Cosciani Cunico E.1, Fierro A.2 ,Finazzi G.1, Ruggiero V.1, Oliverio E.1, Sabatucci G., Losio M. N.1, Varisco G.1
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna – Reparto Tecnologie Acidi Nucleici Applicati agli Alimenti, Brescia 2Centrale del latte di Brescia s.p.a.
Keywords: Bacillus cereus, latte microfiltrato, microbiologia predittiva
SUMMARY
B. cereus is a spore forming gram-positive bacterium. The spores are insensitive to the pasteurization and can stick to all kinds of surfaces (1, 2). B.cereus psychotropic strains are isolated worldwide in milk production (3). In favourable conditions, the spores may germinate into vegetative cells capable of producing food poisoning toxins. For the bacterium characteristic, the micro- filtered pasteurized milk could generate a risk for the consumer. A predictive mathematical model was generated using the database ComBase (4) and validated through specific challenge test in milk. INTRODUZIONE
Il Bacillus cereus (B.cereus) è un microrganismo gram-positivo, anaerobio facoltativo che si può trovare in forma vegetativa o in forma sporigena, è in grado di produrre diversi tipi di tossine dannose per l’uomo. Le spore del B.cereus si trovano nell’ambiente, il suolo può contenerne fino a 100000 ufc/g; le derrate alimentari possono essere contaminate attraverso il terreno (contaminazione diretta) o per contaminazione secondaria (veicolate da insetti). Gli alimenti dove è maggiormente rilevata la presenza del bacillo sono riso, verdure, prodotti carnei, ma anche latte e latticini (2). Negli impianti di trasformazione alimentare, si possono ritrovare le spore del bacillo in quanto sopravvivano senza nutrimento o acqua per anni, sono insensibili a trattamenti termici di pastorizzazione, D92 = 96’, alle radiazioni, ai disinfettanti e ad ambienti fortemente acidi o alcalini. Le spore sono altamente idrofobe e sono in grado di aderire a qualsiasi superficie. Tali peculiarità supportano dati scientifici che riportano come l’incidenza del batterio sia maggiore nel latte trattato termicamente che nel latte crudo (35-48% vs 9%) (1, 2). Se si trovano in substrati favorevoli, le spore sono in grado di germinare e, all’inizio della fase stazionaria di crescita batterica, producono tossine diarroiche o emetiche (2). Generalmente i ceppi di B.cereus sono mesofili, tuttavia, esistono ceppi del bacillo in grado di crescere a temperature inferiori a 8°C (3). In letteratura è riportato che, se il bacillo è presente nel latte pastorizzato, la sua concentrazione iniziale sia comunque contenuta, <10 ufc/ml, e che, se l’alimento è mantenuto ad una temperatura inferiore a 6°C per 5 giorni, la concentrazione rimanga sotto le 105 ufc/ ml, limite inferiore considerato dannoso all’uomo (4). Tuttavia nuove tecnologie di processo, come la microfiltrazione del latte pastorizzato, permettono di attribuire al prodotto una vita commerciale (shelf-life) più lunga, fino a 20 giorni di conservazione a temperature di refrigerazione. Considerando la necessità, per gli operatori del settore alimentare, di valutare il rischio microbiologico del proprio prodotto (Reg. CE 852 del 2004), e che, mentre i soli esami diagnostici sul prodotto finito non risultano idonei a tal fine (2), ma che, al contrario, l’utilizzo di modelli di microbiologia predittiva è avvallato dalla normativa comunitaria (Reg. CE 2073 del 2005), scopo del lavoro è stato, quindi, la costruzione e la validazione di un modello matematico, alimento specifico, in grado di valutare l’evoluzione del B. cereus in funzione della temperatura di stoccaggio del latte. Il modello determina, nella matrice alimentare, il tempo necessario per arrivare al limite
minimo di concentrazione batterica potenzialmente dannosa per il consumatore (5). Ulteriore fine è stato quello di creare un foglio di calcolo, basato sul modello sperimentale, utile per le aziende alimentari e gli organi di controllo, che, potendo inserire un profilo termico di conservazione, ed una concentrazione batterica iniziale riuscirebbero a visualizzare, in grafico, l’evoluzione del batterio nel tempo.
