Gabutti G
Professore Ordinario di Igiene e Medicina Preventiva Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli Studi di Ferrara
Sommario
Infezioni pregresse da HPV oncogeni, agenti in grado di eludere la risposta immunitaria dell’ospite, non necessariamente inducono immunità verso infezioni successive. Il livello di protezione conferito dall’infe- zione naturale è variabile e sono possibili reinfezioni o nuove infezioni. I vaccini sono stati sviluppati per prevenire l’acquisizione di HPV mediante l’induzione della risposta umorale, che impedisce l’ancoraggio e l’ingresso del virus nella cellula. L’elevato valore preventivo dell’immunizzazione è stato confermato nel corso dei numerosi trial clinici ed è stato dimostrato che la risposta immunitaria può essere efficacemente modulata in termini quali/quantitativi nonché di durata utilizzando sistemi adiuvanti innovativi. A fronte della documentata ed elevata efficacia clinica, tollerabilità e sicurezza dei vaccini, rimangono alcuni aspetti che richiedono ulteriori approfondimenti, tra cui quello relativo alla protezione a lungo termine.
Parole chiave: HPV; Risposta immunitaria; Durata della protezione; Protezione a lungo termine
Introduzione
I papillomavirus (HPV) sono agenti ubiquitari a DNA, strutturalmente costituiti da un capside senza involucro esterno. Il genoma ha la capacità di codifica- re per due proteine (L1 ed L2) ad elevato potere immu- nogeno che costituiscono l’involucro esterno e per 6 proteine precoci (E1, E2, E4, E5, E6 ed E7) necessa- rie per la replica del DNA virale e per l’assemblaggio delle nuove progenie virali nelle cellule infettate.
Sulla base dell’omologia genomica inferiore al 90% a livello del gene capsidico L1, vengono riconosciuti oltre 100 tipi di HPV che infettano l’uomo e che vengo- no classificati ad alto e basso rischio in base al loro potenziale oncogeno. I ceppi ad elevato potenziale oncogeno hanno una spiccata tendenza ad integrarsi nel genoma cellulare. In caso di integrazione si deter- mina l’interruzione del gene E2 con conseguente per- dita della sua funzione di controllo sull’espressione dei geni E6 ed E7, i cui prodotti interagiscono con protei- ne regolatorie del ciclo cellulare (p53 e pRB) inibendo- ne la funzione e determinano una elevata instabilità genomica delle cellule infettate e la perdita del control- lo della crescita cellulare.
Il ruolo causale degli HPV ad elevato rischio on- cogeno nel determinismo del carcinoma della cervice uterina è confermato dal punto di vista sia biologico che epidemiologico. Oltre al carcinoma della cervice uterina, gli HPV sono responsabili di altri carcinomi anogenitali (vulva, pene, vagina, ano) e dell’orofaringe. Tra i tipi ad elevato rischio oncogeno, HPV16 ed HPV18 causano oltre il 70% delle neoplasie cervicali,
mentre HPV16, HPV18, HPV45 ed HPV31 sono re- sponsabili di oltre il 90% dei casi di adenocarcinoma cervicale.
Dal punto di vista epidemiologico gli HPV sono virus ubiquitari e fino all’80% delle donne acquisisce un’infezione nel corso della propria vita, con un’inci- denza massima nella fascia di età 20-40 anni.
Nella maggior parte dei casi l’infezione viene bo- nificata e non si innesca il meccanismo dell’infezione persistente. Tuttavia, le infezioni sostenute dai tipi on- cogeni (HPV16 e HPV 18 in particolare) tendono a persistere più frequentemente rispetto a quelle soste- nute da HPV a basso rischio. L’infezione persistente da HPV oncogeno rappresenta il precursore del carci- noma cervicale invasivo. Dopo l’infezione della cervice uterina, si possono verificare lesioni squamose intrae- piteliali di basso grado (ASCUS/LSIL, CIN1) che gene- ralmente regrediscono spontaneamente. Se questa regressione non avviene, si possono verificare lesioni squamose intraepiteliali di grado elevato (HSIL, CIN2 e CIN3), che hanno una maggiore probabilità di evolvere fino al carcinoma invasivo. L’eventuale evoluzione ver- so l’insorgenza di carcinoma avviene in un lasso di tem- po pari a 10-20 anni rispetto al momento dell’infezione. Epidemiologicamente l’impatto degli HPV onco- geni è molto elevato; infatti si stima che ogni anno nel mondo si registrino 500.000 nuovi casi di carcinoma cervicale e circa 270.000 decessi.
