Michelacci V., Morabito S., Tozzoli R., Grande L., Scavia G., Ferreri C., Minelli F., Marziano M. L., Caprioli A.
Laboratorio Europeo e Nazionale di Riferimento per Escherichia coli, Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare, Istituto Superiore di Sanità, Roma, Italia
Keywords: Escherichia coli, VTEC O104:H4, PCR-Real Time
ABSTRACT
A large outbreak of haemolytic uraemic syndrome and bloody diarrhoea has occurred in Europe in May and June 2011. The causative agent was an unusual verocytotoxin-producing Escherichia coli strain, belonging to serotype O104:H4 and lacking the eae gene, which is considered a hallmark of highly pathogenic VTEC. As an early response to the emergency, the European Union Reference Laboratory for E. coli developed a Real Time-PCR based method for the detection of the O104:H4 outbreak strain in foodstuff. Such a method allows the identification of negative and presumptively positive samples in 24 hours and requires further 24 hours for strain isolation and confirmation. The proposed method represents an important tool for the fast and specific detection of this rare and unusual VTEC strain in foodstuff. INTRODUZIONE
Durante i mesi di Maggio e Giugno 2011 si è verificata in Germania una gravissima epidemia di diarrea emorragica e sindrome emolitico uremica (SEU), una complicanza delle infezioni intestinali da Escherichia coli produttore di verocitotossina (VTEC) caratterizzata da un’insufficienza renale acuta che spesso necessita di dialisi. Nel corso dell’epidemia sono stati registrati 4033 casi, di cui 901 casi di SEU e 50 morti (3). Il ceppo responsabile dell’epidemia era uno stipite VTEC appartenente ad un sierotipo inusuale, O104:H4 (6), raramente associato a malattia nell’uomo, e l’origine del focolaio epidemico è stata individuata nel consumo di germogli vegetali crudi contaminati. Nel mese di Giugno un altro focolaio di infezione causato dallo stesso ceppo VTEC è stato identificato in Francia (3).
La caratterizzazione molecolare del ceppo epidemico ha rilevato la presenza del gene vtx2, che codifica per la verocitotossina di tipo 2, e l’assenza del gene eae, marcatore genetico del meccanismo “attaching-effacing” di adesione alla mucosa intestinale, considerato un carattere distintivo dei ceppi VTEC altamente patogeni per l’uomo. Sorprendentemente, il ceppo possedeva invece geni caratteristici degli E. coli enteroaggregativi, che rappresentano un diverso patogruppo di E. coli e sono capaci di colonizzare la mucosa intestinale attraverso un diverso meccanismo di adesione rispetto ai VTEC. Il ceppo epidemico era Inoltre resistente ad una vasta gamma di antibiotici (resistenza ad ampicillina, cefoxitina, cefotaxima, cetfazidime, streptomicina, tetraciclina, trimethoprim/sulfametossazolo ed acido nalidixico) ed era in grado di produrre beta-lattamasi ad ampio spettro (ESBL) (1).
Le particolari caratteristiche del ceppo VTEC O104 hanno inizialmente complicato l’analisi dei campioni di alimenti svolte durante le indagini epidemiologiche nel corso dell’epidemia. Gli unici standard disponibili per la ricerca dei VTEC negli alimenti sono costituiti da un metodo colturale per la ricerca di VTEC O157 (ISO 16654:2001) ed un metodo molecolare di recente formulazione per la ricerca di VTEC appartenenti ai sierogruppi più frequentemente associati a malattia (O157, O26, O103, O111 ed O145), che si basa sull’identificazione dei geni codificanti le verocitotossine (vtx), del gene eae e dei geni associati a tali
sierogruppi (CEN ISO TS 13136, in fase di pubblicazione). Entrambi questi metodi non erano utilizzabili per la ricerca negli alimenti del ceppo VTEC O104:H4 responsabile dell’epidemia. Il nostro laboratorio, in qualità di Laboratorio di Riferimento per l’Unione Europea per E. coli (EU-RL), ha rapidamente sviluppato un metodo molecolare basato sulla tecnica della PCR-RealTime, in grado di identificare la presenza presuntiva del ceppo epidemico in campioni di alimenti in 24 ore. Ulteriori 24 ore sono richieste per l’isolamento e la conferma dei ceppi isolati (4). Il metodo è stato diffuso attraverso il sito internet dell’EU-RL già il 27 Maggio, cinque giorni dopo la prima comunicazione delle autorità tedesche dell’esistenza dell’epidemia. Questo ha fornito alla rete europea e nazionale dei laboratori deputati al controllo degli alimenti uno strumento analitico per fronteggiare l’emergenza.
