Tozzoli R., Morabito S., Scavia G., Ferreri C., Grande L., Michelacci V., Minelli F., Marziano M. L., Caprioli A.
Laboratorio Europeo e Nazionale di Riferimento per Escherichia coli, Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare, Roma
Keywords: Escherichia coli, semi, VTEC O104:H4
ABSTRACT
Sprouts have been implicated as the source of the outbreak of Verocytotoxin producing Escherichia coli (VTEC) O104:H4 infections occurred in Europe in May-June 2011. Despite the strong epidemiological evidences on their role, the outbreak strain has never been isolated from either sprouts or seeds used for their production. This has stressed the need for laboratory testing of seeds, which have recognized as the source of sprout contamination in most of the epidemic episodes described in literature.
INTRODUZIONE
Dall’inizio di Maggio 2011 si è verificata in Germania un’epidemia di colite emorragica e sindrome emolitico uremica (SEU) causata da un sierotipo di Escherichia coli produttore di verocitotossina (VTEC) piuttosto raro, E. coli O104:H4. L’epidemia è stata molto vasta: alla fine di Luglio l’ European Centre for Disease Control and Prevention (EDCD) riportava un totale di 4033 casi, 50 decessi e 901 casi di SEU (1). Le indagini epidemiologiche hanno portato ad identificare nel consumo di germogli vegetali crudi contaminati la probabile origine del focolaio epidemico. I germogli di specie vegetali diverse destinati al consumo senza previa cottura sono stati spesso identificati quale sorgente di infezione da Salmonella e da VTEC (3). La maggior parte degli episodi riportati in letteratura era associato all’utilizzo di semi potenzialmente contaminati durante le pratiche agricole di coltivazione, fertilizzazione, raccolta e stoccaggio. La contaminazione può tuttavia avvenire durante la preparazione dei germogli, mediante l’utilizzo di acqua contaminata o a causa dell’adozione di pratiche igieniche scorrette da parte degli operatori.
Nel mese di giugno in Francia si è verificato un secondo focolaio di infezione associato al ceppo VTEC O104:H4 con caratteristiche simili al ceppo epidemico tedesco che ha visto coinvolti 16 pazienti, di cui otto con SEU. Anche questo episodio era riconducibile al consumo di germogli crudi e ha pertanto rafforzato l’ipotesi che entrambi i focolai fossero originati da germogli prodotti da semi contaminati, in particolare dallo stesso lotto di semi di fieno greco utilizzati in entrambi gli episodi.
L’identificazione dei semi quale veicolo di infezione ha portato alla diffusione di allerte RASFF che hanno coinvolto numerosi Stati Membri dell’Unione Europea. I Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR) di tali stati sono stati chiamati ad effettuare analisi di laboratorio su questa matrice e DG SANCO ha chiesto al nostro laboratorio, quale Laboratorio Europeo di Riferimento per Escherichia coli (EU-RL VTEC), di offrire assistenza tecnica ai laboratori europei coinvolti nell’analisi dei campioni di semi. L’EU-RL ha quindi incluso un annesso specifico per la ricerca di VTEC nella matrice “semi” alla procedura già messa a punto per effettuare la ricerca di VTEC O104 negli alimenti. Tale procedura, basata sullo screening di colture di arricchimento per la presenza dei geni codificanti le VT e l’antigene di superficie
O104 mediante Real Time PCR era stata resa disponibile alla rete dei laboratori nazionali di riferimento già il 2 Giugno mediante pubblicazione sul sito web dell’EU-RL VTEC (2). Nel corso di indagini svolte presso il nostro laboratorio su lotti di semi ritirati in Italia, abbiamo identificato in alcuni campioni la presenza di ceppi VTEC. I ceppi, diversi dal ceppo epidemico tedesco sono stati isolati e caratterizzati. Questi campioni sono stati quindi utilizzati per organizzare uno studio interlaboratorio per i LNR degli stati membri maggiormente coinvolti nelle analisi di laboratorio successive ai RASFF. Gli obiettivi di tale studio erano:
1. armonizzare le procedure di laboratorio
2. contribuire alla comprensione della natura della contaminazione da VTEC nella matrice semi.
