebbe essere sottoposto a periodici controlli in quanto si è visto che potrebbe essere soggetto ad eventuali errori. Booij, 1972. [84]
Si tratta di un metodo che in definitiva, se ben usato e controllato, risulta abbastanza accurato, tanto che i suoi risultati sono ben correlati con quelli ottenuti tramite il metodo del biureto, metodo
chimico riconosciuto come metodo di riferimento per la determinazione delle proteine totali a livello ematico. [65, 85, 66] Una discrepanza maggiore sembrerebbe essere presente nei campioni
provenienti dalla specie aviarie, utilizzando le due tecniche. [65, 85]
Di solito con il metodo refrattometrico non vengono considerati affidabili i risultati ottenuti da campioni dove il contenuto proteico è inferiore a 2,5 g/100ml. [85] La correlazione con il metodo al biureto sembrerebbe essere tuttavia presente fino a valori di appena 0,6 g/100ml. [66, 85]
Inoltre anche la temperatura può condizionare in parte i risultati. [97, 165] In commercio esistono refrattometri detti a temperatura compensata: in questi non è necessario un quotidiano
aggiustamento in base alla temperatura ambiente e risultano essere molto più accurati. [97, 165] Infatti con temperatura superiore a 20° C si può ottenere un discostamento dal metodo al biureto anche di 0,7 g/100ml. [66, 165, 65]
Infine aspetto molto importante risulta considerare se ciò che si utilizza è plasma o siero. [165, 65] Come indicato nel capitolo 1 il siero differisce dal plasma per tutti quei fattori che hanno preso parte al processo coagulativo. In sostanza è il fibrinogeno che manca nel siero.
Tuttavia è necessario considerare che i due fluidi differiscono anche per altri elementi. [165, 2] Durante il processo coagulativo, dal quale poi si ottiene il siero, è possibile la diffusione di acqua a partire dagli eritrociti. [165] Ecco che alla fine del processo i soluti presenti nel siero potrebbero aver subito una diluizione, poiché è incrementata la quantità di solvente. [165, 117] E’ anche vero che si tratta di modificazioni veramente limitate, spesso considerate insignificanti. [165]
Invece quando si utilizza il plasma, al di là della differente composizione proteica, è necessario ricordare che sono stati aggiunti anticoagulanti, sostanze che possono pur sempre alterare l’indice di rifrazione comportandosi un po’ come soluti. [26, 165] E’ anche vero però che alcuni anticoagulanti, fatta eccezione per l’eparina, comportano liberazione di acqua dagli eritrociti e quindi il risultato finale in realtà può essere una diluizione dei soluti. [26, 165] Anche in questo caso le modificazioni
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che ne derivano sul calcolo delle proteine totali sono così limitate da non essere poi considerate. [165, 26]
Altri metodi fisici attualmente non vengono utilizzati.