Di Bartolo I.1, Angeloni G.1, Ponterio E.1, Maione E.1, Ostanello F.2, Ruggeri F. M.1
1Dip. Sanità pubblica veterinaria e sicurezza alimentare, Istituto Superiore di Sanità, Roma. 2Dip. di Scienze mediche veterinarie, Università di Bologna, Ozzano Emilia (BO).
Keywords: Hepatitis E, suino.
SUMMARY
Hepatitis E virus (HEV) is an emerging disease with a potential zoonotic transmission. The causative agent of hepatitis E is an unenveloped positive sense single-stranded RNA virus. The genome of HEV is approximately 7.2 kb and contains three open reading frames. ORF1 encodes non-structural proteins, and ORF2 and 3 code for the capsid protein and a small protein of unknown function, respectively. HEV is an emerging public health concern in many developing countries, where it can cause large epidemics mainly via contaminated water. Swine HEV strains are genetically close to human strains from the same area, suggesting the occurrence of zoonotic transmission. This route might play an important role in spreading infection also in Europe and other industrialized areas. In the last five years several investigations were performed at ISS to identify the presence of HEV swine infection within farms and slaughterhouses in Northern and Central Italy. Results of molecular diagnostic assays indicate the wide spread of HEV RNA in swine, including animals at slaughterhouse. Nucleotide sequences further confirm that the strains belong to genotype 3, also identified in humans.
INTRODUZIONE
L’Epatite E è una malattia infettiva con caratteristiche cliniche di epatite acuta. L’agente responsabile è il virus a RNA dell’Epatite E (HEV), di recente identificazione. La malattia è considerata endemica nei paesi in via di sviluppo, dove si manifesta con episodi epidemici generalmente associati al consumo di acqua contaminata. Di recente, casi sporadici di origine autoctona sono stati descritti anche in numerosi paesi industrializzati, compresa l’Italia. A partire dal 1997, ceppi suini di Epatite E (SwHEV) sono stati identificati in suini clinicamente sani nei diversi continenti. Infezioni sperimentali, studi di sieroprevalenza e analisi filogenetiche hanno dimostrato la possibile trasmissione interspecie dal suino all’uomo del virus HEV. In particolare, i ceppi di SwHEV sono spesso geneticamente simili ai ceppi responsabili di episodi sporadici di malattia nell’uomo nelle stesse aree geografiche, confermando la possibilità di una trasmissione zoonotica dell’infezione. Casi umani di epatite E sono stati recentemente correlati con il consumo di carne o organi crudi o poco cotti di suino, cinghiale e cervo.
In questo lavoro, sono riportati i dati raccolti in >7 anni di studi condotti su popolazioni di suini appartenenti a diverse classi di età. I dati dimostrano un’elevata diffusione del virus dell’HEV, anche in animali adulti prossimi alla fase di macellazione. Tutti i ceppi identificati risultano di genotipo 3.
MATERIALI E METODI
Dal 2005 ad oggi sono stati esaminati 416 campioni di feci, 185 campioni di bile, 88 campioni di fegato, prelevati da suini appartenenti a differenti categorie produttive e classi d’età: animali da ingrasso (3-4 mesi–magroni e 8-9 mesi–grassi) e da riproduzione (8-11 mesi-scrofette, 11-17 mesi-giovani scrofe, e di
età superiore ai 17 mesi–scrofe pluripare). I campioni sono stati prelevati da allevamenti a ciclo chiuso e aperto della provincia di Modena, Bologna e in diverse province del Sud Italia. Tutti gli animali esaminati risultavano clinicamente sani, a eccezione di 137 suini affetti da altre patologie (PWMS, PRRS).
Il genoma virale (RNA) è stato estratto da sospensione fecali al 10% (in acqua) o da 250mg di fegato/salsicce sottoposti a lisi meccanica, mediante il kit Qiamp-Viral RNA (Qiagen) e analizzato mediante RT-PCR e nested-PCR con primer degenerati (gene ORF2, proteina del capside virale) (1) e nella ORF1. Inoltre, i campioni di fegato e salsiccia sono stati analizzati mediante real-time PCR (2).
Gli amplificati ottenuti (145 bp; 348bp) sono stati sequenziati utilizzando ABI PRISM BigDye Terminator kit version 2.0 (Applied Biosystems); le sequenze ottenute sono state analizzate con il software DNASIS Max 2.0 (Hitachi) e gli studi filogenetici (Figura 1) sono stati effettuati mediante il software Bionumerics (Applied Maths, Kortrijk, Belgium).
RISULTATI
Tra gennaio e giugno del 2005, sono stati prelevati 274 campioni di feci da altrettanti suini provenienti da 6 allevamenti a “ciclo chiuso” nella provincia di Modena. Dall’analisi dei campioni condotta mediante nested PCR, 115 suini sono risultati positivi per la presenza di RNA virale (Tabella 1). Nel complesso, tutti gli allevamenti sono risultati positivi con una prevalenza media del 32.1% che varia dal 12.8% (allevamento 4) al 72.5% (allevamento 2).
Tabella 1. Risultati delle nested-PCR condotte sui campioni di feci di suino, divisi per allevamento.
