Chiaravalle A. E.1, Bisceglia D.2, Miedico O.1, Laconca L.1, Pompa C.1, Tarallo M.1, Ferrara A.1
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Foggia 2ASL-FOGGIA Servizio Veterinario - Distretto di Manfredonia
Key words: Datteri di mare, metalli pesanti, DRC-ICP-MS
SUMMARY
A survey on the incidence of 18 metals in samples of bivalve molluscs was obtained using an existing method validated and optimized based on a micro-wave mineralization followed by analysis with Inducted coupled plasma mass spectrometry (ICP/MS) with dynamic cell reaction (DRC). The specimens were divided in four different parts (muscle, stomach, liver- pancreas and bowels) and considering the different lengths which is connected to the age to better understand the bio- characteristic of this specie and the capability of absorption of the considered metals.
INTRODUZIONE
Il dattero di mare (Litophaga litophaga) è un bivalve dimiario, eteromiario, perforatore, di cui è vietata la raccolta, la commercializzazione ed ogni forma di importazione su tutto il territorio nazionale (DM 16/10/1998). Benché privo di interesse nutrizionale, esso si presta ad essere considerato un interessante oggetto di indagini scientifiche non solo per la capacità di filtrazione e bio-accumulo comune a tutti i M.E.L. (molluschi eduli lamellibranchi), ma soprattutto per la caratteristica longevità e stanzialità che lo rendono un ottimo bioindicatore. Infatti sono stati trovati individui di oltre 50 anni, in base al conteggio delle linee di accrescimento annuali lungo la sezione longitudinale del guscio1.
A causa del divieto nazionale di commercializzazione e della difficoltà intrinseca della raccolta, la letteratura scientifica internazionale non è ancora approdata ad un grado di conoscenza approfondito riguardo la peculiarità biologiche di questo mollusco. Pertanto, per dare un valido contributo in tale direzione, è stato condotto il presente lavoro di caratterizzazione dei datteri di mare riguardo al contenuto di 18 elementi (sia contaminanti che oligoelementi) su diversi comparti biologici (muscolo detrattore delle valve – stomaco – epatopancreas - resto dei visceri).
MATERIALI E METODI
Campioni analizzati: per lo studio di caratterizzazione è stata analizzata una partita di datteri di mare pescata nel golfo di Manfredonia e sottoposta a sequestro giudiziario da parte del Servizio Veterinario ASL-FG. L’intera partita, costituita da 231 esemplari (circa 3,0 kg in totale), è stata suddivisa in 4 gruppi in base alla lunghezza e di conseguenza in base all’età. In particolare, 34 esemplari da 3 a 5 cm; 80 esemplari tra 5,1 a 6,0 cm; 85 esemplari da 6,1 a 6,5 cm e 32 esemplari da 6,6 a 8,0 cm. Le analisi chimiche, sono state eseguite presso la Struttura Complessa CHIMICA dell’IZS di Foggia. Allo scopo è stato utilizzato un metodo validato e accreditato, opportunamente modificato.
Preparazione dei campioni: per ciascun esemplare di dattero di mare sono stati separati i diversi comparti biologici (muscoli detrattori delle valve, stomaco, epatopancreas e visceri), riuniti in base al gruppo di appartenenza, per formare 16
campioni globali (4 comparti per 4 gruppi). Ciascun campione è stato infine omogeneizzato e una aliquota (1,0 grammi con accuratezza di 0,1 mg) è stata mineralizzata in forno a microonde (modello ETHOS-ONE della Milestone) con 8 ml di acido nitrico (HNO3) e 2 ml di acqua ossigenata (H2O2).
Determinazione Strumentale: la soluzione mineralizzata, diluita ad un volume noto con Acqua UltraPura, è stata sottoposta a determinazione strumentale mediante uno Spettrometro di Massa al plasma induttivamente accoppiato, (ICP-MS, Modello Elan DRC II della PerkinElmer).
