Giacinti G., Tammaro A., Sagrafoli D., Proietti A., Veschetti M.C., Bicocchi R., Franco A., Carratù D., Battisti A., Cordaro G., Amatiste S.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle regioni Lazio e Toscana; CRN-Antibioticoresistenza
Key words: Methicillin resistant Staphylococcus aureus, survey, bulk tank milk
SUMMARY
Staphylococcus .aureus (S. aureus), one of the most important causative factor of mastitis in dairy cattle, is commonly found in bulk tank milk from farms with infected cows. However a little evidence of Methicillin resistant S. aureus (MRSA) has been detected in bulk tank milk. The objective of the study was to survey dairy cattle herds of the Latium region both for S. aureus and MRSA from 399 bulk tank milk samples by using non-selective and selective culture methods. A total of 190 samples (47,6%) positive for S. aureus were plated on BBL CHROMagarTM MRSA after subculture on MH Broth 6,5% NaCl. After 24 h of incubation, 19 samples resulted suspected of MRSA, and 10 (5,3%) of all samples harboured isolates that were confirmed as phenotypically resistant to beta-lactams and positive for the mecA gene by PCR. The use of a selective medium for MRSA such as CHROMagarTM resulted useful as a screening tool for bulk tank milk samples.
INTRODUZIONE
Sthaphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) è tra le cause primarie di infezioni nosocomiali, mostrando una particolare rapidità diffusiva sia in ambiente ospedaliero che nella comunità.
Alcuni cloni di MRSA si sono diffusi tra gli allevamenti di animali zootecnici e negli animali da compagnia (11, 7), rappresentando un rischio emergente per la salute pubblica, nonostante non se ne conosca ancora il potenziale impatto nel campo della sicurezza alimentare. La prima segnalazione di MRSA, in ambito veterinario, risale al 1972 (3), a seguito di controlli su campioni di latte prodotto da bovine con mastite. Il fenomeno, in continuo aumento, è stato considerato associato alla pressione selettiva esercitata dall’ampio impiego di antibiotici intramammari usati in questa specie.
Recentemente in Italia sono stati isolati numerosi ceppi di MRSA da campioni di latte bovino e da prodotti lattiero-caseari (6, 1). Alcuni autori (8) inoltre hanno isolato MRSA in diversi allevamenti da casi di mastite bovina anche se la prevalenza di bovine infette è risultata essere molto bassa negli allevamenti controllati (8). S. aureus risulta il principale agente di infezione intramammaria (4) nella specie bovina ed è comunemente presente nel latte di massa di allevamenti con bovine infette (5). L’enumerazione di S. aureus nel latte di massa viene infatti impiegata per la valutazione del livello d’infezione intra-allevamento (2). Tuttavia l’isolamento di MRSA da questa matrice può trovare difficoltà per un numero esiguo di ufc/ml, per la co-presenza di ceppi S. aureus meticillino-sensibili (MSSA) e di stafilococchi coagulasi negativi meticillino-resistenti (10).
Negli ultimi anni sono stati commercializzati terreni cromogeni che consentono la rilevazione di MRSA, talvolta utilizzati nella routine senza test di conferma, anche in campioni contaminati (9), trovando principale impiego in campioni clinici umani, mentre scarso è il loro utilizzo in campioni di origine animale e in particolare nel latte di massa.
Scopo del lavoro è stato quello di effettuare una indagine per
valutare la diffusione di MSSA ed MRSA nel latte crudo di massa di allevamenti di bovine della regione Lazio, attraverso l’utilizzo di protocolli colturali non-selettivi e selettivi.
