Barbaro A. 1, Battistini R. 2, Vitale N. 1,Chiavacci L. 1,Rossini I. 2, Goria M. 3, Sant S. 3, Ercolini C. 2 , Serracca L. 2
1 S.S. Osservatorio Epidemiologico, Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino; 2 S.S. Microbiologia Marina, Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, sezione La Spezia;
1 S.C. Biotecnologie, Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino.
Key words: Norovirus, shellfish, PCR, depuration Parole chiave: Norovirus, molluschi bivalvi, PCR, depurazione
SUMMARY
Shellfish consumption has always been one of the major risk factors for Norovirus infection, especially when these products are eaten raw or slightly cooked, because depuration and relaying would occasionally be inadequate to remove viruses from live bivalve shellfish. The aim of this work was to assess the effectiveness of depuration treatments currently in use for purification of bivalve molluscs against Norovirus during the period November 2008 March 2010 in a purification plant in the gulf of La Spezia. A total of 144 samples of purified bivalve molluscs (Mytilus galloprovincialis) were examined by RT-PCR. The results showed the presence of viral RNA in 11 of 144 samples. These results demonstrated that shellfish depuration treatments currently used are insufficient for the complete removal of noroviruses, therefore becomes essential the improvement of these systems and the preventive measures.
INTRODUZIONE
I molluschi eduli lamellibranchi bivalvi sono implicati da sempre nella trasmissione di malattie gastroenteriche di origine virale soprattutto per la loro capacità di accumulare e concentrare patogeni nella ghiandola digestiva, e per il modo in cui vengono abitualmente consumati. Essi infatti non vengono eviscerati, e spesso vengono mangiati crudi o cotti solo all’apertura delle valve, il che accade dopo appena un minuto di cottura a vapore. Occorrono invece almeno 3 minuti di bollitura per raggiungere una temperatura interna adatta all’inattivazione dei virus (1). La cottura di per se quindi non rappresenta sempre un fattore di protezione assoluto (2).
La contaminazione virale dei mitili rappresenta un rischio elevato per la salute dell’uomo, in quanto le patologie gastroenteriche virali possono essere causate anche da una bassa carica virale che potrebbe residuare dopo trattamento termico non adeguato. Inoltre spesso, essendo i sintomi gastrointestinali di lieve entità, i casi presenti nella popolazione sono sottostimati. Prima degli anni ’90 non era possibile assegnare una eziologia certa a molte epidemie legate al consumo di mitili; successivamente, grazie allo sviluppo delle tecniche di biologia molecolare, è stato possibile riconoscere i Norovirus come responsabili di infezioni gastrointestinali di origine alimentare (6-7). I Norovirus possono infatti resistere a temperature superiori a 60° C ed inferiori a 0° C, a concentrazioni di cloro fino a 100 ppm ed ad altri disinfettanti ambientali, per cui è molto difficile la loro eliminazione dall’acqua potabile e dall’ambiente. Studi condotti allo scopo di testare l’efficacia di diversi processi di depurazione a cui sono normalmente sottoposti i molluschi hanno dimostrato che tali trattamenti non sempre assicurano la bonifica del prodotto da contaminazioni
virali in quanto il corpo del mollusco esercita un effetto protettivo sui virus presenti (8-9). Il presente lavoro ha avuto l’obiettivo principale di dimostrare, attraverso la rilevazione di campioni positivi, la scarsa efficacia dei trattamenti subiti dai molluschi bivalvi depurati e destinati al consumo umano: secondariamente è stato valutato l’effetto stagionalità.
MATERIALI E METODI
Nel periodo Novembre 2008 - Marzo 2010 sono stati esaminati 144 campioni di molluschi bivalvi (Mytilus galloprovincialis) provenienti da un impianto di depurazione di La Spezia a cui affluiscono molluschi da 6 siti di allevamento della zona. L’impianto prevede la depurazione dei mitili attraverso lo stazionamento per 24 ore in vasche con acqua di mare filtrata ed ozonizzata.
Figura 1 - La mappa rappresenta il golfo di La Spezia. In piccolo la mappa della Liguria con evidenziata la provincia di La Spezia. I pallini neri rappresentano i 6 siti di prelievo campioni.