Sono stati analizzati 18 elementi in totale, divisi tra metalli pesanti (Mercurio, Piombo, Cadmio, Arsenico, Cromo, Uranio e Nichel) ed oligoelementi (Cobalto, Molibdeno, Selenio, Rame, Zinco, Vanadio, Ferro, Calcio, Alluminio, Stronzio e Manganese). La determinazione strumentale è stata eseguita mediante calibrazione esterna, con standard acquosi acidificati al 2% di HNO3, con range di taratura specifico per ciascun elemento in base al livello di concentrazione presunto. Le interferenze isobariche, tipiche di questa tecnica analitica in particolar modo per alcuni elementi (es: Cromo, Arsenico, Ferro, etc…) sono state eliminate con la Cella Dinamica di Reazione, un dispositivo che consente di trattare i cationi formatisi nel plasma di argon con un opportuno gas reattivo, per scomporre ed abbattere selettivamente le interferenze isobariche dovute a ossidi, argidi, cloruri,… In particolare è stato adoperato il Metano (grado di purezza al 99,9999%) per la determinazione del Selenio e l’Ammoniaca (anidra al 100%) per Arsenico, Ferro, Nichel, Rame, Zinco, Alluminio, Vanadio e Manganese.
La qualità dei risultati è stata garantita mediante l’utilizzo di opportuni Materiali Certificati (NIST 1566b Oyster Tissue e ERM CE278 Mussel Tissue). L’analisi per ogni campione globale è stata eseguita in doppio, verificandone la ripetibilità. RISULTATI E DISCUSSIONE
I risultati sulla concentrazione dei diversi analiti in tutto il mollusco (concentr. totale) riportati in Tabella 1 mostrano che non vi è una significativa differenza dovuta all’età (e quindi alla grandezza longitudinale dei gusci) dei datteri di mare. Tuttavia, considerando più in dettaglio i singoli comparti biologici, si può osservare che la concentrazione di alcuni elementi tende ad aumentare al crescere della lunghezza del mollusco. Ad esempio per i metalli pesanti Uranio, Cromo e Mercurio, nel comparto epatopancreas si nota un andamento crescente, probabilmente proprio a causa della maggiore longevità degli esemplari più grandi.
Ciò che emerge con forza è la differenza dei tenori della maggior parte degli elementi nei diversi comparti biologici: infatti l’epatopancreas e i visceri mostrano concentrazioni molto più elevate rispetto ai comparti stomaco e soprattutto muscolo. Ad esempio il piombo nell’epatopancreas ha una concentrazione 6 e 10 volte maggiore che nello stomaco e nel muscolo, rispettivamente. Il mercurio e il cadmio mostrano un
accumulo da 3 a 5 volte maggiore nei comparti epatopancreas e visceri; molibdeno, cobalto e nichel hanno una concentrazione paragonabile nei due comparti epatopancreas e visceri, molto più elevata che nel muscolo e nello stomaco. Invece per l’arsenico e soprattutto per il rame tale fenomeno, pur riscontrabile, non è così marcato (fattore di accumulo pari a 2 o 3). Si può notare inoltre che alluminio, ferro e zinco si concentrano in particolar modo nell’epatopancreas, mentre stronzio, calcio e manganese sono presenti maggiormente nei visceri. Tutte queste differenziazioni possono essere attribuite al ruolo biologico dei tessuti analizzati, dei quali muscolo e stomaco rappresentano comparti poco attivi e di transito, contrariamente all’epatopancreas che possiede una intensa attività secretoria e di assorbimento.
Un’attenzione particolare va rivolta al Vanadio, riscontrabile quasi esclusivamente nell’epatopancreas. I dati ottenuti mostrano come i livelli di questo elemento siano simili a quelli riscontrati da precedenti studi condotti nei laboratori dell’IZS di Foggia sulla matrice ascidie (Microcosmus sulcatus, meglio conosciuto come taratuffo o uovo di mare), dove si registra un tenore medio di Vanadio di 1,58 mg/kg. In questo particolare organismo marino il Vanadio costituisce il gruppo prostetico di un pigmento respiratorio: l’emovanadina. Verosimile dunque che questa proteina coniugata in sede epatica possa svolgere non solo funzione ossiforica ma anche di “O2 binding” in grado di far fronte a periodi di ipossia2.