MATERIALI E METODI
Sono stati esaminati 399 campioni di latte di massa bovino appartenenti ad altrettanti allevamenti della regione Lazio, per la ricerca quantitativa di S. aureus e per la presenza di MRSA nel periodo maggio-luglio 2011. I campioni di latte, prelevati da diverse Cooperative di Produttori, rientravano nell’ambito dei controlli effettuati per il pagamento latte secondo qualità. Entro 24 ore dal prelievo è stata eseguita la semina in terreno Baird Parker + Rabbit Plasma Fibrinogen (BP-RPF) secondo la ISO 6888-1:1999 per la ricerca quantitativa di S. aureus e la semina di 1 ml di latte in Muller-Hinton Broth al 6,5% di NaCl. Dopo 24 ore d’incubazione a 37°C, 10 µl delle brodo colture corrispondenti ai campioni risultati positivi per S. aureus con il terreno BP-RPF, sono stati seminati per isolamento su terreno cromogeno CHROMagarTM MRSA. Il terreno è stato incubato a 37°C in aerobiosi con lettura delle piastre dopo 24 ore, valutando la presenza di colonie tipiche MRSA; in assenza di crescita o di colorazione le piastre sono state incubate per altre 24 ore. Secondo le indicazione della casa produttrice le colonie che appaiono di colore rosa-malva a 24 ore sono riferibili a MRSA, senza ulteriori conferme. Colonie rosa-malva che appaiano dopo 48 ore devono essere sottoposte al test della coagulasi. MSSA risulterebbero inibiti mentre altri microrganismi possono sviluppare con colonie incolore o blu.
Tutte le colonie tipiche (rosa-malva), sviluppate entro 24 e 48 ore d’incubazione, sono state sottoposte al test della coagulasi, alla valutazione dell’emolisi e alla verifica fenotipica della meticillino-resistenza mediante test di diffusione in agar, secondo le standard CLSI, e alla conferma della presenza del gene mecA mediante PCR.
RISULTATI
La presenza di S. aureus è risultata in 190 campioni (47,6%, 95% C. I. 42,7-52,5%), con un range di concentrazione tra 101 e 103 ufc/ml (Tabella 1). La crescita di colonie tipiche su terreno cromogeno è stata osservata in 19 campioni dopo 24 ore d’incubazione e in altri 11 campioni dopo 48 ore. Tutte le colonie tipiche cresciute a 24 e 48 ore sono state confermate fenotipicamente come S. aureus. I campioni risultati sospetti per MRSA con il terreno cromogeno sono stati 19 (10%) e 30 (15,8%), rispettivamente a 24 e 48 h di incubazione. Le indagini fenotipiche e molecolari hanno confermato la presenza di MRSA in 10 campioni di 10 diverse aziende, con una prevalenza sul totale delle aziende esaminate del 2,5% (95% C. I. 1,0 - 4,0%). I campioni falsi positivi sono risultati 9 a 24 h e 20 a 48 h. I campioni di latte crudo di massa positivi per MRSA hanno rappresentato il 5,3%, (95% C. I. 2,1-8,4%) dei campioni complessivamente positivi per S. aureus. La distribuzione delle aziende MRSA in funzione della concentrazione di S. aureus (ufc/ml) è risultata omogenea nelle classi centrali (Tabella 1).
Tabella 1. Distribuzione delle aziende positive a MRSA e MSSA in funzione delle ufc/ml di S.aureus
ufc/ml di S.aureus N°aziende S.aureus+ N°aziende MRSA+ <50 52 0 50-200 49 3 201-500 39 3 501-1000 32 3 >1000 18 1 Totale 190 10 DISCUSSIONE
I risultati ottenuti hanno permesso di evidenziare una elevata diffusione di S. aureus (52,6%) nel latte crudo di massa proveniente da allevamenti della regione Lazio, confermando un dato già rilevato da studi precedenti (4). La presenza di MRSA è stata rilevata nel 2,5% degli allevamenti investigati, e nel 5,3% delle aziende positive per S. aureus.
La prevalenza di MRSA da noi riscontrata non è facilmente confrontabile con altri dati di letteratura, e comunque risulta inferiore a quanto osservato in altri studi (8, 1), in cui tuttavia i campioni erano prevalentemente di capezzolo. In una recente indagine condotta negli USA (10) in 542 allevamenti di bovini da latte, nessun MRSA è stato isolato mediante semina diretta dei campioni di latte di massa su terreno cromogeno.
La percentuale di falsi positivi (66,7%) da noi osservata è risultata più elevata di quanto riportato da Van-Vaerenbergh et al (9) in campioni clinici umani, in cui la percentuale di falsi positivi è stata del 39%.
