Maccabiani G., D’Amico S., Fusini F., Finazzi G., Daminelli P., Bertasi B., Losio M. N., Varisco G.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna Reparto Tecnologia Acidi Nucleici Applicata agli Alimenti, Brescia
Keywords: Real-Time PCR, mozzarella, DNA
SUMMARY
Molecular biology techniques have been widely used for species identification in food in recent years. The PCR allows to detect DNA of different species by amplification of a species-specific DNA fragment. Furthermore, Real-Time PCR allows to quantify the DNA target by species-specific probes which emit fluorescence at several wavelengths. In this work Real Time PCR has been tested to detect and quantify bovine DNA in home-made mozzarellas produced with mixtures of bovine and buffalo milk in different ratio, and in some commercial mozzarella cheese.
INTRODUZIONE
L’identificazione di specie nei prodotti a base di latte è estremamente importante sia da un punto di vista commerciale che sanitario. In particolar modo in Italia dove sono presenti molti prodotti caseari a Denominazione di Origine Protetta (DOP), la cui produzione è regolata da normative europee che ne prescrivono le fasi di lavorazione ma soprattutto le materie prime costituenti. Un esempio fra questi è la “mozzarella di bufala campana DOP” la cui valenza economica è rilevante e che deve essere prodotta utilizzando esclusivamente latte di bufala (Regolamento EC n° 1107/96). Per tutelare questi prodotti è quindi importante avere a disposizione strumenti che non solo ne permettano il controllo sulla base dei criteri microbiologici di sicurezza alimentare, ma che rapidamente riescano a confermarne l’autenticità. Da questo punto di vista quindi assume grande importanza la ricerca di latte vaccino nelle mozzarelle di bufala campana DOP.
A tal proposito le metodiche di biologia molecolare consentono di effettuare analisi rapide, sensibili e specifiche fornendo strumenti adeguati per l’identificazione di specie nei prodotti a base di latte. Nel caso delle mozzarelle sono state approntate analisi basate sul pattern proteico dei campioni, come ad esempio isoelectrofocusing (IEF) (3), ELISA (6) o HPLC (5), e basate sull’analisi del DNA (estratto dalle cellule somatiche presenti nel latte), come la multiplex-PCR (1,8), la PCR-RFLP (2) e la Real Time PCR (4). I geni mitocondriali sono largamente utilizzati come target in queste reazioni di PCR in quanto sono presenti in molte copie nelle cellule aumentando di conseguenza la sensibilità dei metodi, soprattutto in presenza di scarso materiale genetico oppure degradato dai processi produttivi a cui è stato sottoposto il campione.
La Real Time PCR permette di affiancare ad un risultato qualitativo (presenza/assenza) anche una quantificazione del DNA bersaglio e quindi, nel caso specifico, consente di discriminare fra una contaminazione in tracce di latte non dichiarato (perciò economicamente irrilevante), e presumibilmente dovuta a cause accidentali, da una contaminazione più consistente (perciò economicamente rilevante) e presumibilmente volontaria.
A tale scopo sono state preparate artificialmente in laboratorio cagliate di latte bufalino (Bubalus bubalis) e bovino (Bos taurus) in diversi rapporti ed analizzate in una reazione di Real Time PCR per valutarne l’accuratezza, ma soprattutto la capacità del metodo di discriminare piccole contaminazioni da altre più marcate e quindi poter riconoscere casi di evidenti frodi alimentari. Contemporaneamente sono state analizzate alcune mozzarelle di bufala prelevate dalla grande distribuzione.
MATERIALI E METODI
Preparazione mozzarelle – Le mozzarelle sono state preparate con latte bufalino crudo a cui è stato aggiunto latte bovino crudo nei seguenti rapporti: 50%, 20%, 8%, 5%, 2%. In particolare in un primo momento sono state prodotte le mozzarelle al 50%, 20% e 5% (vedi risultati tabella 3 Real Time 1-5) e in un secondo momento i campioni all’8%, al 5% e al 2% (vedi risultati tabella 3 Real Time 6-10). Inoltre in entrambi i casi sono state preparate una mozzarella di puro latte bufalino (utilizzata come controllo negativo di processo) e come standard per la quantificazione in Real Time PCR mozzarelle al 100%, al 10% e all’1% di latte bovino. I campioni di latte crudo utilizzati per la preparazione sono stati previamente portati a 37°C in bagnomaria. Successivamente sono state preparate le miscele di latte bovino e bufalino nei rapporti indicati per un volume finale di 100 ml, a cui sono stati aggiunti 40 µl di caglio bovino. I campioni sono stati mantenuti a temperatura ambiente in lenta agitazione. La cagliata prodotta, dopo l’eliminazione del siero, è stata conservata in cella a 4 °C per almeno 48 ore prima dell’estrazione del DNA.