MATERIALI E METODI
Modello matematico di microbiologia predittiva. Dalla banca dati ComBase (4) sono stati estratti 9 record riguardanti l’andamento della concentrazione di diversi ceppi di B.cereus nel latte pastorizzato in un range di temperatura variabile dai 5 ai 13°C. Il tasso di crescita dei batteri (rate) è stato calcolato utilizzando il software DMfit (4) su modello primario Baranyi (6). Il modello secondario, che relaziona la rate alla temperatura del substrato, è stato generato considerando che la radice quadrata della rate è direttamente proporzionale alla temperatura ambientale (fino all’optimum di crescita batterica). Le variabile del modello e i parametri statistici sono stati calcolati utilizzando la funzione di regressione dei dati del programma Excell® (7). L’accuratezza del modello è stata calcolata secondo le indicazioni di Pin e collaboratori (8).
Validazione del modello predittivo.
Preparazione del ceppo batterico. Tre ceppi di B.cereus, ATCC11778 (I), da collezione internazionale, 186656/2 (II), dalla collezione dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (IZSLER), isolato da ricotta, e il ceppo BC1 (III), isolato da latte microfiltrato della Centrale del latte di Brescia s.p.a., sono stati rivitalizzati in terreno liquido (Brain Heart Infusion OXOID CM1032) con due passaggi successivi a 37°C per 24 ore. Le sospensioni batteriche, sotto forma di spora, sono state centrifugate a 12000 rpm per 5 minuti e ri-sospese in soluzione fisiologica sterile e successivamente titolate in terreno generico per la crescita batterica (PCA agar, Oxoid CM0325) incubato per 48 ore a 37°C. Le sospensione dei ceppi di B.cereus sono state diluite in base dieci fino alla concentrazione presunta di 105ufc/ml.
Inoculo e incubazione delle unità di prova. Due lotti di produzione di latte pastorizzato e microfiltrato sono stati utilizzati per il calcolo della rate dei diversi ceppi di B.cereus. Per ogni lotto, sono state allestite 36 unità di prova, costituite da 50 ml di latte distribuito in provette sterili. Il volume di inoculo rispetto al volume di latte inoculato è stato pari all’1%. Le prime 10 unità di prova sono state inoculate con il ceppo I, le seconde con il ceppo II e le terze 10 con il ceppo III, le rimanenti 6 sono state utilizzate come controllo negativo. Le provette di latte inoculate, e non, sono state incubate a 8°C o a 12 °C, in funzione della psicrotrofia del ceppo, per 20 giorni.
Calcolo del tasso di crescita batterico. Le rate dei diversi ceppi batterici cresciuti nel latte microfiltrato, alle rispettive temperature di incubazione, sono state calcolate utilizzando il programma DmFit (4).
RISULTATI
Il calcolo della rate dei dati estratti dalla banca dati ComBase, con relativo record di riferimento, è riportato in tabella 1.
Tabella 1: legenda dei record della banca dati ComBase, le temperatura di conservazione del latte e la rate calcolata con
il programma DmFit
L’equazione 1 descrive il modello secondario sperimentale, alimento specifico, generato dagli stessi dati e l’errore standard del modello.
Eq1 √rate=0,026*Temp-0,025 ± 0,036 Il fattore di accuratezza (Af) è risultato pari a 1,3.
I risultati del challenge test, con i relativi parametri del modello primario, sono riportati in tabella 2 e nelle figure 1 e 2.
Tabella 2: descrizione del ceppo, del lotto, della temperatura e dei parametri statistici del modello, fit, ES e R2.