Un punto chiave nell’evoluzione dell’infezione da HPV è svolto dalla risposta immunitaria che coinvolge sia la branca umorale che quella cellulo-mediata. Gli HPV on-
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cogeni hanno la particolarità di non essere citolitici, non provocare infiammazione, eludere il riconoscimento degli antigeni capsidici da parte delle cellule di Langerhans ed inibire la produzione degli interferoni di tipo alfa e beta; tutto questo rende gli HPV oncogeni agenti in grado di eludere la risposta immunitaria dell’ospite.
Oggi è noto che infezioni pregresse da HPV on- cogeni non inducono necessariamente immunità ver- so infezioni successive; pertanto, il livello di protezio- ne conferito dall’infezione naturale è variabile e sono possibili reinfezioni o nuove infezioni. Ad oggi non è stato definito il meccanismo in base al quale alcuni soggetti non sono in grado di innescare una risposta immunitaria efficace. Esiste invece un ampio consen- so sul ruolo chiave che viene svolto dalla risposta im- mune umorale; in particolare si ritiene che anticorpi diretti verso L1 abbiano la proprietà di prevenire l’anco- raggio e l’ingresso del virus nella cellula. L’immunità cellulo-mediata è importante per eliminare la maggior parte delle infezioni naturali.
Sulla base di queste conoscenze sono stati svi- luppati i vaccini preventivi con l’obiettivo di prevenire l’in- fezione da HPV mediante l’induzione della risposta umorale (anticorpi verso L1). Lo sviluppo dei vaccini pre- ventivi è stato possibile in seguito alla dimostrazione che l’espressione di proteine capsidiche L1 in cellule eucariote risultava nell’auto-assemblaggio in particelle simil-virali (VLP o virus-like particles), strutturalmente simili ai virus HPV ma prive di materiale genetico.
L’importanza della risposta immune
L’immunità anticorpo-mediata verso L1 è tipo-spe- cifica e anticorpi diretti contro VLP L1 proteggono con- tro l’infezione e la malattia.
È importante sottolineare che il livello di risposta anticorpale ottenibile mediante vaccinazione con VLP L1 è nettamente superiore a quello evidenziabile dopo infezione naturale. Questo fatto è ascrivibile non solo all’elevato potere antigenico delle VLP L1 ma anche alle caratteristiche biologiche (elusività) degli HPV, oncoge- ni in particolare, e probabilmente alla via di sommini- strazione (parenterale im), che permette un migliore uptake degli antigeni rispetto alla “normale” via di acqui- sizione dei virus selvaggi a livello delle mucose genitali. La vaccinazione previene l’infezione mediante l’in- duzione di anticorpi neutralizzanti che si legano a siti presenti sul capside e prevengono l’infezione della cel- lula ospite. L’OMS ritiene che gli anticorpi neutraliz- zanti siano fondamentali per la protezione post-vacci- nale nei confronti dell’infezione da HPV anche se non esiste dimostrazione di un correlato immunitario di pro- tezione né a breve né a lungo termine.
Da un punto di vista pratico quello che si vuole ottenere vaccinando contro HPV è l’induzione di una risposta umorale, con elevati titoli di anticorpi anti-VLP L1 neutralizzanti e di lunga durata.
Per quanto concerne il primo aspetto, la tecnolo- gia vaccinologica moderna permette di modulare qualità e quantità della risposta immune antigene-specifica mediante l’utilizzo di adiuvanti. Nel caso dell’infezione da HPV è importante elicitare mediante vaccinazione la
produzione di elevati livelli di anticorpi neutralizzanti se- rici, poiché una quota di questi ultimi dovrà essere di- sponibile a livello cervico-vaginale (per trasudazione o essudazione) per prevenire e bloccare nuove infezioni.
Nei soggetti vaccinati gli anticorpi neutralizzanti rappresentano la prima linea di difesa, prontamente di- sponibile in caso di esposizione al virus. È bene sottoli- neare che gli anticorpi neutralizzanti non vengono pro- dotti in loco, a livello cervicale, ma sono di provenienza dalla circolazione ematica e raggiungono il muco cervi- cale per trasudazione o essudazione. In realtà non si è ancora completamente compreso quale sia il meccani- smo con cui gli anticorpi neutralizzanti raggiungono il distretto cervico-vaginale, cioè se sia più importante un meccanismo di trasudazione che prevede il passaggio delle IgG dal compartimento intravascolare al tratto ge- nitale mediante ultrafiltrazione oppure un meccanismo di essudazione con la fuoriuscita di liquidi biologici (sie- ro) contenenti IgG in sede di microtrauma.