Estrazione del DNA – Sono stati prelevati 200 mg da ogni cagliata prodotta ed il DNA è stato estratto secondo le procedure previste dal kit specifico per prodotti alimentari “Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food” (Promega). Il materiale genomico così ottenuto è stato conservato a 4°C per poi essere analizzato nella reazione di PCR.
Real Time PCR – La reazione di Real Time PCR è stata approntata utilizzando i primer specifici per la specie bovino “BOS F” e “BOS R” (7), amplificanti un frammento di 112 bp del gene mitocondriale 16SrRNA, (concentrazione finale 300 nM) e la sonda MGB “Bovino Probe” marcata all’estremità 5’ con il fluoroforo “FAM” (concentrazione finale 100 nM). Le sequenze di primer e sonde sono specificate in tabella 1. Tabella 1: sequenze dei primer e della sonda
SEQUENZA
BOS F 5’ TTGAACTAGACCTAGCCCAAAGATAC 3’ BOS R 5’ GCCGTACTTAGATTTCTATCTCC -3’ Bovino probe 5’ TCTCGACTAAACAACCAAG 3’
Nella mix di reazione sono stati introdotti anche i controlli interni di amplificazione EXO IPC Mix ed EXO IPC DNA (Applied Biosystems), per un volume finale di 23 µl. A questi sono aggiunti 2 µl di DNA estratto. Il ciclo termico della reazione è mostrato nella tabella 2.
Tabella 2: ciclo termico della reazione di Real Time PCR
Fase Temperatura Tempo N° cicli Attivazione UNG (Uracil
DNA glicosilasi) 50° C 2 min 1 Denaturazione iniziale 95° C 10 min 1
Denaturazione 95° C 15 sec 40 Annealing + Estensione 62° C 60 sec
I campioni utilizzati come “standard” sono stati analizzati in triplice copia, mentre tutti gli altri in duplice copia.
Al termine della reazione il software dello strumento procedeva alla costruzione della curva standard e alla elaborazione quantitativa dei dati ottenuti sulle mozzarelle di bufala artificialmente contaminate da latte bovino. Sono state effettuate 5 diverse reazioni di Real Time PCR per ogni livello di contaminazione scelto per verificarne la ripetibilità e calcolarne l’errore percentuale
Campioni commerciali – 15 mozzarelle di bufala campana D.O.P. in commercio sono state analizzate secondo le procedure del metodo.
RISULTATI
I risultati relativi alle mozzarelle artificialmente contaminate sono riassunti nella tabella 3 (i risultati sono rappresentativi delle medie dei valori ottenuti dalle singole copie).
Tabella 3: risultati quantitativi sulle mozzarelle home-made
50% 20% 8% 5% 2% Real Time 1 27,06 13,23 / 6,22 / Real Time 2 32,4 14,9 / 6,08 / Real Time 3 25,89 15,27 / 6,51 / Real Time 4 39,8 17,87 / 5,5 / Real Time 5 29,86 14 / 5,13 / Real Time 6 / / 5,69 6,89 2,98 Real Time 7 / / 9,16 3,76 1,35 Real Time 8 / / 9,26 3,25 1,34 Real Time 9 / / 9,8 2,97 1,56 Real Time 10 / / 6,73 4,11 2,32
I valori delle slope (pendenza della retta di interpolazione) relative alle curve standard, per ogni reazione di Real Time PCR, sono i seguenti (tabella 4):
Tabella 4: slope calcolati delle curve standard
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Slope 3,6 3,6 3,7 4 3,5 4,5* 3,6 3,2 3,3 3,4
Media = 3,68 Media = 3,4
*: valore non considerato nel calcolo della media
I valori di R2 delle curve standard sono compresi fra 0,96 e 0,99.
Alla luce dei risultati mostrati in tabella 3 sono state calcolate le rispettive medie e deviazioni standard per ogni livello di contaminazione, come mostrato in tabella 5.
Tabella 5: medie e deviazioni standard dei risultati sperimentali
50% 20% 8% 5% 2%
Media ± dev.
Std. 31± 5,5 15±1,7 8,1±1,8 5± 1,4 1,9±0,7
In tutte e 10 le prove di Real Time PCR il controllo negativo di processo è risultato essere effettivamente negativo. Nei campioni commerciali sono state rilevate tracce di DNA bovino a concentrazioni calcolate inferiori allo 0,01% in 10 casi, totale assenza in 4 casi, mentre in un caso la percentuale misurata si attestava sul 15%.
