168 PREMI XIII PREMIO DI STUDIO CITTÀ DI AVERSA

Numerose varianti genetiche sono coinvolte nel metabolismo, nel trasporto e nel meccanismo d’azione dei farmaci ed hanno effetti sia sulla farmacocinetica che sulla farmacodinamica ( 3 )

Tuttavia l' identificazione dei geni candidati sui quali l'analisi deve essere focalizzata è un processo complesso, poiché la maggior parte dei farmaci antineoplastici necessita di un metabolismo attivante o subisce l'azione di enzimi inattivanti o di sistemi di escrezione. Infatti, i prodotti genici possono essere direttamente o indirettamente coinvolti nell' attività dei farmaci antineoplastici.

Le varianti genetiche della 5,10-metilentetraidrofolato reduttasi ( MTHFR ) sono tra i polimorfismi più studiati per l’ identificazione di possibili indicatori per la risposta agli antifolici.

Varianti genetiche associate all’enzima MTHFR

Sono stati descritti 2 polimorfismi più comuni relativi al gene MTHFR: il polimorfismo C677T (presente nell’ esone 4) e il polimorfismo A1298C (nell’esone 7); entrambi il risultato di una mutazione puntiforme per sostituzione di basi.

Nel caso del polimorfismo C677T si tratta di una transizione da citosina a timina al nucleotide 677, che comporta la sostituzione di un’ alanina in valina al codone 222. Tale variazione interessa il sito catalitico della MTHFR e determina la formazione di un enzima termolabile con ridotta attività enzimatica. Individui eterozigoti (CT) presentano, rispetto al costituzionale (CC), una attività enzimatica del 65%, mentre negli omozigoti (TT) l’attività enzimatica è del 30% (8). Questa ridotta attività enzimatica determina un aumento di omocisteina e un abbassamento della concentrazione intracellulare di 5-metil-THF (11).

Il polimorfismo A1298C è dovuto a una transversione di una adenina in citosina al nucleotide 1298 e determina la sostituzione del glutammato con l’alanina al codone 429 (12). Tale variazione interessa il dominio regolatore della MTHFR, determinando la formazione di un enzima che risulta essere insensibile alla SAM. Gli omozigoti per la variante C1298 non hanno proprietà enzimatiche distinguibili dal costituzionale. Il decremento dell’ attività enzimatica in questi individui risulta meno pronunciato rispetto alla variante T677 (65%)

non sembra sufficiente a variare i livelli plasmatici di omocisteina. Linfociti prelevati da individui omozigoti (CC) mostrano un’ attività enzimatica del 60% rispetto al selvatico (AA) in vitro.

Individui eterozigoti per entrambe le mutazioni 677CT e 1298AC hanno dimostrato di avere un’ attività enzimatica del 50-60% rispetto al selvatico (8).

In genere nella popolazione europea ed italiana in particolare, la variante genetica C677T di MTHFR presenta una frequenza di omozigoti per l' allele 677T di circa 8-20% mentre per gli eterozigoti la frequenza è di circa il 40%. Per quanto riguarda A1298C si può osservare una frequenza di omozigoti per l' allele 1298C di circa il 10% mentre per gli eterozigoti la frequenza è circa il 40% (13).

Fig. 2 . Localizzazione citogenetica : 1p36.3

169 PREMI

XIII PREMIO DI STUDIO - CITTÀ DI AVERSA

Il Metotrexato

Gli antifolici occupano un posto di rilievo nella terapia antineoplastica poiché hanno prodotto le prime remissioni nelle leucemie.

Per quanto riguarda la Leucemia Linfoblastica Acuta ( LLA ) dell'età pediatrica i protocolli terapeutici prevedono l' impiego diffuso anche del Metotrexato (MTX), un inibitore della diidrofolato reduttasi, ampiamente utilizzato come agente antineoplastico anche nel trattamento di vari tumori solidi e nelle neoplasie ematologiche.