Comunque, in base alle più recenti conoscenze scientifiche, la disponibilità di elevati titoli anticorpali neutralizzanti a livello della mucosa cervicale al mo- mento dell’esposizione al virus rappresenta la migliore garanzia di protezione. Questo è un aspetto molto im- portante poiché dopo l’immunizzazione, l’eventuale esposizione al virus non stimola in modo significativo la produzione di elevati livelli anticorpali in rapporto alla natura elusiva degli HPV che rende poco visibili i virus al pool di cellule della memoria nella fase precoce del- l’infezione. In altre parole le eventuali reinfezioni non hanno la capacità di indurre una risposta sistemica; quest’ultima è stata dimostrata esclusivamente dopo challenge con vaccino e quindi dopo un booster per via parenterale, che non mima la normale modalità di in- gresso degli HPV.
Da tutto questo deriva la necessità che la vacci- nazione induca un’importante risposta anticorpale non solo in termini qualitativi (anticorpi neutralizzanti) ma anche quantitativi e che renda disponibili elevati livelli anticorpali neutralizzanti sia a livello sistemico che al sito di infezione.
Tutto questo non esclude che un ruolo importan- te venga svolto anche dalla risposta cellulo-mediata (CMI). Quest’ultima avrebbe la funzione di supportare la produzione anticorpale e di favorire la clearance del- l’infezione.
L’induzione di cellule B della memoria è un altro punto cruciale per la persistenza a lungo termine della protezione indotta mediante vaccinazione. È stato di- mostrato che il ricorso agli adiuvanti, ed in particolare al sistema adiuvante AS04, ha la proprietà di indurre un’ele- vata frequenza di cellule B della memoria contribuendo alla generazione di plasma-cellule a lunga vita ed alla risposta anticorpale elevata e mantenuta nel tempo.
Protezione a lungo termine indotta con il vaccino bivalente
Sulla base delle acquisizioni scientifiche sopra riportate sono stati sviluppati i vaccini preventivi per HPV con l’obiettivo principale di prevenire l’insorgenza del carcinoma cervicovaginale.
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In particolare, a seguito delle prime indicazioni sulla potenzialità delle VLP L1 nell’impattare sul carci- noma della cervice uterina, GSK ha sviluppato un vac- cino bivalente (Cervarix) contenente VLP L1 dei tipi HPV16 ed HPV18 con il razionale di intervenire verso i tipi responsabili di circa il 70% di tutti i casi di CIN2/3 e dei casi di carcinoma cervicale e di circa il 25% di tutti i casi di CIN1. Le VLP L1 contenute nel vaccino sono prodotte mediante tecnologia del DNA ricombi- nante utilizzando un sistema di espressione del Bacu- lovirus in cellule derivate da Trichoplusia ni (Hi-5 Rix4446). Il vaccino contiene un nuovo sistema adiu- vante, denominato AS04, costituito da monofosforil li- pide A (MPL), cioè da un lipopolisaccaride detossifica- to ottenuto da Salmonella minnesota adsorbito a idros- sido di alluminio Al(OH)3. La schedula vaccinale preve- de 3 dosi da somministrarsi secondo lo schema 0, 1, 6 mesi; ogni dose contiene 20 mg di VLP L1 di HPV16, 20 mg di VLP L1 di HPV18, 50 mg di AS04 e 0,5 mg di Al3+ in totale.
L’utilizzo del sistema adiuvante AS04 ha la fun- zione di ottimizzare la risposta immunologia stimolan- do le cellule presentanti l’antigene (APC) attraverso i recettori toll-like TLR-4. Le cellule dendritiche (APC) stimolate secernono citochine e presentano gli antige- ni VLP L1 ottimizzando la risposta adattativa, coinvol- gendo sia le cellule B che T e determinando lo sviluppo di un clone di cellule di memoria antigene-specifiche.
La potenzialità dell’adiuvante AS04 è stata valuta- ta rispetto alla risposta immune indotta con VLP L1 di HPV16/18 in formulazioni contenenti solo idrossido di alluminio. Nell’uomo è stato dimostrato che, nel corso di un follow-up fino a 4 anni, il sistema adiuvante AS04 induce una risposta anticorpale verso VLP L1 di HPV16/ 18 significativamente più elevata e persistente rispetto ai sali di alluminio. In particolare, i livelli anticorpali così elevati dopo l’utilizzo di vaccino contenente AS04 sono stati confermati utilizzando diverse metodiche, quali ELISA (per la determinazione degli Ab totali), test di pseudo-neutralizzazione (per la valutazione specifica degli Ab neutralizzanti) e inhibition ELISA (per la determina- zione dei soli Ab epitopo-specifici). È stato altresì dimo- strato che, un mese dopo la terza dose, la frequenza delle cellule B della memoria specifiche per VLP L1 di HPV16 nei soggetti vaccinati era significativamente più elevata rispetto a quella ottenuta con i sali di alluminio. Un trend simile, seppur non significativo, è stato eviden- ziato verso VLP L1 di HPV18.
