Santoro E.1, Benedetti V.1,2, Invernizzi E.2, Miccolupo A.3, Nassuato C.4, Parisi A.3, Vezzoli F.1, Luini M.1
1IZSLER – Sezione di Lodi, 2 ASL della Provincia di Lodi, 3IZS Puglia e Basilicata - Sezione di Putignano (BA), 4IZSLER – S.E.L.
KEY WORDS: Campylobacter jejuni, milk, bovine SUMMARY
Campylobacter jejuni is the most common cause of foodborne infection in Europe. The aim of this study was to evaluate the prevalence of Campylobacter spp. in the bulk tank milk from dairies of an area of the Po Valley and to study the genetic variability among isolates. In total 31 strains of C. jejuni were isolated from the 258 examined samples (12%). Our results suggest that the contamination sources may be either feces or udder infection. The isolates were classified by MLST into 13 different Sequence Types, mainly belonging to the Clonal Complex-21 (9 strains), followed by CC-48 (3 strains), CC-61, CC-206 and CC-403 (2 strains).
INTRODUZIONE
Secondo i dati dell’Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA), le infezioni umane da Campylobacter spp. presentano la maggiore incidenza nell’Unione Europea tra le infezioni batteriche a veicolo alimentare con una stima di nove milioni di casi all’anno (2). Il consumo di carne non adeguatamente cotta, in particolar modo quella di pollame, rappresenta nel 20-30% dei casi la fonte di contaminazione (3,6). Tra gli altri alimenti di origine animale, il latte bovino è ritenuto una potenziale fonte di contagio per l’uomo. La contaminazione del latte da C. jejuni può verificarsi durante la mungitura da parte di stipiti che colonizzano il tratto gastrointestinale di questi animali, o in alternativa essere la conseguenza di una localizzazione a livello mammario di questi microrganismi che genera una contaminazione elevata e persistente del latte delle singole bovine (9). Fra i metodi di caratterizzazione molecolare di Campylobacter, MLST (Multi-Locus Sequence Typing) è una tecnica discriminante e riproducibile utilizzata internazionalmente per gli studi di epidemiologia molecolare (7). Essa in funzione delle sequenze di sette diversi geni cataloga gli isolati in Sequence Types (ST). A loro volta ST geneticamente affini sono riuniti in gruppi denominati Complessi Clonali (CC). In generale, i principali CC isolati dal bovino sono CC-61, CC-48, CC-42, mentre CC-21 mostra una più ampia distribuzione tra le diverse specie animali, probabilmente per una spiccata capacità di adattamento di questo particolare genotipo. L’obbiettivo di questo lavoro è stato quello di studiare la prevalenza della contaminazione da Campylobacter spp. del latte di massa in alcune aziende di bovine da latte della provincia di Lodi ed effettuare la genotipizzazione dei ceppi isolati per considerazioni di tipo epidemiologico.
MATERIALI E METODI
Campioni - Sono stati analizzati campioni di latte di massa provenienti da 258 delle 351 aziende da latte della provincia di Lodi. Il prelievo è stato effettuato in contenitori sterili dopo agitazione e raffreddamento della massa a fine mungitura ed è stato conservato refrigerato a 4-7° C fino alla consegna al laboratorio. In alcune aziende, dopo 30-90 gg è stato effettuato un secondo campionamento del latte di massa ed un campione di feci ambientali (pool di 15 campioni raccolti da terra nei punti di maggiore passaggio).
Esami batteriologici - Isolamento di Campylobacter - I campioni di latte e di feci sono stati inoculati nella quantità di 25 g secondo una diluizione 1:10 in terreno liquido di Bolton. Dopo incubazione per 48 ore a 43 C°, 100 μl di brodo sono stati piastrati su mCCD agar
e Skirrow agar in seguito a filtrazione attraverso una membrana di 0.45 μm ed incubati in microaerofilia (GENbag microaer. Biomerieux) per altre 48 h. Le colonie morfologicamente riferibili a Campylobacter spp. sono state sottoposte a colorazione di Gram e identificate tramite PCR specifica come di seguito descritto. Multiplex PCR - Il DNA è stato estratto a partire da colonie tipiche risospese in 1 ml di Tripticase Soy Broth (TSB) con DNEasy Tissue Kit Qiagen. L’estratto è stato sottoposto ad una multiplex-PCR in grado di amplificare il DNA di C. jejuni e C. coli secondo un metodo descritto in letteratura (11), che prevede l’utilizzo di due coppie di primers specie specifici per C. jejuni e per C. coli che amplificano rispettivamente frammenti di 344 bp e 500 bp. Conta delle enterobatteriacee - Il latte è stato seminato direttamente in quantità di 100 µl tal quale e della diluizione 1:10 su terreno VRBGA, incubato per 24 ore per lo sviluppo di colonie caratteristiche. Il conteggio delle colonie in UFC è stato effettuato con un calcolo della media ponderata delle due sucessive diluizioni.
Genotipizzazione - I DNA estratti sono stati sottoposti a MLST secondo un metodo che evidenzia i polimorfismi a livello di singoli nucleotidi di sette geni housekeeping (1). L’assegnazione dei profili allelici, dei ST e dei CC è stata effettuata mediante il database MLST (http://pubmlst.org/campylobacter/).