E’ infine interessante confrontare da un punto di vista strettamente tossicologico questa particolare specie ittica con
specie simili commerciabili e diffusamente presenti nella dieta umana, ovvero mitili, ostriche e vongole3. Presso la Struttura Complessa CHIMICA del suddetto IZS ogni anno vengono effettuati centinaia di controlli ufficiali su tali tipologie di matrice in merito al contenuto di Mercurio, Piombo e Cadmio, regolamentati dal Reg CE 1881/2006 e s.m.i. In particolare dai dati raccolti nel 2° semestre 2010 e 1° semestre 2011 sui molluschi provenienti dalle coste pugliesi dal lago di Lesina fino a Trani, è possibile definire un tenore medio di questi contaminanti, riportati in Tabella 2:
Mercurio
Piombo
Cadmio
Cozze
0,014 0,178 0,173Ostriche
0,012 0,142 0,215Vongole
0,009 0,128 0,104Tabella 2: Distribuzione media in mg/kg di Mercurio, Piombo e
Cadmio nei molluschi cozze ostriche e vongole pescate nelle acque del golfo di Manfredonia (luglio 2010-giugno 2011) Premesso che i dati sui molluschi commerciabili sono rassicuranti da un punto di vista tossicologico, in quanto ben al di sotto dei limiti di legge, pari a 0,5, 1,5 e 1,0 per Hg, Pb e Cd rispettivamente, a testimonianza del buono stato di salute dell’ambiente marino del basso Adriatico, emergono alcune U Hg Pb Cd Cr Mo Co Ni Se As Cu V Sr Ca Zn Mn Fe Al (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) Concentr. totale Gr. A 32,7 19,3 408 170 322 256 366 787 430 8,82 2,63 1,55 11,33 1414 31,5 12,0 87,0 86,5 Concentr. totale Gr. B 36,6 18,8 404 162 308 267 346 769 366 7,43 2,24 1,56 9,44 915 30,5 12,1 82,5 82,4 Concentr. totale Gr. C 32,7 20,6 385 218 454 291 369 857 375 7,96 2,69 1,56 13,38 1294 32,7 10,8 82,4 82,0 Concentr. totale Gr. D 30,8 19,8 444 188 385 266 361 872 365 8,05 1,81 1,79 9,28 774 32,1 10,3 83,8 90,0 Gruppo A muscolo 4,75 5,72 58,2 66,5 45,3 46,5 88,9 261 125 3,49 0,75 0,11 2,87 272 10,5 4,00 9,04 9,74 Gruppo B muscolo 4,62 4,80 61,8 72,6 55,9 47,9 79,9 234 102 2,84 0,65 0,09 2,69 206 9,7 3,80 7,73 8,05 Gruppo C muscolo 2,99 5,01 44,2 75,8 67,7 38,8 65,7 184 106 2,92 0,52 0,07 3,25 276 8,8 3,22 6,62 7,19 Gruppo D muscolo 3,52 5,01 69,4 72,4 73,0 36,5 63,0 210 113 2,76 0,53 0,07 3,03 257 9,1 3,31 9,22 11,53 Gruppo A stomaco 9,50 8,18 118,0 94,0 111,2 114,1 165,7 406 194 5,38 1,11 0,40 4,09 332 16,9 5,24 18,0 17,8 Gruppo B stomaco 12,05 10,04 122,4 102,3 83,9 129,8 175,8 442 192 4,59 1,03 0,39 5,79 452 15,6 4,90 17,0 17,2 Gruppo C stomaco 11,12 8,95 123,7 115,4 122,5 111,8 141,9 390 187 4,64 0,90 0,40 5,58 431 18,0 4,77 21,8 23,1 Gruppo D stomaco 7,86 8,04 96,4 88,8 86,9 89,8 118,7 345 161 4,47 0,75 0,32 5,03 293 14,6 3,13 12,6 12,9 Gruppo A epatopancr 36,9 23,6 627 190 404 462 497 866 561 9,03 2,55 4,64 7,64 830 45,0 8,91 148 134 Gruppo B epatopancr 47,2 24,2 564 176 424 432 440 837 478 6,34 1,96 4,88 7,76 782 44,3 7,32 152 143 Gruppo C epatopancr 48,3 27,2 593 237 