Nel corso dei diversi trial clinici di fase II e III, accanto alle valutazioni su sicurezza, tollerabilità ed efficacia, sono state anche condotte analisi sull’immu- nogenicità valutando il livello della risposta umorale in- dotta mediante immunizzazione e la durata della ri- sposta immunitaria.
Nel primo studio di fase II, oltre alla dimostrazio- ne di un’elevata efficacia verso l’infezione incidente e verso l’infezione persistente nella coorte ATP (accor- ding to protocol), la percentuale di sieroconversione dopo tre dosi (mese 7) è stata pari a 100% e 99,7% rispettivamente per HPV16 e HPV18. Al mese 18 tutte le donne immunizzate avevano sieroconvertito sia per
HPV16 che HPV18. Il livello di anticorpi (espresso come titolo geometrico medio, GMT) è risultato al mese 7 significativamente più elevato nelle donne immunizza- te rispetto al gruppo placebo.
In particolare il GMT nelle donne immunizzate eccedeva di oltre 80-100 volte il livello anticorpale ri- scontrabile in soggetti con pregressa infezione natura- le da HPV16 ed HPV18. Nelle donne vaccinate i livelli anticorpali sono rimasti persistentemente elevati al mese18, risultando da 10 a 16 volte più elevati rispetto a quanto osservato post-infezione naturale.
Il follow-up delle donne incluse nell’estensione dello studio di fase II è proseguito e a 6,4 anni i livelli anticorpali raggiunti dopo vaccinazione sono risultati almeno 11 volte più elevati rispetto a quanto riscontra- to dopo infezione naturale. Questo dato è stato osser- vato determinando il titolo anticorpale sia mediante test ELISA che con il test di pseudo-neutralizzazione. Esistono evidenze che il test ELISA impiegato in que- sti trials per la rilevazione degli anticorpi anti-HPV16 e -HPV18 ha, in tutte le fasce di età esaminate, un ele- vato grado di correlazione con quanto dosato con il test di pseudo-neutralizzazione, ritenuto altamente af- fidabile; ciò consente di dichiarare che il test ELISA è un eccellente surrogato per l’attività neutralizzante e può essere utilizzato per la valutazione della risposta indotta dalle VLP L1.
Occorre precisare che per lo studio di fase II è prevista un’ulteriore estensione del follow-up fino a 9,5 post-vaccinazione. Recentemente sono stati presen- tati i dati di immunogenicità a 7,3 aa.; tutte le donne incluse nello studio sono rimaste sieropositive per an- ticorpi verso HPV16 e HPV18. I titoli geometrici medi per entrambi gli antigeni hanno raggiunto un plateau 18-24 mesi dopo l’immunizzazione e successivamen- te sono rimasti stabili. I livelli anticorpali sono rimasti almeno 11 (HPV18) e 13 (HPV16) volte più elevati ri- spetto ai livelli evidenziati post-infezione naturale.
Contestualmente alle fase finali dello studio este- so di fase II, è iniziato un trial clinico di fase III, deno- minato studio PATRICIA, che ha coinvolto un’ampia po- polazione (oltre 18.000 donne sane), di età compresa tra 15 e 25 anni. Rispetto agli studi precedenti, al mo- mento dell’arruolamento vi erano donne sieronegative e DNA negative, sieropositive e DNA negative, sierone- gative e DNA positive e sieropositive e DNA positive per HPV16 o HPV18. Questo schema metodologico ha consentito di realizzare uno studio che esaminava una popolazione più simile a quella del contesto reale, rispetto alla popolazione “naïve” esaminata in prece- denza.
Il 99,5% delle donne sieronegative al momento dell’arruolamento ha sieroconvertito sia per HPV16 che per HPV18 dopo la seconda e terza dose. Al mese 7 i titoli anticorpali raggiunti nelle vaccinate erano signifi- cativamente e consistentemente più elevati rispetto ai livelli evidenziati post-infezione naturale.
L’analisi finale dell’efficacia della vaccinazione nelle donne arruolate in questo studio di fase III è stata recentemente pubblicata ed è stata confermata l’ele- vata efficacia del vaccino adiuvato con AS04 nei con-
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fronti di CIN2+ associati con le infezioni da HPV16/18 ed altri tipi HPV oncogeni non inclusi nel vaccino.