I terreni cromogeni per MRSA e in particolare il CHROMAgarTM MRSA sono impiegati prevalentemente per lo screening di campioni clinici umani, le interazioni di questo terreno con matrici complesse come il latte non ci risultano essere state studiate. Tuttavia in campioni come il latte di massa, in cui possono coesistere MRSA, MSSA e stafilococchi coagulasi negativi mecA, l’utilizzo di un terreno selettivo cromogeno può facilitare il rilevamento di allevamenti con presenza di MRSA. In conclusione da questi dati emerge la necessità di un monitoraggio periodico del latte di massa al fine di valutare la presenza di S. aureus, di disporre di stime preliminari sui livelli di prevalenza in allevamento, e di valutare presenza e trend di diffusione di MRSA negli allevamenti da latte.
I risultati ottenuti indicano che anche il terreno CHROMAgarTM MRSA può rappresentare un possibile strumento di screening nella routine microbiologica dei campioni di latte di massa, con l’accortezza che a valle si disponga di robusti metodi di conferma per MRSA degli isolati. Si ritengono tuttavia necessari ulteriori studi per valutarne le caratteristiche di performance con campioni di origine animale.
BIBLIOGRAFIA
1- Benedetti V., Cremonesi P., Ferrari S., Castiglioni B., Fabbi M., Vicari N., Garbarono C., Battisti A., Franco A., Feltrin F., Luini M., 2010. S.aureus meticillino-resistente (MRSA) da campioni di latte bovino. Large Animal Review 16:67-70 2- Bertocchi L., Bolzoni G., Zanardi G., Nassuato C., Bonometti G. Benicchio S., Varisco G. Conteggio delle unità formanti colonia di Staphylococcus aureus nel latte di massa come dato predittivo del livello d’infezione intra-allevamemnto. XII Congresso Nazionale SIDILV. 27-29 Ottobre 2010.
3- Devriese L:A:, Vandamme L.R., Fameree L., 1972. Methicillin (cloxacillin)-resistant S.aureus strains isolated from bovine mastitis cases. Zentralblatt fur Veterinarmedizin B 19,598-605.
4- Giacinti G., Amatiste S., Tammaro A., Franco A., Di Matteo P., Cordaro J. Sorbara L., Rosati R. Sensibilità animicrobica in vitro di batteri isolati da campioni di latte di capezzolo bovino. 6 Congresso Nazionale del Mastitis Council 18-20 febbraio 2008.
5- Normanno A, Celano G.V. et al.2005. Coagulase-positive Staphylococci and S .aureus in food products marketed in Italy. Journal of Food Microb.98 73-79;
6- Normanno G., Corrente M., Calandra L, Dambrosio A., Quaglia Nc., Parisi A., Greco G., Bellacicco AL., Virgilio S., Celano GV., 2007. S.aureus (MRSA) in foods of animal origin product in Italy. Int.J.Food Microbiol., 117:219-222
7- Pan A., Battisti A., Zoncada A., Bernieri F., Boldini M., Franco A., Giorni M., Iurescia M., Lorenzotti S., Martinetti M., Monaci M., Pantosti A., 2009. Community-acquired Methicillin Resistant S.aureus ST398 infection, Italy. Emerging Infections Diseases. Vol, 15
8- Vanderhaeghen W., Cerpentier T., Adriaensen C, Vicca J., Hermans K., Butaye P., 2010. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA)ST398 associated with clinical and subclinical mastitis in Belgian Cows
9- Van-Vaerenbergh KV., Cartuyvels R., Coppens G., Frans J., Van den Abeele AM., De Beenhouwer H. 2010. Performance of a new Chromogenic Medium, BBL CHROMagar MRSA II (BD), for Detection of Methicillin-Resistant S. aureus in Screening Samples. J. of Clinical Microbiology, 1450-1451 10- Virgin J.E., Van Slyke T.M., Lombard J.E., Zadoks R.N., 2009. Short cominication: Methicillin-resistent S.aureus detection in US bulk tank milk
11- Walther B., Friedrich A.W., Brunneberg L., Wieler L.H., Lubke-Becker A.. 2006. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in veterinary medicine: a new emerging pathogen. Berlin und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, vol 119,n°5-6, pp222-232.