I grafici riportati nelle figure 1, 2 descrivono l’andamento della concentrazione del B.cereus, espressa come Log delle ufc per ml nel tempo, nei due lotti di latte microfiltrato a 8 e 12°C. Nei campioni di controllo, analizzati all’inizio, a metà e a fine shelf life, il bacillo non è mai stato isolato.
fig. 1: concentrazione di B.cereus I, II, III (n ) nel lotto 1 a 8°C.
Fit dei dati dal programma DMfit (─) Δt=72h
fig. 2: concentrazione di B.cereus I, II, III (n ) nel lotto 2.
Ceppi I e II incubati a 8°C, ceppo III a 12°C. Fit dei dati dal programma DMfit (─) Δt=72h.
Il grafico in figura 3 rappresenta il modello sperimentale e i dati del challenge test
fig 3: √rate di ceppi di B.cereus a diverse temperature. Ceppi dei record di ComBase (¸), ceppo BCI(▪), ceppo BCII(·),
ceppo BCII(p).
DISCUSSIONE
Il modello sperimentale, se pur generato con un esiguo numero di dati, descrive l’andamento del B.cereus nel latte pastorizzato in modo soddisfacente (Af=1,3 R2=0,86) in linea con i dati della letteratura (8). Il modello, alimento specifico, a differenza dei modelli disponibili in rete, generati da dati ottenuti in brodi colturali (4), risulta più affidabile (5). Infatti, ad influenzare la crescita batterica, non è solo la matrice alimentare, ma anche la presenza di popolazioni batteriche indigene. Anche la robustezza dei dati del challenge test ha permesso di ottenere risultati attendibili per descrivere l’andamento del bacillo nel latte pastorizzato e microfiltrato (0.698<R2<0.995), a diverse temperature, nel tempo. Confrontando i dati del challenge test con il modello sperimentale (fig. 3) si può affermare che esso genera una safe prediction e che la deviazione standard tra il dato sperimentale e quello predetto è tanto più grande quanto meno marcate sono le caratteristiche di psicrotrofia del ceppo. Si nota, infatti, come il ceppo BCIII non sia cresciuto a 8°C, mentre il ceppo BCI ha avuto una rate maggiore rispetto agli altri ceppi batterici (tabella 2). Infine, la generazione di un foglio di calcolo, basato sul modello sperimentale, potrebbe essere un mezzo utile agli organi di controllo e alle aziende alimentari sia per la valutazione del rischio microbiologico sia per determinare l’adeguatezza della shelf life attribuita al prodotto in funzione delle condizioni in cui è conservato. Come output del foglio di calcolo si può stabilire a quanti giorni il prodotto raggiunge una concentrazione tale da poter produrre la tossina.
BIBLIOGRAFIA
1. Shaheen R., Svensson B., Andersson M.A., Christiansson A., Salkinoja-Salonen M.S. 2010 “Persistence strategies of Bacillus cereus spores isolated from dairy silo tanks” Food Microbiology, 27, 347-55.
2. Colavita G. 2008 “Igiene e tecnologie dei prodotti di origine animale” Edizione Point Veterinaire Italie.
3. Dufrenne J., Soentoro P., Tatini S., Day T., Notermans S. 1994 “Characteristics of Bacillus cereus related to safe food production” International Journal of Food Microbiology, 23, 99–109.
4.www.combase.cc.
5. Larsen H.D., Jørgensen K. 1999 “Growth of Bacillus cereus in pasteurized milk products” International Journal of Food Microbiology, 46, 173–176.
6. Baranyi J., Roberts T.A. 1994 ”A dynamic approach to predicting bacterial growth in food” International Journal of Food Microbiology, 23, 277-294.
7. Ratkowsky D.A., Olley J., McMeekin T.A., Ball A. 1982 “Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures” Journal of Bacteriology, 149, 1-5. 8. Pin C., Sutherland J.P., Baranyi J. 1999 “Validating predictive models of food spoilage organisms” Journal of Applied Microbiology, 87, 491-499.