Nel corso di un altro trial clinico è stata valutata la possibilità di immunizzare le ragazze di 10-14 anni di età. Per effettuare questo confronto sono state arruolati 773 soggetti: 458 di 15-25 anni e 158 di 10-14 anni. Tutte sono state immunizzate con tre dosi di vaccino bivalente secondo la schedula 0, 1, 6 mesi. Un mese dopo la terza dose, il tasso di sieroconversione è risul- tato pari al 100% per entrambi gli antigeni in tutti i sog- getti. L’immunogenicità nelle ragazze di 10-14 anni è risultata non inferiore a quella evidenziata nel gruppo 15-25 anni in termini di sieroconversione. Per quanto riguarda i titoli anticorpali raggiunti, i GMT nelle ragazze di 10-14 anni sono risultati sostanzialmente più elevati rispetto a quanto osservato nel gruppo 15-25 anni e nel- le donne arruolate nel primo studio di fase II di efficacia. L’immunogenicità a lungo termine in ragazze di 10-14aa di età è stata valutata nel corso di uno studio con follow-up a 36 mesi dalla prima dose. Il 100% di ragazze sono risultate sieropositive per anti-HPV16 ed anti-HPV18; il picco anticorpale è stato raggiunto al mese 7 e successivamente è calato. Al mese 36 i titoli anticorpali verso entrambi gli antigeni sono rimasti si- gnificativamente più elevati rispetti a quelli rilevati dopo infezione naturale.
È anche in corso uno studio di valutazione del- l’immunogenicità e sicurezza del vaccino bivalente in donne di età compresa tra i 26 ed i 55 anni ed i risultati relativi al follow-up a 24 mesi sono già stati pubblicati. Obiettivo dello studio era la dimostrazione della non inferiorità dei tassi di sieroconversione riscontrati in donne di età 26-45 e 46-55 aa rispetto a quanto rile- vato in donne di età 15-25 aa.
Complessivamente nella prima fase dello studio sono state arruolate 667 donne; oltre il 70% delle don- ne valutate nella coorte ATP erano sieronegative per HPV16 ed HPV18 al momento 0. Tutte le donne siero- negative, in tutti i gruppi di età, hanno sieroconvertito per HPV16 ed HPV18 un mese dopo la terza dose.
La non inferiorità dei tassi di sieroconversione nelle donne di età 26-45 e 46-55 anni rispetto alle donne di età 15-25 aa è stata confermata; in tutte il tasso di sieroconversione è stato pari al 100%. Al mese 24 tut- te le donne sono rimaste positive per anti-HPV16 e anti-HPV18, a prescindere dal gruppo di età di appar- tenenza.
Il picco di risposta anticorpale in termini di GMT è stato osservato al mese 7 e la cinetica degli anticorpi è risultata simile a quanto osservato negli studi di fase II e III con un modesto decremento al mese 18 ed il raggiungimento di un plateau stabile al mese 24, in linea con quanto osservato in donne di età 15-25 aa e comunque significativamente superiore ai titoli anticor- pali indotti dall’infezione naturale.
Al mese 24 su un totale di 250 donne è stata valutata la correlazione tra il livello anticorpale sierico e quello rilevabile nelle secrezioni cervicovaginali. I co- efficienti di correlazione sono risultati elevati a prescin- dere dal gruppo di età considerato. Questo dato merita un’attenta valutazione poichè si ritiene che il principale
meccanismo di protezione nei confronti dell’infezione da HPV è mediato dagli anticorpi neutralizzanti, dispo- nibili a livello cervico-vaginale. Il fatto che il vaccino bi- valente, grazie all’azione dell’adiuvante AS04, induca un’elevata risposta anticorpale comporta anche una ottimale disponibilità di Ab a livello cervicovaginale, ove possono agire in modo efficace contro gli HPV.
Molto recentemente, partendo dai risultati del pri- mo studio di efficacia del vaccino bivalente è stata sti- mata la persistenza a lungo termine della risposta an- ticorpale verso HPV16 e HPV18. Questi risultati sono stati poi analizzati, applicando 3 differenti modelli sta- tistici (power-law e power-law modificato), al fine di ot- tenere delle proiezioni sulla durata nel lungo termine dei titoli anticorpali. Si è visto che, con tutti i tre mo- delli applicati, i livelli anticorpali verso HPV16 e HPV18 rimangono significativamente superiori a quelli eviden- ziabili dopo l’infezione naturale per almeno 20 anni e, nel modello “più ottimistico”, per tutta la vita.
È importante sottolineare che tali risultati sono stati conseguiti senza ricorrere ad alcuna dose di ri- chiamo che, nella prospettiva di un intervento di sanità