512 500 502 965 470 8,51 1,98 5,05 10,10 925 47,6 7,45 148 143 Gruppo D epatopancr 51,9 30,5 578 216 576 537 530 996 465 8,72 2,09 6,36 8,19 692 48,5 6,36 164 170 Gruppo A visceri 41,4 22,5 443 198 383 236 403 931 482 10,40 3,34 0,75 16,11 2129 32,6 16,3 90,8 96,1 Gruppo B visceri 44,6 21,4 475 188 367 270 399 925 413 9,51 2,98 0,69 12,38 1229 32,3 17,8 83,9 87,4 Gruppo C visceri 36,3 23,1 419 255 568 292 417 1023 422 9,25 3,69 0,76 17,90 1784 34,1 14,6 83,6 84,3 Gruppo D visceri 33,1 21,1 536 219 438 250 405 1049 416 9,41 2,16 0,84 11,53 992 34,0 14,4 84,8 93,4
Tabella 1: Concentrazione totale e per comparti biologici di 18 elementi nei 4 gruppi di datteri di mare. Ogni dato analitico è affetto
differenze con la tipologia di molluschi in esame. In particolare, il tenore medio di Mercurio, pur rimanendo ben al di sotto della soglia di allerta tossicologica, è quasi il doppio rispetto alle tre tipologie citate; inoltre il piombo è da 3 a 4 volte più concentrato. Invece praticamente comparabile è la concentrazione di cadmio, se si esclude la matrice vongole, mediamente poco contaminate da questo metallo. Ciò potrebbe in prima battuta essere attribuito alla maggiore longevità dei datteri di mare (nel corso della vita filtrano una maggiore quantità di acqua e di xenobiotici), o anche a proprietà fisiologiche peculiari di questo mollusco.
CONCLUSIONI
Data la limitata conoscenza e l’esiguo numero di lavori scientifici sulla specie ittica Lithophaga-lithophaga, è stato condotto uno studio di caratterizzazione dettagliato dei tenori di metalli pesanti ed oligoelementi, su una partita di datteri di mare. E’ emersa da un lato una sostanziale indifferenziazione in base all’età, dall’altro livelli di accumulo più o meno elevati nei vari comparti biologici. Inoltre, gli organi maggiormente interessati dal fenomeno del bioaccumulo sono epatopancreas e visceri, il primo in quanto sede di attività secretorie e di assorbimento,
il secondo (rappresentato per lo più da branchie, nefridi e gonadi) in quanto sede di attività di filtrazione e di escrezione. Infine, pur rimanendo ben al di sotto della soglia di allerta tossicologica definita per legge sui molluschi commerciabili, si registra un tenore maggiore di Hg e soprattutto Pb, rispetto alle matrici mitili, vongole ed ostriche. Reputiamo tale studio un ottimo punto di partenza per indagini future, volte ad una maggiore conoscenza di questi particolari organismi marini.
BIBLIOGRAFIA
1. Galinou-Mitsoudi S., Sinis A.I. (1995) Age and growth of Lithophaga lithophaga (LINNAEUS, 1758) (Bivalvia: Mytilidae), based on annual growth lines in the schell, Journal of Molluscan studies, Vol 61, Issue 4, pag:435- 453
2. Dieter Rehder, Biorganic Vandium Chemistry, pag 90 – WILEY (Ed 2008)
3. AUSL Rimini, Unità Operativa Igiene Alimenti di origine Animale - I rischi per la salute legati al consume dei molluschi eduli lamellibranchi.