Lo scopo di questa comunicazione è di presentare i risultati dello studio inter-laboratorio condotto su campioni di semi e discutere le problematiche relative all’esame di questa particolare matrice.
DISEGNO DELLO STUDIO
Nel corso delle analisi di laboratorio condotte su lotti di semi potenzialmente coinvolti nell’epidemia da E. coli O104:H4, il nostro laboratorio ha analizzato nel Giugno 2011 dieci lotti di semi di bietola. I test sono stati eseguiti su 50 grammi di semi, arricchiti in 450 ml di Acqua Peptonata Tamponata come riportato nella procedura pubblicata sul sito dell’EU-RL (2). Tre campioni sono risultati positivi alla PCR Real Time per i geni vtx2 ed e-hly, mentre erano negativi per i geni eae e vtx1. Da due dei tre campioni positivi sono stati isolati ceppi VTEC con lo stesso profilo di geni di virulenza (vtx2 ed e-hly), che agglutinavano con un antisiero anti-O74, successivamente inviati al WHO Reference Centre di Copenhagen per la conferma del sierogruppo.
Uno dei due campioni da cui era stato isolato il ceppo VTEC e due dei sette campioni negativi sono stati selezionati per lo studio interlaboratorio. Abbiamo prelevato 50 gr dei campioni ed eseguito nuovamente le analisi di Real Time PCR, che hanno confermato i risultati ottenuti in precedenza.
All’inizio di Luglio i tre campioni sono stati inviati ai laboratori partecipanti, ai quali era richiesto di ricercare i geni vtx nei brodi di arricchimento e di isolare il ceppo VTEC in caso di positività. Il saggio per la determinazione dei geni eae ed e-hly era facoltativo. I partecipanti potevano utilizzare i metodi già in uso nei rispettivi laboratori oppure il metodo fornito dall’EU-RL VTEC.
Tabella 1. Risultati attesi dello screening in Real Time PCR sui campioni di semi inviati per lo studio inter-laboratorio
Campione A Campione B Campione C
vtx2+; vtx1-;
LABORATORI PARTECIPANTI ALLO STUDIO I laboratori che hanno preso parte allo studio erano:
- LNR degli Stati Membri coinvolti nei RASFF sui semi (Germania, Francia, Italia, Olanda e Regno Unito)
- Laboratori particolarmente impegnati nella discussione internazionale sull’analisi dei semi (LNR del Belgio e Danimarca, e ANSES, FR).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Tutti i partecipanti allo studio interlaboratorio hanno utilizzato il metodo fornito dall’EU-RL VTEC. I risultati dello screening in Real Time PCR sono riportati nella Tabella 2. Come si può osservare, due laboratori hanno ottenuto risultato positivo per la presenza del gene eae in un unico campione da cui hanno potuto anche isolare il ceppo di E. coli responsabile per tale positività. Un laboratorio ha riscontrato la presenza del gene vtx2 nel campione B da cui però non è stato possibile isolare il ceppo batterico.
Tabella 2. Risultati dello screening in Real Time PCR riportati dai laboratori partecipanti studio inter-laboratorio
Campione (risultati
attesi)
N. di risultati positivi/N. di analisi
vtx1 vtx2 eae e-hly A (vtx2+, e-hly+) 0/8 0/8 2/6 0/4 B (negativo) 0/8 1/8 0/6 0/4 C (negativo) 0/8 0/8 0/6 0/4
Tutti i laboratori che hanno partecipato allo studio hanno quindi riportato risultati differenti da quelli attesi in base alle prime analisi effettuate presso l’EU-RL VTEC.
Questa mancata corrispondenza tra i risultati ottenuti e quelli attesi non è da considerare del tutto sorprendente. Infatti, i campioni di semi sono composti da particelle che potrebbero essere contaminate singolarmente e distribuite in maniera non omogenea all’interno dei lotti. Inoltre, sulla base dei pochi dati presenti in letteratura, la contaminazione dei semi da parte di germi patogeni spesso avviene a livelli molto bassi.