DISEGNO DEL METODO
Al fine di elaborare un metodo rapido ed efficace per la ricerca del ceppo VTEC O104:H4 negli alimenti, abbiamo messo a punto una procedura che mira all’identificazione del gene associato all’antigene O104 (wzxO104) in colture di arricchimento positive per la presenza dei geni codificanti le verocitotossine (vtx).
Il primo step del metodo consiste nella preparazione di colture di arricchimento mediante aggiunta di 25 g dell’alimento da testare (25 ml nel caso si tratti di alimenti liquidi) a 225 ml di acqua peptonata, che vengono successivamente omogeneizzati e lasciati in incubazione a 37°C ± 1°C per 18-24 ore. Nel caso di analisi di campioni di semi, la probabile fonte di infezione dell’epidemia da VTEC O104:H4, la porzione da saggiare è invece di 50 g (4). Un’aliquota di 1 ml della coltura di arricchimento viene quindi analizzata per la presenza dei geni codificanti le verocitotossine mediante PCR-RealTime secondo quanto descritto nel primo passaggio del metodo standard CEN ISO TS 13136. I campioni che risultano vtx-positivi vengono quindi sottoposti a PCR-RealTime per l’identificazione del gene wzxO104
(Tab. 1) (2).
Tabella 1. Primers e sonde utilizzati nel metodo descritto
Nome Sequenza Gene Pro dot to Acc No. Rif wzxO104fwd TGTCGCGCAAA GAATTTCAAC wzxO104 100 bp CU 928 145 2 wzxO104rev AAAATCCTTTAAA CTATACGCCC w z xO 1 0 4 probe TTGGTTTTTTTGT ATTAGCAATAAGT GGTGTC fliCH4fwd GCTGGGGGTAAA CAAGTCAA fliCH4 192 bp AY2 499 89 4 fliCH4rev CCAGTGCTTTTAA CGGATCG fliCH4probe TCTTACACTGACA CCGCGTC
I campioni positivi ad entrambi i saggi (vtx+, wzxO104+) vengono quindi seminati su piastre di MacConkey agar o TBX allo scopo di isolare singole colonie. Si può scegliere di utilizzare anche un ulteriore terreno selettivo addizionato di uno degli antibiotici per i quali il ceppo mostra resistenza. Un massimo di 50 colonie che mostrano la tipica morfologia degli E. coli o che crescono su piastre selettive vengono seminate su piastre di Nutrient Agar (NA) e contemporaneamente saggiate (singolarmente o in pool da 10 colonie ciascuno) per la presenza dei geni vtx. Le colonie positive a tale saggio vengono testate ulteriormente per la presenza del gene associato all’antigene O104 e del gene fliCH4 (tab. 1), che codifica l’antigene flagellare H4. Una coppia
di primers ed una sonda specifiche sono state sviluppate nel nostro laboratorio sulla base della sequenza del gene fliCH4 del ceppo di E. coli U9-41, disponibile in banca dati con il numero d’accesso AY249989 (Tab.1).
Le due reazioni di PCR-RealTime per i geni wzxO104 e fliCH4 possono essere anche eseguite contemporaneamente in duplex, mediante marcatura delle due sonde molecolari con fluorofori compatibili (ad esempio FAM ed HEX). Un esempio dei risultati ottenuti con una reazione duplex è mostrato in figura 1.
Figura 1. Curve di amplificazione relative ad una reazione di PCR-RealTime per wzxO104 e fliCH4 eseguita in duplex: curve
di amplificazione di un campione positivo e di un controllo negativo per i geni wzxO104 (a) e fliCH4 (b)
In alternativa, la conferma delle colonie isolate può essere effettuata mediante il protocollo di PCR convenzionale sviluppato dal “Konsiliarlabor für Hämolytisch-Urämisches Syndrom (HUS)”, che consiste in una reazione di PCR convenzionale multiplex che ha come target geni caratteristici del ceppo epidemico vtx, TerD, rfbO104 and fliCH4 (5) inserito nella procedura come annesso (4).