RISULTATI
Esami batteriologici - Le indagini hanno evidenziato 31 campioni positivi per Campylobacter spp. su 258 campioni di latte di massa pari al 12 % (I.C. 95%: 10 -14). Tutti gli isolati sono stati identificati come C. jejuni tramite multiplex-PCR. La ricerca delle enterobatteriacee è risultata < 10 UFC/ml nel 5,8% dei campioni e con valori molto variabili compresi fra 10 e 30.000 UFC/ml nei restanti campioni. Il secondo campionamento di latte ed il campionamento di feci ambientali è stato effettuato in 16 delle 31 aziende positive. In 5 aziende è stata confermata la positività del latte di massa (31,3%) e un campione di feci ambientali è risultato positivo per C. jejuni. La conta delle enterobatteriacee sul latte di massa è stata analizzata in due gruppi di aziende: quelle dove il latte di massa è risultato ripetutamente positivo per C. jejuni (5 aziende) e quelle dove invece il secondo campionamento è risultato negativo (11 aziende). I valori limite e la mediana dei due gruppi sono risultati rispettivamente 10 - 673 UFC/ml (mediana: 73) e 73 - 30.000 UFC/ml (mediana 682) (Tabella 1).
Genotipizzazione - La genotipizzazione con MLST è stata eseguita su 23 dei 31 ceppi isolati. Il genotipo riscontrato con più frequenza corrisponde al complesso clonale 21, evidenziato in 9 dei 23 ceppi tipizzati (39,1%) seguito dal CC-48 (3 ceppi), CC-61, CC-206, CC-403 (2 ceppi), CC-42, CC-45, CC-22 e CC-658 con 1 ceppo per ciascuno (Figura 1).
Esito per C. jejuni del 1° e 2° prelievo (n. aziende)
Enterobatteriacee ufc/ml Range (mediana) Positivo / Negativo (11) 73 – 30.000 (682)
Tabella 1 – Risultato della conta delle Enterobatteriacee e della ricerca di C. jejuni al 2° prelievo dopo 30/90 gg in 16 aziende risultate positive per C. jejuni sul latte di massa.
Figura 1 – Albero filogenetico dei 23 ceppi di C. jejuni isolati basato sulla analisi MLST.
DISCUSSIONE
I nostri risultati documentano una prevalenza di C. jejuni nel 12% dei campioni/aziende esaminati, una percentuale che appare rilevante anche rispetto ad analoghe indagini condotte negli USA che hanno messo in evidenza percentuali di positività comprese tra l’1% e il 9% (4,5). Un precedente studio da noi eseguito aveva evidenziato come la localizzazione, in alcune bovine, di C. jejuni a livello mammario possa essere causa di una persistente contaminazione del latte di massa aziendale (9). Nel presente studio è stata dimostrata una persistenza della contaminazione del latte di massa in 5 casi su 16 nei quali è stato effettuato un secondo campionamento a distanza di tempo. In queste 5 aziende la conta delle enterobatteriacee è risultata mediamente molto bassa a suggerire che fosse dovuta ad infezione mammaria di una o più bovine anziché a contaminazione fecale. Al contrario, nelle altre 11 aziende, data l‘elevata presenza media di enterobatteriacee nel latte, si può pensare a contaminazione fecale occasionale come origine della positività del latte.
Inaspettatamente, i campioni di feci ambientali hanno dato esito positivo solo in un caso. Questa bassa percentuale di ritrovamento del Campylobacter nelle feci può essere semplicemente correlata all’inadeguatezza del campione (pool di 15 feci ambientali) ed influenzata anche dal fatto che l’eliminazione fecale mostra una periodicità stagionale con picchi segnalati tra giugno e novembre (7), mentre il nostro secondo campionamento è stato effettuato nei mesi invernali.
Per quanto riguarda l’analisi epidemiologico-molecolare, i ceppi di
C. jejuni presenti nell’area lodigiana corrispondono ai complessi clonali segnalati con maggior frequenza nei paesi dell’Unione Europea, cioè CC-61, CC-48, CC-42, CC-21. Inoltre abbiamo rilevato la presenza di CC-658 e ST-441, che in altri studi sembrano essere correlati principalmente alla malattia nell’uomo, CC-45 frequentemente isolato da campioni d’acqua, ma anche associato a cani, gatti, uomo e animali selvatici, e CC-206 diffuso in campioni animali e ambientali (8,10).
Una analisi spaziale del tutto preliminare della distribuzione dei diversi complessi clonali sul territorio della Provincia non evidenzia alcuna relazione fra ceppi appartenenti allo stesso Complesso Clonale, nè diretta, nè attraverso i corsi d’acqua che attraversano la provincia. Sono da verificare eventuali connessioni fra gli allevamenti come compravendita di animali o altre possibili forme di trasmissione indiretta.
La elevata prevalenza di C. jejuni nel latte bovino nonché la presenza di genotipi evidentemente correlati alla campilobatteriosi umana impone un attento monitoraggio di questa matrice alimentare quale importante veicolo di infezione per l’uomo anche alla luce della possibilità di una sua commercializzazione senza che sia sottoposta ad alcun trattamento termico. Ulteriori indagini sono inoltre necessarie per stabilire il ruolo patogenetico di C. jejuni nella patologia mammaria bovina.
Le ricerche sono state eseguite con il contributo del progetto Regione Lombardia 2009 RELOPROZOO
BIBLIOGRAFIA
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