L’ acido folico è una componente essenziale della dieta e da esso derivano una serie di cofattori tetraidrofolici che forniscono gruppi monocarboniosi per la sintesi di precursori del DNA e dell’ RNA. Per agire da cofattore l’ acido folico, all’ interno della cellula, viene ridotto dalla diidrofolatoreduttasi (DHFR) a tetraidrofolato (FH4). Il metotrexato, che agisce come un antimetabolita, legandosi alla DHFR (fig 3), con una affinità almeno mille volte superiore rispetto a quella del normale substrato, previene la sintesi del FH4, causando un deficit intracellulare acuto di alcuni coenzimi folici tra cui il 5,10-metilen-THF e con l’ accumulo intracellulare del substrato inibitorio tossico, diidrofolato ( FH2 ), ( che a sua volta inibisce sia la timidilato sintetasi, sia gli enzimi coinvolti nella biosintesi delle purine). Le reazioni di trasferimento monocarboniose cruciali per la sintesi delle purine vengono interrotte, bloccando la sintesi del DNA e del RNA e di conseguenza la proliferazione cellulare esponenziale tipica delle cellule neoplastiche.

Tuttavia il metotrexato è un farmaco solo parzialmente selettivo per le cellule tumorali, poichè uccide le cellule durante la fase S del ciclo cellulare ed è quindi tossico per le cellule normali a divisione rapida, come quelle del midollo osseo e dell’ epitelio intestinale. Infatti dopo 5-10 giorni dalla somministrazione del farmaco si ha mielosoppressione, trombocitopenia e mucositi. Il MTX può inoltre causare polmonite, caratterizzata da infiltrati infiammatori che tendono a regredire dopo l’ interruzione della terapia, cirrosi e fibrosi epatica, che si manifestano dopo alcuni mesi di trattamento continuativo con il farmaco usato per via orale; inoltre i pazienti trattati possono essere a rischio emorragie o infezioni potenzialmente fatali. Ciononostante gli effetti tossici possono essere antagonizzati dalla somministrazione di Leucovorin (5-Formil-FH4 ; acido folinico) un coenzima folico che trasportato da un carrier all’ interno della cellula viene convertito ad altri cofattori folici attivi.

Il Metotrexato, inoltre, risulta essere di grande aiuto nel mantenimento della remissione della leucemia, in particolare quando viene somministrato a intermittenza alla dose di 30 mg/m2 per via intramuscolare due volte alla settimana, oppure a dosi “urto”di 175-525 mg/m2 per due giorni una volta al mese ma è scarsamente efficace nelle leucemie dell’ adulto.(14)

Obiettivi

I protocolli chemioterapici per il trattamento dei vari tipi di leucemie vengono stabiliti in base a parametri clinico-biologici e prognostici.

Nonostante ciò, una percentuale di pazienti risponde negativamente e presenta effetti collaterali che possono essere anche molto gravi.

Inoltre la variabilità della risposta farmacologica rimane uno dei problemi più rilevanti del trattamento delle leucemie. Dati gli scarsi risultati ottenuti in sottogruppi di pazienti risultati resistenti alla terapia, nella programmazione della chemioterapia diventa sempre più importante selezionare i pazienti sulla base di determinanti molecolari e genetici che possano influenzare l'efficacia del trattamento.

Poichè il Metotrexato (MTX) rappresenta uno dei fondamentali chemioterapici utilizzati nei protocolli terapeutici internazionali per il trattamento della Leucemia Linfoblastica Acuta (LLA), l’ accumulo intracellulare di 5,10-metilene-tetraidrofolato risultante dalle varianti genetiche di MTHFR, C677T e A1298C, può compromettere l’ effetto citotossico di tale farmaco perché l’ attività del MTX dipende dall’ interazione competitiva con il metabolismo dei folati.

Pertanto il lavoro di tesi svolto ha avuto come scopo quello di analizzare :

1. le frequenze delle varianti genetiche C677T e A1298C del gene MTHFR in una popolazione di bambini affetti da LLA diagnosticati e trattati tra il 1990 e 2009 presso il Servizio di Oncologia Pediatrica della