Tipologia
allevamento* No. Suini positivi/totale (%)
F-W 2 29/40 72.5 F-W 6 23/38 60.5 totale F-W 52/78 66.7 F-F 1 24/50 48.0 F-F 3 12/48 25.0 F-F 4 6/47 12.8 F-F 5 21/51 41.2 totale F-F 63/196 32.1 All farms 115/274 42.0
F-W: ciclo aperto; F-F: ciclo aperto
Tra gennaio e giugno del 2006, 137 campioni di bile sono stati raccolti da altrettanti animali affetti da diverse patologie. Quarantuno dei 137 campioni analizzati (bile, 29.9%) sono risultati positivi per HEV con almeno uno dei due set di primers
utilizzati. Non sono state rilevate associazioni statisticamente significative tra la diagnosi di infezione da HEV e la presenza di patologie concomitanti, o con le diverse tipologie di allevamento esaminate. I risultati dell’analisi multivariata indicavano che i soggetti in magronaggio (età 80-120 giorni) avevano tuttavia un rischio di infezione statisticamente più elevato rispetto ai soggetti più giovani (Odd Ratio=3.78; p=0.009). Nei magroni, infatti, la prevalenza riscontrata era nettamente più elevata (46.9%) rispetto ai soggetti in svezzamento (20%) (Tabella 2).
Tabella 2. Risultati delle nested-PCR condotte sui campioni di bile.
Nel 2008, 141 campioni (45 bili, 48 feci e 48 fegati) sono stati raccolti in fase di macellazione e analizzati per la ricerca di HEV. La prevalenza più elevata è stata riscontrata nei campioni di bile del 51.1% (23/45), mentre la prevalenza nelle feci era del 33.3% (16/48) e nei fegati del 20.8% (10/48) (Tabella 3), confermando l’elevata diffusione del virus in animali in fase di macellazione.
Tabella 3. Risultati della ricerca di genoma di HEV in animali prelevati al macello, divisi per classi di età.
Classe di
età Bile Feci Fegato
Giovani
(3-4 mesi) 13/19 68% 13/20 65% 6/20 30% Adulti
(9-10 mesi) 10/26 39% 3/28 11% 4/28 14% Totale 23/45b 51% 16/48 33% 10/48 21% aCampioni positivi/totale testati; prevalenza in percentuale.
bPer tre animali, i campioni di bile non erano disponibili.
Nel 2010, sono stati raccolti campioni da 34 carcasse di suini, di 6-7 mesi, in un macello del Nord Italia. Da ogni carcassa sono stati prelevati campioni di feci, fegato e muscolo. Successivamente, 52 salsicce sono state raccolte da un sito di lavorazione delle carni, derivate dallo stesso macello coinvolto in questo studio. Infine, 77 salsicce già impacchettate sono state prelevate al punto vendita (supermercato). Tutti i campioni sono stati analizzati per la ricerca del virus HEV e di Adenovirus, come indicatore di contaminazione fecale. I risultati ottenuti mediante real-time PCR sono riassunti in tabella 4.
CONCLUSIONI
L’attività svolta dall’ISS su HEV g3 suino in quasi 10 anni ha riguardato diagnostica e biochimica, monitoraggio del rischio ed epidemiologia molecolare, attraverso 4 diversi Progetti Europei (3,4,5). HEV appare largamente diffuso dall’allevamento al prodotto finito della filiera del suino, a fronte di una trasmissione all’uomo apparentemente limitata. Studi di patogenesi sono necessari per valutare la possibile emersione di ceppi dotati di maggiore virulenza e capacità di trasmissione zoonotica.
Tabella 4. Riassunto dei campioni raccolti nei diversi siti della catena di produzione del suino, risultati ottenuti per la ricerca PAdV e del virus dell’HEV.
Figura 2. Albero filogenetico (maximum parsimony tree) in cui
sono stati inclusi gruppi rappresentativi dei ceppi suini appartenenti a diversi sottotipi g3 (dot in bianco), ceppi suini italiani identificati negli studi descritti (in celeste) e ceppi umani di HEV identificati in Italia (dot blu).
REFERENZE
1. Erker JC, et al., (1999) A hepatitis E virus variant from the United States: molecular characterization and transmission in cynomolgus macaques. J. Gen. Virol. 80:681-90.
2. Jothikumar, N., et al., (2006) A broadly reactive one-step real-time RT- PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus. J Virol Methods. 131: 65-71.
3. Di Bartolo I, Martelli F, Inglese N, Pourshaban M, Caprioli A, Ostanello F, Ruggeri FM. (2008) Widespread diffusion of genotype 3 hepatitis E virus among farming swine in Northern Italy. Vet. Microbiol. 132:47-55. 4. Martelli F, Toma S, Di Bartolo I, Caprioli A, Ruggeri FM, Lelli D, Bonci M, Ostanello F. 2010 Detection of Hepatitis E Virus (HEV) in Italian pigs displaying different pathological lesions. Res Vet Sci.88:492-6.
5. Di Bartolo I, Ponterio E, Castellini L, Ostanello F, Ruggeri FM. (2011). Viral and antibody HEV prevalence in swine at slaughterhouse in Italy. Vet. Microbiol. 149: 330-338.
Dati Positivi/ esaminati (%)
Età (giorni) <80 17/85 (20.0)
80-120 23/49 (46.9)
Patologia epatica presente 6/24 (25.0)
assente 35/113 (31.0) Patologia enterica presente 20/58 (34.5) assente 21/79 (26.6) Patologia polmonare presente 28/81 (34.6) assente 13/56 (23.2)
Altre patologie presente 19/68 (27.9)
assente 22/69 (31.9) PCV2 positivo 14/36 (38.9) negativo 27/101 (26.7) PRRSV positivo 17/54 (28.9) negativo 24/83 (28.9) Tipologia di allevamento ciclo aperto 4/17 (23.5) ciclo chiuso 22/72 (30.6)
Fase Virus Totale Positivi Pos/tot
Macello Feci PAdV 34 31 91% HEV 34 14 41% Fegato PAdV 34 0 - HEV 34 2 6% Muscolo PAdV 34 1* 3% HEV 34 1** 3% Lavorazione Salsicce PAdV 52 0 - HEV 52 0 - Punto vendita Salsicce PAdV 77 1 2% HEV 77 0 -