DISCUSSIONE
I dati risultati dalle prove effettuate sui campioni preparati in laboratorio dimostrano che la metodica in Real Time PCR può essere uno strumento validissimo per individuare e quantificare la presenza di contaminanti di origine bovina nelle mozzarelle di bufala.
I valori ricavati sperimentalmente relativi alle percentuali del 50% e 20% sono sottostimati rispetto ai valori attesi, mentre per quanto riguarda gli altri livelli di contaminazione più bassa la correlazione è buona (tabella 5). Questa disomogeneità non impedisce al metodo di discriminare comunque i campioni in base ai diversi livelli di contaminazione e, soprattutto, di poter separare alte e basse dosi di latte bovino in latte bufalino (tabella 3). Infatti, ad esempio, la presenza di 20% di latte vaccino non è mai stata erroneamente misurata al di sotto del valore del punto inferiore della curva standard. La sottostima rilevata nelle alte dosi di contaminazione può essere dovuta o ad una minore efficienza di estrazione del DNA totale dalle mozzarelle in esame, con conseguente minore quantità di DNA bovino nell’estratto, oppure da una resa inferiore del latte bovino nella formazione della cagliata, con maggiore “dispersione” di materiale genetico target nel siero. Per questo è necessario verificare il metodo partendo da nuove cagliate e misurare la quantità di DNA bovino eventualmente presente nel siero.
La specificità del metodo è buona in quanto la mozzarella di puro latte bufalino è sempre risultata negativa. Le curve standard costruite hanno una slope (valore di riferimento 3,3) che garantisce un calcolo preciso della quantità di DNA presente nel campione amplificato (tabella 4).
Per aumentare la precisione del metodo occorre normalizzare i dati forniti dallo strumento sulla quantità effettiva di DNA estratto dal campione, che può variare nonostante la matrice sia sempre la stessa ed il protocollo di estrazione utilizzato sia un kit standardizzato. Per fare ciò è necessario avere a disposizione una coppia di primer in grado di appaiarsi sia a DNA bovino che bufalino con la stessa efficienza. Ulteriori prove sono attualmente in corso utilizzando l’intercalante SYBR Green come fluoroforo per verificare le differenze relative, in contenuto di DNA totale, di ogni singolo campione per poi procedere con la normalizzazione finale del valore di DNA bovino ottenuto.
BIBLIOGRAFIA
1. Bottero MT., Civera T., Anastasio A., Turi RM., Rosati S., 2002 “Identification of cow’s milk in buffalo cheese by duplex polymerase chain reaction” Journal of Food Proection. 65(2): 362-6.
2. Branciari R., Nijman I., Plas J., Di Antonio E., Lenstra A., 2000 “Species origin of milk in Italian mozzarella and Greek feta cheese” Journal of Food Protection, 63: 408- 411.
3. Commission Regulation (EC) n° 213/2001 of the Commission of 9th January XV, Reference method for the detection of cows’ milk and caseinate in cheeses from ewes’ milk, goats’ milk or buffalos’ milk or mixtures of ewes’ and buffalos’ milk. Official Journal of the European Commission, February 7, 2001, pp 0001-0099.
4. Dalmasso A., Civera T., La Neve F., Bottero MT. 2011, “Simultaneous detection of cow and buffalo milk in mozzarella cheese by Real Time PCR assay” Food Chemistry 124, 362-366.
5. Enne G., Elez D., Fondrini F., Bonizzi I., Feligini
M., Oleandri R. 2005, “High-performance liquid chromatograohy of governing liquid to detect illegal bovine milk’s addition in water-buffalo mozzarella: comparison with results from raw milk and cheese matrix” Journal of Chromatography, 1094, 169-174.
6. Hurley I.P., Ireland H.E., Coleman R.C., Williams J.H.H. 2004 “Application of immunological methods for the detection of species adulteration in diary products. International Journal of Food and Science Technology, 39, 873-878.
7. Maccabiani G., Pavoni E., Tilola M., Agnelli E., Bertasi B., M.N. Losio, Boni P. 2005 “Messa a punto di una metodica di PCR per l’identificazione di specie in latte e derivati” Industrie Alimentari – XLIV (2005) Aprile N° 446: 363-67
8. Rea S., Chikuni K., Branciari R., Sangamayya RS., Ranucci D., Avellini P. 2001 “Use of duplex polymerase chain reaction (duplex PCR) technique to identify bovine and water buffalo milk used in making mozzarella cheese” Journal of Diary Research 68(4): 689-698.