DISCUSSIONE
Il ceppo VTEC responsabile dell’epidemia sviluppatasi in Germania nei mesi di Maggio-Giugno 2011 appartiene ad un sierotipo raramente associato in precedenza a malattia grave nell’uomo e possiede un’inusuale combinazione di determinanti genetici di virulenza (1, 6). Queste caratteristiche fanno sì che i metodi standard ad oggi disponibili per la ricerca dei VTEC, essendo basati sull’identificazione di queste caratteristiche, non siano efficaci per identificarne la presenza. D’altra parte, la ricerca di tale ceppo negli alimenti è risultata immediatamente un aspetto di enorme importanza per identificare la fonte dell’epidemia e rassicurare la popolazione, visto l’enorme impatto emotivo dell’episodio sulla popolazione europea. Per questo motivo, il nostro laboratorio, in qualità di Laboratorio di Riferimento per l’Unione Europea per gli E. coli patogeni, ha sviluppato e divulgato rapidamente (dopo cinque giorni dalla comunicazione che l’epidemia era in corso) attraverso il proprio sito internet (www.iss.it/vtec) un metodo molecolare in grado di identificare la presenza del ceppo VTEC O104:H4 (4)
(Figura 2). Tale metodo si basa sulla ricerca dei geni wzxO104, che codifica l’antigene superficiale O104, e fliCH4, codificante
invece l’antigene flagellare H4, in colture di arricchimento positive per la presenza dei geni vtx.
Questo metodo permette di escludere in sole 24 ore la contaminazione dei campioni da parte del ceppo VTEC O104:H4 o di identificarne la presenza presuntiva qualora le PCR-RealTime che hanno come target i geni vtx e wzxO104 risultino positive. In tal caso, si rende necessario uno step di isolamento su piastra seguito da conferma delle colonie isolate quali VTEC O104:H4 mediante PCR-RealTime o PCR convenzionale. L’identificazione dei campioni positivi e l’isolamento del ceppo VTEC O104:H4 richiede quindi un tempo totale massimo di 48 ore (Figura 2).
Figura 2. Diagramma di flusso della procedura di screening degli alimenti
Questo metodo rappresenta un utile strumento per l’identificazione di ceppi VTEC O104:H4 in campioni di alimenti e grazie alla sua rapidità di esecuzione, si è rilevato di grande utilità nel corso delle analisi svolte durante l’epidemia e resta ad oggi la metodica d’elezione per la ricerca di VTEC O104:H4 negli alimenti.
BIBLIOGRAFIA
1. Bielaszewska M, Mellmann A, Zhang W, Köck R, Fruth A, Bauwens A, Peters G, Karch H. Characterisation of the Escherichia coli strain associated with an outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, 2011: a microbiological study. Lancet Infect Dis. 2011 Sep;11(9):671-6.
2. Bugarel M, Beutin L, Martin A, Gill A, Fach P. Micro-array for the identification of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) seropathotypes associated with Hemorrhagic Colitis and Hemolytic Uremic Syndrome in humans. Int J Food Microbiol. 2010 Sep 1;142(3):318-29.
Shiga toxin-producing E. coli (STEC): Update on outbreak in the EU, 27 July 2011
4. European Reference Laboratory for E. coli. Detection and identification of verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O104:H4 in food by real Time PCR. Rome: Istituto Superiose di Sanità; 2 Jun 2011. Available from: http:// www.iss.it/binary/vtec/cont/Lab_Proc_VTEC_O104.pdf 5. Konsiliarlabor für Hämolytisch-Urämisches Syndrom
(HUS), “Laborinfo Stand 01.06.2011” downloadable from the website www.ehec.org.
6. Scheutz F, Nielsen EM, Frimodt-Møller J, Boisen N, Morabito S, Tozzoli R, Nataro JP, Caprioli A.. Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Euro Surveill. 2011 Jun 16;16(24). pii: 19889.