Da ogni campione, costituito da sacchetti contenenti 1-2 kg di mitili, sono stati prelevati epatopancreas fino a raggiungere il peso complessivo di 25 g. Il materiale ottenuto, dopo omogeneizzazione, è stato sottoposto a trattamento con tampone glicina 0.05 M pH 9.2, e a concentrazione delle particelle virali eventualmente presenti mediante doppia precipitazione in PEG8000 e successive centrifugazioni ad alta velocità (10000 x g). Il pellet finale è stato risospeso in acqua ultrapura e sottoposto ad estrazione dell’RNA genomico mediante kit commerciali basati sul legame di affinità dell’RNA a membrane di silice. Il campione così ottenuto è stato infine analizzato per la ricerca di RNA genomico di Norovirus mediante una booster RT-PCR descritta da Vinjie e Koopmans (10). I campioni risultati positivi sono stati sottoposti a sequenziamento genico e le sequenze ottenute sono state comparate a quelle depositate con l’European Foodborne Viruses Database (https://hypocrates.rivm.nl/bnwww) per l’identificazione del genotipo.
E’ stata condotta un’analisi statistica bivariata con il test statistico chi quadrato tra presenza di norovirus e i fattori di stagionalità (mese e anno dei prelievi) per valutare se la presenza di norovirus fosse influenzata dal periodo dei prelievi dei campioni di mitili. In particolare si voleva valutare se durante i mesi estivi fosse più frequente la presenza di norovirus nei mitili.
Grafico 1 - Distribuzione dei mitili esaminati per la ricerca di norovirus. Sull’asse delle X è rappresentato l’arco temporale, sull’asse delle Y il numero di campioni esaminati.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Le indagini condotte hanno consentito di individuare la presenza di RNA Norovirus in 11 dei 144 campioni di mitili analizzati (7,6%). Le positività si sono riscontrate nei mesi di marzo, aprile, maggio, settembre e novembre (Grafico 1) e tutti i campioni sono risultati appartenenti al genogruppo II. L’analisi statistica bivariata tra presenza di norovirus e periodo temporale (mese ed anno di prelievo campioni) non ha evidenziato associazione statistica tra presenza del virus e stagionalità (c2 9,03 pvalue=0.38 per il fattore mese e c2 0,44 pvalue=0,8 per il fattore anno).
Campioni positivi sono stati trovati in tutti i siti di allevamento (Grafico 2).
Grafico 2 - Il grafico a barre mostra sull’asse delle X i siti di prelievo e sull’asse delle Y la percentuale di campioni di mitili trovati positivi per Norovirus alla PCR sul totale dei campioni di mitili esaminati sullo stesso sito di prelievo.
L’identificazione di RNA virale nei mitili depurati indica un potenziale pericolo per i consumatori e mette in evidenza il fatto che i molluschi crescono in acque contaminate e che, in linea con quanto osservato in altri lavori (11), i trattamenti di depurazione attualmente in uso nell’impianto non sono sufficienti a garantire l’eliminazione dei virus presenti. Studi sull’efficacia della depurazione con ozono di Mytilus galloprovincialis contaminati con Poliovirus 1 e HAV hanno dimostrato come, anche se durante la prime 24 ore di depurazione si assisteva ad una rapida diminuzione del titolo, gli enterovirus erano ancora rilevabili dopo 72 ore (12). Visto che la rimozione di Norovirus non sembra possibile con gli attuali trattamenti di depurazione, diventa fondamentale l’applicazione di metodi di depurazione più efficaci compatibilmente con i parametri sanitari ed organolettici da una parte ed i tempi tecnici richiesti dal mercato dall’altra. Altrettanto importante risulta l’adozione di ulteriori misure preventive quali il monitoraggio delle aree di produzione al fine di valutare l’effettiva presenza del virus, l’individuazione di aree a rischio ed una maggiore attenzione al trattamento dei liquami grezzi.
BIBLIOGRAFIA
1. Hewitt J, Greening GE (2006) J Food Prot. 69(9), 2217-23. 2. Baert L, Debevere J, Uyttendaele M (2009) Int J Food
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3. Ando T, et al (1995) J Med Virol, 47(2), 145-52.
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7. Parashar UD, Monroe SS, (2001) Rev Med Virol, 11(4), 243- 52.
8. Richards, G.P. (1988) J Food Protect, 51, 218–251.
9. Le Guyader FS, et al (2006) Emerg. Infect Dis, 12, 931–936. 10. Vinijé J, Koopmans M (1996) J Infect Dis, 174(3), 610-5. 11. Croci L, et al (2007) Int J Food Microbiol, 114, 252-257. 12. Croci L, et al (1992) Actes de Conf Intern sur la Purification
des Coquillages, France 6-8 Apr.
Ricerca condotta nell’ambito del Progetto di Ricerca Corrente 2007 “Valutazione della presenza di norovirus nell’allevamento e produzione di molluschi eduli lamellibranchi prodotti nel golfo di La Spezia, strategie di controllo e comunicazione del rischio.”