I risultati ottenuti nell’ambito dello studio interlaboratorio potrebbero riflettere un basso livello di contaminazione non omogenea dei lotti di semi da cui sono stati prelevati i campioni. Questa ipotesi è supportata dai risultati di ulteriori indagini effettuate sui lotti di semi presso il nostro laboratorio. Tre porzioni di 50 gr ognuna appartenenti ai lotti usati nello studio sono state saggiate in tre differenti date: due precedenti la spedizione dei campioni e una durante lo svolgimento del test interlaboratorio. I risultati ottenuti sono riportati in Tabella 3.
Tabella 3. Risultati dello screening in Real Time PCR ottenuti presso l’EU-RL VTEC in diverse date sui campioni selezionati
per lo studio inter-laboratorio
Campione
Risultati della Real Time PCR (Ct)
1° test - 12 Giugno 2011 2° test – 5 Luglio 2011 3° test – 14 Luglio 2011 A vtx1- vtx2+ (Ct=20), eae-, e-hly + (Ct=20) vtx1- vtx2+ (Ct=31), eae-, e-hly + (Ct=31) vtx1- vtx2-, eae-, e-hly- B vtx1- vtx2-, eae-, e-hly- vtx1- vtx2-, eae-, e-hly- vtx1- vtx2+ (Ct=37), eae-, e-hly - C vtx1- vtx2-, eae-, e-hly- vtx1- vtx2-, eae-, e-hly- vtx1- vtx2-, eae-, e-hly-
Nel nostro laboratorio abbiamo condotto ulteriori analisi sull’altro lotto di semi positivo per VTEC nella prima analisi effettuata e da cui avevamo isolato il ceppo di E. coli vtx2+. Ulteriori otto porzioni da 50 gr sono state saggiate per la presenza del gene vtx2 mediante Real Time PCR il 14 Luglio. I risultati ottenuti sono riportati in Tabella 4, a confronto con quelli ottenuti nella prima analisi condotta il 12 Giugno.
Tabella 4. Risultati dello screening in Real Time PCR ottenuti presso l’EU-RL VTEC su diverse porzioni di campioni di semi
Data dell’analisi
Risultati della Real Time PCR per l’identificazione del gene vtx2 (Ct) per ogni
porzione 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 Giugno 2011 + (Ct= 23) 14 Luglio 2011 + (Ct= 36) - - + (Ct= 37) - - - -
Questi dati avvalorano l’ipotesi che i risultati riportati nel corso dello studio inter-laboratorio siano dovuti a un livello molto basso e disomogeneo di contaminazione dei semi. Non si può escludere che con il passare dei giorni il livello di contaminazione dei campioni possa essere ulteriormente diminuito. Tuttavia, i dati ad oggi disponibili sembrano mostrare che la contaminazione dei semi da patogeni enterici potrebbe persistere per periodi anche più lunghi rispetto al tempo impiegato per l’organizzazione e lo svolgimento dello studio inter-laboratorio (4).
CONCLUSIONI
In generale i risultati ottenuti suggeriscono che:
- il metodo originato tramite una discussione approfondita tra diversi laboratori durante la crisi e messo a punto dall’EU-RL VTEC rappresenta uno strumento utile per l’identificazione dei VTEC in campioni di semi avendo, portato all’isolamento del ceppo VTEC in almeno due campioni di semi contaminati naturalmente;
- un risultato negativo non definisce con certezza l’assenza del patogeno in un determinato lotto di semi dal momento che la contaminazione sembrerebbe essere un evento sporadico e non omogeneamente distribuita all’interno del lotto.
il punto chiave per l’identificazione di VTEC in campioni di semi sembra essere rappresentato dalla strategia di campionamento. L’approccio basato sul test di una singola porzione di semi sembra non essere sufficiente nell’identificare un lotto positivo, mentre una strategia di campionamento che preveda l’analisi di più unità campionarie potrebbe risultare più efficace.
RIFERIMENTI
1. European Centre for Disease Prevention and Control http:// ecdc.europa.eu/en/activities/sciadvice/Pages/Epidemiological_ Updates.aspx
2. European Reference Laboratory for E. coli http://www.iss.it/ vtec/work/cont.php?id=152&lang=2&tipo=3
3. Registro Italiano della Sindrome Emolitico Uremica. http:// www.iss.it/seu
4. US Food and Drug Administration www.fda.gov/food/ foodsafety/productspecificinformation/fruitsvegetablesjuices/ ucm078789.htm